植物油菜素类固醇敏感性－相关基因及其用途的制作方法

专利名称：植物油菜素类固醇敏感性－相关基因及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种与植物油菜素类固醇敏感性有关的新基因，由该基因编码的蛋白质，及其生产和用途。
背景技术：
近年来，植物分子生物学研究取得显著进展，分析多种生理现象必需进行此类研究。人工修饰草的类型，尤其是控制伸长生长所导致的矮态可以防止植物因过多施肥导致的过度生长所致的倒伏。防止倒伏可在“绿色革命”时期的墨西哥小麦和国际水稻研究中心开发的超级水稻(IR-8)中得以证明。此外，当进行高密度栽培，如水稻栽培时，人们希望通过形成直立的叶以使每个植株所接受的阳光量增加，从而增加产量。另外，这些修饰是很重要的育种目标，因为它们可导致产量增加，还可增加植物生长维持的效率。然而，目前的育种方法不能人工修饰植物的形态学。
矮态是与控制正常伸长生长有关的基因突变所导致的异常生长。植物伸长生长是细胞分裂和细胞伸长累积的结果。细胞分裂和细胞伸长受多种因素所致的复杂效应的控制，所述因素如包括温度和光照的外源性环境因素，以及包括植物激素的内源性环境因素。因此，据推测很多基因与矮态有关，所述基因如与植物激素生物合成和激素受体直接相关的基因，以及与控制这些基因的表达相关的基因(Sakamoto et al.(2000)Kagaku to Seibutsu，38131-139)。
几乎所有的现代japonica水稻品种在营养阶段都能长出15-16个植物繁殖单位，所述单位由叶，腋生芽和短的或伸长的节间部组成。在幼苗分生组织由营养阶段进入繁殖期之后，繁殖分生组织长出约10个植物繁殖单位，所述单位由未发育的叶，伸长的节间部和发育成初生叶轴枝条的腋生芽组成。根据节间部的形态学，可将营养阶段形成的植物繁殖单位分成三类(Suetsugu，Isao.(1968)Japan.J.Crop Sci.37，489-498)。第一类植物繁殖单位在幼年期长成并形成未分化的节和节间部。在苗端分生组织(SAM)由幼年期进入成年期之后，第二类植物繁殖单位的节片分化，其节间部的中央部分腐烂，从而产生气隙。第三类植物繁殖单位由于自居间分生组织生长而含有长的伸长的节间部。
在营养发育阶段，首先产生1型植物繁殖单位，接着依次产生2型和3型植物繁殖单位。在正常生长条件下，很多japonica品种中每种类型植物繁殖单位的数目为4-5，6-7和4-5。从1型到2型的转变受严格调节。根据品种的不同，连续长出4-5个1型植物繁殖单位之后，SAM长出2型植物繁殖单位。然而，从2型到3型的转变并不取决于长出的2型植物繁殖单位的数目。SAM长出15-16个植物繁殖单位，并且从营养阶段进入繁殖期，然后3型植物繁殖单位开始长出，其最上方的4或5个节间部开始伸长。如果通过异常的生长条件来改变转变的时机，2型植物繁殖单位的数目总会受影响，但具有伸长的节间部的3型植物繁殖单位的数目不会改变(Suetsugu，isao.(1968)Japan.J.Crop Sci.37，489-498)。这表明在水稻中，SAM由营养阶段至繁殖期的转变会诱使节间部伸长，在拟南芥中也是如此。
然而，水稻和拟南芥之间有着重要的差别。水稻伸长的节间部源自营养阶段的SAM，而拟南芥伸长的节间部源自繁殖期的SAM。在水稻中，最上方的4或5个节间部由营养阶段的SAM发育而来，起初与较下方的2型节间部没有区别。当SAM进入繁殖期时，由于节间部长出居间分生组织而分化成3型节间部。这种SAM相变与长出居间分生组织之间的同步性导致以下可能性当SAM相变发生时，来自SAM的信号可将这些过程与最上方的4或5个植物繁殖单位相联系。
因其在农学上的重要性，已收集和鉴定了多种水稻矮小型突变体。根据其上部4至5个节间部的伸长模式，可将这些矮小型突变体分成6组(

图1；根据Takeda，K.(1974)Bull.Fac.Agr.Hirosaki Univ.22，19-30重新绘制。在水稻中，从上至下计数每个节间部以使紧靠圆锥花序下方的最上方的节间部为第一个节间部)。本发明人发现，在dn-型突变体中，每个节间部的长度几乎均一地降低，导致类似于野生型植物的伸长模式。与之形成对照的是，dm-型突变体显示出第二个节间部的特异性缩短。在sh-和d6-型突变体中也观察到类似的特定节间部的缩短，其中分别只有最上方的第一个节间部或最上方以下的节间部缩短。由于这些具有特异性缩短的节间部的突变体，如dm-，d6-和sh-型突变体可能在感知来自SAM的信号方面存在缺陷，它们应该对研究节间部伸长的机制及其与SAM中的变化的关系特别有用。
油菜素类固醇(BR)是植物生长和发育所需的，能促进植物生长的天然产物。仅有几篇论文报道了油菜素类固醇对水稻和其它禾本科植物生长和发育的生理学作用。生理学研究表明外源性油菜素类固醇单独，或与植物生长素联合可增强水稻叶片接合处的弯曲。因其对油菜素类固醇的高敏感性，叶片接合处已被用于油菜素类固醇的敏感性生物测定(Maeda，E.(1965)Physiol.Plant.18，813-827；Wada，K.et al.(1981)Plant and Cell Physiol.22，323-325；Takeno，K.and Pharis，R.P.(1982)Plant Cell Physiol.23，1275-1281)。用油菜素内酯或其衍生物castasterone处理黄化小麦幼苗能刺激叶片打开(Wada，K.etal.(1985)Agric.Biol.Chem.49，2249-2251)。用低或高浓度油菜素类固醇处理分别能促进或抑制水稻根的生长(Radi，S.H.and Maeda，E.(1988)J.Crop Sci.57，191-198)。油菜素类固醇也可以促进水稻种子的萌发(Yamaguchi，T.et al.(1987)Stimulation of germination in aged rice seeds by pre-treatment withbrassinolide.InProceeding of the fourteenth annual plant growth regulatorsociety of America Meeting Honolulu.(Cooke AR)，pp.26-27)。
尽管这些结果仅显示了外源性油菜素类固醇而非内源性油菜素类固醇的作用，但它们却暗示出内源性油菜素类固醇对禾本科植物的生长和发育过程具有重要作用。
另一方面，关于油菜素类固醇是否能诱使禾本科植物的细胞伸长，文献中也有一些明显不同的说法。即油菜素内酯处理不会诱使水稻叶鞘伸长(Yokota，T.and Takahashi，N.(1986)Chemistry，physiology and agriculturalapplication of brassinolide and related steroids.InPlant growth substances 1985.(Bopp M，Springer-Verlag，Berlin/Heidelberg/New York)pp.129-138)，但会诱使玉米胚芽鞘和中胚轴伸长(He，R.-Y.et al.(1991)Effects of brassinolide ongrowth and chilling resistance of maize seedlings.InBrassinosteroids-Chemistry，Bioactivity and Applications ACS symposium series 474.(Cutler HGC，Yokota T，Adam G，American Chemical Society，Washington DC)，pp.220-230)。
正如显示出具有异常器官发育的严重矮小型油菜素类固醇合成突变体或对油菜素类固醇不敏感的突变体所证实的那样，油菜素内酯在双子叶植物中的功能是已知的。
然而，对内源性油菜素类固醇在单子叶植物，如水稻或其它禾本科植物中的功能却知之甚少。

发明内容
本发明的目的是提供来自植物，优选来自单子叶植物的与油菜素类固醇敏感性有关的新基因。本发明的另一个目的是通过控制基因表达来修饰植物的油菜素类固醇敏感性。对植物油菜素类固醇敏感性的修饰导致植物形态学的改变。本发明的优选实施方案提供了具有直立叶的植物，由于该植物对油菜素类固醇敏感性降低，导致节间部伸长受到抑制，从而使所述植物变得矮小。
通过用诱变剂处理，本发明人分离出新的水稻矮小型突变品系d61(d61-1和d61-2)，与野生型植物相比，它们显示出较低的油菜素类固醇敏感性并具有较短的节间部。
连锁分析表明d61基因座和与拟南芥BRI1同源的基因区域紧密连锁。本发明人通过筛选水稻基因组DNA文库分离出与拟南芥BRI1基因同源的基因(OsBRI1)。对d61-1和d61-2突变体的OsBRI1基因的核苷酸序列分析表明在每个d61等位基因的不同位点，存在导致氨基酸取代的单个核苷酸取代。
此外，为了进一步证实OsBRI1基因对应于d61基因座，将OsBRI1基因导入d61突变体。结果，OsBRI1基因与d61表型互补，导致突变品系具有野生型表型。因此，可以证实缺失OsBRI1基因的功能可导致产生d61突变体。对植物的表型分析揭示出OsBRI1基因在水稻的多个生长和发育过程中发挥作用，所述过程包括由形成居间分生组织和诱使节间部细胞纵向伸长而导致的节间部伸长，叶片接合处的弯曲和黑暗中的暗形态发生。
此外，当产生具有OsBRI1反义核苷酸的转基因水稻植物时，大多数转基因植物在幼苗生长过程中产生直立的叶。所有转基因植物显示出不同水平的矮化表型。被具有显性失活表型的OSBRI1转化的植物显示出相同的结果。
鉴于上述发现提出本发明，本发明涉及一种与植物油菜素类固醇敏感性相关的新基因，由该基因编码的蛋白质，其生产和用途。另外，本发明涉及通过控制基因表达产生经修饰的植物。
