专利名称：自絮凝细胞颗粒清液连续发酵淀粉质原料生产酒精的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，特别涉及到一种自絮凝细胞颗粒清液连续发酵淀粉质原料生产酒精的工艺技术。
迄今为止，国内外淀粉质原料酒精发酵均采用带渣发酵的生产工艺，主要以玉米为原料，并根据原料玉米前处理方法的不同分为干法和湿法二条技术路线。在湿法工艺中，原料玉米浸泡后经胚乳分离、蛋白分离和纤维分离等工艺步骤得到粗淀粉乳作为后续酒精发酵的原料；而在干法工艺中，原料玉米直接脱胚或脱胚脱皮粉碎后得到玉米粉作为后续酒精发酵的原料。其共同点为粉浆经双酶法液化和糖化后得到的醪液不经过滤或澄清处理直接送入发酵工段，酵母细胞将可发酵性糖发酵生成酒精和二氧化碳后得到的发酵醪中含有原料残渣和大量酵母细胞。
发酵醪蒸馏过程中从粗馏塔塔釜排出大量废糟液。由于原料残渣及酵母细胞在酒精蒸馏过程中受热分解产生很多副产物，当废糟液直接循环使用时，尽管这些副产物在系统中达到平衡浓度，但实验研究和生产实践均表明，如果废糟液直接循环使用的比例高于50％，这些副产物在系统中的平衡浓度会明显抑制酵母细胞的生长和酒精发酵过程。因此，现有淀粉质原料带渣发酵工艺中50％以上的废糟液不得不采用全蒸发浓缩即DDGS(Dry Distilled Grain Soluble)技术处理，蒸发装置投资大，运行过程能耗高。
本发明的目的在于提出一种采用自絮凝细胞颗粒的淀粉质原料清液酒精发酵的工艺技术路线，即粉浆液化糖化后得到的醪液在酒精发酵之前进行固液分离，去除原料残渣得到澄清糖化液，在此基础上使用自絮凝细胞颗粒连续发酵使之生成酒精和二氧化碳。由于细胞自絮凝形成毫米级大小的颗粒，因而在生物反应器中可以实现完全固定化，不仅生物反应器单位体积的细胞密度显著提高，酒精发酵的平均发酵时间相应缩短，而且送至蒸馏工段的发酵液不再含有原料残渣和细胞，蒸馏后得到的废液中有害副产物减少，可以全部直接循环使用。
实现本发明的工艺步骤如下1、粉浆配制淀粉乳或玉米粉按照工艺要求的料水比(视淀粉乳的实际浓度和玉米粉的淀粉含量而定)配制成粉浆，使粉浆的淀粉总糖浓度达到20-22％(w/v)，调节pH值为6.0-6.2，并按每克淀粉15-20活力单位加入淀粉酶，预热至55-60℃。
2、粉浆液化采用蒸汽直接喷射液化技术使粉浆快速加热到108-110℃后进入维持器，维持8-10分钟后常压闪蒸冷却到97-98℃后进入液化柱，继续液化90分钟。
3、糖化液化醪冷却到60-62℃后，使用硫酸调节pH值为4.0-4.5，并按每克淀粉150-200活力单位加入糖化酶，糖化时间为10-15h，使DE值达到90以上，满足后续自絮凝细胞颗粒酒精发酵工艺对糖化工艺的特殊要求。
4、固液分离采用过滤或沉降的方式分离糖化醪中的原料残渣，得到澄清糖化液。
5、种子培养与连续发酵使用自絮凝细胞颗粒，种子培养级数和生物反应器规模可根据装置的生产规模确定，应保证逐级接种的接种量为5-10％。种子扩大培养用培养基为糖浓度稀释到10-12Bx、添加5g/L NH4HCO3和1.5g/LKH2PO4、pH值调节到5.0-5.5的糖化液，培养方式为间歇培养和连续流加培养结合，即接种后先间歇培养至残糖浓度降低到1.0％(w/v)，然后开始流加糖化液进行连续培养。种子培养的工艺条件如下1)培养温度30-32℃；2)pH值3.8-4.2；3)以0.1vvm的速率通风供氧；4)通过调节培养基流加速率控制残糖浓度为0.8-1.0％(w/v)；5)生物反应器中单位体积细胞密度以细胞干重计达到40-50g/L。
生物反应器中种子培养达到规定的密度后，将种子培养用培养基切换成糖浓度20-22％(w/v)的高糖浓度发酵培养基，添加无机盐的浓度从初期的1.5g/LNH4HCO3和0.5g/L KH2PO4逐步递减到0.5g/L NH4HCO3和0.15g/L KH2PO4，可以维持发酵液中无机N和P的浓度分别为0.2-0.3g/L和50-60mg/L，满足自絮凝细胞颗粒正常酒精发酵的要求。采用多级生物反应器串联的工艺方案可以提高发酵终点发酵液中酒精浓度，生物反应器串联级数视生物反应器容积规模而定。酒精发酵的工艺操作条件如下1)发酵温度34-36℃；2)pH值为3.8-4.2；3)CO2的通气速率为0.05vvm；4)糖液流加速率为0.04-0.05h-1，相当于平均发酵时间20-25h。
