萎叶叶子提取物抗利什曼原虫的活性的制作方法

文档序号:567657阅读:273来源:国知局
专利名称:萎叶叶子提取物抗利什曼原虫的活性的制作方法
技术领域
本发明涉及萎叶提取物治疗动物包括人的利什曼病的用途。近些年对内脏利什曼病的化学疗法进展很小。萎叶叶子提取物抗利什曼原虫的活性提示它在治疗人内脏利什曼病的潜在用途。
背景技术
在印度通常称为黑热病的利什曼病是一个全球性的健康问题。利什曼原虫属的多个种和株系的感染会引发人的许多疾病,并且这些疾病的临床症状有许多不同。疾病的严重程度主要取决于被感染个体的免疫状态和所涉及的利什曼原虫属的种。在80个国家,估计约有350百万人受到此疾病的威胁。世界卫生组织(WHO)估计全世界有12百万例利什曼病,每年有超过400,000新病例。内脏型利什曼病或称黑热病,是由寄生虫多氏利什曼虫(Leishmania donovani)引起的,并且经常是致命的。近年来,虽然在对利什曼原虫的生物化学和分子生物学的认识方面有了很大进展,但用化学疗法进行的治疗却几乎没有进展。有毒的五价锑剂仍是治疗利什曼病的主要方法。虽然临床使用二线药物,喷他脒和两性霉素B,但它们存在严重的毒副作用。因此对利什曼病的改进药物疗法仍然是吸引人的。最近吲哚基喹啉衍生物已在体外显示出对多氏利什曼虫前鞭毛型和无鞭毛型的细胞毒性,并且对治疗鼠类内脏利什曼病是有效的(GanesChakrabarti,Anirban Basu,Partha Pratim Manna,Sashi Bhusahan Mahato,Nirup Bikash Mandal和Santu Bandyopadhyay,Journal of AntimicrobialChemotherapy(1999)Vol.43pp.359-366)。
萎叶叶子有强的刺激性的芳香气味并作为咀嚼剂在广泛应用。通常将已停止生长但还未变脆的成熟或过熟的叶用于咀嚼。咀嚼用的碱性制剂由涂有熟石灰和儿茶的萎叶叶子并加入槟榔果的碎屑组成;根据个人口味还使用调味料如椰蓉、丁香、小豆蔻、茴香、甘草粉、肉豆蔻以及烟草。在一些地方,制备用锅镀有银或金叶。作为咀嚼剂有许多性质是可信的它是芳香的,可助消化,可引起刺激和驱风止痛。在药学上,可用于粘膜炎和肺部疾患;它也用于泥敷剂。将萎叶和槟榔果及其他辅剂一起咀嚼的效果是兴奋唾液腺和刺激口腔粘膜。产生的红色是由于槟榔果中的色素所致,这一现象表明它本身受到石灰中的碱和儿茶的作用。产生了温和的刺激,除有令人愉快的气味外,还导致温暖和良好的感觉。判断该叶作为芳香剂价值的最重要的因素是所含精油的量和特别是其性质。来自不同区域的萎叶叶子气味和味道不同。刺激性最强的是三七类(Sanchi type),而最温和、甜的是来源于马德拉斯的(Madras)。萎叶叶子含精油,根据叶的种类的不同,油的含量从0.7%至2.6%。油由酚类和萜类组成。酚油的比例越高,质量越好。称为萎叶酚(萎叶酚;4-烯丙基-2-羟基-1-甲氧基苯)的丁子香酚的一种异构体被认为是萎叶油的特征组分。然而在印度的样品中不含该组分。印度种的萎叶油主要含有酚类组分。萎叶油已用于各种呼吸道粘膜炎的治疗中,如在治疗白喉时采用漱口剂或吸入剂作为局部应用。它具有驱风性能。它对哺乳动物的中枢神经系统显示不同的作用;致死量产生在几个小时内导致死亡的深度昏迷。叶子的精油和提取物有抗多种格兰氏阳性和格兰氏阴性菌-例如白色化脓微球菌(Micrococcus pyogenes var.A1bus)和金黄色化脓微球菌(var.aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和巨大芽孢杆菌(B.Megaterium)、肺炎双球菌(Diplococcus pneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhosa)、逗号弧菌(Vibrio comma)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、茄伯克霍尔德氏菌(Pseudomonas solanacaerum)、藤黄八叠球菌(Sarcina lutea)和胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)-的活性。