专利名称：一种新的基因芯片高通量快速检测技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的基因芯片高通量快速检测技术以及它们的应用。
一.基因芯片的发展现状美国继开展人类基因组计划以后，于1998年正式启动基因芯片计划，美国国立卫生部、能源部、商业部、司法部、国防部、中央情报局等均参与了此项目。同时斯坦福大学、麻省理工学院及部分国立实验室如Argonne Oakridge也参与了该项目的研究和开发。英国剑桥大学、欧亚公司正在从事该领域的研究。世界大型制药公司尤其对基因芯片技术用于基因多态性、疾病相关性、基因药物开发和合成或天然药物筛选等领域感兴趣，都已建立了或正在建立自己的芯片设备和技术。
在国内，虽然起步略晚一些，但清华大学、复旦大学、北京军事科学院、南京东南大学等科研机构都在做芯片的研发工作。这些单位所进行的工作主要是将基因芯片用作基因功能的研究，也即是把芯片当作“基因表达谱芯片”，它所做的工作是从几百条、几万条、十几万条基因中筛选出具有某种功能的基因。但是基因芯片筛选作用的不完整性，决定了它目前只能供科研使用，尚不能进入临床使用。目前国内也有的公司在开发临床诊断用的基因芯片，但由于都采用以下实验路径，烦琐而且灵敏度不高，重复性不好，低密度的基因芯片尚可应用，高密度的基因芯片则从PCR反应到杂交都难以控制，导致临床诊断用的基因芯片难以进入临床实用。
目前所有的DNA芯片技术都包括四个基本要点DNA阵列(微排序)的构建、样品(DNA或RNA)的扩增和标记、杂交和杂交结果的检测及读出。
DNA阵列(微排序)的构建目前制备芯片主要采用表面化学的方法或组合化学的方法来处理固相载体(玻璃片或硅片)，然后使DNA片段按顺序排列在固相载体上。因固相载体种类较多，制备方法也不尽相同，但基本上可分为两大类一类是原位合成(in situ Synthesis)；一类是合成后交联(post-synthesis attachment)。原位合成适用于寡核苷酸；合成后交联多用大片段DNA，有时也用于寡核苷酸，甚至mRNA。
样品DNA或RNA的扩增和标记生物样品往往是非常复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接被芯片检测，必须将样品进行处理。从血液、活组织或其它标本中获取的DNA/mRNA样品，必须扩增以提高阅读灵敏度，同时标记上荧光素、同位素、生物素等检测信标，但这一过程操作起来却有一定的难度。比如在一个癌细胞中有成千上万个正常基因的干扰，杂合癌基因的检测和对它的高效、特异地扩增就不是一件容易的事。因为在一般溶液中聚合酶链反应(PCR)扩增时，存在其它不同的DNA片段与靶片段竞争引物的情况。另一种情况是基因芯片通常要检测很多的目标DNA，而在PCR扩增时，如果反应体系中同时存在很多对引物，则引物和模板DNA之间互相干扰和竞争，反应产物往往不是目标DNA，若进一步进行芯片检测，则可能出现假阳性结果。
杂交杂交是DNA芯片技术中除DNA微排序和样品扩增外最重要的一步，其复杂的程度和具体条件的控制由芯片上的DNA片段的长短和芯片本身的用途而定。如果是表达检测，杂交时需要高盐浓度、低温和长历时(往往要求过夜)，但严谨性要求则比较低。如果要检测是否有突变，因涉及单个碱基的错配，故需要在短时间内(几小时)、低盐、高温条件下高严谨性杂交。
杂交结果的检测和读出目前对目标DNA大多采用荧光标记法，并根据各杂交点的荧光信号强弱用扫描共焦显微镜或激光共聚焦扫描读出结果。它的优点是重复性好，缺点是灵敏度相对较低。为此，人们正在研究多种替代方法，如质谱法、化学发光和光导纤维、二极管方阵检测、乳胶凝集反应、直接电荷变化检测等等。其中最有前途的当推质谱法，但由于在探针的化学合成上还存在一些问题，质谱法还不如荧光标记法用得普遍。
在实际的实验中，由于基因芯片都采用的是上述的四个步骤，导致了基因芯片迟迟不能进入大规模实际应用。