更具体地，本发明提供了(1)DNA，其编码含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白质；
(2)(1)中的DNA，其中DNA是cDNA或基因组DNA；(3)(1)中的DNA，其中DNA含有SEQ ID NO1或3的核苷酸序列的编码区；(4)DNA，其编码与SEQ ID NO2的氨基酸序列具有55％或更高同源性，且与含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白质功能等同的蛋白质，所述DNA选自(a)DNA，其编码含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白质，其中所述蛋白质中的一个或多个氨基酸被取代，缺失，添加和/或插入；和(b)在严紧条件下与含有SEQ ID NO1或3的核苷酸序列的DNA杂交的DNA；(5)(4)中的DNA，其中DNA编码具有下述功能的蛋白质，所述功能选自增加植物中油菜素类固醇敏感性的功能，诱使植物茎的节间部细胞伸长的功能，将微管定位于与植物茎节间部伸长的方向垂直的功能，抑制植物颈部的节间部伸长的功能，和增加植物叶片弯曲度的功能；(6)(4)或(5)中的DNA，其中DNA得自单子叶植物；(7)(6)中的DNA，其中DNA得自禾本科植物；(8)DNA，其编码与(1)至(7)中任一项的DNA的转录物互补的反义RNA；(9)DNA，其编码具有核酶活性的RNA，所述核酶可特异性裂解(1)至(7)中任一项的DNA的转录物；(10)DNA，其编码当在植物细胞中表达时，因共-抑制而能阻抑(1)至(7)中任一项的DNA表达的RNA，所述DNA与(1)至(7)中任一项的DNA具有90％或更高的同源性；(11)DNA，其编码相对于(1)至(7)中任一项的DNA所编码的蛋白质而言具有显性失活表型的蛋白质；(12)含有(1)至(7)中任一项的DNA的载体；(13)转化细胞，其含有(1)至(7)中任一项的DNA或(12)中的载体；(14)由(1)至(7)中任一项的DNA编码的蛋白质；(15)生产(14)中的蛋白质的方法，所述方法包括培养(13)中的转化细胞，从转化细胞或其培养物上清液中回收表达的蛋白质的步骤；(16)含有(8)至(11)中任一项的DNA的载体；(17)转化的植物细胞，其含有(1)至(11)中任一项的DNA或(12)或(16)中的载体；(18)含有(17)中的转化植物细胞的转化植物；(19)转化植物，其为(18)中的转化植物的子代或克隆；(20)(18)或(19)中的转基因植物的繁殖材料；和(21)与(14)中的蛋白质结合的抗体。
本发明提供了编码水稻OsBRI1蛋白的DNA。OsBRI1 cDNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO1，由该DNA编码的蛋白质的氨基酸序列示于SEQ IDNO2，OsBRI1基因组DNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO3(SEQ ID NO3的基因组DNA由一个外显子组成，其中不含内含子)。
本发明的基因导致产生水稻矮小型突变体(d61)，与野生型相比，该突变体具有短的节间部和降低的油菜素类固醇敏感性。因此，可以通过控制OsBRI1基因的表达来修饰植物形态学。
本发明对植物形态学的优选修饰包括通过抑制本发明DNA的表达而使植物呈现矮态。植物的矮态在农业和园艺中具有重大价值。例如，降低植物的高度可以使植物倒伏的倾向性降低，从而可以增加种子的重量。另外，通过降低植物的高度并使每株植物的外形更加紧凑，可以使单位面积种植的植物个体数目增加。在生产诸如水稻，玉米，小麦之类的作物时，所述植物修饰的价值尤为突出。通过矮化植物的高度或茎的长度也可以生产具有新的美学价值的观赏植物。通过使其矮化还可以生产出具有新的商业价值的蔬菜或水果，例如“一口即可吃掉的”蔬菜或水果。除了对工业化植物有用以外，矮态对实验植物也很重要，因为矮小型植物不仅更易于管理，也有助于通过缩短栽培间距而更有效地利用实验场地。
可以考虑通过在植物中表达本发明的DNA来增加对油菜素类固醇敏感性低的植物中的油菜素类固醇敏感性。籍此，可通过培养较高的植物来增加整个植物的产量。因此，这对增加所有饲料作物的产量特别有用。
编码本发明的OsBRI1蛋白的DNA包括基因组DNA，cDNA和化学合成的DNA。可根据本领域技术人员已知的常规方法制备基因组DNA和cDNA。更具体地，可按照例如下述方法制备基因组DNA(1)从植物细胞或组织中提取基因组DNA；(2)构建基因组文库(利用载体，例如质粒，噬菌体，粘粒，BAC，PAC等)；(3)平铺文库；和(4)使用根据编码本发明蛋白质的DNA(例如SEQ ID NO1或3)制备的探针进行菌落杂交或噬斑杂交。或者，可以通过PCR制备基因组DNA，所述PCR使用了特异于编码本发明蛋白质的DNA(例如SEQ ID NO1或3)的引物。另一方面，例如，可以按照下述方法制备cDNA(1)根据提取自植物细胞或组织的mRNA合成cDNA；(2)通过将合成的cDNA插入载体，例如入ZAP来制备cDNA文库；(3)平铺cDNA文库；和(4)按上述进行菌落杂交或噬斑杂交。或者，也可以通过PCR制备cDNA。
本发明包括DNA，其编码功能等同于SEQ ID NO2的OsBRI1蛋白的蛋白质。在本文中，术语“功能等同于OsBRI1蛋白”指的是目的蛋白质具有与SEQ ID NO2的OsBRI1蛋白相同的功能，例如增加植物中油菜素类固醇敏感性的功能，诱使植物茎的节间部伸长的功能，将微管定位于与植物茎节间部细胞伸长的方向垂直的功能，抑制植物颈部的节间部伸长的功能，和/或增加植物叶片弯曲度的功能。所述DNA优选得自单子叶植物，更优选得自禾本科植物，最优选得自水稻。
所述DNA的例子包括编码含有SEQ ID NO2的氨基酸序列，但其中取代，缺失，添加和/或插入了一个或多个氨基酸的突变体，衍生物，等位基因，变体和同系物的DNA。
本领域技术人员众所周知的制备编码含有经改变之氨基酸的蛋白质的DNA的方法包括例如定点诱变(Kramer，W.and Fritz，H.-J.(1987)“Oligonucleotide-directed construction of mutagenesis via gapped duplexDNA.”Methods in Enzymology，154350-367)。实际上，核苷酸序列的突变也可造成蛋白质氨基酸序列的突变。本发明的DNA也包括下述DNA，其编码具有天然OsBRI1蛋白(SEQ ID NO2)的氨基酸序列，但其中的一个或多个氨基酸被取代，缺失，和/或添加的蛋白质，只要它们编码功能等同于天然OsBRI1蛋白的蛋白质即可。另外，本发明的DNA还包括不会导致蛋白质的氨基酸序列发生改变的核苷酸序列突变体(简并突变体)。目的DNA核苷酸突变的数目在氨基酸水平上一般相当于100或更少个残基，优选为50或更少个残基，更优选为20或更少个残基，更优选为10或更少个残基(例如5或更少个残基，或3或更少个残基)。
例如，通过对植物(其中DNA的表达被抑制)进行“叶片接合试验”，并将结果与野生型植物的相应结果进行比较，可以评价某种DNA能否实际编码具有增加植物叶片弯曲度之功能的蛋白质(参见实施例4)。试验结果也可以成为评价植物对油菜素类固醇的敏感性的指标。为了评价DNA能否编码具有诱使植物茎的节间部伸长之功能，将微管定位于与植物茎节间部细胞伸长的方向垂直之功能，或抑制植物颈部的节间部伸长之功能的蛋白质，可以观察DNA表达受抑制的植物节间部细胞的形态学，并与野生型的形态学进行比较(参见实施例2和3)。
可通过例如本领域技术人员众所周知的方法生产编码功能等同于SEQID NO2所述OsBRI1蛋白之蛋白质的DNA，所述方法包括使用杂交技术的方法(Southern，E.M.(1975)Journal of Molecular Biology，98，503)；和聚合酶链反应(PCR)技术(Saiki，R.K.et al.(1985)Science，230，1350-1354；Saiki，R.K.et al.(1988)Science，239，487-491)。即使用OsBRI1基因(SEQ ID NO1或3)或其部分作为探针，与基因特异性杂交的寡核苷酸作为引物，从水稻和其它植物中分离出与OsBRI1基因具有高度同源性的DNA对本领域技术人员而言是常规技术。本发明的DNA包括这种编码功能等同于OsBRI1蛋白的蛋白质，可通过杂交技术或PCR技术得到的DNA。
优选在严紧条件下进行杂交反应以便分离这种DNA。本发明的严紧杂交条件包括如下条件6M尿素，0.4％SDS和0.5×SSC；以及能与所述条件产生类似严紧度的条件。当在具有较高严紧度，例如6M尿素，0.4％SDS和0.1×SSC的条件下进行杂交时，有望能有效分离到具有较高同源性的DNA。在这种条件下分离到的DNA有望能编码与OsBRI1蛋白(SEQ ID NO2)具有高度氨基酸水平同源性的蛋白质。在本文中，“高度同源性”指的是全长氨基酸之间的同一性至少为55％或更高，更优选为70％或更高，最优选为90％或更高(例如95％或更高)。
根据Karlin和Altschul所述的算法BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，905873-5877，1993)，可以测定一个氨基酸序列或核苷酸序列与另一个氨基酸序列或核苷酸序列之间的同源性程度。根据此算法开发出程序BLASTN和BLASTX(Altschul et al.J.Mol.Biol.215403-410，1990)。为了根据基于BLAST的BLASTN分析核苷酸序列，将参数设置为例如分值＝100和字长＝12。另一方面，用于根据基于BLAST的BLASTX分析氨基酸序列的参数包括例如分值＝50和字长＝3。当使用BLAST和带缺口的BLAST程序时，使用每个程序的缺省参数。所述分析所用的特定技术是本领域已知的(http//www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
