专利名称：一种克隆心肌细胞、心脏组织及心脏的方法
技术领域：
本发明涉及细胞、组织和器官的克隆领域，更具体地，本发明涉及克隆心肌细胞、心脏组织及心脏的方法以及专用于该方法的转基因载体。
背景技术：
核移植就是将供核移入受体卵母细胞质获得重组胚胎的过程，1997年世界上首例体细胞移植绵羊Dolly诞生，Dolly羊是以高度分化的成年母羊乳腺细胞为核供体，它采用了趋于成熟的胚胎细胞核移植程序。
美国夏威夷大学的T.wakayama等用小鼠卵丘细胞为核供体，从中克隆出小鼠而后又成功的用克隆出的小鼠卵丘细胞作核供体，从中克隆出第2代小鼠，其技术被称为“檀香山”技术，T.wakayama，et al.，Full-term development ofmice from nucleated oocyte injected with cumulus cell nuclei.Nature，(1998，394369-374)，其克隆小鼠的技术与克隆Dolly的技术有所不同1、将供体核显微注入去核卵母细胞后使之在其中停留1-6小时，目的是给卵母细胞时间以改变供体DNA，从而使发育所必需的基因能有效表达。2、采用化学物质激活卵母细胞，主要的化学物质是锶(10mMSr2+)(激活液中还包括5ug/ml的细胞松弛素B，旨在抑制极体的形成)，锶可以刺激卵母细胞内储钙的释放，是受精后开始卵裂的信号。
随着核移植技术发展，如何利用人体细胞的核移植技术来获得用于治疗病人所需组织或器官，科学家提出了治疗性克隆概念。所谓治疗性克隆，是指应用病人的体细胞移植到去核的卵母细胞内，经过一定的处理使其发育到囊胚，再利用囊胚建立ES细胞(从早期内细胞团或原始生殖细胞经体外分化抑制培养筛选分离出来的具有全能性和多能性的细胞)，在体外进行诱导分化成特定的组织或器官(如皮肤、软骨、乳房、肾脏、心、牙齿、心脏、肝脏、尿道、膀胱等等)，再将组织或器官移植到病人身上。利用这种方法可解决组织或器官移植过程中最重要的排斥反应，而且解决了组织或器官的来源问题。
心脏疾病是威胁人类健康的一大重要病症。为了治疗心脏疾病，目前人工心脏是常用的治疗手段。然而，人工心脏存在多种缺点，例如费用昂贵，存在排异现象等。因此，本领域迫切需要开发克隆心肌细胞、心脏组织和心脏的方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种克隆心肌细胞、心脏组织和心脏的方法。
本发明的另一目的是提供专用于所述方法的转基因载体。
在本发明的第一方面，提供了一种克隆心肌细胞的方法，包括步骤(a)在体外提供胚胎干细胞(ES细胞)；(b)用携带遗传标记基因载体转染胚胎干细胞，其中所述的载体包含心肌特异性启动子和抗性标记基因，从而筛选出带有抗性选择基因的胚胎干细胞，获得带有遗传标记的胚胎干细胞；(c)将步骤(b)中选出的胚胎干细胞经体外定向诱导分化成心肌细胞。
较佳地，所述的胚胎干细胞是通过应用核移植技术建立体细胞克隆囊胚，然后体外培养所述的体细胞克隆囊胚而获得的。其中，所述的载体含有选自下组的标记基因新霉素抗性基因neor、潮霉素抗性基因hygro、绿色荧光蛋白基因GFP、磷酸甘油激酶基因pGK。所述的心肌特异性启动子包括选自下组的启动子心肌肌动蛋白启动子、心室特异表达基因MLC-2C的启动子。
此外，在一优选例中，所述的载体是一个有双选择标记基因的转基因载体，它是通过如下步骤构建的(1)从人的基因组文库中筛选心肌特异的人α心肌肌动蛋白启动子片段；(2)将筛选标记的新霉素抗性基因neor置于心肌特异的人α心肌肌动蛋白启动子的控制之下，同时将绿色荧光蛋白基因和hygro基因置于非组织特异性启动子的控制之下，从而构成一个带有双选择标记基因的转基因载体。
在另一优选例中，本发明方法还包括步骤(d)进一步体外诱导分化成心脏组织与心脏。