按照上述工艺条件，发酵终点酒精浓度可以达到11-14％(v)，其他各项工艺技术指标达到现有酒精发酵工艺的最佳水平。
6、发酵液蒸馏粗馏塔采用再沸器间接加热的工艺技术方案以减少塔釜排出废液总量，保证后续废液直接循环使用时总体工艺水平衡。发酵液蒸馏后得到的废液送固液分离工段洗涤滤渣，再次过滤后所得低浓度糖液送粉浆配制工段配制粉浆。
本发明的效果和益处在于细胞以自絮凝颗粒的方式在生物反应器中实现完全固定化，不仅生物反应器单位体积细胞密度显著提高，酒精发酵的平均发酵时间缩短到现有工艺的1/3-1/2，而且自絮凝细胞颗粒要求清糖液发酵，这些技术特征使得发酵液蒸馏后得到的废液不再含有原料残渣和细胞，全部可以直接循环使用，节省了现有酒精发酵工艺废糟液蒸发浓缩的能耗及新建装置中蒸发浓缩设备的建设投资。
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附图是自絮凝细胞颗粒连续培养和酒精发酵生物反应器的结构示意图。
主体结构包括1封头；2沉降区环形挡板；3沉降区外筒体；4沉降区稳流导筒；5缓冲区过渡节；6主发酵区筒体；7颗粒悬浮导流筒；8底部封头。
主要工艺接管包括a培养基入口；b多余自絮凝细胞颗粒排放口；c驱动气进口，种子扩大培养时使用空气，酒精发酵时使用CO2；d发酵液出口；e接种口；f种子扩大培养时作为尾气出口，酒精发酵时作为CO2出口。
以下结合附图详细叙述本发明的最佳实施例。
本发明最佳实施例中所用菌种为一株具有自絮凝特性且酒精发酵性能优良的酵母，已送指定微生物菌种保藏机构保藏。
本发明最佳实施例中自絮凝细胞颗粒连续扩大培养和酒精发酵的生物反应器如附图所示，公称容积为0.5M3。封头(1)Dg800标准椭圆封头；沉降区环形挡板(2)Dg700筒体，高度1200mm；沉降区外筒体(3)Dg800，高度1200mm；沉降区稳流导筒Dg550，高度500mm，其上端与发酵液出口接管(d)中心线距离300mm；缓冲区过渡节(5)的锥角为60°；主发酵区筒体(6)Dg400，高度3200mm；颗粒悬浮导流筒(7)Dg150，高度3945mm，其底端与主发酵区筒体(6)的底端平齐；底部封头(8)Dg400标准椭圆封头。除颗粒悬浮导流筒(7)采用厚度2mm的不锈钢板卷制外，其余部分均采用厚度4mm的碳钢板制造。培养基入口(a)为Dg10法兰连接接管；多余自絮凝细胞颗粒排放口(b)为Dg25法兰连接接管；驱动气进口(c)为内径φ4nn的喷嘴；发酵液出口(d)为Dg50法兰连接接管，其中心线距离沉降区外筒体(3)底端500mm；接种口(e)为发酵行业通用快接头；种子扩大培养时作为尾气出口及酒精发酵时作为CO2出口的接管(f)为Dg50法兰连接接管。
上述生物反应器的其他尺寸，包括冷却方式等均采用发酵行业常规设计。
以干法脱胚脱皮、粉碎细度60目、淀粉含量78-80％的玉米粉为原料，淀粉酶和糖化酶均为中国无锡星达生物工程有限公司生产的工业用酶制剂，活力分别为20000u/g和100000u/g。
四台上述生物反应器并串联混合使用，自絮凝酵母细胞颗粒种子培养阶段并联操作，酒精发酵阶段串联操作，依靠高位差使发酵液在生物反应器之间流动。
培养基组成如下1#培养基组成为(g/L)葡萄糖10，酵母浸膏5，蛋白胨3，用于三角瓶中游离细胞到自絮凝颗粒的培养；2#培养基组成为(g/L)葡萄糖30，酵母浸膏5，蛋白胨3，用于三角瓶中自絮凝颗粒的扩大培养；3#培养基组成为糖度10-12Bx的糖化液，分别添加5g/L的NH4HCO3和1.5g/L的KH2PO4，用于发酵罐中自絮凝细胞颗粒的扩大培养；4#培养基组成为糖度20-22Bx的糖化液，用于酒精发酵，由于废液循环过程中残余N和P等营养物质的积累，发酵培养基中添加NH4HCO3和KH2PO4的浓度分别由初始的1.5g/L和0.50g/L逐渐降低到0.45g/L和0.15g/L，可以满足自絮凝细胞颗粒正常酒精发酵过程的营养需求。