为了解决PCR反应中的多对引物和模板的相互干扰，美国Mosaic Technology公司发展了一种固相PCR系统。此系统包含两套引物，每套都可以从靶基因两头延伸。当引物和DNA样品及PCR试剂相混时，如果样品包含靶序列，DNA就从引物两头开始合成，并在引物之间形成双链DNA环或“桥”。由于上述反应在固相中产生，因而避免了引物竞争现象，并可减少残留物污染和重复引发。这种固相PCR系统的专利，保护的是同时、相邻地固定在光导纤维末端上的一对引物，并用这对引物扩增目标DNA，最终检测的是经过扩增而在这一对引物之间形成的桥连DNA。在该技术中，如果只是单条引物扩增，未形成桥连DNA，则检测不出信号，见(美国专利US5641658，http//www.mosaic.com)。
二.本发明的具体说明本发明的基因芯片高通量快速检测技术，是通过固相引物(或称为探针)延伸检测技术而实现的，该技术是将作为引物(或称为探针)的寡核苷酸的5’端连接在固相(即基因芯片的固相载体)上，引物与相应的DNA单链模板(即目标DNA)或RNA(即目标RNA)退火后，使用依赖于模板的DNA聚合酶，在含有信标分子的相应的反应体系中进行5’→3’DNA聚合，沿引物的3’端延伸出与目标DNA单链互补的产物DNA单链，这种产物DNA单链在延伸的同时被标记上信标分子，延伸结束后，洗涤去除DNA聚合反应的各种游离成分。标记上信标分子的产物DNA单链被牢固连接在固相上。检测固相上的信标信号。若有信号，则表示被检测样品中有目标DNA或目标RNA；若无信号，则表示被检测样品中没有目标DNA或目标RNA。本发明的固相引物延伸检测技术的特异性，由引物的长度和引物与目标DNA在反应中严格控制的退火温度和盐浓度决定；本发明的灵敏度，即掺入信标的信号强度，则可由聚合产物DNA单链的尽量长的延伸使更多的信标分子被掺入而被放大，这是本发明的第一种信标标记方法。
本发明的第二种信标标记方法包括两个步骤，第一个步骤是采用与上述第一种信标标记方法相同的步骤，但DNA聚合反应体系中不含信标分子，延伸反应结束后，得到未被信标标记的聚合产物DNA单链；第二个步骤是在含信标分子的DNA聚合反应体系中，通过与此聚合产物DNA单链下游核苷酸序列互补的、未连接在固相上的引物进行第二次DNA聚合反应，生成与原聚合产物DNA单链互补的新的被标记上信标的DNA单链，只要不对这前后两条聚合产物单链所形成的DNA互补双链解链，就可通过检测这些被标记上的信标信号而确定目标基因。
本发明的第三种信标标记方法是，将所述的第一种和第二种信标标记方法结合起来，使第一种标记方法所述的固相引物延伸的聚合产物DNA单链被标记上信标，然后再用所述的第二种信标标记方法的第二个步骤产生一条与之互补的被标记上信标的单链，检测这两条单链互补配对所形成的DNA双链的信标信号就可确定目标基因。
本发明的固相引物延伸中所使用的依赖于模板的DNA聚合酶，包括，但不限于，大肠杆菌DNA聚合酶I(全酶)、大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段、T4噬菌体DNA聚合酶、测序酶(T7噬菌体DNA聚合酶)、Taq酶、反转录酶。
本发明的基因芯片所采用的固相载体选自任何可用于制备基因芯片的材料，其包括，但不限于，玻璃片、硅片和塑料片。所述的固相载体经不同的化学修饰后，在其表面带有可以固定核酸分子的活性基团。这些基团包括，但不限于，氨基(-NH2)、醛基(-CHO)、羧基(-COOH)和巯基(-SH)。