精油和叶子的提取物也显示对抗黑色曲菌(Asperigillus niger)、米曲菌(A.oryzae)、新月弯孢(Curvularia lunata)和尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)的抗真菌活性。人们发现该油使原生动物门大草履虫(Paramaecium caudatum)在约5分钟内致死(印度财富(Wealth of India),第8卷,84-94页)。
发明目的本发明的主要目的是通过施用萎叶叶子提取物、冻干提取物或含有萎叶叶子提取物的组合物的方式用萎叶叶子提取物治疗动物-包括人利什曼病。
本发明的另一目的是提供可用于治疗人利什曼病的含有萎叶叶子提取物的组合物。
本发明的又一个目的是萎叶叶子水提取物的制备方法。
在另一实施方案中,以不影响萎叶叶子提取物的活性的方式选择添加剂。
在另一实施方案中,添加剂选自含有蛋白质、碳水化合物、糖、滑石、硬脂酸镁、纤维素、碳酸钙、淀粉-明胶浆和/或药学可接受的载体的营养物组。
在另一实施方案中,萎叶叶子提取物经口或肌内给药。
在又一实施方案中,将萎叶叶子提取物配制成口服的胶嚢、糖浆剂、浓缩物、粉剂或颗粒剂。
在另一实施方案中,萎叶叶子提取物与添加剂的比例在10-1的范围内。
在另一实施方案中,萎叶叶子提取物是以10-20mg/kg体重的剂量水平给药的。
在另一实施方案中,萎叶叶子提取物或含萎叶叶子提取物的组合物隔天给药至少3周,优选1周。
在另一实施方案中,萎叶叶子提取物可以在体外降低前鞭毛型多氏利什曼虫生存力57-79%,并降低脾和肝寄生虫荷载量93-95%。
在本发明的另一实施方案中,萎叶叶子提取物或组合物用于治疗内脏利什曼病或黑热病。
在本发明的另一实施方案中,萎叶叶子提取物或冻干提取物或组合物与药学可接受的添加剂共同或联合给药。
在本发明的另一实施方案中,选择不影响萎叶叶子提取物的活性的添加剂。
在本发明的另一实施方案中,添加剂选自含有蛋白质、碳水化物、糖和药学可接受的载体的营养物组。
在本发明的另一实施方案中,萎叶叶子提取物或组合物经口或肌内给药。
在另一实施方案中,将萎叶叶子提取物配制成口服的胶囊剂、糖浆剂、浓缩剂、粉剂或颗粒剂。
在本发明的另一实施方案中,萎叶叶子提取物与添加剂的比例在10-1的范围内。
在本发明的另一实施方案中,萎叶叶子提取物以10-20mg/kg体重的剂量水平给药。
在本发明的另一实施方案中,萎叶叶子提取物或含萎叶叶子提取物的组合物隔天给药至少3周,优选1个月。
在本发明的另一实施方案中,萎叶叶子提取物在体外降低前鞭毛型多氏利什曼虫生存力达57-79%,并降低脾和肝寄生虫荷载量93-95%。
在本发明的另一实施方案中,通过将萎叶叶子提取物或冻干提取物的药学可接受的组合物给药以治疗内脏利什曼病或黑热病的方法。
在另一实施方案中,通过粉碎萎叶叶子,或用水或有机溶剂如醇、四氯化碳、氯仿和丙酮提取粉碎后的叶子,得到萎叶叶子提取物。
本发明的另一个实施方案涉及制备萎叶叶子提取物,包括以下步骤i)洗萎叶的鲜叶,并在混合搅拌器内均质化;ii)在超声浴中用每15分钟2-3个超声脉冲发射波(burst)超声提取,并过滤提取物,如果需要,重复提取过程至少1次并干燥;并iii)冻干提取物得到半固体团块。
在本发明的另一实施方案中,萎叶叶子选自野生型(Wild type)、攀援型(Climber type)、Bangla型和甜蜜型(Sweet type)。
萎叶叶子提取物在体外对前鞭毛型多氏利什曼虫生存力的作用从野生型、Bangla型和甜蜜型萎叶叶子制备的提取物在以剂赖方式降低多氏利什曼虫前鞭毛型生存力方面几乎等效(表1)。终浓度为12mg/ml的从野生类型萎叶叶子得到的提取物降低前鞭毛型多氏利什曼虫的生存力79%。另一方面,从Bangla型或甜蜜型萎叶叶子得到的提取物在同样的浓度-即12mg/ml降低前鞭毛型生存力分别为57.5%和68.9%。因此,野生型的萎叶叶子提取物比其他类型萎叶叶子提取物显示稍强的抗利什曼原虫活性。