本发明的DNA可被用于例如制备重组蛋白质，通过按上文所述控制其表达来生产具有经改变之表型的转化植物等。
通常可通过将编码本发明蛋白质的DNA插入适当表达载体，将所述载体导入适当的细胞，培养经转化的细胞，纯化表达的蛋白质来制备重组蛋白质。可将重组蛋白质表达成与其它蛋白质的融合蛋白以易于纯化，例如，表达成与大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(New England Biolabs，USA，载体pMAL系列)的融合蛋白，与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)(Amersham Pharmacia Biotech，载体pGEX系列)的融合蛋白，或用组氨酸(Novagen，pET系列)标记。对宿主细胞没有限制，只要所述细胞适于表达重组蛋白质即可。除了上述大肠杆菌以外，还可以利用酵母或多种动物，植物或昆虫细胞。可通过本领域技术人员已知的多种方法将载体导入宿主细胞。例如，可以使用利用钙离子的转化方法(Mandel，M.and Higa，A.(1970)Journal of Molecular Biology，53，158-162；Hanahan，D.(1983)Journal of Molecular Biology，166，557-580)将载体导入大肠杆菌。可通过已知方法从宿主细胞或其培养物上清液中纯化和回收宿主细胞中表达的重组蛋白质。当将重组蛋白质表达成与麦芽糖结合蛋白或其它配对物的融合蛋白时，可通过亲和层析容易地纯化重组蛋白质。
可以使用所得的蛋白质制备与该蛋白质结合的抗体。例如，通过用本发明的纯化蛋白质或其部分免疫接种免疫动物，如兔，过一段时间之后收集血液并除去血块，即可制备出多克隆抗体。通过使骨髓瘤细胞与被上述蛋白质或其部分免疫之动物的抗体-形成细胞融合，分离表达所需抗体的单克隆细胞(杂交瘤)，并从细胞中回收抗体即可制备单克隆抗体。可以使用所得抗体纯化或检测本发明的蛋白质。因此，本发明包括与本发明的蛋白质结合的抗体。
为了生产出能表达本发明DNA的转化植物，将编码本发明蛋白质的DNA插入适当载体；然后将载体导入植物细胞；最后，再生所得的转化植物细胞。
另一方面，可使用阻抑编码本发明蛋白质的DNA表达的DNA产生本发明DNA的表达受到抑制的转化植物其中将DNA插入适当载体，将载体导入植物细胞，然后，再生所得的转化植物细胞。术语“阻抑编码本发明蛋白质的DNA表达”包括抑制基因转录以及抑制其翻译成蛋白质。不仅包括完全不能表达DNA，还包括表达量的降低。
通过利用反义技术的方法可以阻抑植物中特定内源性基因的表达，所述方法是本领域公知的。Ecker等通过使用瞬时基因表达法，首次在植物细胞中阐明通过电穿孔导入的反义RNA的反义效应(J.R.Ecker and R.W.Davis(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 835372)。随后，据报道通过表达反义RNA降低了烟草和矮牵牛花中的靶基因表达(A.R.van der Krol et al.(1988)Nature 333866)。目前，反义技术作为阻抑靶基因表达的一种手段已在植物中建立。
反义核酸阻抑靶基因表达需要多个因素。它们包括通过形成三链体抑制转录起始；通过在RNA聚合酶已形成局部开环结构的位点形成杂交体以抑制转录；通过与正被合成的RNA形成杂交体以抑制转录；通过在内含子与外显子之间的连接处形成杂交体以抑制剪接；通过在剪接体形成位点形成杂交体以抑制剪接；通过与mRNA形成杂交体以抑制mRNA从细胞核转座至细胞质；通过在加帽位点或poly A添加位点形成杂交体以抑制剪接；通过在翻译起始因子的结合位点形成杂交体以抑制翻译起始；通过在起始密码子附近的核糖体结合位点形成杂交体以抑制翻译；通过在已翻译的区域或mRNA的多核糖体结合位点形成杂交体以抑制肽链延伸；和通过在核酸与蛋白质之间相互作用的位点形成杂交体以抑制基因表达。这些因素通过抑制转录，剪接或翻译过程来阻抑靶基因表达(Hirashima and Inoue，“Shin SeikagakuJikken Koza(New Biochemistry Experimentation Lectures)2，Kakusan(NucleicAcids)IV，Idenshi No Fukusei To Hatsugen(Replication and Expression ofGenes)”，Nihon Seikagakukai Hen(The Japanese Biochemical Society)，TokyoKagaku Dozin，pp.319-347，(1993))。
本发明的反义序列可通过上述任一种机制阻抑靶基因表达。在一个实施方案中，如果将反义序列设计成与基因的mRNA的5’末端附近的非翻译区互补，即可有效抑制基因的翻译。也可以使用与编码区或3’方向的非翻译区互补的序列。因此，本发明中所用的反义DNA包括具有基因的非翻译区的反义序列和翻译区的反义序列的DNA。所用反义DNA被连接于适当启动子的下游，优选在3’方向连接含有转录终止信号的序列。通过已知方法将如此制备的DNA转染至所需植物。优选反义DNA的序列是与待转化的植物的内源性基因或其部分互补的序列，但不必精确互补，只要它能有效抑制基因表达即可。转录的RNA与转录的靶基因产物优选至少90％，最优选至少95％互补。使用上述检索可测定序列的互补性。
为了利用反义序列有效抑制靶基因的表达，反义DNA的长度应该至少为15个核苷酸，优选为至少100个核苷酸，更优选为至少500个核苷酸。所用反义DNA一般短于5kb，优选短于2.5kb。
也可以使用编码核酶的DNA阻抑内源性基因的表达。核酶是具有催化活性的RNA分子。有很多种具有多种活性的核酶。对于作为RNA裂解酶的核酶的研究使得人们能设计出位点-特异性裂解RNA的核酶。尽管一些I组内含子型核酶或RNaseP中包含的M1RNA由400或更多个核苷酸组成，其它属于锤头状或发夹状的核酶却具有约40个核苷酸的活性结构域(MakotoKoizumi and Eiko Ohtsuka，(1990)Tanpakushitsu Kakusan Kohso(Nucleic acid，Protein，and Enzyme)，352191)。
锤头状核酶的自-裂解结构域在序列G13U14C15的C15的3’方向进行裂解。据认为在U14和第九位的A之间形成核苷酸对对于核酶活性而言是至关重要的。另外，已证实当第15位的核苷酸是A或U而不是C时，也会发生裂解(M.Koizumi et al.，(1988)FEBS Lett.228225)。如果将核酶的底物结合位点设计成与相邻于靶位点的RNA序列互补，即可产生限制性酶-样的可裂解RNA的核酶，该核酶可识别靶RNA中的序列UC，UU或UA(M.Koizumi et al.，(1988)FEBS Lett.239285；Makoto Koizumi and Eiko Ohtsuka，(1990)Tanpakushitsu Kakusan Kohso(Protein，Nucleic acid，and Enzyme)，352191；M.Koizumi et al.，(1989)Nucleic Acids Res.177059)。例如，在OsBRI1基因的编码区(SEQ ID NO1或3)，有多个可用作核酶靶的位点。
发夹状核酶也可用于本发明。例如，在烟草环斑病毒卫星RNA的负链中可以发现发夹状核酶(J.M.Buzayan，Nature 323349(1986))。另外还证实了该核酶可靶-特异性地裂解RNA(Y.Kikuchi and N.Sasaki，(1992)NucleicAcids Res.196751；Yo Kikuchi，(1992)Kagaku To Seibutsu(Chemistry andBiology)30112)。
将经设计可裂解靶的核酶与启动子(如花椰菜花叶病毒35S启动子)和转录终止序列融合，使其能在植物细胞中被转录。然而，如果在被转录的RNA的5’末端或3’末端添加额外序列，核酶活性可能会丧失。在这种情况下，可以在核酶部分的5’或3’方向再放置一种顺式起作用以进行整理的整理核酶，以从含有核酶的经转录RNA上精确切下核酶部分(K.Taira et al.(1990)Protein Eng.3733；A.M.Dzaianott and J.J.Bujarski(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 864823；C.A.Grosshands and R.T.Cech(1991)Nucleic Acids Res.193875；K.Taira et al.(1991)Nucleic Acid Res.195125)。通过将这些结构单位串联排列以获得更大效果，可以裂解靶基因内的多个位点(N.Yuyama et al.(1992)Biochem.Biophys.Res.Commun.1861271)。通过使用这些核酶，可以特异性裂解本发明的靶基因的转录物，从而阻抑所述基因的表达。