本发明的基因芯片是在所述的固相载体上连接有针对特定的目标基因或目标DNA或目标RNA的特异性核酸引物(或称为探针)，所述的引物为单链DNA分子，其核苷酸序列选自目标基因或DNA双链中的任一条链或选自目标RNA的互补序列，而且在适当的条件下可以与该目标基因或DNA解链后的单链之一或与目标RNA特异杂交。所述的引物可以通过DNA自动合成或PCR扩增而获得，其长度至少为15个核苷酸，优选至少为20个核苷酸，更优选至少为30个核苷酸，还更优选至少为40个核苷酸，还更优选至少为50个核苷酸，最优选至少为60个核苷酸，还最优选至少为70个核苷酸。所述的引物(或称为探针)，其5’端可以直接连接在固相载体上，或在其5’端可以选择性地添加一个目的在于增加该引物的空间活动性以利于杂交的连接臂，引物通过连接臂而连接在固相载体上。所述的连接臂包括，但不限于，多聚胸腺嘧啶核苷poly(dT)n(n≥5)、多聚尿嘧啶核苷poly(dU)n(n≥5)、多聚腺嘌呤核苷poly(dA)n(n≥5)或聚乙二醇等长链状的分子。
在本发明的基因芯片中，所述的核酸引物的5’端或与引物的5’端相连的连接臂的5’端被修饰(连接)有活性基团。这些活性基团包括，但不限于，羧基(-COOH)、氨基(-NH2)、巯基(-SH)、苯硼酸(phenylboronic acid)、乙烯基(CH3C＝CH2)等。如引物的5’端或与引物的5’端相连的连接臂的5’端被羧基修饰，则羧基与固相载体表面的氨基反应，形成酰氨键而将该引物以共价键连接到固相载体上。如引物的5’端或与引物的5’端相连的连接臂的5’端被氨基修饰，则氨基与固相载体表面的醛基或羧基反应，形成酰氨键而将该引物以共价键连接到固相载体上。如引物的5’端或与引物的5’端相连的连接臂的5’端被巯基修饰，则巯基与固相载体表面的巯基反应形成二硫键而将该引物以共价键连接到固相载体上。如引物的5’端或与引物的5’端相连的连接臂的5’端被苯硼酸基修饰，则苯硼酸与固相载体表面的水杨基氧肟酸(salicylhydroxamic acid)反应形成共价键而将该引物连接到固相载体上。如引物的5’端或与引物的5’端相连的连接臂的5’端被乙烯基修饰，则乙烯基与固相载体表面的巯基反应形成硫醚键而将该引物以共价键连接到固相载体上。如引物的5’端或与引物的5’端相连的连接臂的5’端被生物素(biotin)修饰，则生物素与固相载体表面的链霉亲和素(streptavidin)或亲和素(avidin)结合，形成非共价键而将引物固定在固相载体上。
本发明的基因芯片的制备，是利用微排序法按照设计将所述的核酸引物(或称为探针)有序地点样到固相载体上，通过核酸引物的5’端或与引物的5’端相连的连接臂的5’端修饰的活性基团与载体表面相应的活性基团反应，形成共价或非共价连接，将核酸引物固定于载体上，从而制成基因芯片。同时，在所制备的基因芯片上，每一种核酸引物(或探针)都有固定的位置，因此在它们通过固相引物延伸得到与目标DNA单链互补的被标记上信标的产物DNA链后，通过对基因芯片所发出的信标信号的寻址即可确定其对应的特定核酸探针，从而确定与其对应的目标基因。
本发明的固相引物延伸检测目标DNA或RNA的延伸和标记方法，可以利用本领域已知的各种核酸延伸和标记方法，使连接在基因芯片固相载体上的寡核苷酸引物或探针延伸，产生出与目标DNA或RNA互补的单链，此单链在延伸的同时被信标标记和/或随后被另一条与之互补的新的被标记单链而加强标记或被标记。所述的延伸和标记方法包括，但不限于，PCR、RT-PCR、体外转录、随机引物标记、缺口平移以及末端转移标记等方法。所述的信标分子可以为荧光素、同位素或生物素；所述的荧光素包括，但不限于，Cy3、Cy3.5、Cy5、异硫氰酸荧光素、德克萨斯红；所述的同位素包括，但不限于，32P、35S、3H；所述的生物素包括，但不限于，生物素、光敏生物素、长臂光敏生物素。PCR、RT-PCR、体外转录、随机引物标记、缺口平移以及末端转移标记等方法是本领域已知的。延伸和标记后，根据所选用的信标分子采用相应的检测方法对基因芯片进行扫描分析，根据所捕获阳性信号的位置寻址，判断所检测的目标DNA或RNA。在信号采集和分析过程中所需的设备均已经商品化。
