专利名称：具有广泛抑制人免疫缺陷病毒(HIV)活性的两种cDNA及其在原核中的表达、分离、纯化方法
技术领域：
本发明为两个与爱滋病病毒相关的基因/蛋白，中国商陆抗病毒蛋白的基因及其编码蛋白(PAP1)及人免疫缺陷病毒HIV-1基因编码的一个反式作用激活因子(TAT)突变体基因及其编码的蛋白，涉及生物医学高技术中新基因、新蛋白的开发与应用领域。
作为爱滋病预防主要手段之一的HIV疫苗的研制经过众多科学家的潜心研究，已经取得了重大进展，但由于HIV基因组的高度变异给疫苗的研制带来了极大的困难。疫苗的研制尚存在众多的技术问题。因而作为治疗使用的抗AIDS药物研究就显得特别重要。目前，临床使用的抗AIDS药物多为化学合成物，如AZT(azidodeoxy-thumidine)，是逆转录酶的一种抑制剂，它是第一个被美国FDA批准的用于AIDS治疗的抗病毒药物，其毒副作用较大，易产生耐药性。因此有必要用新的思路来研究新的治疗手段或发现新的安全有效的抗HIV-1的药物来对付日益严重的AIDS病的蔓延。
从植物中分离得到的一类核糖体失活蛋白(Ribosome inactibating proteins，RIPS)的抗AIDS活性近年来备受众多科学家所关注，其研究也取得了突破性进展。其中，以天花粉蛋白和美洲商陆抗病毒蛋白的研究最为深入。现有文献报道，关洲商陆抗蛋白作为抗AIDS药物同天花粉蛋白比较，其毒副作用更低，更具临床应用前景。但是，从中国商陆分离该蛋白，克隆该蛋白的编码基因尚未见报道。
Tat蛋白是人免疫缺陷病毒HIV-1基因编码的一个反式作用激活因子，它能增强HIV-1基因转录的起始和延伸效率，在AIDS病毒的发病过程中起着重要作用。因此，Tat蛋白是一个理想的抗HIV-1感染作用的靶子。Tat蛋白的突变体能同Tat蛋白竞争性地结合病毒基因组LTR中的顺式作用元件TAR，从而抑制HIV基因的转录。展示了利用HIV本身元件治疗艾滋病又一思路。此外，Tat蛋白的碱性氨基酸富集域为蛋白传导结构域(protein transduction domain，PTD)，它可以携带许多外源蛋白直接进入细胞内，目前可于同细胞因子或毒素等蛋白偶联，可作为细胞因子或毒素蛋白的导向，成为当今生物治疗中的研究热点。
发明目的1.克隆中国商陆抗病毒蛋白基因，表达其编码蛋白，探索该重组蛋白抑制HIV生物学活性。2.用突变PCR技术获得新的Tat蛋白突变体并以瞬时转染方法验证Tat蛋白保守区域内氨基酸对于Tat蛋白的反式激活活性的重要性。3.体外模拟正常与突变Tat蛋白的高级结构进一步分析HIV-1 Tat蛋白氨基酸改变造成的活性改变与Tat蛋白高级结构变化间的可能关系。4.验证抗性基因对HIV-1 Tat蛋白反式激活活性的影响。最终获得Tat功能降低或丧失的Tat突变体。5.将上述Tat突变体cDNA与中国商陆抗病毒蛋白基因串联，表达其融合蛋白并测定比较重组蛋白体外抗HIV-1的生物学活性。
最终将上述基因/蛋白应用于AIDS的治疗内容与要求应用基因组信息学原理、RT-PCR、PCR突变、分子克隆、DNA序列测定、蛋白表达与分离、纯化，重组蛋白抗HIV-1的生物学活性测定技术等，克隆鉴定编码中国商陆抗病毒蛋白基因及人免疫缺陷病毒反式作用激活因子(Tat)功能降低或丧失的Tat突变体基因，原核表达中国商陆抗病毒蛋白及Tat突变体和中国商陆抗病毒蛋白的融合蛋白，通过测定并比较重组蛋白体外抗HIV-1的生物学活性，为上述蛋白应用于AIDS的治疗打下基础；上述基因/蛋白达到的技术指标为1.中国商陆抗病毒蛋白cDNA编码324aa。2.Tat cDNA编码86aa蛋白。两种突变体为pM1T40A/K41A和pM2R52L。突变后的Tat能显著抑制正常Tat的活性，分别达40％、85％。3.突变Tat蛋白三维空间结构的模拟显示，以上氨基酸的改变引起的Tat的反式激活活性的变化与其三维结构的改变有一定的对应关系。4.Tat突变体及中国商陆抗病毒蛋白的基因串联。5.中国商陆抗病毒蛋白及Tat突变体-中国商陆抗病毒融合蛋白在原核中的高效表达及有效分离纯化。6.重组蛋白体外抗HIV-1良好的生物学活性，表明上述基因及其编码蛋白，可用于AIDS的基因治疗及重组药物的开发。
为比较不同Tat突变蛋白的反式激活活性，用正常和突变tat表达质粒分别与pLTR-luc共转染JurKat细胞，48小时后收集细胞，细胞经裂解，测定荧光酶活性，以正常Tat反式激活活性为100，测定各种Tat突变蛋白的相对活性。正常或突变Tat的反式激活活性应为pLTR-luc与正义或突变Tat表达质粒共转染时的荧光酶活性，减去pLTR-luc单独转染细胞时的荧光酶的活性。Tat有很强的反式激活作用，能使HIV-1 LTR指导的荧光酶的表达增加20倍左右，而突变后的Tat反式激活活性极大地降低或丧失。同时，结果也说明HIV-1 LTR5’端缺失的YL158片段仍可受Tat的调控，因为在pLTR-luc单独转染时只检测到很低的荧光酶活性而一旦与表达Tat的表达质粒共转染，荧光酶的活性很高。