专利名称：：通过可恢复的功能阻断(rbf)系统对转基因分离及其逃逸的分子控制的制作方法
技术领域：
：本发明涉及改进的方法和在此处称为可恢复的功能阻断(RBF)系统的DNA构建体复合物，所述的方法和复合物用于在控制转基因分离和包括基因渗入的转基因逃逸方面，获得提高的安全性水平。所述的方法和系统使农民在没有将转基因泄露到环境之中的危险的前提下，再利用他们的转基因农作物。提高的安全性水平是通过、包括一个或多个与所需转基因(TGI)紧密连接的阻断核苷酸构建体(BC)的可恢复的功能阻断(RBF)系统达到的，其中，若仅使用一个阻断构建体(BC)，则所述的阻断构建体(BC)插入到所需转基因(TGI)的内含子中；若所使用的阻断构建体多于一个，还有一个或多个恢复构建体，即在使用者所控制的化学，物理或机械干预下用于恢复所阻断的功能的核苷酸构建体，则插入到两个阻断构建体之间(BC)。本发明不仅涉及上述方法，还包括可恢复的功能阻断系统(RBF)，及其在生产载体，细胞，细胞系和/或转基因有性繁殖多细胞生物体(SRMO)，特别是植物和某些动物，如鱼，虾，软体动物等中的用途。
背景技术：
：在过去的几年中，转基因农作物生产的安全性是公众普遍担心的问题，这也引起了科学界的极大关注。在一些出版物中报道，转基因植物的花粉可从田间小块中散播。最成问题的是，如果逃逸成功则转基因作物种可与其在自然界中存在的亲缘作物杂交。另外，防止并控制在不同的相关的转基因或非转基因作物植物或相关的野生型植物之间的杂交，即保持种系纯度也是同样重要的。在一定的作物种，例如玉米，一定的产油植物如Brassicae，以及树中发现了危险组，由于它们生长周期长、花粉产量大因而形成了特定的问题。即使目前的问题仅限于植物，但随着动物日益成为转基因生产方法的重要目标，很可能也会涉及类似的问题。鱼、虾、家禽、羊等已易于形成转基因家畜。将来也可能对转基因植物进行更大范围的修饰，因而更迫切地需要防止转基因逃逸。虽然可以对威胁人类和动物健康的特定转基因及其产物进行检验和测定，对基因逃逸的影响的评估则较为复杂。另一方面，由于重组DNA技术改良作物的潜力如此巨大，更为经济有效的是找到防止基因泄露或逃逸的解决办法，而非禁止转基因的使用。由于转基因的巨大影响和对关于可能发生的转基因逃逸的担忧，在现有技术中已经提出了几种解决这一问题的方法。第一种方法是由Monsanto提出的，其包括使植物工程化不育以及控制种子萌发，也称作“终止剂技术”(US5,723,765)。公开了一些应用条件致死因子的报道，所述的条件致死因子被称为自杀基因。有人建议将缓和基因，即弱化在杂草中转基因的选择优势的基因，用于控制转基因逃逸(Gressel，J.，(1999)，Tibtech.17361-366)。几个小组也研究了应用工程化的雄性或雌性不育。在雄性不育(MS)方法中，通过例如抑制mRNA合成来阻断授粉。通过RNA酶抑制剂的表达来恢复授粉。在所述的情况下，授粉系携带恢复因子(RF)。两元件MS和RF分别存在于不同的独立植株中。只有上述两种植株的杂合体同时携带封闭和恢复因子，并由此可育。因此，雄性不育技术目的在于支持杂合种子生产。但是雄性不育技术不能防止转基因逃逸到环境之中，这是由于经授粉的雌性(MS)植株仍能产生杂合的种子，若其脱落，则在收获之后仍可能遗留在田地中。已通过表达在花药毯特异的启动子控制下的RNA酶基因，实现在欧洲油菜(Brassicanapus)中的工程化的繁殖力控制(DeBlockandDebrouwer(1993)，Planta，189218-225)。在花药的绒毡层细胞中表达RNA酶基因将在发育的早期阶段将花药杀死。用表达在同一启动子控制下的RNA酶基因的转基因欧洲油菜(B.Napus)的花粉对雄性不育的花授粉，使雄性不育(MS)特性得以恢复，并且杂种植物可以产生表达两种基因的正常花粉。美国专利US5,750,867公开了雄性不育植物的维持。美国专利公开了类似的用于雌性不育(FM)植物的方法，这一方法中，在所述雌性亲本植物的雄蕊细胞中表达核糖核酸酶基因，在杂种植物中表达的致死基因可通过来自授粉亲本系的恢复基因的表达得以恢复。封闭基因在亲本植株的雌性器官中表达，而花粉仍保持可育。有意用雄性不育(MS)植株对所述的雌性不育(FM)植株授粉，产生杂合种子。美国专利US5,728,92公开了一种基于反义mRNA表达的方法，所述的反义mRNA是对花药发育至关重要的基因的反义mRNA，且反义分子与有意分子同时表达，两分子受同一启动子驱动。有意和反义方向的基因同时表达提供了一种阻断花药发育的沉默机制。美国专利US6,013,859公开了一种杂交的方法。所述的阻断由花药或小孢子中的两个随后的酶反应提供。授粉亲本株系带来选择标记(除草剂)抗性。接下来的美国专利US6,005,167公开了一种方法，该方法应用反义技术提供基于阻断在发育中的花药或花的其他部分中的查耳酮合酶表达的雄性或雌性不育。