在本发明的第二方面，提供了一种载体，它含有(1)心肌特异性启动子元件以及位于所述心肌特异性启动子控制之下的第一标记基因；以及(2)非心肌特异性启动子元件以及位于所述非心肌特异性启动子控制之下的第二标记基因；
所述的第一标记基因与第二标记基因不相同。
较佳地，所述的心肌特异性启动子选自下组心肌肌动蛋白启动子、心室特异表达基因MLC-2C的启动子。
在本发明的一个优选例中，在所述载体中，所述的心肌特异性启动子包括人肌球蛋白重链启动子；第一标记基因包括新霉素抗性基因；非心肌特异性启动子包括GK启动子；第二标记基因包括磷酸甘油激酶基因pGK、绿色荧光蛋白基因、潮霉素抗性基因。
图1是带有多标记基因的转基因载体的结构示意图。其中MHC为人肌球蛋白重链启动子，neo为新霉素抗性基因，pGK为磷酸甘油激酶基因，GFP为绿色荧光蛋白，Hygro为潮霉素抗性基因。
图2是本发明一种技术方案的流程示意图。
图3是光学显微镜下显示的ES细胞体外培养分化为拟胚体的照片。其中图3A分化4天后的简单拟胚体；图3B分化10天后的拟胚体。
图4显示了在不同时间，光学显微镜下观察ES细胞体外定向分化的心肌细胞出现自发节律性收缩的百分比。
图5显示了四种肌动蛋白阳性对照RT-PCR分析结果。分别使用成对引物来扩增从小鼠心脏、大腿骨骼肌、胃平滑肌提取的RNA。PCR结果显示四种肌肉肌动蛋白均能产生与预计片段大小一致的阳性条带。各泳道分别是泳道1，fX174/HindIII分子量标准物；泳道2，α-心肌肌动蛋白；泳道3，α-血管肌动蛋白；泳道4，α-骨骼肌肌动蛋白；泳道5，γ-胃肠肌动蛋白。
图6显示了四种肌动蛋白在不同时相拟胚体中表达情况的RT-PCR分析结果。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，采用已获得的克隆人体细胞囊胚在体外进行培养，获得ES细胞，并用带筛选基因的基因载体进行转染，获得能表达心肌肌动蛋白的ES细胞，并诱导分化成心肌细胞、心肌组织与心脏，从而为临床治疗提供了一条新途径。
使用本发明方法，不仅可以为人体器官直接移植除解决供体来源问题，还可排除器官移植过程产生免疫排斥反应。
如本文所用，术语“心肌特异性启动子”指在心肌细胞、心脏组织或心脏中发挥启动作用，但在其他组织(如骨骼肌、肝脏等)中并不发挥启动作用的启动子。可用于本发明的心肌特异性启动子包括各种已发现或将来发现的心肌特异性启动子。代表性的例子包括(但并不限于)心肌肌动蛋白启动子、心室特异表达基因MLC-2C的启动子等。
用于在本发明的心肌特异性启动子，还可含有天然与其相连的且处于其控制之下的外显子序列。例如，当心肌特异性启动子是人肌球蛋白重链启动子α-MHC，它可包括4.5kb的5’端侧翼序列(启动子区)和1kb含外显子1-3的序列。当心肌特异性启动子含有天然与其相连的且处于其控制之下的外显子序列时，在转染的ES细胞定向分化后，还可利用表达的所述外显子筛选心肌细胞。
在本发明方法中，首先是在体外提供胚胎干细胞(ES细胞)。这些ES细胞可用各种常规方法获得。一种优选的方法是先获得克隆体细胞囊胚，然后将囊胚体外培养成ES细胞。
克隆体细胞囊胚的获得一种克隆体细胞囊胚的获得方法详见中国专利申请No.99119951.0，(1999年11月2日提交)。简而言之，以人为例，就是通过将人体细胞直接注射到去核的人或山羊卵母细胞胞质内，再利用电刺激或化学激活的方法使直接注射的胚胎激活；或将人体细胞直接注射到去核的山羊卵母细胞透明带下，通过电刺激使之融合，再利用电刺激或化学激活的方法使融合卵激活。将激活的重构胚移植到羊输卵管内作短暂的培养，回收并观察胚胎的发育情况，获得发育至桑椹或囊胚期胚胎。
一种代表性的方法包括以下步骤提供去核的非人哺乳动物供质卵母细胞和用于供核的人体细胞；用显微注射法，将用于供核的人体细胞直接注射入所述的去核供质卵母细胞，形成重构卵；或者将用于供核的人体细胞直接注射入非人哺乳动物的卵周隙中，再用电刺激法使人体细胞融合进卵母细胞内，形成重构卵；
