专利名称：一种基因克隆的高效方法
技术领域：
本发明涉及的是生物克隆方法，特别是一种基因克隆的高效方法，适合于克隆基因组DNA和PCR扩增产物。
背景资料原核生物基因的克隆可以通过构建基因组文库方法来筛选目的基因，也可通过PCR扩增目的基因的方法来克隆。
目前最常用的基因组文库的构建方法是这样的，基因组DNA用Sau3A I部分酶切后，克隆到经BamH I酶切，去磷酸化的载体上，或基因组DNA用Sau3A I部分酶切，经半补平克隆到经Sal I(或Xho I)酶切，半补平的载体上。这两种方法均存在着不足，众所周知，载体去磷酸化反应难以控制，对转化效率影响很大，而载体和基因组半补平反应效率也不高，这都造成克隆效率低下的结果。
PCR产物的克隆目前常用的方法有限制性内切酶位点添加法、尿密啶DNA糖基化酶克隆法、不依赖连接反应的克隆法、T/A克隆法及平端克隆法。限制性内切酶位点添加法克隆PCR产物，需在PCR扩增后再增加几步处理过程，不仅花费时间，而且会损失DNA，降低克隆效率，而且基因内部存在的限制性酶切位点常常会妨碍这种方法的应用；不依赖连接反应的克隆方法引入非基因序列过多；而平端克隆效率很低；T/A克隆法是最流行的PCR产物克隆的方法，但使用T载体克隆，只能用缺乏3′～5′校正酶活性的DNA聚合酶(如Taq聚合酶)或这类酶与其他类聚合酶的混合物扩增目的基因，不适合于单一的具有3′～5′校正酶活性的DNA聚合酶扩增的PCR产物。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效基因克隆的方法，既可用来高效构建基因组文库，也适用于克隆任何一种DNA聚合酶扩增的PCR产物。
本发明是这样实现的，按克隆的要求选择载体和外源基因DNA片段。在载体上串联两个限制性内切酶的酶切位点(如Ear I或Sap I)，经Ear I(或Sap I)酶切或Ear I和Sap I双酶切产生5′端突出3个碱基的粘性末端5′CTCTTCC 3′3′GAGAAGGCTA5′；外源基因组DNA用合适的限制性内切酶，如Sau3A I(或Sau 3A I的同尾酶)酶切后，用Klenow酶补加一个碱基(dGTP)，形成能与载体粘性末端匹配的粘性末端5′NG3′NCTAG 5′；或者在克隆PCR产物时，扩增引物的两端分别引入额外的3～4个核苷酸如Sau3A I酶切位点，得到的产物在d GTP存在下，被T4DNA聚合酶削出5′端突出3个碱基的粘性末端5′GATC3′3′G 5′恰好与载体酶切形成的粘性末端匹配。
载体与上述方法修饰过的基因组DNA片段或PCR产物通过三个碱基的粘性末端互补而连接起来。
载体选用的限制性内切酶可以是Ear I和Sap I中的任一种，或者是这两种酶的组合，消化外源片段所选用的内切酶可以是Sau3A I，也可用其它Sau3A I的同尾酶。
本发明的原理是根据碱基互补配对的原则，使克隆载体与外源DNA片段产生能相互匹配的粘性末端，同时避免载体自连和外源片段串联，从而极大地提高克隆效率。
本发明不仅可用于基因组文库的构建，还可用于PCR产物的克隆，且适合各种DNA聚合酶扩增的PCR产物的克隆，克隆效率均优于现行的克隆方法。按本发明的方法克隆效率可达90％以上。
具体实施例方式
实施例1枯草芽孢杆菌外切菊粉酶基因的克隆首先通过定点诱变消除载体pUC18上的三个Ear I酶切位点，再接上一个含两个串联Ear I酶切位点的接头，构建好克隆载体，该克隆载体用Ear I酶切，回收大片段，片段两端均有一个5′端突出3个碱基的粘性末端。抽提枯草芽孢杆菌基因组DNA，用Sau3A I部分酶切并回收2～6kb片段，加dGTP，给Klenow酶作用后，片段两端均产生一个5′端突出3个碱基的粘性末端，然后该片段与酶切后回收的克隆载体连接，再转化大肠杆菌DH5α，通过特异性选择平板筛选到含目的基因的克隆，克隆重组效率达90％以上。
实施例2短小芽孢杆菌内切-β-1，4-葡聚糖酶基因的克隆首先定点诱变消除pUC18上的一个Sap I位点，接上一个含两个串联Sap I酶切位点的接头，构建好克隆载体，用Sap I酶切该克隆载体，回收大片段，片段两端均有一个5′端突出3个碱基的粘性末端。根据已发表的内切-β-1，4-葡聚糖酶的基因序列设计引物，并在5′端引入四个核苷酸5′GATC 3′，扩增产物加dGTP和T4DNA聚合酶作用后，产生5′端突出3个碱基的粘性末端，然后将该PCR产物与酶切后的克隆载体连接，再转化大肠杆菌DH5α，通过特异性选择平板筛选到含目的基因的克隆。
权利要求
1.一种基因克隆的高效方法，按克隆的要求选择载体和外源基因DNA片段，其特征在于在载体上串联两个限制性内切酶的酶切位点，酶切产生5′端突出3个碱基的粘性末端；外源基因组DNA用合适的限制性内切酶酶切后，经Klenow酶补加一个碱基(dGTP)，形成能与载体粘性末端匹配的粘性末端，或者在克隆PCR产物时，扩增引物的两端分别引入额外的3～4个核苷酸得到的产物在dGTP存在下，被T4DNA聚合酶削出5′端突出3个碱基的粘性末端，恰好与载体酶切形成的粘性末端匹配，载体与基因组DNA片段或PCR产物通过三个碱基的粘性末端互补而连接起来，因而外源DNA片段能克隆到载体上。
2.根据权利要求1所述的基因克隆的高效方法，载体选用的限制性内切酶可以是Ear I和Sap I中的任一种，或者是这两种酶的组合，消化外源片段所选用的内切酶可以是Sau3A I，也可用其它Sau3A I的同尾酶。
3.根据权利要求1或2所述的克隆方法，其特征在于该方法既可用于构建基因组文库，也可用于克隆用各种DNA聚合酶扩增的PCR产物。
全文摘要
本发明提出一种用于克隆基因组DNA的高效方法。构建的克隆载体经特定的限制性内切酶酶切后,产生的粘性末端能与Sau3A I(或Sau3A I的同尾酶)部分酶切的基因组片段补加一个碱基dGTP后的粘性末端匹配,可有效地构建基因组文库,也能克隆PCR产物。该方法选用的限制性内切酶可以是EarI和SapI中的任一种。使用该载体克隆PCR产物时需在PCR引物的5′端额外引进Sau3A I酶切位点,在dGTP存在的条件下,利用T
文档编号C12P19/34GK1341750SQ0113351
公开日2002年3月27日 申请日期2001年9月30日 优先权日2001年9月30日
发明者马立新, 蒋思婧 申请人:湖北大学