专利名称：杨树叶绿体定点转化方法以及用于该方法的dna序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的杨树转基因方法，即利用两段来源于杨树叶绿体DNA的序列作为同源重组片段，构建叶绿体定点转化载体，这类载体可将外源基因定点插入杨树叶绿体基因组的合适位置，并使之在杨树叶绿体基因组中高效表达。本发明还提供了用于本发明的方法的DNA序列。
在高等植物的细胞中，细胞核、叶绿体和线粒体三种细胞器各含有DNA分子，构成了既独立又相互联系的遗传体系。自70年代初基因工程技术诞生以来，向细胞核导入外源基因的转化技术已经普遍地应用于重要农作物遗传改良与分子生物学机理研究中。几十年来，外源基因向核基因组中导入一直是植物基因工程的主要研究和应用方向。然而，随着研究的深入发展，人们逐渐认识到核基因组中的基因工程操作有着如下难以克服的困难1.细胞核基因组庞大，背景复杂；2.导入的外源基因随机插入核基因组中；3.外源基因表达效率低，且表达不稳定；4.有时外源基因的插入会引起其它性状的变异，从而影响其经济价值；5.安全性不好，外源基因易随花粉扩散等。这些问题严重制约着外源基因转化技术的改进及其在实践中的应用。
为了克服以上这些缺点，1988年Boynton等人以莱茵衣藻(Chlamydomonas reinbardii)为材料，用基因枪将外源基因导入突变体的叶绿体DNA中，将突变体成功转化为能进行光合作用的正常莱茵衣藻，首次证实叶绿体转化的可行性(Boynton等，Science，1988，2401534-1538)。其后，Svab等人(Proc Natl Acad Sci USA，1990，878526-8530)将此技术应用于烟草中，获得了稳定的叶绿体转化体，由此建立起高等植物叶绿体转化新体系。外源基因向叶绿体基因组中转化，在一定程度上克服了核基因转化的不足，具有外源基因可定点插入、外源基因表达效率高、变异小、便于遗传操作、安全性好(母系遗传，外源基因不随花粉扩散)等优越性。
但要进行叶绿体遗传操作必须具备两个条件一是构建植物叶绿体定点转化载体；二是最好具有叶片再生的组培基础。而前者是至关重要的技术环节。要构建合适的叶绿体定点转化载体，首先须选好定位片段，即与叶绿体基因组的同源片段之间发生重组的片段，从而确定外源基因的插入位点。作为定位片段，一般要求具备下面两个条件足够的DNA长度，一般为1-2kb，以保证外源DNA的有效整合(Carrer等，Mol GenGene，1993，24149-56；Svab等，Proc Natl Acad Sci USA，1993，90913-917；Zoubenko等，Nucl Acid Res，1994，223819-3824；McBride等，BioTechnol，1995，13362-365)；合适的插入位点。外源基因的插入要求既不引起原有叶绿体基因组重要序列的丢失，又不至于干扰临近基因的正常功能。在烟草的叶绿体转化研究中的插入位点在大单拷贝区的rbcL/accD(Carrer等，Mol Gen Gene，1993，24149-56；Svab等，ProcNatl Acad Sci USA，1993，90913-917；Kota等，Proc Natl Acad Sci USA，1999，961840-1845)和位于反向重复序列区的16S trnV/rps12(Zoubenko等，Nucl Acid Res，1994，223819-3824)。如果插入位点在反向重复序列区，整合到其中一个重复序列区上的外源基因会通过所谓的拷贝矫正作用使另一个重复序列区也含有外源基因(Maliga，TIBTECH，1993，11101-107)。为了使外源基因整合进叶绿体基因组后能够高效表达，在构建转化载体时，一般选用叶绿体来源的强启动子和终止子。最常用的启动子是光系统II作用蛋白基因psbA的启动子和核糖体RNA基因rrn的启动子，而常用的终止子是psbA基因的终止子，从而保证外源基因在受体植物DNA中的正常表达。此外，转化载体还须包含适合的抗生素基因，以便对转化体进行有效筛选。