对所述的重构卵进行激活处理，形成激活的重构卵；将所述的激活的重构卵移植到非人寄母动物的输卵管中，作短暂培养，再回收发育的早期胚胎。
其中，通过激活处理，形成被激活的重构卵。本领域中的常规的激活处理方法都可用于本发明。通常，对重构卵的激活处理可用电刺激和/或化学刺激法进行。较佳地，在本发明中对重构卵的激活处理选自下组(i)重构卵在0.2-0.4M甘露醇，3-5mg/ml的胎牛血清，0.08-0.12mM MgSO4的激活液中，进行1-3次电刺激，电压为600-800V/cm，每次电刺激持续20-100μs；(ii)重构卵在0.2-0.4M甘露醇，3-5mg/ml的胎牛血清，0.08-0.12mM MgSO4的激活液中，进行1-3次电刺激，电压为600-800V/cm，每次电刺激持续20-100μs(更佳地25-80μs)，然后再如下进行化学法激活即在5-20μM离子霉素中激活5分钟，并在1-5μM 6-DMAP(6-dimethylaminopurine，即6-二甲基氨基嘌呤)激活1-6小时。
囊胚体外培养成ES细胞1.小鼠成纤维细胞(MEF)的原代培养一种方法包括步骤解剖孕12.5-13.5天的neor小鼠，取其胚胎于PBS中洗去血块；去除头、四肢及内脏团，PBS洗涤3次；将胚胎剪成泥状；用胰酶处理；终止消化，并离心；弃去上清，加入新的培养液，打匀细胞后，接种至培养瓶中，37℃，5％CO2培养。
如果倘若消化效果不好，可尝试以下方法在50ml血清瓶中加10ml胰酶，37℃磁力搅拌消化10分钟，吸出5ml消化液于1号离心管中同时加5ml培养液。再加5ml胰酶于血清瓶中，继续消化10分钟，同样吸出5ml消化液于2号离心管，重复上述步骤5次，随后离心继续下步操作。
2.MEF(小鼠成纤维细胞)的再培养待细胞80％汇合生长后，留1-2瓶传代，其余细胞冻存。
3.饲养层(feeder)的制备饲养层制备时，接种的培养皿或培养瓶预先用0.1％的明胶处理2小时；4孔板每孔接种15万个细胞，10cm的平皿接种500万个细胞，也可按7.5×104-10×104/cm2MEF计算；饲养细胞一般使用5天，在接种前制备。
4.ES细胞的原代培养将囊胚置于含有小鼠成纤维细胞的多孔板中培养，加培养液培养。同时，可设置对照，例如通过热休克处理将囊胚置于高于正常温度下处理一定时间，如41℃ 60分钟。
待内细胞团长大后，用末端封闭的巴斯德吸管使其脱离孔底，再用毛细吸管转移细胞至PBS中洗涤；胰酶消化；加入培养液终止消化，将细胞打散后，再转移至新的培养板培养。
5.ES细胞的再培养与细胞的常规培养相同，要注意每天更换培养液，及时传代(2-3天传一次)，传代时将细胞打散成单个细胞。
转基因载体的构建在本发明另一方面，提供了一种用于筛选心肌细胞的转基因载体，它包括心肌特异性启动子元件以及位于所述心肌特异性启动子控制之下的第一标记基因；以及(2)非心肌特异性启动子元件以及位于所述非心肌特异性启动子控制之下的第二标记基因；所述的第一标记基因与第二标记基因不相同。
本发明转基因载体的构建可用常规方法进行。例如，从人的基因组文库中筛选心肌特异的人α心肌肌动蛋白启动子片段。然后，将筛选标记的新霉素抗性基因(neor)置于心特异的人α心肌肌动蛋白启动子的控制之下，同时将绿色荧光蛋白基因和潮霉素抗性基因hygro置于非组织特异性启动子(GK启动子)的控制之下，从而构成一个带有双选择标记基团的转基因载体。
在获得了转基因载体后，可采用本领域常规方法来转染ES细胞，并根据具体的标记基因进行筛选。一种优选的方法是抗生素抗性基因进行筛选。另一种优选方法是用利用荧光基因(如GFP基因)进行筛选。
ES细胞分化及其衍生的心肌细胞的筛选