通过用具有与靶基因序列相同或类似序列的DNA转化以进行共-抑制，也可以阻抑内源性基因的表达。“共-抑制”指的是当通过转化将具有与靶内源性基因序列相同或类似序列的基因导入植物时，导入的外源性基因和靶内源性基因的表达同时受抑制的现象。尽管仍不清楚共-抑制的详细机理，但在植物中经常能观察到共-抑制现象(Curr.Biol.(1996)7R793(1997)，Curr.Biol.6810)。例如，如果希望得到OsBRI1基因受到共-阻抑的植物体，可用经设计能表达OsBRI1基因的载体DNA或具有类似序列的DNA转化所述植物，以在所得的植物中选择出具有OsBRI1突变体特征的植物，例如，节间部伸长受抑制的植物。用于共-抑制的基因不必与靶基因完全相同，但应该具有至少70％或更高的序列同一性，优选80％或更高的序列同一性，更优选90％或更高(例如95％或更高)的序列同一性。通过上述检索可测定序列同一性。
另外，通过用具有靶基因显性失活表型的基因转化植物，也可以阻抑本发明的内源性基因表达。在本文中，“编码具有显性失活表型之蛋白质的DNA”指的是当DNA表达时，其所编码的蛋白质能消除或降低由植物固有的本发明内源性基因所编码蛋白质的活性的DNA。优选所述DNA是编码缺乏本发明蛋白质的N-末端区域但含有其激酶区域的肽(例如含有SEQ ID NO2的氨基酸的739至1035残基的肽，或等同于该肽的另一种蛋白质的肽)的DNA。可按上文所述，通过目的DNA是否能消除或削弱增强植物中的油菜素类固醇敏感性的功能，诱使植物茎的节间部伸长的功能，将微管定位于与植物茎节间部细胞伸长的方向垂直的功能，抑制植物颈部的节间部伸长的功能，和/或增加植物叶片弯曲度的功能，来测定目的DNA是否具有消除或增强本发明内源性基因之活性的功能。
对用于转化植物细胞的载体没有限制，只要该载体能在植物细胞中表达插入的基因即可。例如，可以使用含有能在植物细胞中组成型表达基因的启动子(例如花椰菜花叶病毒35S启动子)和可被外源性刺激物诱导的启动子。本文所用术语“植物细胞”包括多种形式的植物细胞，如经培养的细胞悬浮物，原生质体，叶片和愈伤组织。
可通过已知方法将载体导入植物细胞，所述方法如聚乙二醇法，电穿孔，农杆菌介导的转移和颗粒轰击。可根据植物细胞的类型，通过已知方法由转化的植物细胞再生植物(Toki et al.，(1995)Plant Physiol.1001503-1507)。例如，水稻植物的转化和再生方法包括(1)使用聚乙二醇将基因导入原生质体并再生植物体(适于indica水稻品种)(Datta，S.K.(1995)in“Gene Transfer ToPlants”，Potrykus I and Spangenberg Eds.，pp66-74)；(2)使用电脉冲将基因导入原生质体并再生植物体(适于japonica水稻品种)(Toki et al(1992)PlantPhysiol.100，1503-1507)；(3)通过颗粒轰击将基因直接导入细胞并再生植物体(Christou et al.(1991)Bio/Technology，9957-962)；(4)使用农杆菌导入基因并再生植物体等。这些方法已在本领域中建立，并广泛应用于本发明的技术领域。所述方法适用于本发明。
一旦获得已将本发明的DNA导入基因组的转化植物，即可通过有性或无性繁殖由上述植物体获得后代。或者，可由得自植物，及其后代或其克隆的繁殖材料(例如种子，果实，谷穗，块茎，小块茎，tubs，愈伤组织，原生质体等)大量产生植物。被本发明的DNA转化的植物细胞，包括这些细胞的植物体，植物的后代和克隆，以及得自植物，其后代和克隆的繁殖材料都包括在本发明中。
本发明的植物优选为单子叶植物，更优选为禾本科植物，最优选为水稻。本发明的植物的表型不同于野生型表型。在本发明产生的植物中，有所改变的表型包括植物的油菜素类固醇敏感性，植物生长(如植物茎节间部细胞的伸长和谷穗节间部的伸长)，叶的弯曲，和将微管定位于与植物茎节间部细胞伸长的方向垂直。
附图简述图1是野生型水稻和多种矮小型突变体和野生型水稻植物的节间部伸长模式的示意图。示意图中显示出每个节间部与茎相比较的相对长度。野生型以N表示。
图2是显示d61突变体表型的照片。
(A)总体形态学。(左边)野生型植物；(中间)d61-1突变体(弱等位基因)；(右边)d61-2突变体(强等位基因)。
(B)节间部的伸长模式。野生型植物(左边)显示出N-型伸长模式，而d61-1(中间)和d61-2(右边)突变体分别显示出典型的dn-和d6-型模式。
(C)圆锥花序结构。野生型植物(左边)具有短的圆锥花序，而d61-1(中间)和d61-2(右边)突变体具有较长的圆锥花序。
(D)d61直立的叶。野生型植物(左边)的叶在白色箭头所示的叶片接合处弯曲，而d61-1(中间)和d61-2(右边)突变体的叶更加直立。
(E)d61的叶鞘。d61-1(中间)和d61-2(右边)突变体的叶鞘短于野生型植物(左边)的叶鞘。
图3是显示野生型和d61-2水稻植物已完全长好的节间部之结构的显微照片，其中(A)野生型水稻第一节间部的纵向切片；(B)野生型水稻第二节间部的纵向切片；(C)野生型水稻第三节间部的纵向切片；(D)野生型水稻第四节间部的纵向切片；(E)d61-2水稻植物第一节间部的纵向切片；(F)d61-2水稻植物第二节间部的纵向切片；(G)d61-2水稻植物第三节间部的纵向切片；和(H)d61-2水稻植物第四节间部的纵向切片；标尺分别为100μm。
图4是显示野生型和d61-2植物第一节间部内伸长的细胞中的微管方向的照片和图，由野生型(A和C)和d61-2(B和D)植物第一节间部的节间薄壁组织细胞中微管排布的免疫荧光图像(A和B)或图示(C和D)组成。标尺为50μm。
图5是显示野生型，D61-1和d61-2幼苗对油菜素内酯的反应的照片。
在存在或缺乏1μM油菜素内酯(BL)时，在琼脂平板上萌发种子。萌发1天后观察幼苗。BL处理诱使野生型植物异常生长，而突变体幼苗不受其影响。
图6是显示油菜素内酯对野生型，D61-1和d61-2植物黄化叶片倾斜程度的影响的照片。
图中显示出野生型(A组)的叶反应最大，突变体植物d61-1(B组)和d61-2(C组)的叶反应减弱。
图7是显示野生型和d61-2水稻植物中油菜素类固醇及其生物合成前体的量的图。
图中显示出突变体(上图)和野生型(下图)植物中每种化合物的量(ng/g鲜重)。ND表示未检测。
图8是显示d61在黑暗中的去-黄化表型的照片。
(A)野生型左边在黑暗中生长2周的幼苗右边在光照下生长2周的幼苗野生型(A)和两种赤霉素缺陷型水稻突变体d18(D)和d35(E)在黑暗中显示出节间部伸长。
(B)d61-1突变体左边在黑暗中生长2周的幼苗右边在光照下生长2周的幼苗白色箭头表示在每组右边的黑暗条件下的节间部伸长。在光照条件下(每组的左边)未观察到伸长。
(C)d61-2突变体左边在黑暗中生长2周的幼苗右边在光照下生长2周的幼苗甚至在黑暗的条件下，在d61突变体，d61-1(B)和d61-2(C)中也未观察到节间部伸长。本发明人剥下在黑暗中生长的植物的叶鞘。
(D)d18突变体左边在黑暗中生长2周的幼苗右边在光照下生长2周的幼苗(E)d35突变体左边在黑暗中生长2周的幼苗右边在光照下生长2周的幼苗图9是显示d61基因座和OsBRI1之间强连锁的图和照片。
(A)是表示d61基因座在染色体1长臂上的作图位置的图。
(B)是显示检测d61基因座和OsBRI1之间的连锁的DNA杂交分析之结果的照片。当用EcoRI消化基因组DNA时，在Japonica亲本T65(泳道T，12.5kb)和Indica亲本Kasarath(泳道K，17.5kb)之间观察到OsBRI1的RFLP。具有正常表型的植物(WT)是杂合的(12.517.5kb)，或是Indica等位基因为纯合的(17.5kb)，而具有突变表型的植物(突变体)总是Japonica等位基因为纯合的(12.5kb)。
图10显示了OsBRI1和拟南芥BRI1推定氨基酸序列的比较。涂黑部分为相同的碱基。下划线区域*1，*2，*3和*4表示推定的信号肽，亮氨酸拉链基元，半胱氨酸对的N和C侧。
图11是图10的延续。
图12是显示OsBRI1在多个器官中的表达模式的照片。
将得自野生型植物多个器官的总RNA(10μg)上样于每个泳道。
OsBRI1的器官特异性表达(A)叶片(泳道1)，叶鞘(泳道2)，已长好的花(泳道3)，叶轴(泳道4)，苗端(泳道5)，根(泳道6)和种子(泳道7)。
OsBRI1在处于生长中的第一节间部中的区域特异性表达(B)处于生长中的节间部的节(泳道1)，分裂区带(泳道2)，伸长区带(泳道3)和已伸长的区带(泳道4)。
OsBRI1在每个正在伸长的节间部中的差异表达(C)分别为第一至第四节间部的，正处于每个节间部的活跃伸长期的分裂和伸长区带(泳道1-4)。OsBRI1在营养阶段未伸长的茎中也能高水平地表达(泳道5)。
OsBRI1依赖于光和依赖于油菜素内酯的表达(D)在存在(泳道2和4)或缺乏(泳道1和3)1μM油菜素内酯时，在琼脂平板上将水稻幼苗在光照下(泳道1和2)或黑暗中(泳道3和4)培养10天。
图13是显示表达OsBRI1反义链的转基因水稻植物之表型的照片。
(A)与野生型植物(左边)相比，具有中度(中间)和重度矮化表型(右边)的OsBRI1反义植物的矮化表型。
(B)具有重度矮化表型的转基因植物的近观图。标尺为5cm。
(C)转基因植物的裸秆节间部。从左至右分别显示了具有正常的节间部伸长模式的野生型植物和具有dm，dm-d6和d6表型的转基因植物。
(D)野生型(左边)和具有轻度矮化表型(右边)的转基因植物的叶形态学，后者显示出直立的叶。
(E)具有重度矮化表型的转基因植物的异常叶形态学，显示出缺乏长成的鞘器官。标尺为10cm。
(F)野生型(左边)和具有轻度(中间)和中度矮化表型(右边)的转基因植物的圆锥花序形态学。
图14是显示转基因植物表型的照片，所述植物表达显性失活的OsBRI1。图中显示了转基因植物(左边)和含有不含任何插入物之载体的对照植物(右边)。
实施本发明的最佳方式下文将参照实施例具体阐明本发明，但本发明并不局限于此。
将水稻(Oriza sativa)种子浸泡在蒸馏水中，于30℃让其吸收水份48小时。用蒸馏水将种子清洗几次，于30℃的暗室中将种子萌发8天。于30℃(白天)和24℃(夜晚)在大田或温室中培养水稻植物。
