专利名称：高效表达d－氨基酸氧化酶的甲醇酵母,其构建及发酵方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体地说，本发明涉及一种高效表达D-氨基酸氧化酶的甲醇酵母基因工程菌株SIBAS0111，其构建方法以及发酵表达。
在生产SSC中，7-ACA是一种很关键的中间体。多年来，SSC主要仰仗化学脱酰即亚胺醚法生产。这种生产方法有着众多的缺陷，如低温、长时间、以及有毒试剂和溶剂等。20多年来人们致力于开发生物转化技术，直接从CPC生物脱酰而成。从而形成了D-氨基酸氧化酶氧化脱氨和GL-7-ADCA酰化酶催化脱酰生产7-ACA的两步酶法。两步酶法合成工艺消除了一些溶剂和重金属的污染，操作简单，脱酰率高。
D-氨基酸氧化酶(D-Amino Acid Oxidase.EC1.4.3.3.DAAO)是一种以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)作为辅基的典型黄素酶，广泛存在于动物和多种微生物中。天然酶蛋白为86kDa的二聚体，对头孢菌素C具有催化活力。哺乳动物的DAAO与辅基FAD结合较松，辅基易丢失而使酶失活；而某些酵母与辅基FAD的结合较强，有较高活性。其中，三角酵母的DAAO是最常用并且最有应用潜力的(Dominguez，A，Yeast 1997，131399-1408)。DAAO能够催化D-氨基酸氧化脱氨生成酮酸。头孢菌素C经DAAO催化能够氧化脱氨产生α-酮基己二酰-7ACA，在H2O2存在下，后者易氧化脱羧形成GL-7ACA(Shewale，JG，JBiotechnol.1999，7511-22)。最后，以GL-7ACA酰化酶催化GL-7ACA脱酰生成7-ACA。
随着基因工程的发展，DAAO基因在大肠杆菌和酵母中克隆和表达已大量出现。产量有改进，不过大肠杆菌的重组产物虽较高，但后处理很难，而酵母的重组产物虽后处理容易，但产量较少。近年，我们建立了甲醇酵母表达系统。甲醇酵母具有特有的AOX1强启动子，并且可以高密度培养，成本低，生产效率高。我们首次选用甲醇酵母克隆和表达三角酵母DAAO，并经过发酵达到了很高的表达水平，为23000U/L。
本发明的另一个目的在于提供一种构建上述高效表达DAAO的基因工程菌株的方法。
本发明的另一个目的在于提供上述甲醇酵母工程菌的发酵方法，从而可以通过高密度发酵，高效率，低成本地生产DAAO。
本发明所使用的装有去除内含子区域的三角酵母DAAO基因的质粒pAO6蒙西班牙Dominguez教授惠赠。我们以质粒pAO6为模板，用PCR扩增DAAO的基因片段。DAAO基因被首先连到T-载体(pUC18制备而成)上，再借助引物上引入的EcoR I限制性酶切位点和T载体上的Kpn I限制性酶切位点，将DAAO基因克隆到质粒pTRCHISA上，最后利用BamH I和EcoR I两个限制性酶切位点将DAAO基因克隆到甲醇酵母表达质粒pPIC3.5K上，得到整合质粒pPIC3.5K-DAAO。整合质粒用Sal I限制性内切酶线性化，以电穿孔转化法将其转入甲醇酵母GS115菌株体内，整合质粒pPIC3.5K-DAAO与甲醇酵母的基因组DNA发生同源重组而使DAAO基因的表达盒整合入甲醇酵母的基因组DNA中，用PCR法筛选得到阳性重组菌株，再通过测酶活筛选出高产菌株。
所得的高产菌株以基本无机盐、微量元素为主体培养基，在pH5.0-6.5，28-30℃并控制溶氧度的条件下进行发酵。经过甘油生长期、甘油流加期以及甲醇诱导期进行发酵培养。