从囊胚的内细胞团发育而来的胚胎干细胞，在特定培养条件下，ES细胞在体外可分化为血液始祖细胞、内皮细胞、神经细胞等，这些细胞在体外分化过程可在很大程度上模仿它们在正常胚胎中的发育过程。将胚胎干细胞先进行8天的心肌细胞生成诱导，然后在含G418筛选培养液和普通培养液中分别再培养8天，对体外诱导生成的心肌细胞进行免疫组化鉴定和超微结构分析，确定用心肌特异启动子调控抗性基因筛选心肌细胞的有效性。
下面结合实施例进一步详细地描述本发明，应理解，这些实施例仅用于阐述目的而不用于限制本发明范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1克隆鼠体细胞囊胚的获得将人体细胞直接注射到去核的小鼠卵母细胞胞质内，再利用电刺激或化学激活的方法使直接注射的胚胎激活；或将小鼠体细胞直接注射到去核的山羊卵母细胞透明带下，通过电刺激使之融合，再利用电刺激或化学激活的方法使融合卵激活。将激活的重构胚移植到小鼠输卵管内作短暂的培养，回收并观察胚胎的发育情况，获得发育至桑椹或囊胚期胚胎(图2)。
实施例2囊胚体外培养成ES细胞1.小鼠成纤维细胞(MEF)的原代培养i)解剖孕12.5-13.5天的neor小鼠(由上海市转基因研究中心胚胎工程部提供)，取其胚胎于PBS中洗去血块；ii)去除头，四肢，及内脏团，PBS洗涤3次；iii)转移胚胎至一小的培养皿中，用剪刀将胚胎剪成泥状；iv)用吸管转移胚胎至50ml血清瓶中，加入5-10ml胰酶，37℃，磁力搅拌消化20分钟；v)加入25ml培养液终止消化，500g离心15分钟；
VI)弃去上清，加入新的培养液，打匀细胞后，接种至培养瓶中，37℃，5％CO2培养。
2.EF的再培养待细胞80％汇合生长后，留1-2瓶传代，其余细胞冻存。
传代1)弃去培养液，用PBS洗涤1次；2)加胰酶消化1分钟，而后加入培养液终止消化，1000rpm离心5分钟；3)弃去上清，加入新鲜培养液，打匀细胞后，将其传至培养瓶。
冻存1)按常规培养将细胞制成悬液，计数，令细胞密度达到5×106/ml左右；2)用培养液+DMSO配成10％的DMSO培养液，按与去上清相同的量一滴一滴加入离心管中，然后用吸管轻轻吹打细胞；3)分装冻存管，置于泡沫盒中，放在-80℃，几天后转移至液氮中保存。
复苏1)从液氮中取出冻存管，不时摇动，使其急速融化，一般在30秒至1分钟内完成；2)吸取冻存液至离心管中，1000rpm离心5分钟；3)弃去上清，加入新的培养液，混匀后接种至培养瓶；4)次日更换培养液，进行常规培养。
3.饲养层的制备1)弃去旧的培养液，PBS洗涤1次，加入含10μg/ml丝裂霉素C的培养液，37℃温育3-5小时；2)PBS洗涤4遍以彻底清除残留的丝裂霉素C；3)胰酶消化1分钟，而后加入培养液终止消化，1000rpm离心5分钟；4)弃去上清，加入新鲜培养液，打匀细胞后进行细胞计数；5)按所需细胞数将细胞接种至培养皿或培养瓶。
4.ES细胞的原代培养1)将囊胚置于含有MEF的4孔板中培养，加1ml培养液，对照热休克处理将囊胚置于高于正常温度下处理一定时间，如41℃60分钟；
2)待内细胞团长大后，用末端封闭的巴斯德吸管使其脱离孔底，再用毛细吸管转移细胞至PBS中洗涤1-2次；3)用毛细吸管转移细胞至胰酶中消化3-4分钟(37℃)；4)加入培养液终止消化，用口径很小的吸管将细胞打散成3-4个细胞小团块，再转移至新的培养板培养。
5.ES细胞的再培养与细胞的常规培养相同，要注意每天更换培养液，及时传代(2-3天传一次)，传代时将细胞打散成单个细胞。
6.细胞系的鉴定采用以下方法进行细胞系鉴定(1)AKP染色钙-钴法显示碱性磷酸酶固定福尔马林-钙，4℃制片冰冻切片，恒冷切片A.作用液3％β-甘油磷酸钠 2.5ml2％巴比妥钠2.5ml2％氯化钙 5.0ml5％氯化镁 0.25ml双蒸水 0.25ml调节PH至 9.0-9.4B.2％硝酸钴C.1％硫化铵D.2％甲基绿操作程序1)切片入蒸馏水，入作用液，37℃，25分钟至6小时(时间视固定，制片方法及组织内酶活性强弱而定，恒冷切片需时较短)；2)蒸馏水洗2次；3)硝酸钴3分钟；4)蒸馏水充分漂洗；