对附图的简要说明


图1多氏利什曼虫感染的金仓鼠经用PBS和萎叶叶子提取物治疗后,以吉姆萨染色的肝和脾涂片的显微照片。
以解释的方式给出以下实施例,只用来详细说明,不应将这些实施例理解为以任何方式来限制本发明的范围。
iii.用Intersil ODS-3(4.6×250mm)分析柱对活性物质进行HPLC分析,溶剂系统为甲醇-水(4∶1),流速为1.0ml/min.,在217nm检测,发现此物质分为11个峰,保留时间分别为2.69、4.27、5.95、6.97、7.49、9.39、11.20、12.40、15.53、18.90和21.49分钟。
表1
萎叶叶子提取物降低前鞭毛型多氏利什曼虫的体外生存活力

实施例5萎叶叶子提取物体内抗利什曼原虫活性在金仓鼠体内测定萎叶叶子提取物抗利什曼原虫的活性。心内注射新鲜制备的无鞭毛型多氏利什曼虫(1×107/只仓鼠)使金仓鼠(4-6周龄)感染。感染1天后将金仓鼠分成3组(5只动物/组);一组接受肌内注射野生型萎叶叶子提取物(10mg/kg体重,隔日),每只动物接受共15次注射。另一组通过经口途径接受同样剂量(10-mg/kg体重,隔日)的野生型萎叶叶子提取物。对照组的动物经口隔日接受PBS。末次处理后1周,即注射5周后处死全部动物。用吉姆萨染色后,从压制的涂片检查脾和肝的寄生虫荷载量。用下式表示每个器官中所荷载的寄生虫量器官重量(mg)×每细胞核的无鞭毛型数量×[2×105]浓度为10mg/kg体重的萎叶叶子提取物对降低多氏利什曼虫感染的仓鼠脾和肝中寄生虫荷载量是有效的。肌内和经口两种途径是等效的。采用这两种途径,寄生虫荷载量降低百分数在93-95%之间。结果示于表2和
图1。
表2用萎叶叶子提取物治疗多氏利什曼虫感染的金仓鼠

*-3-5个动物的平均值±S.D**-2个动物的平均值如表-2和
图1所示,浓度为10mg/kg体重的萎叶叶子提取物在降低多氏利什曼虫感染的金仓鼠脾和肝寄生虫荷载量方面是有效的。注意的是两种途径,即肌内或经口几乎等效。采用这两个途径,寄生虫荷载量降低的百分数为93-95%。
权利要求
1.萎叶叶子提取物或含萎叶叶子提取物的组合物治疗动物包括人内脏利什曼病或黑热病的用途,包括将药学有效量的萎叶叶子提取物单独或与添加剂组合对动物包括人给药的步聚。
2.根据权利要求1所述的用途,其中萎叶叶子提取物或含萎叶叶子提取物的组合物与药学可接受的添加剂联合或组合给药。
3.根据权利要求1所述的用途,其中选择的添加剂不干扰萎叶叶子提取物的活性。
4.根据权利要求1所述的用途其中添加剂选自含有蛋白质、碳水化合物、糖、滑石、硬脂酸镁、纤维素、碳酸钙、淀粉-明胶糊和/或药学可接受的载体的营养物组。
5.根据权利要求1所述的用途,其中萎叶叶子提取物或含萎叶叶子提取物的组合物经口或肌内途径给药。
6.根据权利要求1所述的用途,其中将萎叶叶子提取物制成经口给药的片剂、糖浆剂、浓缩物、粉剂或颗粒剂。
7.根据权利要求1所述的用途,其中萎叶叶子提取物与添加剂的比例在1-10∶10-1之间。
8.根据权利要求1所述的用途,其中萎叶叶子提取物或组合物以10-20mg/kg体重的剂量水平给药。
9.根据权利要求1所述的用途,其中萎叶叶子提取物或含提取物的组合物隔天给药至少3周,优选1周。
10.根据权利要求1所述的用途,其中萎叶叶子提取物或组合物降低前鞭毛型多氏利什曼虫体外生存力57-79%,降低脾和肝寄生虫荷载量93-95%。
11.根据权利要求1所述的用途,其中所用萎叶叶子提取物有以下性质i)干燥的样品是深色的物质,溶于水和二甲基亚砜;ii)在正丁醇、醋酸、水的比例分别为9∶5∶7的溶剂系统中,活性物质的薄层色谱显示Rf分别为0.75、0.64、0.50、0.40和0.33的5个点;iii)用Intersil ODS-3(4.6×250mm)分析柱对活性物质进行HPLC分析,溶剂系统为4∶1比例的甲醇-水,流速为1.0ml/min.,在217nm检测,发现此物质分成11个峰,保留时间分别为2.69、4.27、5.95、6.97、7.49、9.39、11.20、12.40、15.53、18.90和21.49分钟。