查耳酮合酶是类黄酮生物合成中的关键酶。封闭该基因的表达导致授精作用不可恢复的阻断。美国专利描述了一种阻止种子萌发或功能的方法。该技术包括通过特定的Cre重组酶切除启动子和阻断或终止子基因之间的特定DNA序列，激活被抑制的阻断基因功能，其中所述的Cre重组酶由受Tet-抑制的启动子控制下的另一基因编码。未经四环素处理的转基因植物的种子在自然条件下能够萌发。如果用四环素处理转基因植物的种子，编码Cre重组酶的基因活化并切除处于Lea启动子和毒素基因之间的DNA插入序列。由此，去除了阻断、激活了毒素。所述的毒素并不立即杀死植物，这是由于只有伴随Lea启动子作用下的晚期胚发生过程中才起始所述的表达。在US5,723,765中所公开的思路暗示在第二代中种子发育的抑制作用。如果没有抑制机制，所述的“致死”基因在子代胚胎发育的最后阶段被激活，由此下一代的种子不再萌发。所述技术的基本问题在于，一旦所述植物经四环素处理了，即所述的致死基因被激活，它们是无法解救的。而且如果带有四环素恢复构建体的所述的转基因植物逃逸到环境中，其可以萌发、生长成熟，开花并进行有性生殖。换句话说，由所述转基因植物造成的转基因逃逸是无可避免的。所述的“终止子技术”已得到了消极的公众关注，这是由于其给予种子生产公司控制转基因种子生产的市场的可能。国际专利申请WO94/03619公开了通过化学激活或“基因开关”对转基因植物生长的控制。上述的开关基因产生可以灭活“破坏基因”表达的阻遏物。当对阻遏物基因进行化学诱导时，破坏基因即被阻遏。若没有激活阻遏基因，所述的破坏基因即摧毁细胞和所述植物的功能。上述的阻遏机制可以包括阻遏物蛋白，并包括启动子和操纵基因系统。另外，所述的阻遏物可表现为某种基因的形式，其编码破坏蛋白基因的抑制物。在WO94/03619中描述的“化学开关”可去除重组酶识别位点两侧的DNA序列，由此用于控制所述重组酶基因的活性。所述的重组酶去除特征基因的一部分，并阻断该增值基因的功能。国际专利申请WO00/37660公开了限制异型杂交和不需要的基因流入作物植物的方法和遗传组合物。WO00/37660中公开了一个遗传系统，其包含两个DNA构建体、可抑制的显性致死基因和定位于与可抑制的显性致死基因独立分离的位点的阻遏物基因。还描述了用于设计在不同姊妹染色体上包含可抑制的显性致死基因和阻遏物基因的植物的复杂克隆和筛选系统。美国专利US5,498,533公开了通过表达有意和反义钙调蛋白基因构建体的表达对马铃薯发育进行调节。有意方向的钙调蛋白基因的表达提高枝条和块茎的生长，而带有反义构建体的植物的枝条和块茎的生长减弱，由此反义钙调蛋白基因的表达可以用作阻断生理功能的因子。Gressel(1999)在其综述(Tibtech，17361-366)中描述了几种基于下述系统的申请，所述的系统为用于阻止超杂草疯长的串联转基因-缓和(TM)技术的现有和假定系统。所述的TM基因对作物而言是有益或中性的，但对杂草是有害的。TM基因可以通过提供种子休眠，早期或晚期种子成熟，植株矮化或其它相对于亲本株系弱化自生杂草进化适应性的特性，改变杂草的形态或生理机能。但和缓基因并不能完全阻止转基因逃逸，因为它们对作物植物而言不是致死的，甚至不会带来不利。因此，转基因缓和技术不能阻止同一植物不同品系之间的杂交。一般缓和基因的作用仅是在长期的负筛选之后实现，在这一过程中缓和基因中可能的沉默或突变减弱了它们的作用，由此妨碍了实现阻止转基因逃逸。在他的综述文章Gressel(1999)中建议使用含两个缓和基因的串联构建体，以降低转基因逃逸的可能性。串联的缓和基因构建体不能解决在相关作物植物不同品系间的杂交问题。在一个缓和基因中的沉默和突变减弱了作用中的负筛选压力。现有技术中描述的大部分试图提供控制转基因植物逃逸的系统是不可恢复的。换言之，在应用了恢复系统后它们就不能被再次应用。在以上描述的一些系统中进一步的限制在于由于授精和胚胎发育受到抑制，所以需要进行无性繁殖。因此尽管在现有技术中存在多种不同的方法，控制形式还是很不理想。仍然需要解决这一问题的更有效的方法和系统。从使用缓和基因的一开始，就可以推断用缓和基因不能达到足够的安全性。需要致死或造成不育的基因。现有技术中已描述并使用了应用致死或造成不育的基因的系统，但其不能确保足够的安全性，特别是需要长期筛选的时候。现有技术中的方法和系统所没有解决的一个问题是例如在经常出现的致死，破坏或阻断基因失活的情况下将会怎样？致死或造成不育的基因的沉默或突变频率大约在10-6，其可导致少量的但可证实的转基因逃逸。而且现有技术中的一些应用致死或引起不育的基因的系统需要一些非理想的步骤，如将化学物质散布到环境中。这是使用者和公众未能很好地认识到的。还可以提到的是缺乏作物再利用的可能性。本发明的主要目的在于提供提高的控制基因渗入或转基因分离，以及向环境中逃逸的安全性水平。