本发明获得了高效表达DAAO的基因工程菌株SIBAS0111，最高产酶量达到了23000U/L，属国内领先水平。此酶具有发酵条件简单、高效、成本低、无污染等特点，已达到工业生产的要求。
图3是本发明的D-氨基酸氧化酶的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱，其中1为线性空载体pPIC3.5K转化的重组菌株的胞内蛋白；2，3，4分别为8，10，12小时高产菌株的胞内蛋白；5为低分子量标准蛋白(条带大小分别为97.400；66.200；43.000；31.000kDa)；图4是本发明的重组甲醇酵母表达D-氨基酸氧化酶的酶活曲线和菌的生长曲线；图5是本发明测酶活所需的丙酮酸钠标准曲线。
实施例3 D-氨基酸氧化酶基因重组质粒pTRCHISA-DAAO的构建将T-载体-DAAO质粒用BamH I单酶切，切出一条大小约1.3Kb的DNA条带，证明D-氨基酸氧化酶基因为反向接入。用Kpn I单酶切，再用EcoR I不完全酶切，1％琼脂糖电泳，DNA胶回收试剂盒回收约1.3Kb的D-氨基酸氧化酶基因片段。回收片段与用相同酶切的pTRCHISA质粒连接，连接反应体系如下pTRCHISA(Kpn I，EcoR I切) 1ulD-氨基酸氧化酶基因片段 3ul5×连接缓冲液 3ulT4 DNA连接酶(1u/ul)1.5ulH2O 6.5ul以上混合物共15ul于16℃反应过夜。所得连接产物转化E.coli TG1感受态细胞，涂布于氨苄青霉素板筛选阳性克隆。采用质粒抽提试剂盒抽提质粒DNA，所得质粒DNA用PCR法鉴定证明重组质粒为pTRCHISA-DAAO。
实施例4 醇酵母整合质粒pPIC3.5K-DAAO的构建将重组质粒pTRCHISA-DAAO用BamH I单酶切，而后用EcoR I不完全酶切，1％琼脂糖电泳，DNA胶回收试剂盒回收约1.3Kb的D-氨基酸氧化酶基因片段，再与用相同酶切的pPIC3.5K质粒连接，连接反应体系如下pPIC3.5K(BamH I，EcoR I切) 1ulD-氨基酸氧化酶基因片段3ul5×连接缓冲液 3ulT4 DNA连接酶(1u/ul) 1.5ulH2O 6.5ul以上混合物共15ul于16℃反应过夜。所得连接产物转化E.coli TG1感受态细胞，涂布于氨苄青霉素板筛选阳性克隆。采用质粒抽提试剂盒抽提质粒DNA，所得质粒DNA用PCR法鉴定出甲醇酵母整合质粒pPIC3.5K-DAAO。测序结果与报道的基因序列吻合。
实施例5 整合质粒pPIC3.5K-DAAO电转化甲醇酵母GS115细胞将构建的整合质粒pPIC3.5K-DAAO约10ug用Sal I酶切线性化，乙醇沉淀线性DNA并溶解于10ul无菌水中，同时将空载pPIC3.5K质粒经相同酶切线性化并回收作为对照。接种GS115于50ml YPD培养基(1％酵母膏、2％蛋白胨、2％葡萄糖)，28-30℃培养至OD600为1.3-1.5。5000rpm离心5min，菌体沉淀分别用100ml冷无菌水、20ml冷无菌水和20ml 1mol/L的冷山梨醇各洗一次。每次洗后均在5000rpm离心5min并收集菌体。最后将离心的菌体细胞用200ul 1M冰的山梨醇悬浮，即为电击感受态细胞。将上述线性化DNA分别与80ul GS115电转化细胞混合，采用GIBCOL BRL电转化仪CELL-PORATOR电击转化。电转化条件为电压1500V，电容50uF，电阻4KΩ。然后立即向电转化杯中加入0.5ml 1mol/L冰浴预冷的山梨醇，悬浮的电转化产物分别移入无菌微量离心管中。取200ul涂布于MD平板。30℃培养直至单菌落出现，再通过MM和MD平板筛选Mut+。