这也是我们选用其作启动子的原因。3.突变Tat蛋白的高级结构预测及相应结构参数为进一步分析HIV-1 Tat蛋白中上述位点的氨基酸替换造成的活性改变与Tat蛋白高级结构变化间的可能关系，我们模拟了正常与突变Tat蛋白的高级结构。方法首先从Brookhaven PDB(protein data bank)中查到由二维核磁共振(2D NMR)和分子动态计算(MD)得到的HIV-1 Tat蛋白的各原子相对空间坐标，共有10个文件(由于用NMR得到的各原子坐标的不确定性，每组坐标代表一种可能性)，用Biosym公司的DISCOVER软件包对上述10个文件的各组数据进行分析，选取其中具有最低能量结构的数据作为我们模拟HIV-1 Tat高级结构的基础。同样用Biosym公司的INSIGHT II软件包根据选取的Tat各空间原子相对坐标模拟出HIV-1 Tat蛋白的三维空间结构；改变每个突变位点的原子参数模拟出突变蛋白的三维空间结构。如图3所示氨基酸替换前后Tat蛋白三维结构变化可用每个原子对问的均方根差(RootMean Sequere Derivates，RMSD)来量化。4.突变Tat对HIV-1 Tat活性的影响TD蛋白是一类结构突变的病毒蛋白，它能与正常的病毒蛋白竞争性作用，干扰正常病毒蛋白的功能，已有一些TD蛋白用于抗HIV的研究。前面我们证实Tat蛋白的一些氨基酸的突变能导致其功能的降低或丧失；为了筛选TD Tat蛋白，我们测定了不同突变Tat蛋白对正常Tat蛋白的活性的影响。在这里，以空载体pLTR-luc及pS-Tat分别与不同突变Tat基因表达质粒共转染JurKat细胞，其中pLTR-luc和pS-Tat分别为400ng。各种突变Tat表达质粒(pM1-pM6)为4ug。转染48小时后收集细胞，测定荧光酶的活性，并计算Tat的反式激活活性，然后计算突变Tat对正常Tat活性的影响。在计算Tat的反式激活活性时，pLTR-luc单独转染JurKat细胞时的荧光酶活性被扣除。结果说明不同Tat突变蛋白对正常Tat均有一定程度的抑制作用，其中以M5最大，达85％。另外，Thr40/Lys41氨基酸的替换(M3)和Lys50的终止突变体(M4)能分别抑制Tat的活性40％和50％，而当Thr40/Lys41和Lys50三位的氨基酸同时突变时则抑制达60％。5.中国商陆抗病毒蛋白基因的克隆取中国商陆叶片，加少量液氮，研磨破壁。用GIBCO公司的TRIZOL试剂，一步法提取总RNA。用Roche公司的RT试剂盒进行cDNA第一链的合成，按其说明进行操作。PCR引物由上海生物工程公司合成。P15’…atgaagtcgatgcttgtgg…3’，P25’…tcagaatccttcaaatagatc…3’。PCR反应体系的组成为RT产物5μl，上、下游引物终浓度均为50pmol，dNTPs终浓度200μM，Pfu Turbo 1U/μl，反应体系50μl。
扩增参数为94℃，5min。94℃，30s，55℃，30s，72℃，1min，35个循环。72℃，10min。反应体系中直接加入Taq DNA聚合酶1U，72℃继续10min以加A。取PCR产物5μl，1％琼脂糖凝胶电泳检测。获得一长约950bp片段。
PCR产物与pGEM-T Easy的连接、转化PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，胶回收试剂盒回收。回收后的PCR产物与pGEM-T室温连接1小时后，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经IPTG、X-gal筛选后，挑白色菌落，抽提质粒。采用ABI公司377型DNA自动测序仪进行核苷酸序列测定。6.Tat突变体与中国商陆抗病毒蛋白基因的串联串联引物1#5’…ggatccgagccagtagatcctagactag…3’；2#5’gcccacgcccggcacgcccacgcccggcacttccttcgggcctgtcgg.. 3’3#5’gtgccgggcgtgggcgtgccgggcgtgggcgtgaatccaatcatctacaatg 3’4#5’aagctttcagaatccttcaaatagatcacc 3’。串联PCR的基本过程是先用引物1#，2#；3#，4#引物分别进行PCR，得到Tat突变体与中国商陆抗病毒蛋白PCR产物；再以这两个片段为模板，用引物1#，4#PCR即可得到Tat突变体与中国商陆抗病毒蛋白基因的串联。串联PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，胶回收试剂盒回收。回收后的PCR产物与pGEM-T室温连接1小时后，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经IPTG、X-gal筛选后，挑白色菌落，抽提质粒。采用ABI公司377型DNA自动测序仪进行核苷酸序列测定。7.