本发明的再一目的在于，为农民再利用他们的作物提供正确地指导。本发明的又一目的是提供一种系统，其中的阻断基因的作用在不使用化学物质的情况下即可以恢复，如果必须使用化学物质，所述的恢复可以在限定的条件下进行。发明简述以提高了的安全性水平控制转基因分离和向环境中逃逸，是通过下述方法和/或系统实现的，所述的系统包括含一个或多个阻断构建体(BCs)的DNA构建体复合物，所述的阻断构建体包含能够阻断一个或多个对转基因生物体的存活或有性繁殖至关重要的功能的基因。提高的安全性水平是通过下述达到的以一个或多个转基因插件(TIs)或DNA框的形式，将一个或多个阻断构建体(BCs)整合到受体生物或有性繁殖多细胞生物(SRMO)中，所述的阻断构建体可置于目标转基因(TGI)的内含子中，或位于紧邻包含一个或多个目标转基因(TGIs)的转基因插件(TI)的位置。被阻断构建体(BC)所阻断的功能，优选地在使用者可控制的干预下得以恢复，而这种干预在自然条件下是不存在的。若出现转基因生物异型杂交的情况，对存活或有性生殖至关重要的功能是被阻断的。使用者可控制的干预是可以不止一次，而是多次重复的，优选所述的必须在环境中应用的干预不需要化学物质介入。实现与现有技术的方法和系统相比提高了的安全性水平，是特别通过使用置于包含一个或多个目标转基因(TGIs)的转基因插件(TI)两侧的，两个或更多个阻断构建体(BC)，或置于目标转基因(TGI)的内含子中的阻断构建体(BC)实现的。因此本发明涉及通过提供包含下述步骤的分子控制机制提高控制转基因分离，和阻止转基因向环境中逃逸的安全性水平的方法，所述的步骤是构建一个或多个在此处称为可恢复的功能阻断(RBF)系统的DNA构建体复合物，所述的DNA构建体复合物中还包含一个或多个目标转基因(TGIs)、一个或多个位于紧邻目标转基因(TGI)的阻断构建体(BCs)，以及至少一种恢复方式或恢复工具，也就是使用者可控制的方式或对恢复被阻断功能的干预，所述的阻断构建体(BCs)优选位于目标转基因(TGI)的内含子中，或者当使用多于一个阻断构建体(BCs)时，位于所述的阻断构建体(BCs)之间。所述的阻断构建体(BC)具有至少一种阻断对有性繁殖多细胞生物(SRMO)的存活和/或有性繁殖至关重要的功能的能力。在所述的阻断构建体(BC)中提供阻断作用的核酸序列或基因，或是目标转基因(TGI)，或其与至少一种编码所需转基因产物的目标转基因(TGI)紧邻。对被阻断功能的恢复包括至少一种使用者可控制的干预，其可选择地与一个或多个恢复构建体(RCs)相结合。在第一次逃逸的含目标转基因(TGI)的杂种世代之后的世代中，通过负筛选自动进行所述的控制。在本发明的可恢复的功能阻断(RBC)技术中存在恢复构建体(RC)，使得在阻断构建体(BC)中能够使用致死或引起宿主细胞不育的转基因。使用这些基因使得为达到所述效果所需的负筛选发生，与缓和技术中所需的负筛选时间相比，更完全并缩短所需时间。应用双阻断构建体(BCs)的可恢复的功能阻断(RBF)系统的安全性水平得以提高，这是由于其中一个阻断构建体(BCs)的沉默或突变不降低第二个阻断构建体(BC)的作用。另外本发明的可恢复的功能阻断(RBF)系统的安全性水平，可通过向目标转基因(TGI)的内含子中引入阻断构建体(BC)而得以提高。这降低了下述可能性，即通过杂交使阻断构建体(BC)失活或在没有针对所述目标转基因(TGI)的有害的作用下使阻断构建体(BC)突变。因此，可恢复的功能阻断(RBF)的概念与多重，即双重或多重和/或内含子-诱导的阻断构建体(BC)系统的结合，在控制转基因分离和转基因逃逸进而使所述系统可在转基因植物或动物技术中实施方面，提供了的实质上提高了的安全性水平。所述的阻断构建体(BC)最终阻止转基因的有性繁殖多细胞生物进行有性繁殖(SRMO)或产生有生活力的后代，所述的阻断构建体在天然的或非控制的情况下抑制对所述有性繁殖多细胞生物(SRMO)存活和繁殖至关重要的功能。为了农业的、园艺的、林业的、工业的或任何其他可行的目的，可通过至少一种使用者控制的干预恢复被阻断的功能，以获得正常的发育、繁殖、生长和有性繁殖，所述的干预在有性繁殖多细胞生物(SRMO)发育周期中的某个易感时期恢复被阻断的功能。所述的恢复包括，外部的、使用者控制的处理或操作步骤，包括化学的物理的或机械的干预，其可恢复或放开被阻断的功能。通过阻断构建体(BC)单元的作用，防止转基因通过亲本转基因有性繁殖多细胞生物(SRMO)与其野生型的亲缘生物，或其他培养的非转基因或转基因亲缘生物之间的杂交、或异型杂交泄露到环境中，在没有使用者控制的外界干预的自然条件下，上述阻断构建体(BC)抑制转基因的有性繁殖多细胞生物(SRMO)或任何携带所述阻断构建体(BC)的杂合体的功能的重要功能。这种对分离的控制迅速地使转基因从自然界中消失。