由于定位片段的确立是以了解叶绿体基因组序列为基础。目前仅有少数高等植物的叶绿体序列被全部或部分测定，因此高等植物的叶绿体转化只在烟草(McBride等，BioTechnol，1995，13362-365)、拟南芥(Sikdar等，Plant Cell Rep，1998，1820-24)、水稻(Khan等，Nat Biotechnol，1999，17910-915)和马铃薯(Sidorov等，Plant J，1999，19209-216)中开展。
杨树为杨柳科、杨柳属木本植物，是重要的速生林树种，由于其本身具有生长快速、易于繁殖的优点，因此不仅在木材工业生产上有重要用途，而且还广泛用于防护林的建造及生态环境保护。目前的杨树基因工程研究和应用均限于核基因组操作，还没有关于杨树叶绿体基因组序列及以叶绿体为对象进行遗传转化的报道。
本发明的目的是提供一种向杨树叶绿体中定点转化外源DNA的方法。
本发明的再一个目的是提供用于本发明的方法的DNA序列。
本发明提供了一种向杨树叶绿体中定点转化外源DNA的方法，包括(1)使用SEQ ID NO1所示的序列或其不小于1kb的片段、SEQ ID NO2所示的序列或其不小于1kb的片段和外源基因构建DNA重组片段，外源基因位于SEQ ID NO1或其片段和SEQ ID NO2或其片段的中间；(2)将得到的DNA片段插入一种克隆载体中；(3)使用得到的克隆载体转化杨树细胞；(4)将转化后的杨树细胞培育成植株。
在本发明的上述方法中，所述的SEQ ID NO1的不小于1kb的片段最好位于其3′端，即包括最3′端的核苷酸序列；SEQ ID NO2的不小于1kb的片段最好位于其5′端，即包括最5′端的核苷酸序列。
本发明所述的外源基因(也称作目的DNA片段)可以是完整的一个或多个基因，也可以是基因的片段或任何DNA序列片段。
本发明所述的定点插入位置是由转化载体上的定位片段的序列所决定的。为了保证转化过程不引起原有叶绿体基因组重要序列的丢失或干扰临近基因的正常功能，整合位点应是在叶绿体基因组的非功能区或功能不重要区内。所谓基因组的非功能区是指植物基因组中不具编码蛋白质、调控基因复制、转录、翻译等一切生化反应功能的核苷酸序列，如基因之间的间隔区、假基因序列区、转录间隔区等。而功能不重要区是指植物基因组中的核苷酸序列，它所表达的产物在植物的正常生长发育和生理代谢中不起重要的作用，缺失后不影响植物的正常发育与代谢活动。
本发明中所谓的适合的整合位点是杨树叶绿体基因组中的rps7基因和ndhB基因之间的间隔区，即SEQ ID NO1(
图1)的3’端到SEQ ID NO2(图2)的5’端区域。第一片段有1766个核苷酸，包含3’rps12基因、rps7基因及其边界序列(图1)；第二个片段共有1601个核苷酸，包含部分ndhB基因及基因间隔区(图2)。以此为定位片段构建的杨树叶绿体定点转化载体，可将外源DNA插入到rps7基因和ndhB基因之间的间隔区，即杨树叶绿体基因组中第一片段的3’端至第二片段的5’端之间。这两个片段的获得可利用已测序的烟草叶绿体DNA序列设计引物，用PCR的方法从杨树叶绿体基因组中分离相应的DNA片段。
本发明所述的克隆载体可以是现有技术中已知的任何一种克隆载体，例如SK质粒，pUC18，pUC19，pUC118，pUC119等。用于叶绿体定点转化的外源基因是指任意的目的基因，包括用于叶绿体转化的机理研究、对杨树进行遗传改良，乃至以杨树作为生物反应器生产工业用酶或药用蛋白等的基因。
用于本发明的本发明中杨树叶绿体定点转化载体可以是以绿色荧光蛋白(GFP)基因为外源基因，与抗生素筛选基因原核表达框一起构建为杨树叶绿体的定点转化载体。插入位点为rps7基因和ndhB基因之间的间隔区。构建图如图3所示。该载体应用的主要目的是建立杨树高效的叶绿体表达体系，包括转化方法、获得同质化转化体的步骤。