12.治疗动物包括人类内脏利什曼病或黑热病的药物组合物,此组合物含有有效量的萎叶叶子提取物及药学可接受的添加剂。
13.根据权利要求12所述的组合物,其中选择的添加剂不影响萎叶叶子提取物的活性。
14.根据权利要求12所述的组合物,其中的添加剂选自含有蛋白质、碳水化合物、糖、滑石、硬脂酸镁、纤维素、碳酸钙、淀粉-明胶浆和/或药学可接受的载体的营养物组
15.根据权利要求12所述的组合物,其中组合物经口或肌肉内途径给药。
16.权利要求12所述的组合物,其中将萎叶叶子提取物制成经口给药的胶囊剂、糖浆剂、浓缩物、粉剂或颗粒剂。
17.根据权利要求12所述的组合物,其中萎叶叶子提取物与添加剂的比例在1-10∶10-1之间。
18.根据权利要求12所述的组合物,其中萎叶叶子提取物或组合物以10-20mg/kg体重的剂量水平给药。
19.根据权利要求12所述的组合物,其中萎叶叶子提取物或含提取物的组合物隔天给药至少3周,优选1周。
20.根据权利要求12所述的组合物,其中组合物降低前鞭毛型多氏利什曼虫体外生存力57-79%,降低脾和肝寄生虫荷载量93-95%。
21.根据权利要求12所述的组合物,其中所用的萎叶叶子提取物有以下性质i)干燥的样品是深色的物质,溶于水和二甲基亚砜;ii)在正丁醇、醋酸、水的比例分别为9∶5∶7的溶剂系统中,活性物质的薄层色谱显示Rf分别为0.75、0.64、0.50、0.40和0.33的5个点;iii)用Intersil ODS-3(4.6×250mm)分析柱对活性物质进行HPLC分析,溶剂系统为4∶1比例的甲醇-水,流速为1.0ml/min.,在217nm检测,发现此物质分成11个峰,保留时间分别为2.69、4.27、5.95、6.97、7.49、9.39、11.20、12.40、15.53、18.90和21.49分钟。
21.治疗动物包括人内脏利什曼病或黑热病的方法,包括将药学有效量的萎叶叶子提取物或含萎叶叶子提取物的组合物对动物给药。
22.根据权利要求22所述的方法,其中组合物含有效量的萎叶叶子提取物与药学可接受的添加剂。
23.根据权利要求22所述的方法,其中的添加剂选自营养物,例如蛋白质、碳水化合物、糖、滑石、硬脂酸镁、纤维素、碳酸钙、淀粉-明胶浆和/或药学可接受的载体、赋形剂、稀释剂或溶剂。
24.根据权利要求22所述的方法,其中萎叶叶子提取物或含萎叶叶子提取物的组合物经口或肌内途径给药。
25.根据权利要求22所述的方法,其中经口途径是以胶囊剂、糖浆剂、浓缩物、粉剂或颗粒剂形式进行的。
26.根据权利要求22所述的方法,其中萎叶叶子提取物与添加剂的比例在1-10∶10-1之间。
27.根据权利要求22所述的方法,其中通过粉碎萎叶叶子或提取粉碎的叶子得到萎叶叶子提取物,提取溶剂为水或有机溶剂如醇、四氯化碳、氯仿和丙酮。
28.根据权利要求22所述的方法,其中萎叶叶子提取物或含有萎叶叶子提取物的组合物以10-20mg/kg体重的剂量水平隔天给药一个月。
29.根据权利要求22所述的方法,其中萎叶叶子提取物或含有萎叶叶子提取物的组合物降低多氏利什曼虫前鞭毛型体外生存力57-79%,降低脾和肝寄生虫荷载量93-95%。
全文摘要
本发明涉及用有效量的萎叶叶子提取物或冻干的提取物与添加剂,或含萎叶叶子提取物及药学可接受的添加剂的组合物给药,以治疗内脏利什曼病或黑热病的方法。
文档编号C12N9/02GK1454096SQ00819919
公开日2003年11月5日 申请日期2000年12月4日 优先权日2000年12月4日
发明者S·班迪奥帕迪亚雅, B·佩尔, S·巴塔查里亚, M·雷, K·C·罗伊 申请人:科学与工业研究会
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