本发明提供用于防止有性繁殖多细胞生物(SRMO)中的转基因分离并逃逸到环境中的DNA构建体复合物。所述的DNA构建体复合物在此处称为可恢复的功能阻断(RBF)系统；其包含一个或多个阻断构建体(BC)，该阻断构建体包含至少一个能够阻断对转基因有性繁殖多细胞生物(SRMO)的存活和/或繁殖至关重要的分子或生理功能的核酸序列。所述的阻断构建体(BC)中的核酸序列基因也可以是目标转基因(TGI)，即其可形成自我控制实体的核酸序列。优选地，将其置于紧邻所述的目标转基因(TGI)或所述目标转基因(TGI)附近，或者位于内含子中，或者位于两阻断构建体(BCs)之间。该可恢复的功能阻断(RBF)还可以包括一个或多个可任选的恢复构建体(RCs)，其靠近阻断构建体(BCs)或位于非等位染色体上。所述的恢复构建体(RCs)不应当置于含有以阻断构建体(BCs)为侧翼序列的目标转基因(TGI)的，或已将阻断构建体插入到目标转基因(TGI)内含子中的染色体的姊妹染色体上。所述的恢复构建体(RC)受外界的，使用者控制的人工干预调节。换言之，在能够获得并使用某些用于恢复的外界的手段或干预、使用者控制的恢复处理的情况下，无论恢复构建体(RC)存在与否，所述的可恢复的功能阻断(RBF)系统均可行使功能。撤消使用者应用的、阻止阻断构建体(BC)作用的干预，可阻止转基因有性繁殖多细胞生物(SRMO)繁殖。所述的作用例如，异型杂交，抑制或改变影响转基因有性繁殖多细胞生物(SRMO)生存、发育和/或有性繁殖的重要功能。为了使所述的生物体在包括农业的、园艺业的、林业的和/或工业应用的所述生物体进行正常的生长和繁殖，通过应用至少一种外界适用的，人工的和使用者可控制的干预，在有性繁殖多细胞生物(SRMO)生长周期中的某个易感时刻恢复被阻断的功能。所述的转基因有性繁殖多细胞生物(SRMO)倾向于杂种繁殖或与培养的其野生型亲缘种类进行异型杂交，通过下述事实使所述的转基因分离可以控制，和/或所述的转基因向环境中的泄露得以防止，上述事实是指在自然界中不存在去除开放阻断构建体(BC)的负效应的干预或处理。因此，在天然条件下，转基因有性繁殖多细胞生物(SRMO)的至少一个重要分子或生理功能被阻止，其功能在于阻止有性繁殖。本发明的方法中，影响宿主有性繁殖多细胞生物(SRMO)生存或其发育和/或其生殖周期的功能，以器官特异的、时空的或组成型的方式抑制发育，改变有性繁殖多细胞生物(SRMO)的表型或形态进行表征，通过此种方式抑制生存和有性繁殖。应用外界的，人工的和使用者控制的干预步骤去除或者恢复阻断作用的适当时刻是有性繁殖多细胞生物(SRMO)发育周期中的易感时刻或阶段，在这样的时刻，器官特异的，时空的或组成型的形态改变阻止有性繁殖多细胞生物(SRMO)进行自由杂交或交换，并由此阻止其在自然条件下进行有性繁殖。这种易感时刻是例如种子萌发，开花的早期或晚期，不能形成花序，花或果实和/或形成矮化表型，特别是当阻断构建体(BC)包含核酸序列的时候，所述核酸序列的表达阻断重要的分子或生理功能，或引起阻止自由杂交和/或繁殖的形态改变。所述的阻断出现在DNA，mRNA，蛋白或代谢水平并导致死亡，表型或生理改变，如早期或晚期种子萌发，缺乏生长和/或增殖，不能形成花，花序，花或果实，形成矮化表型等。阻断构建体(BC)可以置于目标转基因(TGI)核酸序列的内含子中，或者，两个或两个以上的阻断构建体(BCs)置于包含一个或多个目标转基因(TGIs)转基因插件(TI)的两侧。如果所述的两个阻断构建体(BCs)相同或不同，且可通过相同或不同的恢复机制恢复，它们置于有用的核酸序列(TGI)的两侧形成多重，即二重或三重可恢复的功能阻断(M-RBF，D-RBF或T-RBF)系统。相反，所述的恢复构建体(RC)应置于相同的SRMO，但优选位于不同的非等位染色体，形成分离的可恢复功能阻断(S-RBF)系统。在多重可恢复的功能阻断(M-RBF)系统中，第一恢复构建体在第一转基因插件(TI)中位于靠近第二个阻断构建体(BC2)的位置。在第二非等位染色体中设置第二个恢复构建体-第一个阻断构建体(RC2-BC1)复合物控制该转基因插件(TI)，第一个转基因插件(TI)控制第二个转基因插件(TI)。所述的目标转基因-阻断-构建体(BCI-TGI-BC2)复合物以提高了的可靠性控制另一个目标转基因-阻断-构建体(TGI-BC)复合物，并对目标转基因(TGI)进行负筛选。本发明还包括克隆载体，即DNA框和便于制备转基因植物或转基因非人动物的细胞或细胞系，所述的转基因动植物带有一个或多个受本发明的可恢复的功能阻断(RBF)系统控制的转基因插件(TI)。如SEQIDNO4中所示的新的多克隆位点，也是为了方便地插入目标转基因(TGIs)和其他阻断或恢复构建体(BCs和RCs)。再有，适合于插入目标转基因(TGIs)的内含子中，或目标转基因(TGIs)侧翼序列中，并适合插入到模式植物和/或动物中的合成的核苷酸序列也做了描述。