从操作步骤来看，本发明直接将目标DNA或RNA在芯片上进行固相引物延伸，几分钟到几十分钟反应完成后简单洗涤即可进行荧光扫描，简单快速；避免了目前常用的先用PCR扩增目标DNA或RNA，再将扩增产物与芯片上的探针杂交的耗时约为6至10小时的复杂冗长步骤。从检测结果的特异性来看，本发明在进行固相引物延伸时，由于不同的引物都被固定在不同的区域，因此即使同时检测上千个不同的目标DNA或RNA，这些引物都不会相互干扰，从而真正达到了目前的基因芯片检测所难以达到的高通量、高准确性检测；而且受引物长度、引物与模板退火时的碱基互补配对所决定的杂交特异性、严格的退火温度和盐浓度等因素影响，本发明对所检测的目标DNA和RNA具有高度特异性。从检测结果的信号强度看，由于在引物固相延伸时，聚合产物DNA单链可以尽量长地延伸并不断掺入信标分子，因此信号强度大，信号结合牢固。
通过以下实施例对本发明的基因芯片的制备、固相引物延伸、检测方法及其应用进行描述。需说明的是，下述实施例只是用来说明而非限制本发明，本领域技术人员所熟知的其他通过基因芯片对目标DNA或目标基因进行检测的技术均在本发明的范围内。实施例1通过酰胺键将引物连接在固相载体上制成基因芯片，用Taq酶延伸固相引物以检测目标基因(目标DNA)检测幽门螺杆菌(H.pylori)尿素酶B基因和大肠杆菌外膜蛋白phoE基因的基因芯片。
①引物合成利用PCR引物设计软件Primer Premier5.0设计出一条幽门螺杆菌尿素酶B基因(ureB)特异的引物5’GTT GCT CCT AAA AAA TCC T 3’和一条大肠杆菌外膜蛋白phoE基因特异的引物5’AAA GCC GTG GCA CAG GCA AGC GT 3’，利用DNA自动合成仪(PE公司)按照此二核苷酸引物序列合成相应的寡核苷酸引物。在合成这两条寡核苷酸引物过程中，于每条引物序列的5’端均添加20个额外的胸腺嘧啶核苷(poly(dT)20)，并对所合成寡核苷酸引物的5’端进行氨基修饰。通过聚乙烯酰胺(PAGE)凝胶电泳对合成的寡核苷酸进行纯化。所述的纯化方法是本领域技术人员已知的。
②基因芯片的制备将合成的两条寡核苷酸引物分别溶于适当体积的无菌去离子水中，使引物的终浓度都为60μM。分别从引物溶液中吸取5μl置于微量离心管内，并分别向微量离心管中加入5μl的二甲基亚砜(DMSO)(Sigma，美国)。将引物溶液和二甲基亚砜充分混匀后，取5μl置于386孔板的相应孔中。以醛基修饰的玻片(CSS-100 Silylated Slides，CEL Associates，Inc.，休斯敦，美国)作为固相载体。利用GSI Flexys基因芯片点样仪(Genomic Solution，美国)将引物按照3×3的矩形点阵点到玻片上相应的位置处(即微排序点样)，引物5’端的氨基与玻片表面的醛基反应形成酰氨键而将引物固定在玻片上。这样，不同位置上的寡核苷酸引物矩阵便分别对应于幽门螺杆菌尿素酶B基因和大肠杆菌外膜蛋白phoE基因。室温下将基因芯片避光放置至少24小时。
③Taq酶延伸固相引物检测幽门螺杆菌尿素酶B基因和大肠杆菌外膜蛋白phoE基因按照本领域技术人员已知的DNA提取方法，制备四种待测的DNA样品含有幽门螺杆菌尿素酶B基因的DNA样品、含有大肠杆菌外膜蛋白phoE基因的DNA样品、混合有幽门螺杆菌尿素酶B基因和大肠杆菌外膜蛋白phoE基因的DNA样品、不含有幽门螺杆菌尿素酶B基因和大肠杆菌外膜蛋白phoE基因的DNA样品，利用上述的基因芯片，采用固相引物延伸技术分别检测这四种DNA样品。
简言之，配制20-200μl PCR反应液，其成分如下1×Taq酶反应缓冲液、2.0mM MgCl2、各200μM的dATP、dTTP和dGTP、各100μM的dCTP和Cy3-dCTP、Taq酶0.5u/20μl、适量的待测DNA样品(预变性或不预变性均可)。取PCR反应液适量加入到基因芯片上的反应池中，密闭反应池以防反应液蒸发。开始固相引物延伸的PCR反应。