本发明提供的定点转化载体也可以是以杀虫蛋白基因Bt cryIA(a)(专利申请号99119236.2)为外源基因而构建的杨树叶绿体定点转化载体。插入位点为rps7基因和ndhB基因之间的间隔区。该载体的构建图如图4所示。在已建立的杨树高效叶绿体表达体系的基础上，应用该载体可获得抗虫转基因杨树植株。
在载体构建方面，除前述的适合的定位片段、目的基因外，须具备抗生素筛选标记基因，以便于转化个体的筛选。本发明所使用的抗生素标记基因为壮观霉素基因。此外，目的基因和抗生素标记基因均须在原核启动子和终止子驱动的原核表达框内才能在叶绿体中高效表达。因此，本发明所使用的启动子为来自烟草的核糖体RNA基因rrn的启动子；终止子为烟草psbA基因的终止子。另外，目的基因编码序列最好使用原核表达所喜好的翻译密码子。在载体的导入方面，常用的基因枪法、微束激光穿刺法、原生质体融合法均适合于本发明所述的杨树叶绿体转化。在叶绿体转化个体的筛选方面，本发明使用了壮观霉素筛选标记基因，只要在培养基中加入适当浓度的壮观霉素便可得到转化个体。本发明所谓适当的抗生素浓度是指在转化筛选初期用2.5mg/L，然后逐渐提高为5mg/L、7.5mg/L、10mg/L。在10mg/L条件下获得转化个体之后，继续在该浓度下培养直至转化苗具4-6片叶片。再逐步降低壮观霉素浓度至2.5mg/L以获得健康(具健康的根系和绿色健壮的叶片)的转化个体。所获得的T0代转化个体通过常规的分子生物学手段检测没达到纯合，即转化个体中不是所有的叶绿体基因组均具外源基因。本发明中获得同质化转化个体的方式为取T0代转化个体的叶片进行再生培养，使用的培养基仍为抗生素筛选培养基，壮观霉素浓度同T0代转化株的筛选。可获得再生苗，即T1代转化苗。这样筛选四代后，便可得到同质化的转化个体，即转化个体中所有的叶绿体基因组均具外源目的基因。
本发明还提供了一种用于向杨树叶绿体中定点转化外源DNA的DNA序列，它具有SEQ ID NO1所示的序列或其不小于1kb的片断。
本发明还提供了与上述序列配合使用的用于向杨树叶绿体中定点转化外源DNA的DNA序列，它具有SEQ ID NO2所示的序列或其不小于1kb的片断。
本发明提供了一种全新的杨树转化方法，即杨树叶绿体定点转化方法。与目前使用的杨树核基因转化方法相比，它具有如下的优点外源基因表达效率高，可比核基因转化的表达效率提高至少10倍，甚至高出40-50倍；外源基因可定点整合，减小了转化个体及其后代的变异与畸形化几率；安全性好，外源基因不随花粉随意扩散等。因此，本发明为杨树的基因工程遗传改良提供了全新的机遇。对其它树种的改良，也具有普遍的参考意义。
4.叶绿体转化体的获得在筛选培养基上的叶片组织块经过约一个月的培养，有的组织块发黄、萎蔫；有的组织块从叶缘分化出绿色的芽点。再经过约一个月的培养，绿色的分化芽逐渐长大。这样的绿苗可用于检测，首先用紫外灯照射所得到的绿苗，能发出绿色荧光的为转基因个体，在检测的25株苗中有17株发出了明显的荧光。提取这17株发荧光苗的叶绿体DNA进行PCR检测，证实确为转基因植株。为了证明GFP基因表达的部位，我们应用激光共聚焦扫描显微镜，对转基因植株中GFP的表达部位进行亚细胞定位，证明发荧光的主要部位位于叶绿体细胞器中。同时用荧光光度计对转基因植株中GFP基因的表达蛋白进行定量测定。对经上述检测的阳性植株的叶绿体DNA进行适当的酶切、转膜，然后进行Southern杂交，证明外源基因已经整合进杨树的叶绿体DNA，但均未同质化，即为杂合子。
5.同质化转化体的获得取用分子生物学方法证实的转基因植株的叶片进行再分化，在含壮观霉素的筛选培养上筛选培养约3个月，获得再生的绿苗，用上述分子生物学的方法进行各方面的检测，证明仍未达到同质化。接着再取第二次筛选获得的转基因植株(T1代)的叶片进行叶片再生，在筛选培养基上筛选约3个月，获得再生的绿苗。共筛选了四代，并用上述分子生物学的方法对转基因植株中的GFP蛋白进行了定性、定位、定量的测定，证明所获得的T4代转化体已同质化。
