专利名称：棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒穿梭表达载体及制备方法
技术领域：
本发明属于分子生物学和生物工程技术领域，特别是涉及一种棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒穿梭表达载体，还涉及该穿梭表达载体的制备方法。
背景技术：
杆状病毒广泛用于农林害虫的生物防治。同时杆状病毒-昆虫(细胞)系统还是十分优良的真核表达系统，已用于外源基因、诊断试剂和疫苗等的研究和生产。和其它杆状病毒一样，中国棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒(Helicoverpaarmigera single nucleocapsid nucleopolyhedrovirus，以下简称野生型病毒或HaSNPV)作为杀虫剂由于存在杀虫速度慢的缺点，致使其大面积控制棉铃虫危害的作用受到限制；而不断提高病毒表达系统的表达量也一直是当今生物工程领域的研究热点。对杆状病毒分子生物学的研究，特别是对病毒基因的结构与功能的研究将有助于揭示病毒的复制和侵染规律，为重组病毒杀虫剂和快速、高效表达载体的开发和应用奠定基础。
自1983年Smith和Summers首次报道利用AcMNPV在Sf9细胞中表达人-β干扰素，杆状病毒表达载体因其能在昆虫细胞和昆虫幼虫中高效表达外源基因，且在大多数情况下杆状病毒表达系统具有加工和修饰表达产物的能力，如信号肽的切割、糖基化和磷酸化作用以及大多数表达产物具有很高的生物活性等优点，使其成为十分重要的真核表达系统。目前应用杆状病毒表达系统已表达了几百种不同来源的外源基因。
传统的重组杆状病毒构建需要按以下两步进行首先必须将外源基因克隆到转移载体质粒的多克隆位点上，通常多克隆位点位于杆状病毒的强启动子控制下。将转移载体同杆状病毒DNA共转染到昆虫细胞内，经同源重组产生重组病毒，重组率通常在0.1-1％之间。其次需用空斑法鉴定和纯化重组病毒。由于重组病毒的产生率低以及空斑纯化法操作复杂、耗时，往往需数月甚至更长的时间构建一个完整的重组病毒。鉴于杆状病毒表达系统存在上述两个缺陷，Kuckow发明了一种快速、有效产生重组杆状病毒的方法，即Bac-to-Bac系统，能在7天内完成重组病毒的构建和外源基因的高效表达。该系统由Bacmid和pFastBacTM供体质粒M两部分组成。Bacmid含有一个低拷贝数的mini-F replicon、一个卡那霉素抗性基因和一个lacZα基因的8.5kb的DNA片段，一个作为细菌转位子插入位点(mini-attTn7)的短片段插入到lacZα基因N-末端，该片段的插入并不改变lacZα基因的阅读框。该Bacmid既能在E.coli内复制又可在昆虫细胞内复制形成完整的病毒粒子。pFastBacTM供体质粒则是由一个mini-Tn7转位因子组成，在mini-Tn7左右臂之间插入有一个庆大霉素抗性基因、一个杆状病毒特异强启动子、一个多克隆位点和SV40(A)poly信号序列组成的表达框。在辅助质粒提供的转位酶的作用下，克隆于pFastBacTM供体质粒多克隆位点的外源基因能转位至Bacmid的mini-attTn7位点上，通过抗生素抗性筛选和蓝白斑筛选鉴定重组Bacmid，随后从E.coli内提取BacmidDNA转染到昆虫细胞内进行外源基因的表达。该方法具有重组率高、重组病毒筛选方便等优点。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒全基因组穿梭表达载体，能将外源基因快速插入棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒全基因组穿梭表达载体(HZ8)上，仅需要7-15天可获得重组病毒，并在细胞内表达外源基因，同时在P10强启动子的调控下，高效表达外源基因，快速鉴定重组病毒。
本发明的另一个目的在于提供该多角体病毒穿梭表达载体的制备方法。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施将含有低拷贝数的mini-Freplicon、一个卡那霉素抗性基因和一个lacZα基因8.5kb的DNA片段插入到棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒基因组中的多角体基因内，构建了既能在E.coli内复制又可在昆虫细胞内复制形成完整的病毒粒子的棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒HZ8(Ha-Bacmid)，最近我们在pFastDual质粒的基础上成功构建了HapFastPhP10质粒，并将eGFP基因插入到P10启动子控制下的多克隆位点，经在DH10B受体菌中转位后，将重组HZ8Ph+eGFP质粒转染到HzAm1细胞内进行表达，至此我们已成功构建一套完善的HaBac to Bac表达系统。棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒全基因组穿梭表达载体HaBacmid，保藏号CCTCC M201048。棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒全基因组穿梭表达载体HZ8转化到Eschrichia Coli Dh10B株内-80℃保藏。棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒全基因组穿梭表达载体(HZ8Bac)的构建是利用同源重组的方法将一个含有低拷贝数的细菌DNA F复制因子(mini-F replicon)、一个卡那霉素抗性基因和一个lacZα基因、一个作为细菌转位子插入位点(mini-attTn7)的短片段插入到lacZα基因N-末端的8.5kb的DNA片段置换到病毒基因组的多角体基因位点上，因此，所构建的棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒全基因组穿梭表达载体(HZ8)是缺少多角体基因的重组病毒，用这种重组病毒感染棉铃虫细胞(HzAm1)仅能产生细胞病变，但不能在细胞核内形成包涵体，见图。在利用供体质粒(HapFastBac)将外源基因转位到棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒全基因组穿梭表达载体(HZ8)的转位子插入位点(mini-attTn7)，其DNA转染棉铃虫细胞(HzAm1)后，能形成具有感染性的重组病毒粒子，并能在多角体启动子和P10启动子控制下表达外源基因。与苜蓿银纹夜蛾多粒包埋核型多角体病毒穿梭表达系统(AcBacmid)不同的是所构建的供体质粒(pFastPhP10)既有P10启动子控制下的多克隆位点又插入带有多角体启动子序列的完整的多角体基因。
其优点是当外源基因插入到P10控制下的多克隆位点后，经转位将外源基因和多角体基因同时插入到棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒全基因组穿梭表达载体(HaBcmid)中的转位子插入位点，转染到棉铃虫细胞(HzAm1)后，能在光学显微镜下观察细胞内是否形成包涵体，如细胞内形成包涵体，证明转染获得成功，随后可收集重组病毒粒子再感染细胞并可进行外源基因表达水平的检测。因此多角体基因的表达和包涵体的形成可作为转染成功的重要识别标记。另外，由于重新将多角体基因插入到病毒基因组，所产生的重组病毒是一个不缺失任何基因的重组病毒，因而该重组病毒不仅能在昆虫细胞内也可在昆虫幼虫内表达外源基因。另一个重要优点是便于插入对昆虫有特异性毒杀作用的毒素基因，构建高效、快速的重组病毒杀虫剂。
图1为棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒穿梭质粒的构建示意图；经同源重组的方法将一个含有低拷贝数的细菌DNA复制子(mini-Freplicon)、一个卡那霉素抗性基因和一个lacZα基因、一个作为细菌转位子插入位点(mini-attTn7)的短片段插入到lacZα基因N-末端的8.5kb的DNA片段置换到棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒(HaSNPV)基因组的多角体基因位点上，构建能在昆虫细胞或昆虫体内复制又可在细菌内复制的棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒全基因组穿梭表达载体(HaBacmid)。
图2为外源基因在棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒穿梭表达系统的表达示意图；外源基因经供体质粒(HapFastPhP10)导入棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒全基因组穿梭表达载体(HaBacmid)内随后转染到棉铃虫细胞(HzAm1)内表达外源基因的流程图。
图3为棉铃虫单粒包埋核型多角体穿梭表达载体DNA转染棉铃虫细胞的病理切片示意图。
棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒全基因组穿梭表达载体(HaBacmid)感染棉铃虫细胞(HzAm1)的病理切片。
