专利名称：有机磷农药降解菌及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术，具体涉及一株可高效降解有机磷农药的细菌菌株(Pseudomonas sp.WBC-3)，还涉及一种有机磷农药降解菌的制备方法。
我国是高毒农药生产大国，其中有机磷农药约占整个农药的57％。对硫磷一类的有机磷农药被大量用于农业生产与害虫防治，但其残毒会造成环境与食品的严重污染，并产生大量的杀虫剂废物，严重影响了人们的身体健康及农产品的出口创汇，引起越来越多的社会的广泛关注。一方面，国家石化局和农业部制订出中国农药工业“十五”发展规划，要求在“十五”期间，削减生产高毒有机磷杀虫剂，同时大力开发新型高效低毒替代产品；另一方面，针对目前该类农药的大量使用对人类造成的影响，如何有效地处理，避免残药对环境及人类的损害，成为人们亟待解决的问题。国外文献报道，传统的处理有机磷农药残留主要采取化学法(40℃时以0.1N的NaOH处理)或焚烧、掩埋的方法，这些方法的副作用大，往往造成环境的二次污染，并且作用很慢。
曾有文献报道了微生物处理有机磷农药残留的方法。多株微生物可以共代谢的方式矿化对硫磷，即一株菌将对硫磷降解成对硝基苯酚后再由其他菌株进行彻底的分解。但至今尚未有一株菌进行对硫磷有机磷农药彻底降解的报道。
本发明的目的是提供一种有机磷农药降解菌，利用该菌能完全降解对硫磷和甲基对硫磷，并能降解其他多种农药，可用于治理有机磷类农药及部分芳烃类化合物引起的环境污染与食品污染。
本发明另一目的是提供一种方法易行、操作方便的有机磷农药降解菌的制备方法。
为达到上述目的，本发明叙述如下本发明所提供的典型微生物是假单胞菌属的一株命名为WBC-3的菌株(Pseudomonas sp.WBC-3，CCTCC No.M201027)。该菌种的主要特征为菌体呈短杆状，极生单鞭毛，革兰氏染色阴性，氧化葡萄糖产酸、硝酸盐还原及V.P.反应阴性，过氧化氢酶和氧化酶测定阳性。丰富培养基上菌落白色，光滑，边缘整齐。能以对硝基苯酚(PNP)或对硫磷做唯一碳氮源生长，在无机盐培养基(外加PNP浓度为100ppm-500ppm或外加MPAR浓度为100ppm-800ppm)中、28-32℃摇床培养时生长很快。在pH6-8、温度20-40℃范围内均生长良好；该菌的16S rDNA序列的GenBank编号为AY040872。
本发明采用先富集后筛选的方法获得该菌。其步骤如下1)将含有机磷农药污染土样配制成10-30％的菌悬液，菌悬液按5％计接种于外加甲基对硫磷0.005％的无机盐培养基，培养至稳定生长期。培养基为K2HPO40.02％，KH2PO40.08％，MgSO40.02％，CaSO4.2H2O0.01％，NaMoO4.2H2O0.00033％，FeSO4.7H2O0.0005％，(NH4)2SO40.05-0.1％；培养条件为28-32℃.摇床培养时生长很快，PH6-8.温度20-40℃范围内均生长良好。
2)将上述培养菌悬液接入与步骤1)同样的培养基中，培养至对数生长期，以后传代过程中外加甲基对硫磷浓度为0.01-0.08％，逐渐升高，自0.01％逐渐升高至0.08％；3)将上述最终培养菌液用平板稀释法进行分离纯化，获得在上述培养基中生长快、菌落规则、性状稳定的单菌落；4)经生理生化鉴定，确定上述菌株是假单胞菌属(Pseudomonassp.)，保存于LB斜面，使用前以外加甲基对硫磷(0.01％-0.08％)的上述培养基进行驯化。
本发明用于农业生产中可有效地去除有机磷农药残留，与已报道的降解菌株相比，优点在于具有野生菌株的生长优势，筛选菌株降解性能稳定，降解酶系丰富，降解底物范围广，可彻底降解对硫磷等有机磷类农药。对于保护环境，减少农产品中农药残留，保护人们的健康具有重要的意义，适合在果蔬去农药毒、环境污染整治中进行推广应用。
实施例1将斜面菌种接种于含0.06％对硝基苯酚的无机盐培养基中，活化至对数期，培养基成分为K2HPO40.02％，KH2PO40.08％，MgSO40.02％，CaSO4.2H2O0.01％，NaMoO4.2H2O0.00033％，FeSO4.7H2O0.0005％，(NH4)2SO40.1％。将所得菌液按4％计接于含0.005％-0.1％甲基对硫磷的无机盐培养基中，30℃培养28小时左右测其OD600值。同样以活化好的菌液接种到含0.02％-0.3％的甲基对硫磷的葡萄糖(浓度为0.1％)无机盐培养基中，培养至稳定期测其OD600值。结果是该菌对甲基对硫磷的耐受浓度很高，在单纯无机盐培养基中可达到0.08％，在含有葡萄糖的培养基中可达到0.2％。该菌对高浓底物的耐受是降解性能得以实现的基础。