本发明的特性在权利要求中作出了更为详细地定义。图1是介绍用于简单可恢复的功能阻断(RBF)系统的分子构建体的略图。详细地介绍所述的构建体(上行的箭头)及以更一般的水平(中间和下部的箭头)显示设置基因的原则。用箭头尖所表示的启动子框表明基因序列的方向。缩写词p，启动子；3′端，基因或多腺苷酸信号位点的3′末端；as，反义。图1a代表实施例1中所描述的构建体图1b代表实施例2中所描述的构建体。图2代表在实施例3中所描述的，用于可恢复的功能阻断(RBF)系统的分子构建体。详细地介绍所述的构建体(上行的箭头)及以更一般的水平(中间和下部的箭头)显示设置基因的原则。用箭头尖所表示的启动子框表明基因序列的方向。缩写词p，启动子；3′end，基因或多腺苷酸信号位点的3′末端；as，反义。图3是经或不经热激处理的情况下，在胚成熟、种子萌发过程中转基因烟草中barnase和barstar表达的Northern印迹分析。在可恢复的功能阻断(RBF)系统中，barnase和barstar基因分别作为阻断和恢复基因。图3a表示在处于胚发生的中期阶段(苍白胚)和晚期阶段(淡黄胚)barnasemRNA在烟草胚中的表达。每一泳道加入10mg总RNA。非转基因胚的总RNA和0.1，0.3和1.0pg合成的barnaseRNA相混合，用10mg来自未转化的烟草胚的RNA作为对照。Barnase的mRNA表达在胚形成的中间阶段是0.1pg/mg总RNA在胚形成的晚期阶段为0.03pg/mg总RNA。图3b表示在烟草幼苗中barnasemRNA的表达。每泳道上样10mg总RNA。非转基因胚的总RNA和0.2，0.5和1.0pg合成的barnaseRNA相混合，用10mg来自未转化的烟草胚的RNA作为对照。BarnasemRNA的表达在出芽的第三天开始，在第四天达到最高0.04pg/mg总RNA，在出芽的第五天衰减下来。在所述的印记上还检测到两条非特异的叶绿体核糖体RNA的带。图3c表示未经热激及经热激(h.s.)后barstarmRNA的表达。每泳道上样10mg总RNA。0.5，2.0和10pg合成的barstarRNA与10mg来自非转基因对照烟草胚的RNA用作阳性对照。经热激处理刺激barnasemRNA在发育的胚发生和出芽阶段的表达高达1-3pg/mg总RNA。在HSp下的BarstarmRNA表达，在未经温度处理的情况下以0.05-0.2pg/mg总RNA的水平泄露。图4代表在实施例4中描述的，用于可恢复的功能阻断(RBF)系统的分子构建体。详细地介绍所述的构建体(上行的箭头)及以更一般的水平(中间和下部的箭头)显示设置基因的原则。用箭头尖所表示的启动子框表明基因序列的方向。缩写词p，启动子；3′end，基因或多腺苷酸信号位点的3′末端。所述的构建体I和II插入到不同的非等位染色体中并分别表示。图5代表在实施例5中描述的，用于可恢复的功能阻断(RBF)系统的分子构建体。详细地介绍所述的构建体(上行的箭头)及以更一般的水平(中间和下部的箭头)显示设置基因的原则。用箭头尖所表示的启动子框表明基因序列的方向。所述的构建体I和II插入到不同的非等位染色体中并分别表示。缩写词p，启动子；3′end，基因或多腺苷酸信号位点的3′末端。图5a详细地及以更一般的水平表示在染色体I中的所述构建体。图5b详细地及以更一般的水平表示在染色体II中的所述构建体。图6表示置于uidA基因内含子中的barnase基因的序列所述的barnase基因构建体在下游示出，其包含SH-EP启动子(示出约后300个核苷酸)编码序列和多腺苷酸信号位点。所述的uidA基因构建体置于从编码序列第1735个核苷酸开始的上游。所述的uidA基因表现为外显子-内含子-外显子-多腺苷酸位点序列。缩写词nt核苷酸；FUE多腺苷酸位点远距离的上游元件；NUE多腺苷酸近距离的上游元件；SphI，SpeI，PstI，Bel1，限制性位点；＞和＜信号肽的方向，CAAT和TATA，启动子的信号框。图7代表在实施例6中描述的，用于可恢复的功能阻断(RBF)系统的分子构建体。详细地介绍所述的构建体(上行的箭头)及以更一般的水平(中间和下部的箭头)显示设置基因的原则。用箭头尖所表示的启动子框表明基因序列的方向。所述的构建体I和II插入到不同的非等位染色体中并分别表示。缩写词p，启动子；3′端，基因或多腺苷酸信号位点的3′末端。图7a表示双重诱导可恢复的功能阻断(RBF)系统的单插入构建体。图7b表示双重分离可恢复的功能阻断(RBF)系统的双插入构建体。图8是表明带有分离的可恢复功能阻断(S-RBF)系统的转基因插件(TIs)的植物的杂交略图(在实施例4、5和6中所描述的及图4，5和7b中所表示的)。也示出了与有用(T)基因连接的阻断构建体(B)，以及置于不同非等位染色体上的恢复构建体(R)。