中国商陆抗病毒蛋白及Tat突变体与中国商陆抗病毒蛋白融合蛋白的表达带有中国商陆抗病毒蛋白基因及Tat突变体与中国商陆抗病毒蛋白串联基因的pGEM-T质粒Bam HI/Hind III双酶切，37℃，2hr。同时，pPROEXHTb质粒Bam HI/Hind III双酶切，37℃，2hr。酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，回收基因片段和pPROEXHTb载体部分。回收产物经16℃连接过夜后，转化大肠杆菌DH5α。挑取菌落经PCR初步鉴定后，抽提质粒并进一步酶切鉴定。重组质粒用Bam HI/Hind III双酶切后分别得到一950bp和1.2kb片段，表明重组质粒已插入上述基因。经酶切鉴定后的表达质粒转化大肠杆菌BL21。挑起单个BL21转化菌落，接种于5ml含氨苄青霉素100μg/ml的LB培养基中37℃过夜培养。按1∶100接种于100ml含氨苄青霉素100μg/ml的2×YT培养基中，37℃继续培养至OD600约为1。待培养液冷却至室温后补加氨苄青霉素100μg/ml并经不同浓度(0.1Mm-1mM)和不同温度(16℃-30℃)诱导表达摸索后获得该蛋白最佳表达条件，即为1mM IPTG，室温(25℃)表达。SDS-PAGE结果显示，与诱导前对比，在分子量约35kDa和45kDa附近出现一条新的蛋白带。经紫外扫描显示，该蛋白带约占菌体总蛋白的25％。菌体经超声破碎离心后取上清和沉淀，进一步SDS-PAGE分析显示，该蛋白主要为可溶性蛋白。8.中国商陆抗病毒蛋白ORF基因序列1 ATG GAG CCA GTA GAT CCT AGA CTA GAG CCC TGG AAG CAT CCA GGA AGT481 M E P V D P R L E P W K H P G S 1649 CAG CCT AAA ACT GCT TGT ACC AAT TGC TAT TGT AAA AAG TGT TGC TTT9617 Q P K T A C T N C Y C K K C C F 3297 CAT TGC CAA GTT TGT TTC ATA ACA AAA GCC TTA GGC ATC TCC TAT GGC 14433 H C Q V C F I T K A L G I S Y G 48145 AGG AAG AAG CGG AGA CAG CGA CGA AGA CCT CCT CAA GGC AGT CAG ACT 19249 R K K R R Q R R R P P Q G S Q T 64193 CAT CAA GTT TCT CTA TCA AAG CAA CCC ACC TCC CAA TCC CGA GGG GAC 24065 H Q V S L S K Q P T S Q S R G D 80241 CCG ACA GGC CCG AAG GAA GTG CCG GGC GTG GGC GTG CCG GGC GTG GGC 28881 P T G P K E V P G V G V P G V G 96289 GTG AAT ACA ATC ATC TAC AAT GTT GGA AGT ACC ACC ATT AGC AAA TAC 33697 V N T I I Y N V G S T T I S K Y112337 GCC ACT TTT CTG GAT AAT CTT CGT AAT GAA GCG AAA GAT CCA AGT TTA 384113 A T F L D N L R N E A K D P S L128385 AAA TGC TAT GGA ATA CCA ATG TTG CCC AAT ACA AAT CCA AAT CCA AAG 432129 K C Y G I P M L P N T N P N P K144433 TAC GTG TTG GTT GAG CTC CAA GGT TCA AAT AAA AAA ACC ATC ACA CTA 480145 Y V L V E L Q G S N K K T I T L160481 ATG CTG AGA CGA AAC AAT TTG TAT GTG ATG GGC TAT TCT GAT CCC TTT 528161 M L R R N N L Y V M G Y S D P F176529 GAT ACC AAT AAG TGT CGT TAC CAT ATC TTT AGT GAT ATC TCA GGT ACT 576177 D T N K C R Y H I F S D I S G T192577 GAA CGC CAA GAT GTA GAG ACT ACT CTT TGC CCA AAT CCC AAT TCT CGT 624193 E R Q D V E T T L C P N P N S R208625 GTT AGT AAA AAC ATA AAC TAT GAT AGT CGA TAT CCA ACA TTG GAA TCA 672209 V S K N