反应池可由以下方式形成(1)在基因芯片上寡核苷酸引物矩阵的四周，用涂有粘胶的薄橡胶条、硅胶条、塑料条等，或gene frame原位框(GENE公司)围成一个反应池，加入PCR反应液后，在反应池上覆盖玻片或硅烷化后的盖玻片或塑料片或聚乙烯薄膜等，使反应池密闭。(2)在PCR反应液中加入GENE公司的Self-seal自动防蒸剂，然后滴加PCR反应液覆盖寡核苷酸引物矩阵，在PCR反应液上覆盖玻片或硅烷化后的盖玻片或塑料片或聚乙烯薄膜等，在PCR反应过程中，由于高温，边缘的液体蒸发而形成固体胶墙，从而形成一个密闭的PCR反应池。(3)预先对基因芯片的固相载体进行蚀刻，使在进行微排序点样的区域形成凹陷；在此凹陷区域进行微排序点样后，加入PCR反应液，直接在基因芯片的固相载体表面覆盖涂有粘胶的盖玻片、玻片或塑料片等，即可形成密闭的反应池。(4)预先对基因芯片的固相载体进行蚀刻，使在进行微排序点样的区域形成凹陷；在此凹陷区域进行微排序点样后，直接在在基因芯片的固相载体表面覆盖涂有粘胶的盖玻片、破片或塑料片等，形成反应池，此反应池有反应液进口和出口，加入PCR反应液后，关闭反应液进口和出口即形成密闭的反应池。
还有一种不需要在基因芯片形成密闭反应池就可进行固相引物延伸的PCR反应的方式，即配制较大体积的PCR反应液，直接将基因芯片浸入PCR反应液中就可进行PCR反应。
所述的PCR反应是，以88-94℃10-300秒，40-65℃10-300秒，72℃10-300秒的循环参数进行1次循环以上，最后于72℃进行延伸反应10秒至数分钟。
PCR反应结束后，对于上述的(1)、(2)、(3)种反应池，揭去反应池上覆盖的盖玻片或塑料片等物，暴露微排序点样区域；对于上述的第(4)种反应池，从反应液出口或入口移去PCR反应液；对于上述的将基因芯片直接浸入PCR反应液所进行的反应，则直接取出基因芯片。用水或TE缓冲液或杂交缓冲液(12×SSC，0.2％SDS)等洗涤基因芯片的微排序点样区，去除芯片表面未反应的PCR反应液的成分。
洗涤结束，取出后自然凉干。利用GeneTAC 2000基因芯片扫描仪(Genomic Solution Inc.，美国)，在532nm的激发光波长下进行扫描并自动曝光。分析扫描结果，并对荧光信号进行寻址，并与特异性寡核苷酸探针相对应，确定标本中的目标DNA或目标基因。
检测结果①对于只含有幽门螺杆菌尿素酶B基因DNA的样品，基因芯片只在幽门螺杆菌尿素酶B基因特异引物的矩阵点样区域发出荧光信号。②对于只含有大肠杆菌外膜蛋白phoE基因DNA的样品，基因芯片只在大肠杆菌外膜蛋白phoE基因特异引物的矩阵点样区域发出荧光信号。③对于混合有幽门螺杆菌尿素酶B基因和大肠杆菌外膜蛋白phoE基因DNA的样品，基因芯片在幽门螺杆菌尿素酶B基因特异引物的矩阵点样区域和大肠杆菌外膜蛋白phoE基因特异引物的矩阵点样区域都发出了荧光信号。④对于不含有幽门螺杆菌尿素酶B基因和大肠杆菌外膜蛋白phoE基因DNA的样品，基因芯片上无荧光信号出现。实施例2通过二硫键将引物连接在固相载体上制成基因芯片，用Taq酶进行固相引物延伸以检测目标基因(目标DNA)检测幽门螺杆菌(H.pylori)尿素酶B基因和大肠杆菌外膜蛋白phoE基因的基因芯片。
①引物合成所合成的引物的核苷酸序列同实施例1，于每条引物序列的5’端均添加20个额外的尿嘧啶核苷(poly(dU)20)，但对所合成寡核苷酸引物的5’端进行的是巯基修饰，具体而言，修饰的基团是将Cruachem公司的C6disulphide phosphoramidite连接到引物的5’端而得到的。
②基因芯片的制备方法和步骤同实施例1，但所用的固相载体是用3-Mercaptopropyltrimethoxysilane处理而得到的巯基修饰的玻片。玻片表面的巯基与引物5’端的C6disulphide phosphoramidite反应，形成二硫键而将引物固定在玻片上。
