专利名称：一种基于基因芯片进行抗肿瘤药物筛选的方法
技术领域：
本发明涉及一种抗肿瘤药物的筛选方法。
背景技术：
恶性肿瘤是危害人类健康、导致死亡最为严重的疾病之一。在我国，每年约有90万肿瘤病人死亡，并且近年来死亡人数呈逐年递增的趋势。因此，世界各国都投入巨资研究开发抗肿瘤药物。
尽管到目前为止已有数十种化疗或辅助抗肿瘤药物可以用于临床治疗，但大多数药物只能使病情缓解，无法达到治愈的目的。尤其是大多数死亡率很高而又很常见的癌症，如胃癌、食道癌、肺癌等仍缺乏有效的抗癌药物。因此，迫切需要新的、具有明显疗效的抗癌药物的研究和开发。
筛选模型和筛选技术是创新药发展阶段的主要环节。全世界每年新增可供筛选的合成化合物和从动植物中提取的天然化合物数以万计，从中筛选药物的主要障碍在于筛选通量、效率和成本。只有通过先进的筛选模型与技术才能快速有效地发现具有特异性生物活性的后选药物。其中主要包括分子、亚细胞结构、细胞、离体器官及整体动物等一系列筛选模型及筛选技术。目前临床使用的大部分抗肿瘤药物是通过体外细胞筛选系统、动物体内肿瘤模型或者近年发展起来的人肿瘤移植瘤筛选得到的。
随着人类基因测序工作的大规模展开，使人类掌握了大量基因组信息，获得人类疾病的相关基因。关键疾病基因的确定，为药物作用提供了大量的新靶点。随着分子肿瘤学、分子药理学的发展，越来越多的证据表明，抗肿瘤药物发挥作用的机理均通过影响肿瘤细胞基因表达而进一步引起细胞和瘤体表型的改变。药物作用后细胞内基因表达变化特征与细胞和瘤体表型改变呈现内在规律，根据这种规律，可以在未观察到细胞表型变化之前就推测药物的作用机理。
药物引发的基因表达变化非常复杂，呈现基因相互作用和调控后的级联反应。因此，根据个别基因的变化来推测药物最终引起的表型变化往往有失偏颇。而通过观察基因群的变化，虽复杂但能反映药物作用的内在规律。传统的分子生物学技术均无法在同一时间内分析大量的基因表达变化，而基因表达谱芯片集成了成千上万种基因，因此使在同一时间内分析大量的基因表达变化成为可能。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供了一种基于基因芯片的抗肿瘤药物筛选方法，在国内外首次建立了基于基因芯片的抗肿瘤药物筛选模型，使大规模、高通量筛选抗肿瘤药物成为可能。
本发明的主要思路是1)将已知四大类细胞毒抗肿瘤药物中代表性药物的药物反应基因和已知的肿瘤相关基因克隆，合并另外已有的待筛选基因作为待检靶基因；2)选择临床使用的、作用机理较为明确的四大类细胞毒抗肿瘤药物中具有代表性的药物作为工具药物；3)选择若干种常用的筛选抗肿瘤药物的细胞株作为细胞模型；4)用上述工具药分别作用各种细胞后，筛选出各工具药物相应的敏感细胞系，然后用基因表达谱芯片检测药物作用的早期反应基因；5)应用计算机分析软件对药物反应基因进行统计和分类，得到药物标志基因和特异性肿瘤基因；6)依据药物标志基因和特异性肿瘤基因的变化规律验证2种化合物的抗瘤活性，进一步在细胞水平上加以确证。
本发明采用的筛选抗肿瘤药物的细胞株是目前常用的肿瘤细胞株，它们可以是早幼细胞白血病HL-60、慢性髓细胞性白血病K-562、神经母细胞瘤SK-N-SH、肝癌QGY-7703、胃腺癌SGC7903、乳腺癌Bcap-37、卵巢癌H08910和宫颈癌Hela等。
本发明采用四大类细胞毒抗肿瘤药物中已知具有代表性的、临床有效的药物，它们可以是甲氨喋呤、喜树碱、鬼臼素、放线菌素D、紫杉醇、秋水仙碱和高三尖酯碱等。