5)硫化铵2分钟；6)蒸馏水充分漂洗；7)甲基绿对比染色1-2分钟；(此步可省)8)自来水洗，甘油明胶封盖。
结果碱性磷酸酶-棕黑色，细胞核-绿色。
对照1)底物对照作用液中以蒸馏水代替β-甘油磷酸钠；2)制酶活性对照作用液前先将切片以L-四咪唑(tetramisol)10-4mol/L处理。
(2)体内分化实验1)取1-2板长满ES细胞的3.5cm培养皿，用常规传代的方法将其制成单细胞悬液；2)取少许细胞悬液，适度稀释后计数；3)离心(1000rpm，10min)，弃上清；4)加少量培养基(约0.5×107-1×107/0.1ml)；5)取同性别小鼠，在其腹股沟处注射ES细胞悬液，每只小鼠1×107细胞；6)两周后观察，4-5周后，处死小鼠，取出肿块；7)固定，切片，染色观察。
(3)形态学观察及生长曲线的测定基本上按照《动物组织培养技术及其应用》(陈瑞铭主编)的方法进行。
生长曲线的测定1.按常规制备细胞悬液，再用培养液稀释细胞悬液至104个/ml，105个/ml两个浓度；2.从4个培养体系个各取1ml细胞悬液，接种至24孔板，每种细胞浓度做3个平行，放入培养箱培养。24小时后，将培养液吸出，加入胰酶消化，随后从孔中取出细胞悬液计数，其余放回CO2培养箱内继续培养；3.定时进行细胞计数，以细胞数/ml作为纵坐标，与之相对应的时间为横坐标，作曲线。细胞数量增加一倍的时间为倍增时间。
实施例3转基因载体的构建
1.从人的基因组文库中筛选心肌特异的人肌球蛋白重链(MHC)启动子取1ul人基因组文库为模板，用MHC启动子特异的引物15-’TCATTGCTGAAACCGAGAA-3’(SEQ ID NO1)；引物25’-TTGCCTGCACAGTGACTAG-3’(SEQ ID NO2)进行PCR扩增，获得688bp的目的片段，回收。采用Promega公司pGEM-T载体，用Nco I和Spe I酶切后将目的片段用T4连接酶连接到T载体上(3674bp)。制备感受态细胞，转化，挑单菌落测序。测序正确后大提质粒DNA，用Nco I和Spe I酶切鉴定后，用[α-32P]dCTP标记探针，与人的基因组文库杂交，依据《分子克隆》操作。挑取阳性菌落，提取DNA，获得的α-MHC启动子含有4.5kb的5’端侧翼序列及1kb的包含外显子1-3的基因，但不包括起始密码子。
2.从pMC1-neo polyA(购自Stratagene公司)载体中用SalI和XhoI酶切获得1146bp的新霉素基因neor cDNA片段。
3.用T4连接酶连接MHC-neor cDNA片段，12-16℃过夜。
4.克隆磷酸甘油酸激酶(pGK)-潮霉素(hygro)cDNA片段取1ul人基因组文库为模板，用pGK启动子特异的引物15’-TGGGTCTCGCACATTCTTCA-3’(SEQ ID NO3)，引物2 GGTCTTTCGTGGGCTTCAGT(SEQID NO4)进行PCR扩增，获得692bp的目的片段，回收、测序。测序结果与GenBank中人pGK基因序列(L00159)进行比较，结果正确。然后将pGK片段与购自Stratagene公司的Hygromycin B基因片段用T4连接酶进行连接，形成pGK-hygro片段。
5.克隆pGK-GFP cDNA片段同步骤4，将获得的pGK片段与购自Invitrogen公司的GFP连接，形成pGK-GFP。
6.取MHC-neo cDNA片段，pGK-hygro cDNA片段，PBM20载体(BoehringerMannheim公司)(带有HindIII和XhoI酶切位点)，pGK-GFP cDNA片段，T4连接酶进行连接反应。
7.制备感受态细菌。
8.取连接产物于JM109感受态细菌中进行转化。