实施例2同实施例1的方法，将0.04％对硝基苯酚中培养20小时，活化至对数期的菌液，按5％计接于含0.03％甲基对硫磷的无机盐培养基中，每隔一定时间取样一次，经萃取提纯后进行气相色谱分析，测定培养基中甲基对硫磷的残留量。中间产物对硝基苯酚的浓度则以其在405nm的特征光吸收值来测定。结果是该菌能够以甲基对硫磷作为唯一碳源、氮源，将其水解成对硝基苯酚后再彻底降解作为生长基质。生长到对数期时对底物的消耗最为旺盛，对于0.03％的甲基对硫磷在22小时即可降解完全。
实施例3将斜面菌种首先接种于含0.004％的2，3-二氯酚、邻苯二酚或马拉硫磷的富集培养基中，培养基成分为K2HPO40.02％，KH2PO40.08％，MgSO40.02％，CaSO4.2H2O0.01％，NaMoO4.2H2O0.00033％，FeSO4.7H2O0.0005％，(NH4)2SO40.1％，酵母提取物0.02％。24小时培养至菌体的OD600分别达到1.5、1.5和0.5时，取出OD值为0.75的菌量做测定用的菌膜，以0.001％标准GGA溶液(成分为150ppm葡萄糖和150ppm谷氨酸)加0.001％的二氯酚或马拉硫磷活化所做菌膜，用活化好的菌膜进行呼吸耗氧实验，实验装置为文献(环境科学学报，1986，6184-192)所述。某些对细胞呼吸代谢有较大毒性的化合物，试验过程同时开展了以邻苯二酚、二氯酚、亚胺硫磷、二嗪农、杀螟松、马拉硫磷为唯一碳源的培养试验在0.04％的对硝基苯酚中活化的菌种以4％接种于5mL无机盐培养基(含0.004％底物)中，于30℃振荡培养，48小时后测其OD600的变化。结果见表1。表1可见该菌对于某些芳烃衍生物，如2，3-二氯酚、邻苯二酚、邻苯二胺、对苯二酚、马拉硫磷等有较强的代谢活性；另外，对于3，4-二氯酚、PNP、二嗪农、杀螟松、喹硫磷、辛硫磷、乐果等也有一定代谢活性。用2，3-二氯酚、邻苯二酚、马拉硫磷、二嗪农、杀螟松、二嗪农、亚胺硫磷等物质分别培养WBC-3菌时也显示了同样的结果，表明该菌是一株可降解多种底物的高效菌株。
表1培养结果底物BODm 可生化性*(以OD600表示)甲胺磷 0.390.37+亚胺硫磷0 0.0299 -杀螟松 0.260.0730 +二嗪农 0.250.0494 +喹硫磷 0.18 —+辛硫磷 0.15 —+乐果0.220.15+马拉硫磷0.510.4906 +2，4，5-T 0 0 -五氯酚钠0 0 -3，4-二氯酚 0.21 —+2，3-二氯酚 1.521.519 +++对硝基苯酚(PNP) 0.220.1529 +对苯二酚0.68 —++邻苯二酚1.591.492 +++邻苯二胺0.70 —++*+，表示可生化；++，表示生化性较强；+++，表示生化性很强；-，表示无生化性
权利要求
1.一种有机磷农药降解菌，其特征在于该微生物是假单胞菌属Pseudomonas sp.WBC-3菌株，CCTCC NO.M201027；该菌的16S rDNA序列为GenBank Accession No.AY040872。
2.一种实现权利要求1所述的有机磷农药降解菌的制备方法，其步骤是A)将含有有机磷农药污染土样配制成菌悬液，悬液按5％计接种于外加甲基对硫磷0.005％的无机盐培养基，培养基为K2HPO40.02％，KH2PO40.08％，MgSO40.02％，CaSO4.2H2O0.01％，NaMoO4.2H2O0.00033％，FeSO4.7H2O0.0005％，NH4)2SO40.05-0.1％，培养条件为28-32℃摇床培养，PH6-8，温度20-40℃；B)将上述培养菌悬液接入步骤A)同样的培养基中，培养至对数生长期，以后传代过程中外加甲基对硫磷浓度为0.01％-0.08％C)将上述培养菌液用平板稀释法进行分离纯化；D)经生理生化鉴定，确定上述菌株是假单胞菌属Pseudomonassp.，保存于LB斜面，使用前外加甲基对硫磷的上述培养基进行驯化。
全文摘要
本发明公开了一种有机磷农药降解菌及其制备方法。该微生物是假单胞菌WBC－3菌株,CCTCCNO.M201027,该菌的16SrDNA序列号为GenBank AccessionNo.AY040872。制备该菌株的步骤是首先将含有有机磷农药污染土样配制成菌悬液,悬液接种含甲基对硫磷的无机盐培养基;其次是将上述菌悬液接入培养基中,培养至对数生长期;第三是上述培养菌液用平板稀释法进行分离纯化;第四是经生理生化鉴定,确定上述菌株是假单胞菌,保存于LB斜面,使用前外加甲基对硫磷的培养基进行驯化。本发明筛选的菌株降解性能稳定,降解酶系丰富,降解底物范围广,能完全降解对硫磷等有机磷农药,适合在果蔬农药去毒。
文档编号C12N1/20GK1329138SQ01128319
公开日2002年1月2日 申请日期2001年8月7日 优先权日2001年8月7日
发明者张先恩, 陈亚丽, 刘虹, 夏祥明, 王银善 申请人:中国科学院武汉病毒研究所