用四唑氮盐(MTT)比色法检测抗肿瘤药物对上述肿瘤细胞株的药物细胞毒作用。处于快速增殖期的细胞(贴壁细胞用胰酶消化后)计数后接种于96孔酶标板上(贴壁细胞预培养24小时)，加入药物或无药溶剂对照培养24小时后，加入MTT20ul的DMSO后避光，振荡15分钟后，在酶联免疫检测仪上测定570nm波长的OD值，五个复孔取平均值，按下式计算不同药物作用下的肿瘤细胞的抑制率，采用曲线专家1.3将药物浓度以抑制率画图并求出半抑制浓度值IC50。获得敏感肿瘤细胞系药物的IC50值(见图1)。
抑制率(％)＝(对照组OD值-用药组OD值)/对照组OD值×100用上述细胞药物毒性实验获得的药物IC50浓度处理相应肿瘤细胞系，然后用芯片杂交技术检测药物作用下基因表达水平变化。
肿瘤细胞用药物相应的IC50浓度或药物溶剂对照处理0.5小时或1小时后，抽提细胞总RNA，再用OligotexmRNAMidi Kit纯化mRNA。药物及溶剂对照组mRNA分别用cDNA一链合成掺入荧光标记dUTP(Cy 3-dUTP/Cy5-dUTP)的方法制备cDNA探针，混合后在密封仓内与表达谱芯片42℃杂交16小时。杂交结束后按BioDoor洗片技术进行洗涤和晾干。再用ScanArray3000扫描芯片，用ImaGene软件分析Cy3，Cy5两种荧光信号的强度和比值。每个芯片杂交重复三次。
三次芯片杂交所得的Cy3/Cy5比值取均值后，均值大于等于2或小于等0.5标准作为判定药物作用下肿瘤细胞系基因表达差异标准，把所有差异表达的基因定为药物反应基因。用自编软件聚类分析药物反应基因，筛选确定药物筛选共用标志基因(Common Marker Genes，CMG)以及特异性肿瘤基因(Specific Tumor Genes，STG)。
药物筛选共同标志基因分成3级I级CMG为对7个药物的共同反应基因；II级CMG为对6个药物的共同反应基因；III级CMG为对5个药物的共同反应基因。
特异性肿瘤基因(STG)为各个肿瘤细胞系所特有的药物反应基因。
在计算机辅助下运用聚类分析方法对实验所得药物反应基因进行分析，得到一定数量的抗肿瘤药物标志基因和特异性肿瘤基因。将这些抗肿瘤药物标志基因和特异性肿瘤基因进行基因芯片制作，制备成抗肿瘤药物筛选芯片。
用鬼臼素分别处理药物敏感细胞系，各个细胞株可以分别抽提mRNA，然后等量RNA混合后进行芯片杂交。也可用鬼臼素分别处理了药物敏感细胞系后合并所有细胞同时抽提mRNA，再进行芯片杂交。
另外，本发明的发明人还利用表达谱芯片检测了非IC50浓度的细胞毒抗肿瘤药物处理药物敏感细胞株的药物反应基因的表达水平。结果表明，非IC50浓度的药物出来不会影响芯片对药物的显性筛选结果。因此在实际筛选中，可以选择较高的药物浓度进行细胞刺激。
为了进一步验证抗肿瘤药物基因芯片技术的可行性，本发明的发明人还采用双盲法，利用肿瘤细胞株用抗肿瘤药物筛选芯片筛选了两个样品，然后用细胞毒实验验证有效药物的抗肿瘤作用瘤谱。
基因表达谱芯片集成了成千上万种基因，使在同一时间内分析大量的基因表达变化成为可能，克服了传统的分子生物学技术的缺陷。因此，本发明的利用基因芯片的抗肿瘤药物筛选方法具有更高的筛选效率，并且可以在基因调控水平上部分阐明药物的作用机理，为大规模、高通量筛选肿瘤药物提供了技术手段，同时也为筛选其他类型的药物提供了理论依据和技术思路。
附图1 抗肿瘤药物对8种肿瘤细胞系半数抑制浓度IC50附图2 肿瘤细胞的抗肿瘤药物反应基因的表达水平具体实施方式