所示的没有BT或R标记的是野生型(WT)染色体。杂交中所包含的亲本植物(P)在第一行示出。在系内杂交的结果中，在可恢复的功能阻断(RBF)中所包含的基因的状况没有改变系内的F1子代具有可恢复的功能阻断(RBF)和所述有用基因的纯合基因型。可恢复的功能阻断(RBF)的外部调节暗示支持系内杂交转基因的纯合状况。在外部杂交的情况下，所述的第一F1杂合子代基因型对所有转基因构建体而言都是杂合的。所述植物仍存活。所述的可分离的可恢复的功能阻断(RBF)在外部杂交的情况下从F2杂种子代开始作用。在F2杂合体中只有一半的植物带有与目标转基因(T)相连接的阻断构建体(B)。它们中有一般由于缺乏恢复构建体(R)而不能繁殖。因此，从第二外部杂合子代开始，通过50％的负筛选从自然种群中剔除所述的目标转基因。在可恢复的功能阻断(RBF)中，恢复构建体(R)在野生种群植物的基因组中可自由分离。图9代表在实施例7中描述的，用于可恢复的功能阻断(RBF)系统的分子构建体。详细地介绍所述的构建体(上行的箭头)及以更一般的水平(中间和下部的箭头)显示设置基因的原则。用箭头尖所表示的启动子框表明基因序列的方向。所述的构建体I、II和III插入到不同的非等位染色体中并分别表示。缩写词p，启动子；3′端，基因或多腺苷酸信号位点的3′末端；BC1第一个阻断构建体；BC2，第二个阻断构建体；RC1，第一个恢复构建体；RC2，第二个恢复构建体。图10表示三重可恢复的功能阻断(T-RBF)系统。现成的作为受体的有性繁殖多细胞生物(SRMO)带有三个转基因插件(TIs)或DNA框，其分别定位于有性繁殖多细胞生物(SRMO)系的不同的非等位染色体上。在第一转基因插件(TI-I)中有第一阻断构建体(BC-1)及第二恢复构建体(RC-2)，在第二转基因插件(TI-11)中有第二阻断构建体(BC-2)和第一恢复构建体(RC-1)。所述的第一和第二转基因插件(TI-I和TI-II)位于两个不同的非等位染色体上。将目标转基因(TGIs)克隆到两阻断构建体(BC-1和BC-2)之间的多克隆位点显示为第三个转基因插件III，将其转化到作为受体的有性繁殖多细胞生物(SRMO)系的第三个非等位染色体上。所述的箭头和箭头尖指示阻断个恢复构建体(BC&RC)之间的相互作用。所述的第一恢复构建体(RC-1)控制第一和第三转基因插件(TI-I和TI-III)中的阻断构建体(BC-1)，第二恢复构建体(RC-II)控制着在在第二转基因插件(TG-II)和第三转基因插件(TI-III)中的第二阻断构建体(BC-II)。如果所得的有性繁殖多细胞生物(SRMO)与野生型的亲缘生物杂交，所述的染色体将按照孟德尔法则在每一世代中以7/8的频率分离。图11是表示转基因植物与带有三重可恢复的功能阻断(T-RBF)系统的转基因插件(TIs)的有性生殖多细胞生物(SRMOs)之间的杂交的略图。所述的第一可恢复的功能阻断(RBF)构建体被描述为B1和R1，它们分别代表阻断和恢复构建体。B2和R2构建体属于第二可恢复的功能阻断(RBF)。所述的阻断和恢复构建体以相反的次序分别置于不同的非等位染色体，并成对地连接在一起R1+B2和R2+B1。所述的目标转基因(T)置于第三条非等位染色体上。其位于第一(B1)和第二(B2)阻断构建体之间。所述的系内杂交支持子代中两可恢复的功能阻断(RBF)的纯合基因型。F1外部杂合子代对所有可恢复的功能阻断(RBF)构建体和有用基因而言带有杂合基因型。子代植物是可以繁殖的。在F2外部杂合子代中所述构建体分离导致带有有用的基因(T)的有性繁殖多细胞生物(SRMOs)中的强烈的负筛选。八个杂合基因型中只有一个可以进行有性繁殖并带有目标转基因(T)。所有的转基因构建体均不能与野生型的亲缘植物自由杂交。列于框中的F2子代能进行有性繁殖。发明详述在本发明中使用的术语大部分与它们在重组DNA技术，分子生物学，动植物育种领域中一般所具有的意义相同。但也有一些术语在使用方式上有些许的不同，这将在下文中进行详细描述。所用术语“可恢复的功能阻断(RBF)系统”指一种概念上的分子系统或分子控制机制，其包括一个或多个DNA构建体或转基因插件(TIs)，所述的转基因插件包含一个或多个能阻断对转基因有性繁殖多细胞生物(SRMO)存活和繁殖至关重要的功能的核酸或DNA序列的阻断构建体(BCs)，以及使用者控制的恢复被阻断的功能的方法，即恢复工具。所述的可恢复的功能阻断(RBF)系统控制分离并阻止有性繁殖多细胞生物(SRMO)的有用基因(TGIs)中的转基因泄露到环境中，所述的有性繁殖多细胞生物包括可应用可恢复的功能阻断(RBF)系统的植物和非人动物。通过目前已知的转化方法将所述的可恢复的功能阻断(RBF)系统中的转基因插件(TI)与目标转基因(TGIs)一起引入有性繁殖多细胞生物(SRMOs)中。