I N Y D S R Y P T L E S224673 AAA GCG GGA GTA AAA TCA AGA AGT CAA GTT CAA CTG GGA ATT CAA ATA 720225 K A G V K S R S Q V Q L G I Q I 240721 CTC GAC AGT AAT ATT GGA AAG ATT TCT GGA GTG ACG TCA TTC ACT GAG 768241 L D S N I G K I S G V T S F T E 256769 AAA ACC GAA GCC GAA TTC CTA CTG GTA GCC ATA CAA ATG GTA TCA GAG 816257 K T E A E F L L V A I Q M V S E 272817 GCA GCA AGA TTC AAG TAC ATA GGG AAT CAG GTG AAA ACT AAT TTT AAC 864273 A A R F K Y I G N Q V K T N F N 288865 AGA GCA TTC AAT CCT AAT CCC AAA GTA CTT AAT TTG GAA GAG ACA TGG 912289 R A F N P N P K V L N L E E T W 304913 GGT AAG ATT TCT ACA GCA ATT CAT GAT GCC AAG AAT GGA GTT TTA CCC 960305 G K I S T A I H D A K N G V L P 320961 AAA CCT CTC GAG CTA GTG GAT GCC AGT GGT GCC AAG TGG ATA GTG TTG1008321 K P L E L V D A S G A K W I V L 3361009 AGA GTG GAT GAT ATC AAG CCT GAT GTA GCA CTC TTA AAC TAC GTT GGT1056337 R V D D I K P D V A L L N Y V G 3521057 GGG AGC TGC CAA ACA ACT TAT AAC CAA AAT GCC ATG TTT CCT CAA CTT1104353 G S C Q T T Y N Q N A M F P Q L 3681105 ATA ATG TCT ACT TAT TAT AAT TAT ATG GCT AAT CTT GGT GAT CTA TTT1152369 I M S T Y Y N Y M A N L G D L F 3841153 GAA GGA TTC TGA1164385 E G F * 3879.Tat突变体的蛋白ORF基因序列1G ATG AAG TCG ATG CTT GTG GTG ACA ATA TCA GTA TGG CTC ATT CTT GCA CCA ACT TCA 581 M K S M L V V T I S V M L I L A P T S 1959 ACT TGG GCT GTG AAT ACA ATC ATC TAC AAT GTT GGA AGT ACC ACC ATT AGC AAA TAC GCC 11820 T W A V N T I I Y N V G S T T I S K Y A 39119 ACT TTT CTG GAT AAT CTT CGT AAT GAA GCG AAA GAT CCA ACT TTA AAA TGC TAT GGA ATA 17840 T F L D N L R N E A K D P S L K C Y G I 59179 CCA ATG TTG CCC AAT ACA AAT CCA AAT CCA AAG TAC GTG TTG GTT GAG CTC CAA GGT TCA 23860 P M L P N T N P N P K Y V L V E L Q G S 79239 AAT AAA AAA ACC ATC ACA CTA ATG CTG AGA CGA AAC AAT TTG TAT GTG ATG GGC TAT TCT 29880 N K K T I T L M L R R N N L Y V M G Y S 99299 GAT CCC TTT GAT ACC AAT AAG TGT CGT TAC CAT ATC TTT AGT GAT ATC TCA GGT ACT GAA 358100 D P F D T N K C R Y H I F S D I S G T E 119359 CGC CAA GAT GTA GAG ACT ACT CTT TGC CCA AAT CCC AAT TCT CGT GTT AGT AAA AAC ATA 418120 R Q D V E T T L C P N P N S R V S K N I 139419 AAC TAT GAT AGT CGA TAT CCA ACA TTG