专利名称：带有棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒基因和p10基因启动子序列的快速供体质粒及构建方法
技术领域：
本发明属于分子生物学和生物工程技术领域，具体涉及一种带有棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒基因和P10基因启动子序列的快速供体质粒，还涉及该质粒的构建方法。
背景技术：
杆状病毒广泛用于农林害虫的生物防治。同时杆状病毒-昆虫(细胞)系统还是十分优良的真核表达系统，已用于外源基因、诊断试剂和疫苗等的研究和生产。和其它杆状病毒一样，中国棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒(Helicoverpaarmigera single nucleocapsid nucleopolyhedrovims，以下简称野生型病毒或HaSNPV)作为杀虫剂由于存在杀虫速度慢的缺点，致使其大面积控制棉铃虫危害的作用受到限制；而不断提高病毒表达系统的表达量也一直是当今生物工程领域的研究热点。对杆状病毒分子生物学的研究，特别是对病毒基因的结构与功能的研究将有助于揭示病毒的复制和侵染规律，为重组病毒杀虫剂和快速、高效表达载体的开发和应用奠定基础。
自1983年Smith和Summers首次报道利用苜蓿银纹夜蛾多粒包埋核型多角体病毒在Sf9细胞中表达人-β干扰素基因，杆状病毒表达载体因其能在昆虫细胞和昆虫幼虫中高效表达外源基因，且在大多数请况下杆状病毒表达系统具有加工和修饰表达产物的能力，如信号肽的切割、糖基化和磷酸化作用以及大多数表达产物具有很高的生物活性等优点，使其成为十分重要的真核表达系统。目前应用杆状病毒表达系统已表达了几百种不同来源的外源基因。
传统的重组杆状病毒构建需要按以下两步进行首先必须将外源基因克隆到转移载体质粒的多克隆位点上，通常多克隆位点位于杆状病毒的强启动子控制下。将转移载体同杆状病毒DNA共转染到昆虫细胞内，经同源重组产生重组病毒，重组率通常在0.1-1％之间。其次需用空斑法鉴定和纯化重组病毒。由于重组病毒的产生率低以及空斑纯化法操作复杂、耗时，往往需数月甚至更长的时间构建一个完整的重组病毒。鉴于杆状病毒表达系统存在上述两个缺陷，Kuckow发明了一种快速、有效构建重组杆状病毒的方法，即杆状病毒穿梭表达载体系统，能在7天内完成重组病毒的构建和外源基因的高效表达。该系统由穿梭表达载体(Bacmid)和快速供体质粒(pFastBacTM)两部分组成。穿梭表达载体(Bacmid)含有一个低拷贝数的细菌DNA复制子(mini-F replicon)、一个卡那霉素抗性基因和一个半乳糖苷酶基因(lacZα)的8.5kb的DNA片段，同时一个作为细菌转位子插入位点(mini-attTn7)的短片段插入到lacZα基因N-末端，该片段的插入并不改变lacZα基因的阅读框。该穿梭表达载体(Bacmid)既能在E.coli内复制又可在昆虫细胞内复制形成完整的病毒粒子。快速供体质粒(pFastBacTM)则是由一个mini-Tn7转位因子组成，在mini-Tn7左右臂之间插入一个庆大霉素抗性基因、一个杆状病毒特异强启动子、一个多克隆位点和猴多泡病毒40多聚A(SV40(A)poly)信号序列组成的表达框。在辅助质粒提供的转位酶的作用下，克隆于快速供体质粒(pFastBacTM)多克隆位点的外源基因能转位至穿梭表达载体(Bacmid)的mini-attTn7位点上，通过抗生素抗性筛选和蓝白斑筛选鉴定重组穿梭表达载体(Bacmid)，随后从E.coli内提取穿梭表达载体DNA转染到昆虫细胞内进行外源基因的表达。该方法具有重组率高、重组病毒筛选方便等优点。但该穿梭表达载体为一个缺失多角体基因的不完整病毒，因而仅能在细胞内产生病毒，不易判定细胞是否被重组病毒感染。另外，由于缺失多角体基因，重组病毒不能感染昆虫，就是说不能在昆虫体内表达外源基因。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种带有棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒基因和P10基因启动子序列的快速供体质粒，将外源基因快速插入HZ8表达载体上，快速获得重组病毒，并在细胞内表达外源基因，同时在P10强启动子的调控下，高效表达外源基因，快速鉴定重组病毒。