③用Taq酶延伸固相引物检测幽门螺杆菌尿素酶B基因和大肠杆菌外膜蛋白phoE基因固相引物延伸的PCR反应条件、反应池的准备、反应后基因芯片的洗涤和扫描以及检测结果都同实施例1。实施例3通过二硫键将引物连接在固相载体上制成基因芯片，用大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段进行固相引物延伸以检测目标基因(目标DNA)检测幽门螺杆菌(H.pylori)尿素酶B基因和大肠杆菌外膜蛋白phoE基因的基因芯片。①除于每条引物序列的5’端均添加20个额外的腺嘌呤核苷(poly(dA)20)外，引物序列、对所合成的寡核苷酸的5’端进行的巯基修饰和基因芯片的制备均同实施例2。②大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段延伸固相引物以检测幽门螺杆菌尿素酶B基因和大肠杆菌外膜蛋白phoE基因按照实施例1所述的方法制备四种待测的DNA样品，将它们预变性，即在99℃变性2分钟后立即置于冰浴。利用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段按照本领域技术人员已知的方法延伸基因芯片上的引物并对延伸产物DNA单链进行荧光素标记。具体如下配制反应液，使得在50μl终体积中含有1×大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段反应缓冲液、50个单位的大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段、各200μM的dATP、dTTP和dGTP、各100μM的dCTP和Cy3-dCTP以及适量的预变性后的待测DNA样品。用反应液覆盖基因芯片上寡核苷酸引物矩阵区域，于37℃温育2小时。反应结束后，用水或TE缓冲液或杂交缓冲液(12×SSC，0.2％SDS)等洗涤基因芯片的微排序点样区，去除芯片表面未反应的反应液成分。
洗涤结束，取出后自然凉干。利用GeneTAC 2000基因芯片扫描仪(Genomic Solution Inc.，美国)，在532nm的激发光波长下进行扫描并自动曝光。分析扫描结果，并对荧光信号进行寻址，并与特异性寡核苷酸引物相对应，确定标本中的目标DNA或目标基因。
检测结果同实施例1。实施例4通过二硫键将引物连接在固相载体上制成基因芯片，用大肠杆菌DNA聚合酶I全酶进行固相引物延伸以检测目标基因(目标DNA)检测幽门螺杆菌(H.pylori)尿素酶B基因和大肠杆菌外膜蛋白phoE基因的基因芯片。
除于每条引物序列的5’端均添加聚乙二醇臂(spacer amidite，18 atom spacerphosphoramidite，Cruachem公司)并在相当于引物5’端的聚乙二醇臂末端用C6disulphidephosphoramidite进行巯基修饰外，引物序列、基因芯片的制备、四种待测DNA样品的制备及预变性都与实施例3相同。
利用大肠杆菌DNA聚合酶I全酶，按照本领域技术人员已知的方法延伸基因芯片上的引物并对延伸产物DNA单链进行荧光素标记。具体如下配制反应液，使得在50μl终体积中含有1×大肠杆菌DNA聚合酶I反应缓冲液、50个单位的大肠杆菌DNA聚合酶I全酶、各200μM的dATP、dTTP和dGTP、各100μM的dCTP和Cy3-dCTP以及适量的预变性后的待测DNA样品。用反应液覆盖基因芯片上寡核苷酸引物矩阵区域，于37℃温育2小时。
反应后的洗涤、荧光扫描和检测结果同实施例3。实施例5通过二硫键将引物连接在固相载体上制成基因芯片，用T4噬菌体DNA聚合酶进行固相引物延伸以检测目标基因(目标DNA)检测幽门螺杆菌(H.pylori)尿素酶B基因和大肠杆菌外膜蛋白phoE基因的基因芯片。
引物序列、引物的合成、基因芯片的制备、四种待测DNA样品的制备及预变性都与实施例3相同。
利用T4噬菌体DNA聚合酶，按照本领域技术人员已知的方法延伸基因芯片上的引物并对延伸产物DNA单链进行荧光素标记。具体如下配制反应液，使得在50μl终体积中含有1×T4噬菌体DNA聚合酶反应缓冲液、4个单位的T4噬菌体DNA聚合酶、各200μM的dATP、dTTP和dGTP、各100μM的dCTP和Cy3-dCTP以及适量的预变性后的待测DNA样品。用反应液覆盖基因芯片上寡核苷酸引物矩阵区域，于37℃温育2小时。