应当注意下述定义的某些可恢复的功能阻断(RBF)系统由于不包括本发明的新特征，所以不是新的，其是所述的阻断构建体(BCs)的位置，或位于目标转基因(TGI)的内含子中，或位于目标转基因(TGI)两侧的两阻断构建体(BCs)中，或位于多重可恢复功能阻断(M-RBF)系统中。术语“延迟的可恢复的功能阻断(D-RBF)系统”或“分离的可恢复的功能阻断(S-RBF)系统”是指一种可恢复的功能阻断(RBF)系统，其中所述的恢复构建体(RC)或构建体位于除与目标转基因(TGIs)紧密连接的阻断构建体(BC)外的同一个体生物的不同非等位染色体上，即TGI-BC-构建体复合物。因此，TGI-BC-构建体复合物的分离是独立发生的。这意味着当如下所述阻断和恢复构建体(BCs和RCs)分离到不同的子细胞中时，阻断因子直到第二杂合的杂种子代(F2)才开始发挥作用。所述的可恢复的功能阻断(RBF)模式系统可根据作用机制、排列或构建体的结构分为下述类型。如果可恢复的功能阻断(RBF)系统包含唯一的阻断构建体(BC)并且，其作用可通过外部使用的恢复得以补偿，则该系统是简单可恢复的功能阻断(RBF)系统。如果所述的恢复构建体(RC)被外界的刺激所激活并且解除了由在不同启动子控制下表达的阻断构建体(BC)所以致的功能，则这种模型是一般的、完全的，此处称作可恢复的功能阻断(I-RBF)系统。如果所述的恢复构建体(RC)置于不同的非等位染色体，该模型为分离的可恢复的功能阻断(S-RBF)系统。所述的倒转分离可恢复的功能阻断(RS-RBF)系统包括两个不同的可恢复的功能阻断(RBF)系统的转基因插件(TIs)。它们位于彼此相对的不同的非等位染色体上以使得第一可恢复的功能阻断(RBF)的阻断构建体(BC)与第二可恢复的功能阻断(RBF)系统中的恢复构建体(RC)相连接，第二可恢复的功能阻断(RBF)系统中的阻断构建体(BC)与第一可恢复的功能阻断(RBF)系统中的恢复构建体(RC)相连接。术语“外部补偿或简单可恢复的功能阻断(RBF)”是指可恢复的功能阻断(RBF)系统，其中仅包含单一的阻断构建体(BC)。所述的阻断构建体(BC)如实施例1中所述可能是组成型激活的，如实施例2中所述的发育特异性的或器官特异性的。所述的恢复工具包括必需代谢的外部补偿，如实施例1所述的氨基酸，如实施例2所述的激素或其他代谢。此处没有恢复构建体(RC)。术语“可诱导的可恢复的功能阻断(I-RBF)”是指可恢复的功能阻断(RBF)系统，其包括阻断构建体(BC)和恢复构建体(RC)。所述阻断构建体(BC)的表达可以是组成型的，也可以是如实施例3中所述的发育特异性或器官特异性的。所述的恢复构建体(RC)可对如实施例3中所述的外部物理刺激或如WO94/03619中所述的化学刺激产生应答。本发明的物理诱导可恢复的功能阻断(I-RBF)与WO94/03619中描述的化学诱导可恢复的功能阻断(I-RBF)不同还在于下述事实，即阻断构建体(BC)是位于目标转基因(TGI)的内含子中。术语“恢复构建体(RC)”表示的物质可与形成“可诱导可恢复的功能阻断(I-RBF)系统”的阻断构建体(BC)置于同一染色体上。所述的恢复构建体(RC)可置于与如WO00/37660中所描述的目标转基因(TGI)和/或阻断构建体(BC)所在的染色体相同或等位的染色体上，或者其也可以置于不同的、非等位染色体上构成分离的可恢复的功能阻断(S-RBF)系统。术语＂延迟的可恢复功能阻断＂或＂分离的可恢复功能阻断(S-RBF)＂是指包含阻断构建体(BC)和位于同一生物的不同染色体上的恢复构建体(RC)的可恢复的功能阻断(RBF)系统。所述的恢复过程或在这一系统中的干预，意味着支持可恢复的功能阻断(RBF)基因纯合的条件，和防止阻断和恢复构建体(RC&BC)分离的系内杂交。术语＂倒转延迟可恢复的功能阻断系统(RD-RBF)＂或＂倒转分离可恢复的功能阻断系统(RS-RBF)＂是指附加的阻断构建体(BC)连接到第一转基因插件(TI)中的第一恢复构建体(RC1)上，这一附加的阻断构建体(BC)由与目标转基因(TGI)相连接的第二恢复构建体(RC2)，及在第二转基因插件(TI)中的第一阻断构建体(BC1)恢复。所述的倒转分离可恢复的功能阻断系统(RS-RBF)控制阻断和恢复构建体(BC&RC)向环境中的泄露。分离的可恢复的功能阻断(S-RBF)系统在系外(outline)杂交的第一世代中不起作用，这是因为其将出现在杂合的情况下，标记为BbRr(其中′b′和′r′是隐性等位基因，它们分别不包含阻断构建体(BC)或恢复构建体(RC))。因此，两构建体均与在纯合的亲本系中的作用相同。所述的分离的可恢复的功能阻断(S-RBF)系统从第二异型杂交世代开始作用，此时所有的Bbrr杂种均由于缺乏恢复构建体(RC)而死亡或改变为其它的特性。