鉴定水稻d61矮小型突变体通过用N-甲基-N-亚硝基脲(NMU)处理，分别获得水稻矮小型突变体d61-1和d61-2(图2A)。
携有弱等位基因的d61突变体特异性地无法伸长第二节间部(dm-型)，而具有强等位基因的突变体不能伸长除最上方的节间部以外的所有节间部(d6-型)(Wu，X.et al.(1999)Bread.Sci.49，147-153)。
d61-2的秆比d61-1的要短得多。另外，d61-1显示出典型的dm-型节间部伸长模式，而d61-2显示出d6-型的节间部伸长模式(图2B)。因此，起初将它们鉴定为两种独立的突变体。然而，杂交试验表明它们是位于单个基因座上的等位基因。这是第一例显示出不同的，特异性的节间部伸长抑制模式的单基因座水稻突变体。
多效作用以及特异性抑制节间部伸长的结果导致这些突变体具有其它异常的表型。例如，突变体的颈节间部长于野生型植物(图2C)。由于这些植物的颈节间部长度与秆的长度呈负相关，因此，野生型植物具有最长的秆和最短的颈节间部，d61-1突变体具有中等长度的秆和颈节间部，d61-2具有最短的秆和最长的颈节间部。
这些突变体的另一个异常表型是直立的叶(图2D)。在野生型植物中，叶片弯曲，偏离指向远轴方向的叶鞘垂直轴。正如图2D中的箭头所示，叶片弯曲，偏离特定器官即叶片接合处的叶鞘。当叶片和叶鞘完全伸长时，叶片接合处近轴方向的细胞开始伸长，导致叶片弯曲偏离叶鞘。然而，突变体的叶片并未明显弯曲偏离叶鞘。在d61-1突变体中，一些叶仍显示出轻微弯曲(图2D，中间)，但在d61-2突变体中，几乎所有的叶都完全直立(图2D，右边)。
也就是说，叶片的倾斜度与矮态的严重程度相关。叶片严重倾斜的持续性表明叶片近轴方向的表面细胞纵向伸长，导致叶片倾斜，持续地对油菜素类固醇信号作出反应。
没有或较少长出叶片接合处不是突变体的叶不弯曲的原因。实际上，甚至叶片接合处具有严重表型的d61-2突变体也能正常发育。与野生型植物相比，突变体显示出较短的叶鞘(图2E)。
观察节间部的细胞形态学节间部伸长是由居间分生组织中的细胞分裂和伸长区带中的细胞伸长引起的(Hoshikawa，K.(1989)Stem.InThe growing rice plant.(Nobunkyo)，pp.123-148)。因此，秆的矮化可能是其中一个或两个过程的缺陷引起的。为了区分这些可能性，本发明人在显微镜下观察了成年植物每个节间部的切片。
在FAA(福尔马林∶冰醋酸∶70％乙醇，1∶1∶18)中固定取自不同阶段的成长中的或已长好的秆，并在乙醇梯度系列中脱水。将样品包埋于于45℃聚合化的Technovit 7100树脂(Kurzer，德国)，切下3-5μm的切片，用ToluidineBlue染色并在光学显微镜下观察。
图3显示了野生型植物和d61-2突变体上面4个节间部的细胞形态学。在野生型植物中，所有节间部中的细胞纵向伸长，并以纵格排列较好地组织在一起(图3A，3B，3C和3D)。在突变体植物的第一节间部也观察到类似的纵向细胞排列，尽管细胞略短于野生型植物中的细胞(图3E)。在突变体未伸长的节间部，如第二和第三节间部中，细胞排列是紊乱的，没有明显的有组织的细胞纵列(图3F和3G)。节间部细胞排列紊乱表示未伸长的节间部中没有长出突变体的居间分生组织，所述分生组织一般能产生纵向排列的伸长细胞。在第四节间部中，存在有组织的细胞排列，但细胞要比野生型植物的短很多(与图3D和3H相比)。这表明这些节间部中确实长出了居间分生组织，但细胞不能伸长。
观察微管排列据详细描述，细胞伸长取决于微纤维的方向(Ledbetter，M.C.and Porter，K.R.(1963)J.Cell Biol.19，239-250；Green，P.B.(1962)Science.138，1404)。因此，本发明人通过免疫荧光显微术检查了野生型和d61-2突变体植物节间部细胞的微管排列情况。
对节间部薄壁组织中的微管进行免疫荧光染色。更具体地，于室温下，用含有3.7％(w/v)低聚甲醛的微管-稳定缓冲液(0.1M哌嗪-二乙醇磺酸，1mM MgCl2，5 mM乙二醇-双(3-氨基甲基醚-N，N，N’，N’-四乙酸，0.2％(v/v)Triton X-100，1％(w/v)甘油，pH6.9)将节间部薄壁组织预固定45分钟。用新刀片切割纵向切片，将切片收集于固定溶液中，在其中处理40分钟，用不含低聚甲醛的固定溶液清洗。然后于37℃将切片与已用含有0.1％(v/v)Triton X-100的磷酸缓冲盐水稀释500倍的兔抗α-微管蛋白单克隆抗体保温1小时。用不含抗血清的缓冲液将切片清洗3次，然后于4℃与已用含有0.1％(v/v)Triton X-100的磷酸缓冲盐水稀释50倍的，经荧光素-异硫氰酸盐-标记的小鼠抗-兔IgG抗体保温过夜。用相同的缓冲液清洗3次之后，将它们安放在抗衰减溶液(Fluoro Guard Antifade reagent，Bio-Rad)中，并在荧光显微镜下进行观察。
结果，在野生型植物中，正在伸长的节间部的细胞中的微管以与伸长方向呈直角的方式整齐排列(图4A)。然而，在d61-2突变体中，第一个正在伸长的节间部的细胞中的微管在每个细胞中以显然为随机的不同的方向排列(图4B)。另外，相对于野生型植物而言，突变体中的微管显得较细而且较不清楚。
另外，本发明人未能在突变体植物未伸长的节间部的细胞中观察到任何有组织的微管排列。
实施例2的结果总括起来可以说明突变体中未伸长的节间部不能长出居间分生组织，细胞中的微管不能有组织地排列。在突变体中的确实能够伸长(但比不上野生型植物)的节间部中，实际上长出了居间分生组织，但细胞中的微管不能较好地有组织地排列。
油菜素类固醇敏感性试验d61突变体的矮小表型和直立的叶暗示D61基因产物参与油菜素类固醇生物合成或信号转导的可能性。因此，本发明人进行了下列实验。
首先，本发明人尝试恢复d61突变体的矮态，但通过使用油菜素内酯无法达至到此目的。
接着，在含或不含1μM油菜素内酯的琼脂平板上萌发野生型和突变体植物的种子。在萌发1天后观察整个幼苗的特征。
结果表明当在含有油菜素内酯的平板上萌发野生型植物时，野生型植物的胚芽鞘异常伸长，导致外形扭曲，营养叶长势较差，不能突破胚芽鞘(图5)。另外，根的伸长受到抑制，因此根不直，但是以波浪形长出。野生型植物在缺乏油菜素内酯时能正常生长，胚芽鞘伸长终止于萌发早期，然后营养叶伸长以摆脱胚芽鞘的束缚。根正常生长，不具有任何波浪形(图5)。与野生型植物形成对照的是，在不含油菜素类固醇的平板上，甚至在存在油菜素类固醇的平板上，突变体仍能显示出与野生型植物一样好的正常生长模式。这些结果表明与野生型植物相比，突变体植物对油菜素内酯较不敏感。
本发明人使用更加量化的方法进一步检测了突变体对油菜素内酯的敏感性。
众所周知，水稻叶片和叶鞘之间的弯曲度对油菜素内酯或其相关化合物的浓度敏感。即使不知道内源性油菜素类固醇在包括水稻的单子叶植物中的生物学功能，水稻叶的这一不寻常特征仍可作为油菜素类固醇定量生物测定(已知为叶片接合处试验(Wada，K et al.(1981)Plant and Cell Physiol.22，323-325))的基础。如果突变体对油菜素类固醇较不敏感，突变体植物叶片和叶鞘之间的弯曲度将低于野生型植物叶片和叶鞘之间的弯曲度。
分别用10-3和10-3μg/ml油菜素类固醇检测野生型T65植物(突变体的背景品系)，d61-1突变体和d61-2突变体第一片叶的叶片接合。
结果，在缺乏外源性油菜素内酯时，野生型T65植物的叶片以几乎与叶鞘轴呈直角的方式弯曲，在存在增加浓度的油菜素内酯时，甚至变得更加弯曲(图6A)。当将突变体用于试验时，与野生型植物一样，油菜素内酯浓度较高时，弯曲程度增加。然而，在相同条件下，突变体叶弯曲的绝对程度要比野生型植物的低很多(图6B和C)。这一点在d61-2突变体中特别明显，其中对照叶几乎是直的，用10-2μg/ml油菜素内酯处理过的叶以与叶鞘轴呈小于直角的角度弯曲。叶片接合处试验的结果进一步证实突变体对油菜素类固醇的敏感性比野生型植物的要低。
定量分析d61-2突变体中的油菜素类固醇实施例4阐明了突变体对油菜素类固醇的敏感性降低。即突变体可合成较高浓度的油菜素类固醇以补偿所述降低。因此，本发明人使用具有内部标准的GC-SIM测定了d61-2突变体和野生型植物中的油菜素类固醇浓度。
在16小时白天和8小时夜晚的温室中培养野生型和d61-2植物。收集2月龄植物的枝条，立即冻干。用250ml MeOH-CHCl3(4∶1[v/v])将冻干的枝条(相当于50g鲜重)提取2次，在其中加入经deuterium-标记的内部标准(1ng/g鲜重)。真空蒸发溶剂之后，将提取物分配于CHCl3和H2O之间。对能溶解于CHCl3的级分进行硅胶层析(Wako-gel C-300；Wako；15g)。用各为150ml的含有2％甲醇的CHCl3和含有7％甲醇的CHCl3依次洗脱柱。通过Sephadex LH-20柱层析纯化每个级分，其中柱体积为200ml，用甲醇-CHCl3(4∶1[v/v])洗脱柱。收集洗脱自0.6至0.8(Ve/Vt)的级分，作为油菜素类固醇级分。在用MeOH洗脱的ODS柱体柱(10×50mm[内部直径x柱长])上预纯化之后，用65％乙腈作为溶剂，以8ml/min的流速对得自7％MeOH级分的洗脱物进行ODS-HPLC。在HPLC纯化中，将7％甲醇洗脱物拆分为castasterone(保留时间为10至15分钟)，香蒲甾醇(25至30分钟)，6-deoxocastasterone(40至45分钟)级分，2％甲醇洗脱物给出6-deoxotyphasterol级分(55至60分钟)。通过GC-SIM衍生化和分析每个级分。由内源性油菜素类固醇和内部标准中占优势的离子的峰面积比率计算出内源性油菜素类固醇水平。