本发明的另一个目的是提供该供体质粒的构建方法。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案构建了带有棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒基因和P10基因启动子序列的快速供体质粒pFastPhP10，CCTCC M201047。带有棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒基因和P10基因启动子序列的快速供体质粒(pFastPhP10)转化到Eschrichia Coli DH5α株内，-80℃保藏。在带有苜蓿银纹夜蛾多粒包埋核型多角体病毒多角体基因启动子序列和P10基因启动子序列的双向供体质粒(pFastBacdual)的基础上成功构建了带有棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒基因和P10基因启动子序列的快速供体质粒(pFastPhP10)，并将绿色荧光蛋白(eGFP)基因插入到P10启动子控制下的多克隆位点，经在DH10B受体菌中转位后，将插入有多角体基因和绿色荧光蛋白基因的重组穿梭表达载体(HZ8Ph+eGFP)DNA转染到棉铃虫细胞内进行表达，至此已成功构建一套完善的棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒穿梭表达载体的表达系统。HZ8是利用同源重组的方法将一个含有低拷贝数的细菌DNA F复制因子(mini-F replicon)、一个卡那霉素抗性基因和一个lacZα基因、一个作为细菌转位子插入位点(mini-attTn7)的短片段同时插入到lacZα基因N-末端的8.5kb的DNA片段置换到病毒基因组的多角体基因位点上，因此，所构建的HZ8是缺少多角体基因的重组病毒，用这种重组病毒感染HzAm1细胞仅能产生细胞病变，但不能在细胞核内形成包涵体，在利用pFastPhP10供体质粒将外源基因转位到HZ8的转位子插入位点(mini-attTn7)后，其DNA转染HzAm1细胞后，能形成具有感染性的重组病毒粒子，并能在多角体启动子和P10启动子控制下表达外源基因。与苜蓿银纹夜蛾多粒包埋核型多角体病毒穿梭表达系统(AcBacmid)不同的是所构建的供体质粒(pFastPhP10)既有P10启动子控制下的多克隆位点又插入带有多角体启动子序列的完整的多角体基因。
其优点是当外源基因插入到P10控制下的多克隆位点后，经转位将外源基因和多角体基因同时插入到棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒全基因组穿梭表达载体(HaBcmid)中的转位子插入位点，转染到棉铃虫细胞(HzAm1)后，能在光学显微镜下观察细胞内是否形成包涵体，如细胞内形成包涵体，证明转染获得成功，随后可收集重组病毒粒子再感染细胞，并可进行外源基因表达水平的检测。因此多角体基因的表达和包涵体的形成可作为转染成功的重要识别标记。另外，由于重新将多角体基因插入到病毒基因组，所产生的重组病毒是一个不缺失任何基因的重组病毒，因而该重组病毒不仅能在昆虫细胞内也可在昆虫幼虫体内表达外源基因。另一个重要优点是便于插入对昆虫有特异性毒杀作用的毒素基因，构建高效、快速的重组病毒杀虫剂。
图1为一种pFastPhP10供体质粒构建流程图；图2为一种pFastPhP10供体质粒的物理图谱；图3为一种pFastPhP10供体质粒的工作原理示意图。
具体实施例方式
下面结合附图对本发明作进一步详细描述根据图1、图2、图3可知，利用一对特异棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒(HaSNPV)的多角体基因的上下游引物，从HaSNPV的基因组中扩增出带有启动子序列的多角体基因。
引物序列Ph-1 CGGATCCCTTATACTTCTAAACTGTTCGTCGTCPh-2 CGTATACTTAATATGCAGGACCAGTGTATAG；利用一对特异棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒(HaSNPV)的P10启动子的上下游引物，从HaSNPV的基因组中扩增出HaP10启动子序列。
引物序列P10-1 AGATCTCGAAACCTGACACGAAACGP10-2 GGATCCCGTGATTATTTCGTCGTACAGTTGG；将两者分别克隆到pGEMT-ease载体上，得到pGEMTP10和pGEMTPh质粒；利用Pst I和Bgl II限制性内切酶切割pGEMTP10质粒，用0.7％琼脂糖凝胶电泳分离线性化的pGEMTP10质粒；利用Pst I和BamH I限制性内切酶切割pGEMTPh质粒，用0.7％琼脂糖凝胶电泳分离线性化的带有启动子的多角体基因；利用DNA连接酶将多角体基因连接到pGEMTP10质粒上，得到带有多角体基因和P10启动子的重组质粒，命名为pHZT PhP10质粒；用Nhe I和BamH I限制性内切酶切割pFastBacdual质粒，用0.7％琼脂糖凝胶电泳分离线性化的大pFastBacdual质粒片段；用Spe I和BamH I限制性内切酶切割pHZTPhP10质粒，用0.7％琼脂糖凝胶电泳分离含有多角体基因和P10启动子序列的片段；将含有多角体基因和P10启动子序列的片段连接到第7步制备的大pFastBacdual质粒片段上，构建成供体重组质粒，命名为pFastPhP10质粒。
权利要求