GAA TCA AAA GCG GGA GTA AAA TCA AGA AGT CAA 478140 N Y D S R Y P T L E S K A G V K S R S Q 159479 GTT CAA CTG GGA ATT CAA ATA CTC GAC AGT AAT ATT GGA AAG ATT TCT GGA GTG ACG TCA 538160 V Q L G I Q I L D S N I G K I S G V T S 179539 TTC ACT GAG AAA ACC GAA GCC GAA TTC CTA CTG GTA GCC ATA CAA ATG GTA TCA GAG GCA 598180 F T E K T E A E F L L V A I Q M V S E A 199599 GCA AGA TTC AAG TAC ATA GGG AAT CAG GTG AAA ACT AAT TTT AAC AGA GCA TTC AAT CCT 658200 A R F K Y I G N Q V K T N F N R A F N P 219659 AAT CCC AAA GTA CTT AAT TTG GAA GAG ACA TGG GGT AAG ATT TCT ACA GCA ATT CAT GAT 718220 N P K V L N L E E T W G K I S T A I H D 239719 GCC AAG AAT GGA GTT TTA CCC AAA CCT CTC GAG CTA GTG GAT GCC AGT GGT GCC AAG TGG 778240 A K N G V L P K P L E L V D A S G A K W 259779 ATA GTG TTG AGA GTG GAT GAT ATC AAG CCT GAT GTA GCA CTC TTA AAC TAC GTT GGT GGG 838260 I V L R V D D I K P D V A L L N Y V G G 279839 AGC TGC CAA ACA ACT TAT AAC CAA AAT GCC ATG TTT CCT CAA CTT ATA ATG TCT ACT TAT 898280S C Q T T Y N Q N A M F P Q L I M S T Y 299899 TAT AAT TAT ATG GCT AAT CTT GGT GAT CTA TTT GAA GGA TTC TGA TCA TAA ACA TAA TAA 958300Y N Y M A N L G D L F E G F 313959 GGA GTA TAT ATA TAT TAC TCC AAC TAT ATT ATA AAG CTT AAA TAA GAG GCC GTG TTA ATT 10181019 AGT ACT TGT TGC CTT TTG CTT TAT GGT GTT GTT TAT TAT GCC TTG TAT GCT TGT AAT ATT 10781079 ATC TAG AGA ACA AGA TGT ACT GTG TAA TAG TCT TGT TTG AAA TAA AAC TTC CAA TTA TGA 11381139 TGC AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AA 116权利要求
1.一种从植物-中国商陆叶片中分离、克隆得到的cDNA，其特征是所述的cDNA编码一324aa的蛋白。
2.一种为人免疫缺陷病毒HIV-1基因编码的一个反式作用激活因子的突变体，其特征是所述的cDNA的编码86aa的蛋白，突变体分别为T40A/K41A和R52L。
3.如权利要求1所述的cDNA，其特征是所述的序列是从中国商陆植物叶片中分离、克隆得到。
4.如权利要求2所述的cDNA，其特征是所述的序列是采用PCR技术体外突变获得的。
5.一种含有如权利要求1所述的cDNA原核表达载体的构建，及蛋白的分离、纯化方法。
6.一种含有如权利要求1、2所述的cDNA原核融合表达载体的构建，及融合蛋白的分离、纯化方法。
7.如权利要求1、2所述的cDNA在制备基因治疗艾滋病的制剂中的应用。
全文摘要
本发明涉及两种能抑制人免疫缺陷病毒(HIV－1)活性的cDNA，包括这两种cDNA的分离克隆，体外突变，在原核中的融合表达以及该cDNA在制备治疗病毒、肿瘤的制剂中的应用。所述的cDNA中一种是从植物中国商陆叶片中分离、克隆得到的。另一种则为人免疫缺陷病毒HIV－1基因编码的一个反式作用激活因子(Tat)突变体。
文档编号C12P19/34GK1400220SQ0112391
公开日2003年3月5日 申请日期2001年8月2日 优先权日2001年8月2日
发明者彭小忠, 白龙川, 阴彬, 金鑑, 周严, 胡晓燕, 韩春雨, 邵一鸣, 袁建刚, 强伯勤 申请人:中国医学科学院基础医学研究所