结果，在突变体或野生型植物的枝条中未检测到油菜素类固醇，这表明油菜素内酯是总油菜素类固醇集合物的小组分。然而，除了在野生型植物中未发现teasterone外，在两种植物中检测到所有其它油菜素类固醇。在突变体植物中，所检测到的所有油菜素类固醇化合物的含量更高(图7)。特别是，突变体中的castasterone比野生型中的高4倍。这些结果支持以下假说，即突变体对油菜素类固醇无敏感性。
d61突变体的去-黄化表型据报道，当在黑暗中生长时，油菜素类固醇生物合成或油菜素类固醇信号传导有缺陷的拟南芥突变体在完全黑暗中胚轴的伸长减缓，并出现子叶和初生叶孔(Kauschmann，A et al.(1996)Plant J.9，701.703；Szekeres，M.et al.(1996)Cell.85，171-182)。
这种黑暗中的去-黄化(DET)或组成型光形态发生(COP)表型是拟南芥油菜素类固醇-相关突变体的共有特征。在番茄矮小型(d)突变体中也可观察到类似的DET或COP表型，所述突变体显示出短胚轴，缺乏顶端的钩和子叶展开(Bishop，G.J.et al.(1996)Plant Cell.8，959-969)。与之形成对照的是，豌豆油菜素类固醇-缺损突变体lkb未显示出这种DET表型(Nomura，T.et al.(1997)Plant Physiol.93，572-577)。在黑暗中培养突变体以测定是否也能在单子叶植物中发现这种DET或COP表型，以及d61水稻突变体是否显示出暗形态发生的特征。
结果，当在黑暗中萌发野生型植物时，与在光照中生长的幼苗相比，它们显示出不寻常的中胚轴和节间部伸长(图8A)。甚至在黑暗中，突变体中也不会出现这种中胚轴和节间部伸长(图8B和8C)。在黑暗中中胚轴和节间部不能伸长不是水稻矮小型突变体的共有特征。例如，当在黑暗中生长时，赤霉素生物合成有缺陷的两种其它矮小型突变体d18和d35显示出伸长的中胚轴和节间部(分别为图8D和8E)。
因此，可以想到中胚轴和节间部的伸长减缓是d61突变体的特殊特征，且d61突变体具有去-黄化表型。另外，还表明油菜素类固醇信号缺陷所致的去-黄化是双子叶和单子叶植物共有的特征。由此可以想到油菜素类固醇信号对于双子叶和单子叶植物的暗形态发生至关重要。
D61基因座的作图和连锁分析为了作图D61基因座，本发明人将d61-2突变体与Indica水稻品种Kasarath(Oriza sativa L.cv.Kasarath)杂交。突变体表型与水稻基因组计划(Tsukuba，日本)释放的限制性片段多态性(RFLP)标记之间的连锁分析揭示出D61基因座作图于染色体1的长臂上，与RFLP标记C1370紧密连锁(图9A)。
由于d61可被鉴定为对油菜素类固醇无敏感性或敏感性降低的突变体，本发明人还检测了突变体表型与同拟南芥BRI1基因同源的水稻基因之间的连锁。
拟南芥BRI1基因是唯一被分离的，参与油菜素类固醇信号转导的基因(Li，J.and Chory，J.(1997)Cell.90，929-938)。另外，本发明人进行了BLAST检索以鉴定一个水稻EST克隆S1676，该克隆与拟南芥BRI1基因具有高同源性(Li，J.and Chory，J.(1997)Cell.90，929-938)。
使用ISOPLANT DNA分离试剂盒(Nippon GENE Co.，日本)从叶组织中分离水稻基因组DNA。用适当的限制性酶消化1μg基因组DNA，并在碱性条件下转移至Hybond N膜(Amersham)。使用部分cDNA片段(对应于激酶结构域中Ser740至Asp1116的区域)探测膜，所述片段与编码OsBRI1的基因组DNA片段特异性杂交。除了在高严紧度(68℃)下与膜杂交之外，根据Church和Gilbert(1984)PNAS.81，1991-1995所述的方法进行所有步骤。
当用EcoRI消化基因组DNA并用cDNA克隆探测基因组DNA时，能观察到Japonica(12.5kb)和Indica(17.5kb)水稻之间的RFLP。所有具有突变体表型的F2植物的Japonica等位基因(12.5kb)为纯合，而具有野生型表型的F2植物或者是Indica等位基因(17.5kb)为纯合，或者为杂合，同时具有Japonica和Indica等位基因(12.5 17.5kb，图9B)。这一结果表明D61基因座与同拟南芥BRI1同源的水稻基因的位置紧密连锁。
鉴定d61基因上述连锁分析强烈暗示d61突变是由拟南芥BRI1基因的水稻同系物的功能丧失引起的。为了检测此可能性，本发明人用探针筛选水稻基因组DNA文库，并分离出全长水稻BRI1同源基因(OsBRI1，Oryza sativa BRI1)。除了在较高严紧度(68℃)下与膜杂交之外，根据Church和Gilbert(1984)所述的方法进行所述筛选中的杂交。根据与Church和Gilbert所述相同的方法进行测序。
就其全长而言，OsBRI1基因的结构与拟南芥BRI1基因十分相似(图10和图11)。推测的OsBRI1多肽含有几个也存在于BRI1中的结构域，有人曾讨论过它的功能(Li，J.and Chory，J.(1997)Cell.90，929-938)。这些结构域由推定的信号肽，两个被保守地隔开的半胱氨酸对，富含亮氨酸的重复结构域，跨膜结构域和激酶结构域组成。推测的OsBRI1多肽的N-末端具有疏水区段，据推测该区段可用作信号肽以将蛋白质转运至质膜。据Li和Chory推测，在BRI1蛋白中，信号肽之后有一个潜在的4-hepted两亲性亮氨酸拉链基元(Li，J.and Chory，J.(1997)Cell.90，929-938)，但OsBRI1在相应的区域不具有这种典型的亮氨酸拉链基元。
推定的胞外结构域(Met1至Leu670)的侧翼是多对被保守地隔开的半胱氨酸，所述胞外结构域由22个约24个氨基酸长的富含亮氨酸的重复序列(LRR)拷贝串联组成，具有12个潜在的N-糖基化位点(Asn-X-Ser/Thr)。LRR可能在蛋白质-蛋白质相互作用中发挥作用(Kobe，B.and Deisenhofer，J.(1994)Trends Biochem.Science.19，415-421)。
与BRI1序列相比，OsBRI1缺乏三个对应于拟南芥BRI1第三至第五重复序列的LRR结构域。除了在其它LRR蛋白之间发现的共有残基外，位于该缺失之前的两个LRR较不保守，但在LRR共有残基和非保守氨基酸中，两种蛋白质位于缺失之后的LRR的保守性较好。BRI1 LRR区域的不寻常特征是在第21和第22个LRR之间存在70个氨基酸长的岛(Li，J.and Chory，J.(1997)Cell.90，929-938)。OsBRI1中也存在非常相似的特征，在对应于BRI1中的岛的位点，在第18和第19个LRR之间存在相同数目的氨基酸。LRR区域不寻常的氨基酸岛对其功能一定是至关重要的，因为该岛中氨基酸残基的交换导致BRI1功能的丧失(Li，J.and Chory，J.(1997)Cell.90，929-938)。据认为该基元对于与油菜素类固醇的直接相互作用或维持油菜素类固醇-结合结构域的结构至关重要(Li，J.and Chory，J.(1997)Cell.90，929-938)。
OsBRI1的蛋白质激酶结构域具有真核蛋白质激酶的所有11个保守的亚结构域，在其适当的位置保留了未变异的氨基酸残基(Hanks，S.K.and Quinn，A.M.(1991)Meth.Enzymol.200，38-62)。OsBRI1的蛋白质激酶结构域在整个区域内与BRI1的相应结构域高度相关(44％)。它也和高等植物中的其它受体-样蛋白质激酶的激酶结构域相关，所述蛋白质激酶如得自拟南芥的ERECTA(Torii，K.U.et al.(1996)Plant Cell.8，735-746)，CLV1(Clark，S.E.etal.(1997)Cell.3，575-585)和RLK5(Walker，J.C.(1993)Plant J.3，451-456)，和得自水稻的Xa21(Song et al.，1995)。OsBRI1和这些受体-样蛋白质激酶，尤其是Vib和VIII中的高度保守的结构暗示OsBRI1是丝氨酸/苏氨酸激酶，而不是酪氨酸激酶(Hanks，S.K.and Quinn，A.M.(1991)Meth.Enzymol.200，38-62)。
在d61-1和d61-2突变体中筛选OsBRI1基因本发明人还测定了d61-1和d61-2突变体中OsBRI1基因的完整序列，并将它们与野生型的相应序列进行比较。本发明人在不同的位点鉴定出每个突变体等位基因中的单个核苷酸取代(表1)。d61-1中的基因组突变导致在OsBRI1和BRI1之间保守的激酶结构域的亚结构域IX中的残基989由苏氨酸转变为异亮氨酸。d61-2中的基因组突变使得刚好位于不寻常的70个氨基酸长的间断区域之前的第17个LRR中的残基491由缬氨酸转变为甲硫氨酸。d61突变体OsBRI1基因中的这些突变为OsBRI1编码D61基因座提供了强有力的证据。
表1等位基因 编码序列突变位置的特征d61-1 C→TThr→Ile(989)d61-2 G→AVal→Met(491)[实施例10]通过导入OsBRI1基因对d61突变体进行分子互补分析为了进一步证实OsBRI1对应于d61基因座，本发明人通过导入野生型OsBRI1基因对d61-1突变体进行互补分析。
更具体地，为了进一步证实导入包括其5’和3’侧翼区的基因组OsBRI1克隆所致的d61表型互补性，将包括完整编码区的10.5-kb限制性片断克隆至潮霉素抗性双元载体pBI101-Hm3(Sato，Y.et al.(1999)EMBO J.18，992-1002)的XbaI-SmaI位点。将pBI-cont用作对照载体。本发明人进行了水稻组织培养和根瘤农杆菌介导的转化。
用不含水稻基因组DNA的对照载体转化d61对秆长或叶的结构没有明显效果。然而，当导入含有完整野生型OsBRI1基因的10.5kb DNA片断时，几乎在所有对潮霉素具有抗性的植物中都能发现正常表型。这一结果进一步证实了d61突变体表型是由OsBRI1基因的功能丧失突变引起的。