6.杨树叶绿体转化体系的建立*转化方法的建立叶绿体定点转化载体的导入通常用基因枪的方法，这里我们建立了适合于杨树叶绿体基因枪转化的方法，包括高质量质粒DNA的提取、适合的质粒浓度与微粒子弹的制备、受体材料取材的部位与时期、材料高渗处理的时间与浓度、微粒子弹轰击时的各技术参数等。
*筛选转化植株方法的建立从杨树叶片分化获得再生苗的组培技术已成熟，我们在此基础上对其进行了进一步的优化，在较短的时间内可获得大量健康的分化再生苗。此外，我们对转基因杨树的筛选培养，尤其是壮观霉素的浓度梯度进行了大量的比较研究，建立了有效筛选转化体的方法。
*获得同质化个体方法的建立建立了在较短的时间内从T0代转化个体获得同质化个体的技术方法，包括组织培养方法和分子生物学的检测手段。
*外源基因在叶绿体转化体系中的表达效率的确立首次将GFP基因在不同同质化程度的转基因个体中的表达位置、表达量进行了定性、定量的测定与比较，揭示了同质化程度与基因表达量之间的关系，确立了杨树叶绿体转化体系中外源基因的表达效率。
*叶绿体转化与核基因转化的比较我们在进行叶绿体定点转化的同时，也构建了一套核基因转化的载体，即其他元件均一样，只去掉了两个定位片段。将这两套载体用同样的材料、同样的转化方法与条件进行转化，筛选获得各自的转化个体，再从分子生物学各方面进行比较，发现用这两种载体获得的转化个体中，GFP基因在拷贝数、整合位点、GFP蛋白在表达位置、表达量方面均有区别，尤其是在表达量上，叶绿体转化体的表达量是核基因转化体的10到15倍。揭示外源基因在杨树核基因组及叶绿体基因组中表达效率和规律。
5.叶绿体转化体的抗虫实验利用不同同质化程度的转基因杨树个体(T0，T1，T2，T3，T4，)的叶片饲喂小菜蛾幼虫，四天后统计幼虫死亡率，并计算出校正死亡率。[校正死亡率＝(处理的平均死亡率-对照的平均死亡率)/对照的平均存活率×100％]。每个处理重复三次。在转基因杨树叶片上饲喂的幼虫除了死亡外，存活的幼虫生长很慢、个体较小、体重减轻(见表1)。
表1叶绿体转化杨树的抗虫性分析
此实验结果表明，杨树叶绿体转化植株具有杀虫和抑制幼虫生长的特性。且同质化程度越高，抗虫性越强。
权利要求
1.一种向杨树叶绿体中定点转化外源DNA的方法，包括(1)使用SEQ ID NO1所示的序列或其不小于1kb的片段、SEQ IDNO2所示的序列或其不小于1kb的片段和一种外源基因构建重组DNA片段，外源基因位于SEQ ID NO1或其片段和SEQ ID NO2或其片段的中间；(2)将得到的重组DNA片段插入一种克隆载体中获得杨树叶绿体基因组定点重组转化载体；(3)使用得到的转化载体转化杨树细胞；(4)将转化后的杨树细胞培育成植株。
2.按照权利要求1所述的方法，其中，所述的SEQ ID NO1的不小于1kb的片段包括其3′端序列。
3.按照权利要求1或2所述的方法，其中，所述的SEQ ID NO2的不小于1kb的片段包括其5′端序列。
4.按照权利要求1所述的方法，其中，所述的外源基因是编码杀虫蛋白的基因。
5.一种用于向杨树叶绿体中定点转化外源DNA的DNA序列，它具有SEQ ID NO1所示的序列或其不小于1kb的片段。
6.一种用于向杨树叶绿体中定点转化外源DNA的DNA序列，它具有SEQ ID NO2所示的序列或其不小于1kb的片段。
全文摘要
本发明提供了一种向杨树叶绿体中定点转化外源DNA的方法,包括:使用SEQ ID NO:1所示的序列或其不小于1kb的片段、SEQ ID NO:2所示的序列或其不小于1kb的片段和一种外源基因构建的DNA重组片段,外源基因位于SEQ IDNO:1或其片段和SEQ ID NO:2或其片段的中间;将得到的DNA重组片段插入一种克隆载体中,获得杨树叶绿体基因组定点重组转化载体;使用得到的载体转化杨树细胞;将转化后的杨树细胞培育成植株。本发明还提供了用于该方法的DNA序列。
文档编号C12N15/11GK1380417SQ01110539
公开日2002年11月20日 申请日期2001年4月10日 优先权日2001年4月10日
发明者周奕华, 张丽华, 陈正华, 石东乔, 侯丙凯, 胡赞民 申请人:中国科学院遗传研究所