实施例6 PCR方法筛选阳性重组酵母菌株用牙签挑取单克隆细胞至含10ul水的离心管中；加入5ul 5U/μlLytigase，混匀，30℃处理10分钟；浸液氮1分钟；如下设立PCR反应体系10×缓冲液 5ulMgCl2(2.5mM) 5uldNTP(25 mM each) 2ul5’AOXI Primer(10mM) 2ul3’AOXI Primer(10mM) 2ul模板(取5ul样品)5ulTaq DNA聚合酶 1ul无菌水 28ul以上混合物共50ul在下述条件下进行PCR反应94℃，1min30个循环94℃ 5min →→ 55℃，1min→→→→72℃，10min72℃，2min取5ul PCR产物进行1％凝胶电泳检测。阳性重组酵母菌株的电泳图谱为2.2Kb和1.48Kb(1.26Kb+220bp)两条带，而阴性非重组菌株则仅有2.2Kb一条带(电泳图谱见图2)，由此筛选出阳性重组菌株。
实施例7 摇瓶中甲醇诱导重组菌株表达DAAO将50ul重组菌株接种于5mlBMGY(1％酵母膏，2％蛋白胨，100mM pH6.0磷酸钾，1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％甘油)中，30℃ 300rpm培养至OD600＝2-6。室温下，4000rpm离心5分钟，去上清，菌体沉淀用10ml BMMY(1％酵母膏，2％蛋白胨，100mM pH6.0磷酸钾，1.34％YNB，4×10-5％生物素，0.5％甲醇)重悬，30℃ 300rpm培养五天。每隔6小时取菌体待测。每24小时补加甲醇使其终浓度为0.5％。
实施例8 DAAO的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析用100ul裂解液(50mM磷酸钾，pH7.4，1mM PMSF，1mM EDTA，5％甘油)重悬1ml菌体沉淀，并加入100ul酸处理玻璃珠(0.5mm)。振荡30秒，随后冰浴30秒，如此反复8个循环，4℃，12000rpm离心10min，取上清于一新EP管中。加入等体积的2×SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液，沸水浴煮3min，取40ul上样。SDS-聚丙烯酰胺凝胶浓度为12％。DAAO电泳呈现43kDa一条蛋白带(结果见图3)。
实施例9 DAAO活力测定(Nilsson.K，and Mosbach.K，Appl BiochemBiotechnol，1981，6293-308)1.测活时取1ml发酵液于1.5ml EP管中，9000rpm离心5分钟，移去上清，菌体沉淀保存于-20℃冰箱。
2.测活前，用1ml焦磷酸缓冲液(0.05M，pH8.5)重悬菌体，吸取200ul置于50ml离心管中。加入10ml含30％丙酮的焦磷酸缓冲液(0.05M，pH8.5)，置于25℃水浴并轻微振荡30min。
3.4000rpm离心10min，移去上清。菌体沉淀用生理盐水洗涤，离心。
4.用5ml焦磷酸缓冲液重悬菌体，并取0.5ml加入到装有4.5ml D-丙氨酸(50mM)的50ml离心管中，于37℃水浴振荡反应30min(离心管敞口)，用3ml 10％三氯乙酸终止。
5.1ml反应混合液稀释10倍后，取1ml，加入用2M HCl溶液饱和(0.2％)的2，4-二硝基苯肼0.4ml，混匀，静置10分钟。
6.加入3M的NaOH 1.5ml，摇匀，静置15分钟，4000rpm离心10分钟。取上清，测OD550nm值。
注i.酶活定义上述条件下，每分钟氧化脱氨生成1umol酮酸所需的酶量定义为1单位(U)DAAO。