OsBRI1的RNA杂交分析关于内源性油菜素类固醇在单子叶植物中的功能一无所知。因此，本发明人通过RNA杂交分析在多个水稻器官中检测了OsBRI1基因的表达模式。
按文献所述，从多个水稻组织中分离RNA(Chomczynski，P.and Sacchi，N.Anal.Biochem.(1987)162156)。在1％琼脂糖凝胶中电泳10μg总RNA，然后转移至Hybond N膜(Amersham)，通过RNA凝胶印迹杂交进行分析。本发明人将部分cDNA片断(对应于激酶结构域的Ser740至Asp1116)用作探针，该探针能与编码OsBRI1的基因组DNA片断特异性杂交。使用相同的探针和如上文所述的杂交条件进行DNA杂交分析。
结果，在得自营养苗端的RNA中检测到单条强-杂交带(图12A)。带的大小约为3.5kb，几乎与最长的cDNA克隆大小相同。在得自花，叶轴，根和展开的叶鞘的RNA中也观察到相同大小的较弱的杂交带，而在得自展开的叶片的RNA中观察不到或只能观察到很弱的带。因此，器官不同，OsBRI1的表达也明显不同，这表明这些器官中的油菜素类固醇敏感性也有所不同。
本发明人还检查了OsBRI1在正在伸长的秆中的表达(图12B)。正在伸长的秆被分成四部分节和节间部的分裂，伸长和已伸长的区带。结果，在得自分裂区带的RNA中发现最强的杂交带。得自伸长区带的RNA也给出强信号。得自节的RNA仅给出弱信号，而得自已伸长的节间部的RNA未给出任何信号。这些结果表明正在伸长的秆的各部分对油菜素类固醇的敏感性也各不相同，最敏感的部分是细胞正在活跃分裂和伸长的分裂区带和伸长区带。
本发明人进一步检查了OsBRI1在上面四个处于活跃伸长期的节间部的伸长区带中的表达。在得自最上方(第一)和最下方(第四)节间部的伸长区带的RNA中发现强杂交带，而在第二和第三节间部发现相对较弱的带(图12C)。这一结果表明节间部对油菜素类固醇的敏感性各不相同，第二和第三节间部最不敏感。
据观察节间部对油菜素类固醇的敏感性各不相同。这暗示着如果OsBRI1的量是油菜素类固醇信号转导中的限制因素的话，那么与第二和第三节间部相比，第一和第四节间部对油菜素类固醇的敏感性较高。这一想法得到具有中度dm-d6型表型的突变体等位基因的支持。这些植物显示出第二和第三节间部的特异性缩短，而第一和第四节间部却有所伸长。这与以下事实是一致的，即第二和第三节间部具有较低的OsBRI1表达水平，对油菜素类固醇的敏感性较低，从而不能对油菜素类固醇信号作出反应并伸长。假定第一和第四节间部中较高的OsBRI1表达水平使得这些节间部对油菜素类固醇信号作出反应并伸长。第一和第四节间部中较高的OsBRI1表达水平能解释dm-d6型不寻常的节间部伸长模式，但无法解释d6或dm型的出现。除了第一节间部外所有节间部皆缩短的d6型可以说明与第四节间部相比，第一节间部暴露于较高水平的油菜素类固醇中。第一节间部伸长时机的选择与花中花药的发育相对应，在很多植物的这些器官中已观察到高水平的油菜素类固醇(Grove，M.et al.(1979)Nature，281，216-217；Plattner，D.et al.(1986)J.Natural Products.49，540-545；Ikekawa，N.et al.(1988)Chem.Pharm.Bull.36，405-407；Takatuto，S.et al.(1989b)Agric.Biol.Chem.53，2177-2180；Suzuki，Y.et al.(1986)Agric.Biol.Chem.50，3133-3138；Gamoh，K.et al.(1990)Anal.Chim.Acta.228，101-105)。高水平的油菜素类固醇似乎从花药下移至较下方的器官，如第一节间部并诱使节间部伸长，第四节间部在花发育之前就已完成其伸长，在其活跃伸长时期不接受来自花的高水平油菜素类固醇信号。OsBRI1的油菜素类固醇水平和对油菜素类固醇的敏感性不能解释在dm-型突变体中观察到的第二节间部的特异性生长阻滞。因此，一些其它因素也必须参与。看上去第二节间部的伸长似乎受几个因素调节，因为存在几个具有dm表型的矮小型突变体，包括d1，d2，d11和d61。
最近，有人分离出D1基因，发现它编码与G蛋白的α亚单位(G-α)具有类似结构的蛋白质(Fujisawa，Y.et al.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.96，7575-7580；Ashikari，M.et al.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.96，10284-10289)。目前认为D1 G-α样蛋白参与赤霉素(GA)信号转导途径，因为d1突变体等位基因对活性GA的敏感性低或无敏感性。有趣的是油菜素类固醇信号-相关蛋白OsBRI1的功能丧失突变体和GA信号-相关蛋白Gα的功能丧失突变体显示出相同表型，即第二节间部的特异性生长阻滞。因此，在诱使第二节间部伸长时，第二节间部中可能存在油菜素类固醇和GA信号转导所共有的特定机制。
有趣的是，在节间部不伸长的营养阶段的茎中也发现了高水平的OsBRI1表达，这说明秆中高水平的OsBRI1表达不必与节间部伸长相一致。
外源性油菜素内酯和光照对OsBRI1 mRNA水平的影响本发明人还检测了外源加入的油菜素内酯和光照对OsBRI1 mRNA水平的影响。将萌发中的种子放在含或不含1μM油菜素内酯的0.9％琼脂平板上，在光照或黑暗中培养6天。
结果，在不含油菜素类固醇的平板上，黑暗中生长的幼苗中的OsBRI1表达水平高于光照下生长的幼苗(图12D)。
这表明与在光照下生长的植物相比，黑暗中生长的水稻幼苗对油菜素类固醇的敏感性较高(Worley，J.F.and Mitchell，J.W.(1971)J.Amer.Soc.Hort.Sci.96，270-273)。在黑暗中生长的植物对油菜素类固醇的高敏感性可归因于在光照下生长的植物的细胞对油菜素类固醇不反应的情况下节间部细胞的伸长。
此外，在含有油菜素类固醇的平板上，在光照下和黑暗中生长的水稻幼苗都具有降低水平的OsBRI1表达。
与水稻形成对照的是，拟南芥在黑暗和光照下生长的幼苗中的BRI1表达水平改变很小(Li，J.and Chory，J.(1997)Cell.90，929-938)。引起水稻OsBRI1和拟南芥BRI1之间表达模式差异的原因仍是未知的。然而，差异可能与光反应机制的差异有关，水稻是短日照植物，而拟南芥是长日照植物。
表达OsBRI1反义链的转基因植物的表型分析上述d61突变体的表型分析和每个突变体中OsBRI1基因的单个核苷酸改变暗示着它们可能不是无效等位基因，可能保留了一些部分功能。为了进一步研究油菜素类固醇在水稻中的功能，本发明人尝试通过在水稻Actin1基因启动子(Zang，W.et al.(1991)Plant Cell.3，1155-1165)的控制之下过量表达OsBRI1转录物的反义链，以产生具有更严重表型的其它突变体。
为了构建Actin1启动子∷反义OsBRI1，通过用Act1启动子(Zhang，W.etal.(1991)Plant Cell.3，1155-1165)取代潮霉素抗性双元载体pBI35Snos(Sato，Y.et al.(1999)EMBO J.18，992-1002)中的35S启动子，构建含有Act1启动子和NOS终止子的启动子-终止子盒(pBIActlnos)，其中所述载体的HindIII和XbaI位点之间含有35S启动子和NOS终止子。将编码完整OsBRI1编码区的cDNA克隆导入pBIActlnos的XbaI和SmaI位点之间。将不含插入物的载体pBI-cont用作对照载体。
为了降低OsBRI1表达，将OsBRI1-反义cDNA导入水稻品种Nipponbare。本发明人进行了水稻组织培养和根瘤农杆菌介导的转化。
几乎所有所得的转基因植物(90％或更多，20个中的18个)在幼苗生长早期都产生了直立的叶(图13D)。所有转化体(20个中的20个)都显示出不同程度的矮小表型(图13A)。在具有最弱表型的植物中，每个节间部的长度部分和均一地降低，导致伸长模式类似于野生型植物的伸长模式(图13C)(dn-型突变体)。具有中度表型的植物具有典型的dm-型(第二节间部特异性缩短，图13C)或d6-型(第二至第四节间部特异性缩短，图13C)突变体或混合dm-和d6-型表型(第二和第三节间部特异性缩短，图13C)的节间部伸长模式。具有严重表型的植物仅形成异常的叶，所述叶不具备已长好的鞘器官，节间部并不伸长(图13E)。甚至在培养1年或更长时间之后，这些类型的植物仍低于15-cm，而且不能产生种子(图13B)。其它表型可遗传至下一代，并与潮霉素抗性一起共分离。异常表型和潮霉素抗性之间的共分离，以及反义植物的中度表型与d61突变体的中度表型之间的相似性表明转基因植物中的反义链能够抑制OsBRI1的功能。
表达显性失活OsBRI1的转基因植物的表型产生含有OsBRI1基因的激酶区域的转基因水稻，以分析水稻油菜素类固醇受体的功能，所述基因处于水稻肌动蛋白1基因启动子(Zhang，W.et al.，(1991)Plant Cell，31155-1165)的控制之下。即按下述构建质粒，使得只有油菜素类固醇受体的羧基端激酶结构域可被表达，而从第一位的甲硫氨酸至第738位甘氨酸的氨基末端区域不能被表达。本发明人使用了一对引物，即5’-GGCTCTAGACAGCCATGGCGAGCAAGCGG CGGAGGCTG-3’/SEQ IDNO4(5’-引物其包括TCTAGA作为XhoI位点，添加CAGCC以增加翻译效率，以ATG作为起始密码子，一个额外的编码丙氨酸的GCG和编码第739位丝氨酸的AGC，后面紧接着编码野生型序列第740位残基之后的氨基酸，即赖氨酸，精氨酸，精氨酸和亮氨酸的其它核苷酸)和5’-AGATCTACTCCTATAGGTA-3’/SEQ ID NO5(3’-引物其包括AGATCT作为XbaI位点，其后为3’-非翻译区)。使用这两个引物扩增油菜素类固醇受体的激酶区域。然后用XbaI消化扩增的片段，插入pBI载体的XbaI-SmaI位点之间。将不含插入物的载体pBI-cont用作对照。