1.一种带有棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒基因和P10基因启动子序列的快速供体质粒，pFastPhP10，CCTCC M201047，在带有苜蓿银纹夜蛾多粒包埋核型多角体病毒多角体基因启动子序列和P10基因启动子序列的双向供体质粒上用棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒的多角体基因和P10基因的启动子序列取代苜蓿银纹夜蛾多粒包埋核型多角体病毒多角体基因启动子序列和P10基因启动子序列；载体组装于Tn7转座子的左右臂序列和带有自身启动子的棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒多角体基因和棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒的P10基因的强启动子序列和一个多克隆位点。
2.一种实现权利要求1所述的带有棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒基因和P10基因启动子序列的快速供体质粒的构建方法，包括下列步骤A、利用一对棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒的多角体基因的上下游引物，从HaSNPV的基因组中扩增出带有启动子序列的多角体基因；B、利用一对棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒的P10启动子的上下游引物，从HaSNPV的基因组中扩增出P10启动子序列；C、将两者分别克隆到pGEMT-ease载体上，得到pGEMTP10和pGEMTPh质粒；D、用Pst I和Bgl II限制性内切酶切割pGEMTP10质粒，用0.7％琼脂糖凝胶电泳分离线性化的pGEMTP10质粒；E、利用Pst I和BamH I限制性内切酶切割pGEMTPh质粒，用0.7％琼脂糖凝胶电泳分离线性化的带有启动子的多角体基因；F、利用DNA连接酶将多角体基因连接到pGEMTP10质粒上，得到带有多角体基因和P10启动子的重组质粒；G、用Nhe I和BamH I限制性内切酶切割pFastBacdual质粒，用0.7％琼脂糖凝胶电泳分离线性化的大pFastBacdual质粒片段；H、用Spe I和BamH I限制性内切酶切割pHZTPhP10质粒，用0.7％琼脂糖凝胶电泳分离含有多角体基因和P10启动子序列的片段；J、将含有多角体基因和P10启动子序列的片段连接到第G步制备的大pFastBacdual质粒片段上，构建成供体重组质粒。
3.根据权利要求2所述的带有棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒基因和P10基因启动子序列的快速供体质粒的构建方法，其特征在于棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒的多角体基因的上下游引物，引物序列引物序列Ph-1 CGGATCCCTTATACTTCTAAACTGTTCGTCGTCPh-2 CGTATACTTAATATGCAGGACCAGTGTATAG。
4.根据权利要求2所述的带有棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒基因和P10基因启动子序列的快速供体质粒的构建方法，其特征在于棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒的P10启动子的上下游引物，引物序列引物序列P10-1 AGATCTCGAAACCTGACACGAAACGP10-2 GGATCCCGTGATTATTTCGTCGTACAGTTGG。
全文摘要
本发明公开了一种带有棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒基因和P10基因启动子序列的快速供体质粒的构建方法，当外源基因插入到P10控制下的多克隆位点后，经转位将外源基因和多角体基因同时插入到棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒穿梭表达载体中的转位子插入位点，转染到棉铃虫细胞后，能在光学显微镜下观察细胞内是否形成包涵体，如细胞内形成包涵体，证明转染获得成功，随后收集重组病毒粒子再感染细胞，并可进行外源基因表达水平的检测。本发明将外源基因快速插入到HZ8表达载体上，仅需7－14天就能获得重组病毒并能在HzAml细胞内表达外源基因；在P10强启动子的调解下能高效表达外源基因；能通过多角体表型快速鉴定重组病毒。
文档编号C12N7/01GK1429903SQ0113837
公开日2003年7月16日 申请日期2001年12月31日 优先权日2001年12月31日
发明者王汉中, 陈新文, 胡志红 申请人:中国科学院武汉病毒研究所