ii.酶活计算公式酶活(U/L)＝K×OD550nm×M/(T×D)K系数(标准曲线的斜率)；M稀释倍数；T酶与底物反应时间(分钟)；D所取菌液体积(L)。
iii.以丙酮酸钠制作标准曲线(见图5)。
实施例10 1升发酵罐中甲醇诱导重组菌株表达DAAO筛选出的重组菌株接种于3ml的YPD试管，30℃ 300rpm培养过夜。以0.2％-0.5％的接种量接种于50ml BMGY培养基(1％酵母膏，2％蛋白胨，100mMpH6.0磷酸钾，1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％甘油)，30℃ 300rpm培养至OD600＝1.6-1.8。作为种子液接入1升含甘油的基本盐培养液/微量元素(2ml/L)培养基(成份详见表1)的发酵罐中。溶氧度会在一定范围内进行波动，根据具体情况控制合适的溶氧度(％pO210-150)，在pH6.0，28-30℃的条件下进行发酵培养。待甘油耗尽，溶氧明显上升并停留在最高值附近。此时开始逐渐滴加甘油(50％ w/v)，并控制滴加速度(15ml/literhr)以保证适当的溶氧(％pO210-150)，使菌体生长旺盛生长。经过约5h后，OD600达到100-120，停止滴加甘油，待甘油耗尽，溶氧升高时开始以补料方式流加甲醇(3.5ml/liter hr)以诱导酵母重组菌株大量表达D-氨基酸氧化酶并同时监控溶氧度等参数变化。按时取样待测。放罐时生物量(湿重)达250g/L，DAAO活力最高可达23000U/L。(结果见图4)
表权利要求
1.一种高效表达D-氨基酸氧化酶的甲醇酵母工程菌株SIBAS0111，其特征在于该菌株的基因组DNA上整合了来源于三角酵母的D-氨基酸氧化酶基因，其保藏编号为CGMCC No.0649。
2.一种高效表达D-氨基酸氧化酶的甲醇酵母工程菌株SIBAS0111的构建方法，其特征在于构建该菌株的重组DNA的方法包括下列步骤一、以装有去除了内含子的三角酵母D-氨基酸氧化酶基因的质粒pA06为模板，根据D-氨基酸氧化酶基因结构设计5’端和3’端引物，并在引物上引入BamH I及EcoR I酶切位点。二、以质粒pA06为模板，通过PCR扩增法，借助T-载体及质粒pTRCHISA，构建甲醇酵母整合质粒pPIC3.5K-DAAO。三、将整合质粒pPIC3.5K-DAAO用Sal I限制性内切酶线性化，运用电穿孔转化法将D-氨基酸氧化酶基因整合到宿主甲醇酵母GS115细胞的染色体DNA上。四、整合的重组细胞用PCR法筛选出阳性重组菌株，用酶活力测定法筛选得到高产D-氨基酸氧化酶菌株。
3.一种高效表达D-氨基酸氧化酶的甲醇酵母工程菌株SIBAS0111的发酵方法，其特征在于该菌株的发酵以基本无机盐、微量元素为主体培养基，pH5.0-6.5，28-30℃并控制溶氧度的条件下进行发酵。经过甘油生长期、甘油流加期以及甲醇诱导期的发酵培养，D-氨基酸氧化酶在细胞内高效表达，酶活达到15,000-25,000U/L。
全文摘要
本发明公开了一种来源于高效表达D－氨基酸氧化酶的甲醇酵母基因工程菌株SIBAS0111,其D－氨基酸氧化酶基因来源于三角酵母Trigonopsis Vriabllis。本发明的特征在于通过重组表达质粒pPIC3.5K－DAAO的构建、转化以及筛选获得高产D－氨基酸氧化酶的重组基因工程菌株。经发酵表达,D－氨基酸氧化酶在发酵液中的表达水平可达23,000U/L。
文档编号C12N15/81GK1385521SQ01132380
公开日2002年12月18日 申请日期2001年11月30日 优先权日2001年11月30日
发明者袁中一, 于健, 李东阳, 杨晟 申请人:中国科学院上海生物化学研究所