使用水稻品种Nipponbare产生表达激酶结构域以控制OsBRI1表达的转基因植物。进行水稻组织培养和根瘤农杆菌介导的转化。
结果，大多数转基因植物(90％或更多，25/27个)在幼苗生长早期形成了直立的叶(图14)。节间部之间的长度部分和等同缩短。通过与潮霉素抗性活性共-分离将表型遗传至后代。异常表型和潮霉素抗性之间的共-分离以及显性失活植物和d61突变体中度表型之间的相似性说明激酶部分的部分cDNA在转基因植物中具有活性，并且能抑制OsBRI1功能。
工业实用性本发明提供了具有增加水稻油菜素类固醇敏感性之功能的基因和蛋白质。该基因参与植物节间部细胞的伸长和叶的倾斜。因此，通过控制此基因可产生表型被修饰的植物。例如，通过抑制本发明基因的表达，可产生能抗倒伏并能在单位面积中种植更多个体的矮小型植物，这对生产作物产物效果显著。还可通过抑制本发明DNA的表达，使所述植物的高度或秆的长度矮化，产生具有新的美学价值的观赏植物。另一方面，通过在植物中导入并表达本发明的DNA，可以增加植物的油菜素类固醇敏感性，导致植物高度增加，整个植物的产量提高。这对增加动物饲料用植物的产量尤其有用。
序列表<110> 独立行政法人农业生物资源研究所(National Institute of AgrobiologicalSciences)<120> 植物油菜素类固醇敏感性-相关基因及其用途<130> MOA-A0001P<140><141><150> JP 2000-101276<151> 2000-03-31<160> 5<170> PatentIn Ver.2.1<210> 1<211> 3710<212> DNA<213> 稻(Oryza sativa)<220><221> CDS<222> (1)..(3363)<400> 1atg gat tcc ttg tgg gca gcg ata gcg gca ctg ttt gtg gcg gcg gcg 48Met Asp Ser Leu Trp Ala Ala Ile Ala Ala Leu Phe Val Ala Ala Ala1 5 10 15gtg gtg gtg agg ggg gcg gcg gcg gcc gac gac gcc cag ctg ctc gag 96Val Val Val Arg Gly Ala Ala Ala Ala Asp Asp Ala Gln Leu Leu Glu20 25 30gag ttc agg cag gcg gtg ccg aac cag gcg gcg ctc aag ggg tgg agc 144Glu Phe Arg Gln Ala Val Pro Asn Gln Ala Ala Leu Lys Gly Trp Ser35 40 45ggc ggc gac ggc gcg tgc agg ttc ccg ggg gcc ggg tgc cgg aac ggg 192Gly Gly Asp Gly Ala Cys Arg Phe Pro Gly Ala Gly Cys Arg Asn Gly50 55 60agg ctc acg tcg ctg tcg ctc gcc ggc gtg ccg ctc aat gcc gag ttc 240Arg Leu Thr Ser Leu Ser Leu Ala Gly Val Pro Leu Asn Ala Glu Phe65 70 75 80cgc gcc gtc gcg gcc acc ctg ctg cag 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ctctccggta caaatcttct tagcatcaac 3180ctggctgcat tcgagaagcc attgcagaat ctcaccctgg ctgatcttgt tgaggccaca 3240aatggcttcc acatcgcatg ccaaattggg tctggtgggt ttggtgatgt ctacaaggca 3300cagctcaagg atgggaaggt tgttgcaatc aagaagctaa tacatgtgag cgggcagggt 3360gaccgggagt tcactgcaga aatggagacc attggcaaga tcaaacaccg taaccttgtt 3420ccacttcttg gctattgcaa ggctggtgag gagcggttgt tggtgtatga ttacatgaag 3480tttggcagct tggaggatgt gttgcatgac cgcaaaaaga tcggtaaaaa gctgaattgg 3540gaggcaagac ggaaaatcgc tgttggagca gcaaggggtt tggcattcct ccaccacaat 3600tgcattcctc acatcattca ccgagacatg aagtcgagca atgtgcttat cgatgaacaa 3660ctggaagcaa gggtatctga tttcggtatg gcgaggctga tgagcgtggt ggatacacac 3720cttagcgtgt ccactcttgc tggaacgcca gggtatgtac caccggagta ctaccagagc 3780ttcagatgca ccaccaaggg tgatgtttat agctatggtg ttgtgttgct ggagctgctc 3840accgggaaac cgccgacgga ctcggcagac tttggcgagg acaataacct tgtggggtgg 3900gtcaagcagc acaccaaatt gaagatcacg gatgtcttcg accctgagct actcaaggag 3960gatccatccg tcgagcttga gctgctggag catttgaaaa 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权利要求
1.DNA，其编码含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白质。
2.权利要求1的DNA，其中所述DNA是cDNA或基因组DNA。
3.权利要求1的DNA，其中所述DNA含有SEQ ID NO1或3的核苷酸序列编码区。
4.DNA，其编码与SEQ ID NO2的氨基酸序列具有55％或更高同源性，且与含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白质功能等同的蛋白质，所述DNA选自(a)DNA，其编码含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白质，其中所述蛋白质中的一个或多个氨基酸被取代，缺失，添加和/或插入；和(b)在严紧条件下与含有SEQ ID NO1或3的核苷酸序列的DNA杂交的DNA。
5.权利要求4中的DNA，其中DNA编码具有下述功能的蛋白质，所述功能选自增加植物中油菜素类固醇敏感性的功能，诱使植物茎的节间部细胞伸长的功能，将微管定位于与植物茎节间部伸长的方向垂直的功能，抑制植物颈部的节间部伸长的功能，和增加植物叶片弯曲度的功能。
6.权利要求4或5中的DNA，其中DNA得自单子叶植物。
7.权利要求6中的DNA，其中DNA得自禾本科植物。
8.DNA，其编码与权利要求1至7中任一项的DNA的转录物互补的反义RNA。
9.DNA，其编码具有核酶活性的RNA，所述核酶可特异性裂解权利要求1至7中任一项的DNA的转录物。
10.DNA，其编码当在植物细胞中表达时，因共-抑制而能阻抑权利要求1至7中任一项的DNA表达的RNA，所述DNA与权利要求1至7中任一项的DNA具有90％或更高的同源性。
11.DNA，其编码相对于权利要求1至7中任一项的DNA所编码的蛋白质而言具有显性失活表型的蛋白质。
12.含有权利要求1至7中任一项的DNA的载体。
13.转化细胞，其含有权利要求1至7中任一项的DNA或权利要求12中的载体。
14.由权利要求1至7中任一项的DNA编码的蛋白质。
15.生产权利要求14中的蛋白质的方法，所述方法包括培养权利要求13中的转化细胞，从转化细胞或其培养物上清液中回收表达的蛋白质的步骤。
16.含有权利要求8至11中任一项的DNA的载体。
17.转化的植物细胞，其含有权利要求1至11中任一项的DNA或权利要求12或16中的载体。
18.含有权利要求17中的转化植物细胞的转化植物。
19.转化植物，其为权利要求18中的转化植物的子代或克隆。
20.权利要求18或19中的转基因植物的繁殖材料。
21.与权利要求14中的蛋白质结合的抗体。
全文摘要
本发明人成功生产出水稻矮小型突变体d61，并分离出对应于d61基因座中的区域的OsBRI1基因。发现OsBRI1可增加植物的油菜素类固醇敏感性。另外，本发明人还证明了OsBRI1在水稻生长和发育过程中的功能，例如，通过诱使节间部细胞伸长导致节间部伸长，以及使叶片接合处倾斜。通过导入反义核苷酸或显性失活的OsBRI1，本发明人生产出表型被修饰的转基因水稻植物。
文档编号C12N15/29GK1430671SQ01809828
公开日2003年7月16日 申请日期2001年3月30日 优先权日2000年3月31日
发明者田中宥司, 萱野晓明, 松冈信 申请人:独立行政法人农业生物资源研究所