9.挑取转化皿上的单菌落，接种于LB培养基中(含100ug/ml Amp)。
10.提取质粒。
11.酶切鉴定(XhoI和HindIII)，获得带有多标记基因的转基因载体。
在构建的转基因载体中，有关元件的结构如图1所示。其中MHC为人肌球蛋白重链启动子，neo为新霉素抗性基因，pGK为磷酸甘油激酶基因，GFP为绿色荧光蛋白，Hygro为潮霉素抗性基因。
实施例4ES细胞的转染及筛选用实施例3制备的转基因载体(打靶载体)通过以下方法转染ES细胞1、复苏的ES细胞传代后的第2天(36hr)进行转染实验。
2、转染2hr前，换新鲜的培养基。
3、吸弃培养基，用PBS漂洗培养皿2次4、每100mm培养皿加1.5ml 0.25％胰酶，37℃，5min。
5、加3.5ml ES细胞培养基，用吸管反复抽吸，20次。用血球计数板测定细胞总数，通常每个打靶载体每次转染约需2×107个细胞。
6、1000rpm，2min离心ES细胞悬液。吸弃上清，将细胞重悬于10ml PBS中。
7、重新离心，1000rpm，2min。将细胞重悬于PBS中，使细胞密度达到2×107/ml。
8、将30～50μg线性化的打靶载体DNA与1ml细胞混匀装入电穿孔槽中，室温放置5min。
9、在基因脉冲仪中电击(600V，25μF)，室温放置1min。
10、将电穿孔槽中的细胞与7ml新鲜的ES细胞培养基混匀，分入4个已长满滋养层细胞的培养皿中(100mm)。
11、将40μl未转染的细胞铺于一个100mm培养皿中作为对照。
12、24小时后，换成潮霉素(200μg/ml)ES细胞筛选培养基，此后每天更换新鲜的筛选培养基。
13、通常转染7天后可以开始挑取克隆进行鉴定。
实施例5筛选后ES细胞定向分化成心肌细胞将实施例4中挑取的单个未分化的ES克隆在荧光显微镜下筛选，含有绿色荧光蛋白的克隆进行扩增。用PCR鉴定含有MHC-neor和-hygro片段的胚胎干细胞。将这些胚胎干细胞先进行8天的心肌细胞生成诱导，然后在含G418筛选培养液和普通培养液中分别再培养8天，对体外诱导生成的心肌细胞进行免疫组化鉴定和超微结构分析，确定用心肌特异启动子调控抗性基因筛选心肌细胞的有效性。
1.分化ES细胞的悬滴培养未分化的ES细胞经0.05％Trypsin+0.53mM EDTA消化为分散的ES细胞，离心去除上清(以便去除LIF)。加入10ml ES细胞分化培养基(不含LIF，15％FBS增加为20％FBS)。反复吹打形成细胞悬液。细胞计数，用多孔移液管在100mm组织培养皿盖下面滴加5排30μl/滴(104cells/ml)的细胞液，小心翻转盖子，并置于含10mlPBS培养皿上。37℃，5％CO2培养箱中培养两天。
2.分化ES细胞的悬浮培养ES细胞经两天悬滴培养后，小心翻转培养皿盖子并收集，置于含10ml分化培养基的陪氏培养皿中，在培养箱中继续悬浮培养五天，隔天换液。
结果形成了拟胚体。ES细胞经过2天悬滴培养、2天悬浮培养后，便形成简单拟胚体(simple embryoid body，SEB)(图3A)。细胞外周可见内胚层细胞，内胚层细胞的形成被认为是下一步分化起始所需的先决条件。SEB再经过进一步悬浮培养便可见囊性拟胚体(cystic embryoid body，CEB)(图3B)，体积变大，包括柱状外胚层样细胞的内层和此结构内部累积的液体。
3.ES细胞定向分化培养为心肌细胞将经两天悬滴培养、五天悬浮培养的拟胚体转移到含2ml分化培养基、经0.1％明胶处理的24孔培养板中，每孔接种一个拟胚体，令ES细胞贴壁成长为心肌细胞。
结果悬浮培养5天后的ES细胞经贴壁培养后，在接种的第2天，光学显微镜下即可见自发节律性收缩的心肌细胞。随着细胞的进一步培养，出现自发节律性收缩的心肌细胞数目百分比逐渐增大，有的拟胚体在镜下可见多个有着独立收缩频率的收缩区域，可以分为心肌细胞收缩区，平滑肌收缩区，肌小管收缩区，收缩频率为10-220次/分。本实验采用悬滴-悬浮两步培养法，较悬浮一步培养法有明显的优越性，拟胚体的形态更饱满，悬浮培养时贴壁细胞数目少，贴壁培养后出现自发性收缩细胞的百分比较一步法高。在培养后期，自发性收缩心肌细胞的数目逐渐减少，心跳频率逐渐降低，有的细胞出现间歇性停跳，直至最后完全停跳，整个培养过程为40天(图4)。