反应后的洗涤、荧光扫描和检测结果同实施例3。实施例6通过二硫键将引物连接在固相载体上制成基因芯片，用T7噬菌体DNA聚合酶进行固相引物延伸以检测目标基因(目标DNA)检测幽门螺杆菌(H.pylori)尿素酶B基因和大肠杆菌外膜蛋白phoE基因的基因芯片。
引物序列、引物的合成、基因芯片的制备、四种待测DNA样品的制备及预变性都与实施例3相同。
利用T7噬菌体DNA聚合酶，按照本领域技术人员已知的方法延伸基因芯片上的引物并对延伸产物DNA单链进行荧光素标记。具体如下配制反应液，使得在50μl终体积中含有1×T7噬菌体DNA聚合酶反应缓冲液、4个单位的T7噬菌体DNA聚合酶、各200μM的dATP、dTTP和dGTP、各100μM的dCTP和Cy3-dCTP以及适量的预变性后的待测DNA样品。用反应液覆盖基因芯片上寡核苷酸引物矩阵区域，于37℃温育2小时。
反应后的洗涤、荧光扫描和检测结果同实施例3。实施例7通过二硫键将引物连接在固相载体上制成基因芯片，用测序酶进行固相引物延伸以检测目标基因(目标DNA)检测幽门螺杆菌(H.pylori)尿素酶B基因和大肠杆菌外膜蛋白phoE基因的基因芯片。
测序酶是经过修饰而去除了3’→5’外切核酸酶活性，但聚合酶活性仍保留的T7噬菌体DNA聚合酶。
本实施例的引物序列、引物合成、基因芯片的制备、四种待测DNA样品的制备及预变性都与实施例3相同。
利用T7噬菌体DNA聚合酶，按照本领域技术人员已知的方法延伸基因芯片上的引物并对延伸产物DNA单链进行荧光素标记。具体如下配制反应液，使得在50μl终体积中含有1×测序酶反应缓冲液、4个单位的测序酶、各200μM的dATP、dTTP和dGTP、各100μM的dCTP和Cy3-dCTP以及适量的预变性后的待测DNA样品。用反应液覆盖基因芯片上寡核苷酸引物矩阵区域，于37℃温育2小时。
反应后的洗涤、荧光扫描和检测结果同实施例3。实施例8通过二硫键将引物连接在固相载体上制成基因芯片，用禽源反转录酶进行固相引物延伸以检测目标基因(目标DNA)检测幽门螺杆菌(H.pylori)尿素酶B基因和大肠杆菌外膜蛋白phoE基因的基因芯片。
本实施例的引物序列、引物合成、基因芯片的制备、四种待测DNA样品的制备及预变性都与实施例3相同。
利用禽源反转录酶，按照本领域技术人员已知的方法延伸基因芯片上的引物并对延伸产物DNA单链进行荧光素标记。具体如下配制反应液，使得在50μl终体积中含有1×禽源反转录酶反应缓冲液、4个单位的禽源反转录酶、各400μM的dATP、dTTP和dGTP、各200μM的dCTP和Cy3-dCTP以及适量的预变性后的待测DNA样品。用反应液覆盖基因芯片上寡核苷酸引物矩阵区域，于42℃温育2小时。
反应后的洗涤、荧光扫描和检测结果同实施例3。实施例9通过二硫键将引物连接在固相载体上制成基因芯片，用鼠源反转录酶进行固相引物延伸以检测目标基因(目标DNA)检测幽门螺杆菌(H.pylori)尿素酶B基因和大肠杆菌外膜蛋白phoE基因的基因芯片。
本实施例的引物序列、引物合成、基因芯片的制备、四种待测DNA样品的制备及预变性都与实施例3相同。
利用鼠源反转录酶，按照本领域技术人员已知的方法延伸基因芯片上的引物并对延伸产物DNA单链进行荧光素标记。具体如下配制反应液，使得在50μl终体积中含有1×鼠源反转录酶反应缓冲液、4个单位的鼠源反转录酶、各400μM的dATP、dTTP和dGTP、各200μM的dCTP和Cy3-dCTP以及适量的预变性后的待测DNA样品。用反应液覆盖基因芯片上寡核苷酸引物矩阵区域，于37℃温育2小时。
