专利名称：一种用于PCR产物连接的pCH－T载体的制作方法
技术领域：
本发明为一种用于PCR扩增产物连接的pCH-T载体(如附图
一)，它属于基因工程产品。
一般的用于PCR扩增反应的Taq DNA聚合酶都会使PCR扩增产物两边的3’端各带有一个A碱基。基于一般PCR扩增产物的这种特性，本发明的pCH-T载体的两边的3’端各带有一个T碱基，使得其与PCR扩增产物的末端发生互补，因而就可以直接把PCR扩增产物连接到pCH-T载体上。但是也有少数一些具有3’-5’外切核酸酶活性的聚合酶，如Pfu DNA聚合酶，其聚合产生的PCR扩增产物片段为平端，无3’端的A碱基，对于这样的PCR产物就不能直接和pCH-T载体相连。
本发明的pCH-T载体在其具有TA连接功能的基础上，还含有一些利于其使用的特性1.在该载体T位点的两侧提供了两个常用的限制性内切酶BamHI和NcoI的酶切位点(如附图二)，在对转化后得到的阳性质粒进行酶切鉴定时，恰当地选取其中的一种酶就可以把插入片段切下来。这一点与目前世界上现有各公司所生产的T载体都是不同的，不仅仅在于该载体提供了两个酶切位点，而且这两个酶切位点还非常靠近T位点，这也为鉴定工作提供了方便。
2.该载体是利用在实验室中广泛使用的pUC19载体的基础上进行改进所得到，它完全保留了pUC19载体原有的特性，如高拷贝，Ampr抗性，稳定性好等特性。
3.本发明的pCH-T载体是对pUC19载体的多克隆位点进行了改造，使其变成了线性分子，在两侧都引入有BamHI和NcoI两个限制性内切酶位点，并在两边的3’端各加上了一个T碱基。而且该载体如果发生自连，其多克隆位点的碱基排列并没有破坏β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的阅读框架，所以在pCH-T载体与PCR扩增产物连接后进行转化时，就可利用蓝白斑筛选体系挑选阳性白色克隆菌落。
4.对于初步酶切鉴定为阳性的质粒可以利用M13通用引物对其插入的PCR扩增产物进行测序。
对于本发明的pCH-T载体可广泛的应用于各种PCR扩增产物的连接，它可以使得PCR产物直接与之相连，更方便，更快捷地把PCR产物保存到质粒中。而且本发明提供的蓝白斑筛选和两个限制性内切酶位点又非常有利于对含有插入PCR扩增产物的目的质粒进行初步鉴定。
权利要求
本发明为一种直接用于PCR扩增产物连接的pCH-T载体。其特征是在T位点两侧都含有两个限制性内切酶位点BamHI和NcoI。
全文摘要
本发明为一种用于PCR扩增产物连接的pCH－T载体。该载体为线形,在其两边的3’端各有一个突出的T碱基,从而可以和PCR扩增产物两边的3’端带的A碱基相连接。连接后进行转化,可以用蓝白斑的方法进行筛选。而且本发明的pCH－T载体的T位点两侧都含有BamHI和NcoI两个限制性内切酶位点,在鉴定过程中用其中的一种酶就可以把连接产物切下来。并且插入的PCR扩增产物可以用M13通用引物进行测序。
文档编号C12N15/63GK1362521SQ0112821
公开日2002年8月7日 申请日期2001年9月27日 优先权日2001年9月27日
发明者崔斌, 何建勇, 白秀峰, 孔祥银 申请人:崔斌