实施例6ES细胞分化的心肌细胞的 RT-PCR的鉴定对心肌、骨骼肌、肠道平滑肌、血管平滑肌肌动蛋白特异的上下游引物的合成。这些探针的3’-未翻译区为心肌肌动蛋白5’-GGCTAAGAGAGACATCTC-3’(SEQ ID NO5)，骨骼肌肌动蛋白5’-CGAGTCAATCTATGTACACG-3’(SEQ ID NO6)，肠道平滑肌肌动蛋白5’-AAGGCTTGAAGGTTTTAATGATCTGTGGCTGGTGACCAAGTCTTGTGGGGATCCCAGAGAAGG-3’(SEQ ID NO7)，血管平滑肌肌动蛋白5’-CACAGTTGTGTGCTAGAGGCAG-3’(SEQ ID NO8)。
心肌肌动蛋白，骨骼肌肌动蛋白，肠道平滑肌肌动蛋白的5’端引物均为5’-GCTCCCAGCACCATGAAGA TCAAG-3’(SEQ ID NO9)；血管平滑肌肌动蛋白的5’引物为5’-GCACCCAGCACCATGAAGATCAAG-3’(SEQ IDNO10)。
对拟胚体各时相的总体RNA的提取采用Trizol试剂，依据操作说明进行。以3’端未翻译区作为上游引物，反转录合成cDNA单链作为模板，5’-肌动蛋白作为下引物，PCR循环参数为94℃变性3分钟，接着32个循环扩增(94℃1分钟，60℃30秒，72℃1分钟)，最后72℃延伸10分钟。
提取小鼠心脏、腿部骨骼肌、胃、股动脉RNA做阳性对照。用上述引物对来扩增从小鼠心脏、大腿骨骼肌、胃平滑肌提取的RNA。PCR结果显示四种肌肉肌动蛋白均能产生与预计片段大小一致的阳性条带。
提取拟胚体在7天、7+3天、7+5天、7+8天、7+15天、7+19天的总体RNA，经反转录后，除胃肠道肌动蛋白在第7天外，均能扩增出与阳性对照一致的扩增带(图6)。这表明分化的拟胚体提供了一个体外研究纹状肌(心肌和骨骼肌)和平滑肌(血管和胃肠道平滑肌)细胞基因表达的系统。
序列表<110>上海中路生物工程有限公司中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所北京市心肺血管疾病研究所<120>一种克隆心肌细胞、心脏组织及心脏的方法<130>011723<160>10<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>19<212>DNA<213>合成的引物<400>1tcattgctga aaccgagaa 19<210>2<211>19<212>DNA<213>合成的引物<400>2ttgcctgcac agtgactag 19<210>3<211>20<212>DNA<213>合成的引物<400>3tgggtctcgc acattcttca20<210>4<211>20<212>DNA<213>合成的引物<400>4ggtctttcgt gggcttcagt20<210>5<211>18<212>DNA<213>合成的引物<400>5ggctaagaga gacatctc 18<210>6<211>20<212>DNA<213>合成的引物<400>6cgagtcaatc tatgtacacg20<210>7<211>63<212>DNA<213>合成的引物<400>7aaggcttgaa ggttttaatg atctgtggct ggtgaccaag tcttgtgggg atcccagaga60agg 63<210>8<211>22<212>DNA<213>合成的引物<400>8cacagttgtg tgctagaggc ag 22<210>9<211>24<212>DNA<213>合成的引物<400>9gctcccagca ccatgaagat caag24<210>10<211>24<212>DNA<213>合成的引物<400>10gcacccagca ccatgaagat caag2权利要求