具体实施例方式
其步骤如下1、含有HZ8(HaBacmid)和辅助质粒的DH10B受体菌1的活化。将保存于-80℃ DH10B受体菌接种于含有卡那霉素(50μg/ml)和四环素(50μg/ml)的LB固体培养基上，37℃，培养12-16小时，挑选单菌落接种到3mL含有卡那霉素(50μg/ml)和四环素(50μg/ml)的LB液体培养基上，37℃培养24小时，按常规方法制备感受态受体菌。
2、含有HapFastPhP10质粒的DH5α菌的活化和HapFastPhP10质粒2的提取。将保存于-80℃ DH5α受体菌接种于含有庆大霉素(50μg/ml)的LB固体培养基上，37℃，培养12-16小时，挑选单菌落接种到3mL含有庆大霉素(50μg/ml)的LB液体培养基上，37℃培养16小时，按常规提取质粒的方法提取HapFastPhP10质粒。
3、将外源基因连接到HapFASTPhP10质粒3的多克隆位点中，随后将重组质粒转化到含有HZ8(HaBacmid)和辅助质粒的DH10B受体菌中4，将受体菌放在1毫升含有四环素、卡拉霉素、庆大霉素的LB液体培养基中37℃培养4小时后，取100微升菌体接种于含有上述三种抗生素的X-的固体平板培养基上，37℃培养24小时。挑选白色菌种接种于3毫升含有上述三种抗生素的LB液体培养基中37℃培养24小时。按常规方法提取插入有外源基因的质粒HZ8(HaBacmid)DNA。
4、按照常规的转染方法，利用脂质体将含有外源基因的质粒HZ8(HaBacmid)DNA转染到HzAm1细胞内28℃培养4-7天，在显微镜下观察细胞内是否有包涵体出现5。
5、利用常规方法检测外源基因的表达量6。
权利要求
1.一种棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒穿梭表达载体，HZ8，HaBacmid，CCTCC M 201048。
2.一种实现权利要求1所述的棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒穿梭表达载体的制备方法，包括下列步骤A、含有HaBacmid和辅助质粒的DH10B受体菌(1)的活化，将保存于-80℃DH10B受体菌接种于含有卡那霉素和四环素的LB固体培养基上，37℃培养12-16小时，挑选单菌落接种到3mL含有卡那霉素和四环素的LB液体培养基上，37℃培养24小时，按常规方法制备感受态受体菌；B、含有pFastPhP10质粒的DH5α菌的活化和pFastPhP10质粒(2)的提取，将保存于-80℃ DH5α受体菌接种于含有庆大霉素的LB固体培养基上，37培养12-16小时，挑选单菌落接种到3mL含有庆大霉素的LB液体培养基上，37℃培养16小时，按常规提取质粒的方法提取HapFastPhP10质粒；C、将外源基因连接到pFastPhP10质粒(3)的多克隆位点中，随后将重组质粒转化到含有HaBacmid和辅助质粒的DH10B受体菌中(4)，将受体菌放在含有四环素、卡拉霉素、庆大霉素的LB液体培养基中37℃培养4小时后，取100微升菌体接种于含有上述三种抗生素的X-的固体平板培养基上，37℃培养24小时。挑选白色菌种接种于含有上述三种抗生素的LB液体培养基中37℃培养24小时，按常规方法提取插入有外源基因的质粒HaBacmid DNA；D、照常规的转染方法，利用脂质体将含有外源基因的质粒HaBacmid DNA转染到HzAm1细胞内28℃培养4-7天，在显微镜下观察细胞内是否有包涵体出现(5)。E、利用常规方法检测外源基因的表达量(6)。
全文摘要
本发明公开了一种棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒穿梭表达载体及构建方法，将含有低拷贝数的细菌F复制子、卡那霉素抗性基因和β半乳糖苷酶基因、作为细菌转位子插入位点的短片段插入到lacZα基因N－末端的8.5kb的DNA片段置换到病毒基因组的多角体基因位点上，利用供体质粒将外源基因转位到棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒穿梭表达载体的转位子插入位点，其DNA转染棉铃虫细胞后，能形成具有感染性的重组病毒粒子，并能在多角体启动子和P10启动子控制下表达外源基因。本发明能将外源基因快速插入到HZ8表达载体上，获得重组病毒，能高效表达外源基因，能通过多角体表型快速鉴定重组病毒。
文档编号C12N7/01GK1429910SQ0113837
公开日2003年7月16日 申请日期2001年12月31日 优先权日2001年12月31日
发明者王汉中, 陈新文, 胡志红 申请人:中国科学院武汉病毒研究所