实施例1 肿瘤药物标志基因和特异性基因的筛选将已知四大类细胞毒抗肿瘤药物中代表性药物的药物反应基因和已知的肿瘤相关基因克隆，合并另外已有的12000余种基因作为待检靶基因。
使用7个代表性药物作为工具药物，它们分别是甲氨喋呤、喜树碱、鬼臼素、放线菌素D、紫杉醇、秋水仙碱和高三尖酯碱。
选择8种常用的筛选抗肿瘤药物的细胞株作为细胞模型，它们分别是早幼细胞白血病HL-60、慢性髓细胞性白血病K-562、神经母细胞瘤SK-N-SH、肝癌QGY-7703、胃腺癌SGC7903、乳腺癌Bcap-37、卵巢癌H08910和宫颈癌Hela。
用四唑氮盐(MTT)比色法检测了7种临床有效的抗肿瘤药物对8株肿瘤细胞系的药物细胞毒作用，得到敏感肿瘤细胞系药物半数抑制浓度(IC50)32个，结果见图1。
用上述细胞药物毒性实验获得的药物IC50浓度处理相应肿瘤细胞系，然后用芯片杂交技术检测药物作用下基因表达水平变化，结果见图2。
在计算机辅助下运用聚类分析方法对实验所得药物反应基因进行分析，得到569个抗肿瘤药物标志基因和50个特异性肿瘤基因。将这些569个抗肿瘤药物标志基因和50个特异性肿瘤基因进行基因芯片制作，制备成抗肿瘤药物筛选芯片。
其中，I类抗肿瘤标志基因为34个；II类抗肿瘤标志基因为160个；III类抗肿瘤标志基因为375个。神经母细胞瘤特异性基因6条；人急性早幼粒白血病细胞特异性基因4条；慢性髓细胞性白血病特异性基因4条；肝细胞特异性基因4条；胃腺癌特异性基因9条；乳腺癌特异性基因4条；卵巢癌特异性基因9条和宫颈癌细胞特异性基因13条。
I级抗肿瘤标志基因为药物敏感细胞株对7类药物的共同反应基因。在得到的34个I类抗肿瘤标志基因中，33条基因在抗肿瘤药物作用下表达下调，仅一条表达上调。
表达下调的为长插入元件反转录转坐因子(LINE RETROTRANSPOSABLE 1；LRE1)，是哺乳动物基因组中高度保守序列，与基因组进化、染色体异常密切相关，并且参加凋亡早期的DNA片段化形成。在本实验中其表达上调可能与化疗造成的染色体不稳定和凋亡有关。
其余的33条基因在抗肿瘤药物作用下均表达下调，根据文献分析其功能涉及能量代谢、蛋白质合成、结构蛋白、信号转导和肿瘤相关等五个方面。实施例2 两种混合法的比较本发明的发明人摸索了鬼臼素分别处理7株药物敏感肿瘤细胞系，各个细胞系分别抽提mRNA，然后等量RNA混合后芯片杂交的方法，以及鬼臼素分别处理7株敏感细胞系后合并所有细胞同时抽提mRNA，再进行芯片杂交的方法。
把这两种方法与多种细胞系同步单独处理方法相比较，其结果表明，用RNA混合或细胞混合后再提取RNA的方法仍能反映药物作用后基因表达的特征变化规律。因此作为一种优选方式，将细胞混合后再提取RNA的方法更为快捷、简便和经济。实施例3 IC50的浓度处理的比较在建立抗肿瘤药物基因芯片的技术路线中，本发明的发明人采用了IC50的药物处理浓度。而如果应用抗肿瘤药物筛选芯片直接筛选未知药物，我们将面对药效以及半数抑制浓度未知的状况。因此，我们用表达谱芯片检测了非IC50浓度(450μl)的鬼臼素处理7株药物敏感细胞株的药物反应基因的表达水平。结果表明，非IC50浓度的药物处理不会影响芯片对药物的显性筛选结果。因此，在实际药物筛选中可以选择较高的药物浓度进行细胞刺激，使本方法具有经济方便快捷的特点。实施例4 双盲法抗肿瘤药物的筛选采用双盲法利用8种肿瘤细胞株用抗肿瘤药物筛选芯片筛选了两个样品，然后用细胞毒实验验证有效药物的抗肿瘤作用瘤谱。