1.一种克隆心肌细胞的方法，其特征在于，包括步骤(a)在体外提供胚胎干细胞；(b)用携带遗传标记基因载体转染胚胎干细胞，其中所述的载体包含心肌特异性启动子和抗性标记基因，从而筛选出带有抗性选择基因的胚胎干细胞，获得带有遗传标记的胚胎干细胞；(c)将步骤(b)中选出的胚胎干细胞经体外定向诱导分化成心肌细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的胚胎干细胞是通过应用核移植技术建立体细胞克隆囊胚，然后体外培养所述的体细胞克隆囊胚而获得的。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的载体含有选自下组的标记基因新霉素抗性基因neor、潮霉素抗性基因hygro、绿色荧光蛋白基因GFP、磷酸甘油激酶基因pGK。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的心肌特异性启动子包括选自下组的启动子心肌肌动蛋白启动子、心室特异表达基因MLC-2C的启动子。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的载体是一个有双选择标记基因的转基因载体，它是通过如下步骤构建的(1)从人的基因组文库中筛选心肌特异的人α心肌肌动蛋白启动子片段；(2)将筛选标记的新霉素抗性基因neor置于心肌特异的人α心肌肌动蛋白启动子的控制之下，同时将绿色荧光蛋白基因和hygro基因置于非组织特异性启动子的控制之下，从而构成一个带有双选择标记基因的转基因载体。
6.如权利要求1所述的方法，还包括步骤(d)进一步体外诱导分化成心脏组织与心脏。
7.一种载体，其特征在于，它含有(1)心肌特异性启动子元件以及位于所述心肌特异性启动子控制之下的第一标记基因；以及(2)非心肌特异性启动子元件以及位于所述非心肌特异性启动子控制之下的第二标记基因；所述的第一标记基因与第二标记基因不相同。
8.如权利要求7所述的载体，其特征在于，所述的心肌特异性启动子选自下组心肌肌动蛋白启动子、心室特异表达基因MLC-2C的启动子。
9.如权利要求7所述的载体，其特征在于，所述的心肌特异性启动子包括人肌球蛋白重链启动子；第一标记基因包括新霉素抗性基因；非心肌特异性启动子包括GK启动子；第二标记基因包括磷酸甘油激酶基因pGK、绿色荧光蛋白基因、潮霉素抗性基因。
10.如权利要求7所述的载体，其特征在于，所述的心肌特异性启动子是人肌球蛋白重链启动子α-MHC，且包括4.5kb的5’端侧翼序列和1kb含外显子1-3的序列。
全文摘要
本发明提供了一种克隆心肌细胞的方法，包括步骤(a)在体外提供胚胎干细胞(ES细胞)；(b)用携带遗传标记基因载体转染ES细胞，其中所述的载体包含心肌特异性启动子和抗性标记基因，从而筛选出带有抗性选择基因的ES细胞，获得带有遗传标记的ES细胞；(c)将步骤(b)中选出的ES细胞经体外定向诱导分化成心肌细胞。本发明还提供了有关的转基因载体。本发明方法可高效专一地获得定向分化的心肌细胞。
文档编号C12N15/87GK1397646SQ0112612
公开日2003年2月19日 申请日期2001年7月13日 优先权日2001年7月13日
发明者成国祥, 杨晓, 黄益民, 陈建泉, 孙彦洵 申请人:上海杰隆生物工程股份有限公司, 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所, 北京市心肺血管疾病研究所