反应后的洗涤、荧光扫描和检测结果同实施例3。实施例10.通过硫醚键将引物连接在固相载体上制成基因芯片，用Taq酶进行固相引物延伸以检测目标基因(目标DNA)检测幽门螺杆菌(H.pylori)尿素酶B基因和大肠杆菌外膜蛋白phoE基因的基因芯片。①引物合成所合成的引物的核苷酸序列同实施例1，但对引物的5’端进行的是乙烯基修饰，具体而言，修饰的基团是将Mosaic Technologies公司的Acrydite连接到引物的5’端而得到的。②基因芯片的制备固相载体的处理方法同实施例2，是用3-Mercaptopropyltrimethoxysilane处理而得到的巯基修饰的玻片。玻片表面的巯基与引物5’端的乙烯基反应，形成硫醚键而将引物固定在玻片上。③用Taq酶延伸固相引物检测幽门螺杆菌尿素酶B基因和大肠杆菌外膜蛋白phoE基因固相引物延伸的PCR反应条件、反应池的准备、反应后基因芯片的洗涤和扫描以及检测结果都同实施例1。实施例11.通过非共价键将引物连接在固相载体上制成基因芯片，用Taq酶进行固相引物延伸以检测目标基因(目标DNA)检测幽门螺杆菌(H.pylori)尿素酶B基因和大肠杆菌外膜蛋白phoE基因的基因芯片。①引物合成所合成的引物的核苷酸序列同实施例1，但在合成时将引物的5’端标记上生物素(biotin)。④基因芯片的制备将固相载体用链霉亲和素(streptavidin)或亲和素(avidin)以5mg/L的浓度包被，4℃过夜。然后加入封闭剂，4℃过夜。用水洗涤后自然干燥，置4℃保存，从而得到链霉亲和素或亲和素修饰的玻片。玻片表面的链霉亲和素或亲和素与引物5’端的生物素结合，形成非共价键而将引物固定在玻片上。⑤用Taq酶延伸固相引物检测幽门螺杆菌尿素酶B基因和大肠杆菌外膜蛋白phoE基因固相引物延伸的PCR反应条件、反应池的准备、反应后基因芯片的洗涤和扫描以及检测结果都同实施例1。
权利要求
1.检测样品中是否存在目标DNA或RNA的基因芯片固相引物延伸技术，其特征是①所述的基因芯片为按照一定的排序将寡核苷酸的5’端连接在基因芯片的固相载体上而制成，所述的寡核苷酸的5’端是通过共价键或非共价键而连接在基因芯片的固相载体上的；②所述的固相引物为所述的5’端通过共价键或非共价键与基因芯片的固相载体连接的寡核苷酸，所述的固相引物的3’端区域的核苷酸序列可与目标DNA经变性(或解链)所产生的两条DNA单链之一因互补配对而发生退火，或可与目标RNA因互补配对而发生退火；③所述的固相引物延伸为所述的固相引物与所述的目标DNA单链或目标RNA退火后，在依赖于模板的DNA聚合酶作用下，沿引物的3’端延伸出与目标DNA单链或目标RNA互补的产物DNA单链。④所述的产物DNA单链在延伸的同时或随后被标记上信标分子，通过检测基因芯片上信标分子的信号，从而判断出样品中是否存在所述的目标DNA或目标RNA。若有信标分子的信号，则样品中有目标DNA或目标RNA，若无信标分子的信号，则未发生固相引物延伸，样品中无目标DNA或目标RNA。
2.权利要求1所述的依赖于模板的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I(全酶)、大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段、T4噬菌体DNA聚合酶、测序酶(T7噬菌体DNA聚合酶)、Taq酶、反转录酶。
3.权利要求1所述的信标分子是荧光素、同位素或生物素。
4.权利要求1所述的固相引物，在其与基因芯片固相载体连接的5’端可以添加一个目的在于增加该引物的空间活动性以利于退火或杂交的连接臂，所述的连接臂是多聚胸腺嘧啶核苷poly(dT)n(n≥5)、多聚尿嘧啶核苷poly(dU)n(n≥5)、多聚腺嘌呤核苷poly(dA)n(n≥5)或聚乙二醇等长链状的分子。
5.权利要求1所述的固相引物延伸技术的应用。
全文摘要
本发明公开了一种新的基因芯片通用检测技术及其应用，本发明极大简化了基因芯片检测的操作步骤、有效避免了高通量检测时成百上千对引物的相互干扰，实现了基因芯片的高通量快速检测，检测结果的稳定性、特异性、灵敏度和重复性都很好。
文档编号C12Q1/68GK1400315SQ01123528
公开日2003年3月5日 申请日期2001年7月30日 优先权日2001年7月30日
发明者王鹤尧, 郑文婕 申请人:王鹤尧, 郑文婕