上述培养基、生物反应器和工艺管道使用前均需热灭菌，按照发酵行业的常规操作进行。
液化糖化在二台带有夹套、容积5M3的标准机械搅拌式糖化罐中进行，操作步骤如下按照料水比1∶2.5配制粉浆，用NaOH溶液调节pH值为6.0-6.2，并按15u/g玉米粉加入淀粉酶，粉浆预热到55-60℃后，使用直接蒸气快速加热到108-110℃并维持10min，卸压闪蒸使液化醪温度降低到97-98℃，维持90min，完成粉浆液化操作。将液化醪冷却到60-62℃后，使用H2SO4调节pH值为4.0-4.5，按照150u/g玉米粉加入糖化酶，糖化时间10h。糖化后的醪液使用板式过滤机过滤得到澄清糖化液供后续自絮凝细胞颗粒培养和酒精发酵使用，所得滤渣经蒸馏废液洗涤回收残留糖份后作为副产物排出系统。
将斜面试管保藏的菌种接种到装有100mL 1#培养基的250mL三角瓶中，在150rpm和30℃条件下培养24h，酵母细胞可以完全自絮凝形成颗粒，摇瓶停止旋转后，自絮凝酵母细胞颗粒迅速沉降，培养液变得澄清，弃去上清液并更换2#培养基进行分瓶扩大培养，间隔24h再次弃去上清液分瓶扩大培养，直至达到生物反应器接种要求的种子量。
将摇瓶培养的种子接种到装有3#培养基的一台生物反应器中，按照如前所述工艺条件进行通风培养。当生物反应器中残糖浓度降低到1％(w/v)时，开始流加培养，培养基流加速度根据残糖浓度调节，保持残糖浓度不低于1％(w/v)，流加培养3d后各发酵罐中自絮凝细胞颗粒的密度以细胞干重计可以达到20-30g/L时，将培养的自絮凝酵母细胞颗粒种子等分到四台生物反应器中，四台生物反应器并联操作，重复上述培养过程种子至各生物反应器中自絮凝酵母细胞颗粒以细胞干重计细胞密度达到40-50g/L，种子培养结束。
切换4#培养基，同时将通风切换成CO2，并将各生物反应器由并联操作调整为依次串联操作。基于发酵罐总有效容积的稀释速率为0.05h-1，相当于平均发酵时间20h。装置运行过程中间隔24h检测各生物反应器中自絮凝酵母细胞颗粒的浓度、发酵液中总N和总P。当自絮凝酵母细胞颗粒的密度超过50g/L时，可以从生物反应器下部排放口排出多余酵母，保持生物反应器中自絮凝酵母细胞颗粒浓度在工艺规定的范围内，同时使发酵液中总无机N和P保持在0.2-0.3g/L和50-60mg/L范围内。
末级生物反应器流出的发酵液进行蒸馏处理，得到蒸馏废液用来洗涤糖化醪过滤所得滤渣，再次过滤得到稀糖液用于配制粉浆。
上述四级串联生物反应器系统可以稳定运行，达到工艺步骤(5)规定的各项技术指标，整个过程无废液向系统外排放。
权利要求
1.一种自絮凝细胞颗粒清液连续发酵淀粉质原料生产酒精的工艺方法，其特征在于a)淀粉质原料，制备满足自絮凝细胞颗粒酒精发酵工艺特殊要求糖化液的技术，控制糖化时间为10-15h,DE值达到90，糖化后固液分离去除糖化醪中原料残渣；b)淀粉质原料，使用自絮凝细胞颗粒清液发酵生产酒精的技术，生物反应器中的细胞密度以单位体积干重计达到40-50g/L以上，生物反应器多级串联操作，在连续发酵的平均发酵时间20-25h条件下，发酵终点酒精浓度达到11-14％(v)；c)与淀粉质原料自絮凝细胞颗粒清液酒精连续发酵工艺相匹配的蒸馏废液全循环使用的技术。
全文摘要
本发明属于生物工程技术领域,特别涉及到一种自絮凝细胞颗粒清液连续发酵淀粉质原料生产酒精的工艺方法。自絮凝细胞颗粒在生物反应器中实现固定化,生物反应器中的细胞密度以单位体积细胞干重计可以高达40－50g/L以上。生物反应器多级串联,在平均发酵时间为20－25h的条件下,发酵终点酒精浓度达到11－14%(V)。在此基础上,提出了制备满足自絮凝细胞颗粒酒精发酵工艺要求糖化液及酒精蒸馏废液直接循环使用的技术。节省了废糟液蒸发浓缩的能耗。
文档编号C12P7/06GK1323903SQ01114010
公开日2001年11月28日 申请日期2001年5月28日 优先权日2001年5月28日
发明者白凤武, 云战友, 刘传斌, 谢健, 李宁 申请人:大连理工大学