化合物1(128mol/l)和化合物2(128mol/l)分别刺激8种肿瘤细胞系后，进行基因芯片的杂交，结果表明，化合物2作用下，抗肿瘤药物标志基因和瘤谱基因表达变化，说明化合物2具有抗瘤活性，对SK-N-SH、Hela、SGC7901、HL-60和H08910有效。细胞毒实验验证，化合物2呈浓度依赖抑制上述细胞系生长，对K562细胞生长也有抑制作用，对Bcap37GY7703细胞生长抑制作用则较弱。
化合物1作用下，药物标志基因和瘤谱基因表达无变化，表明该化合物无抗瘤活性。细胞毒实验表明，化合物1对8种细胞生长无抑制作用。
解盲结果揭示，化合物1为乙醇(药物溶剂)，化合物2为鬼臼乙叉苷(鬼臼素类似物)。
权利要求
1.一种抗肿瘤药物的筛选方法，其特征在于，它包括以下步骤1)使用若干细胞毒抗肿瘤药物中代表性药物作为工具药物，使用若干种常用的筛选抗肿瘤药物的细胞系作为细胞模型，获得肿瘤细胞的药物敏感性参数；2)用上述工具药分别作用各种细胞后，筛选出各工具药物相应的敏感细胞系，抽提mRNA，与表达谱芯片杂交，检测药物作用的早期反应基因；3)应用计算机分析软件对药物反应基因进行统计和分类，得到药物标志基因和特异性瘤谱基因。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所使用的工具药物是已知四大类细胞毒抗肿瘤药物中临床使用的、作用机理较为明确的的药物。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，采用四唑氮盐比色法检测工具药物对肿瘤细胞系的药物细胞毒作用，得到敏感肿瘤细胞系药物半数抑制浓度，刺激相应的肿瘤细胞系。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，还可选择高于半数抑制浓度的药物浓度进行细胞刺激。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，可采用多种细胞系同步药物处理后分别抽提mRNA，然后等量混合后与表达谱芯片杂交。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，可采用多种细胞系同步药物处理后合并所有细胞，然后抽提mRNA，与表达谱芯片杂交。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，采用聚类分析方法对药物反应基因进行统计和分类。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，可应用双盲法，在基因芯片和细胞水平上二级验证基于基因芯片的药物筛选模型进行抗肿瘤药物筛选的准确性。
全文摘要
本发明提供了一种基于基因芯片的抗肿瘤药物筛选方法，它包括步骤1)使用若干细胞毒抗肿瘤药物中代表性药物作为工具药物，使用若干种常用的筛选抗肿瘤药物的细胞系作为细胞模型，获得肿瘤细胞的药物敏感性参数；2)用上述工具药分别作用各种细胞后，筛选出各工具药物相应的敏感细胞系，抽提mRNA，与表达谱芯片杂交，检测药物作用的早期反应基因；3)应用计算机分析软件对药物反应基因进行统计和分类，得到药物标志基因和特异性瘤谱基因。该方法具有更高的抗肿瘤药物筛选效率，并且可以在基因调控水平上部分阐明药物的作用机理，为大规模、高通量筛选肿瘤药物提供了技术手段。
文档编号C12Q1/68GK1408883SQ0112694
公开日2003年4月9日 申请日期2001年9月30日 优先权日2001年9月30日
发明者毛裕民, 谢毅, 张俊平, 应康, 郭学青, 陈哨辉, 陈颖 申请人:上海博德基因开发有限公司