所述的可恢复的功能阻断(RBF)系统暗示在第一杂种子代后的杂种世代中有50％与阻断构建体(BC)相连的目标转基因(TGI)的负筛选。分离的可恢复的功能阻断(S-RBF)系统暗示对下述事实的认可，即恢复构建体(RC)可能泄露到环境中。术语＂阻断构建体(BC)＂指对转基因的宿主生物的存活和/或有性繁殖至关重要或必需的DNA或核苷酸序列。所述的阻断构建体(BC)可以同时是目标转基因(TGI)以形成自我支持的个体。所述的阻断构建体(BCs)优选不是目标转基因(TGIs)，但它需要与目标转基因(TGIs)紧密相连。所述的阻断构建体(BC)中的阻断DNA或核苷酸序列负责阻断宿主生物中的特定的分子或生理功能。其包括核酸(DNA或RNA)序列，如基因，它的作用导致宿主生物消失或不育。因此，所述的有性繁殖多细胞生物(SRMO)，即所述的动物或植物若逃逸了，在非控制条件或自然条件下不能进行有性繁殖。所述的阻断构建体(BCs)的核酸序列与恢复方式，即恢复工具一起控制目标转基因(TGIs)向下面世代中的转移、并由此将所述的基因散播到自然环境或培养的种群中。阻断构建体(BC)优选地与目标转基因(TGI)相连，在极端的情况下其置于位于其侧翼部分的目标转基因(TGI)的内含子中。先决条件是至少一个优选两个阻断构建体(BCs)位于与目标转基因(TGI)共同的一个转基因插件(TI)中。所有的构建体均应出现在同一个体中。所述的阻断构建体(BC)应在宿主生物中组成型或以器官、发育或时空特异的方式表达。术语＂阻断构建体＂是术语＂致死基因＂、＂破坏基因＂或＂终止子基因＂的同义词，其已在现有技术中的出版物WO94/03619，WO00/37660或US5,723,765中使用。术语＂倒转延迟可恢复的功能阻断(RD-RBF)＂或＂倒转分离的可恢复的功能阻断(RS-RBF)＂是指控制阻断构建体(BC)(与目标转基因(TGI)相连)和恢复构建体(RC)泄露的系统。所述的可恢复的功能阻断(RBF)系统的分离在图11中示出。所述的恢复构建体(RC)包含另一阻断基因，其控制恢复构建体(RC)的释放。所述的阻断基因的行为由与第一阻断构建体(BC)和与所述目标转基因(TGI)相连的第二恢复构建体(RC)恢复。在图11中，对于等位基因中的可恢复的功能阻断(RBF)系统的转基因插件，方便起见将目标转基因标记为T，与第一恢复构建体R1结合作用的第一阻断构建体标记为B1，与第二恢复构建体R2结合作用的第二(与第一不同)阻断构建体标记为B2。所述的等位染色体B1B1TTR2R2位于一对等位(姊妹)染色体上，RIRIB2B2位于另一对等位染色体上。所述的第一异型-杂种将分别带有B1b1TtR2r2和RLRLB2B2基因型。因而从第二异型-杂种世代开始，B1阻断构建体将控制目标转基因T的释放，B2阻断构建体将控制R1恢复构建体的释放。由此，所述的倒转分离的可恢复的功能阻断(RS-RBF)系统控制所有转基因构建体从植物中的释放。外部控制或人工处理包括，使用者以与分离的可恢复的功能阻断(S-RBF)系统类似的方式控制的系内杂交以支持转基因植物的纯合的条件。所述的第二恢复或阻断构建体可与同一基因序列中的第一阻断或恢复构建体融合，如下B1与R2融合，B2与R1融合。WO00/376600中公开了特定类型的可恢复的功能阻断(RBF)。但是，没有公开插入目标转基因(TGI)内含子中的阻断构建体(BC)，及多重、包括二重和三重可恢复的功能阻断(RBF)。术语＂系内杂交＂指在两纯合的生物之间的杂交，这种杂交提供纯合的基因型，换言之，支持纯合的条件，且是本发明提供的环保安全的干预。术语＂基因渗入＂指绕过生殖障碍的基因流动和通过可育杂种与亲代种群的交配在种群之间的迁移。如上所述，本发明的目的在于提高已知的可恢复的功能阻断(RBF)系统的可靠性。这一目的是通过将多重，包括双重和三重可恢复的功能阻断(RBF)系统及内含子-诱导的阻断构建体(BC)系统达到的。术语＂提高的安全性水平＂是指安全性水平，其中灭活目标转基因(TGI)的频率低于10-6，优选低于10-8，更优选低于10-10，最优选是10-12，灭活阻断基因的频率是10-6。双重可恢复的功能阻断(RBF)将上述频率降低到10-12。如果没有灭活的情况出现，双重可恢复的功能阻断(D-RBF)及可诱导的恢复构建体(RC)具有100％负筛选。可以预期有性繁殖多细胞生物(SRMO)以高于在现有技术中提及的频率失去与阻断构建体紧密结合的目标转基因(TGI)。术语＂双重可恢复的功能阻断(D-RBF)＂指由两个阻断构建体(BCs)组成的可恢复的功能阻断(RBF)系统。优选地，两个不同的阻断构建体(BCs)在两个不同的启动子控制下表达。所述的阻断基因两侧与目标转基因(TGI)相连。所述的阻断构建体(BC)甚至可以插入到基因中合适的内含子中(图5)。所述的可恢复的功能阻断(RBF)作用由于交换，DNA缺失，启动子沉默机制或其他类似的时间被破坏的可能性也由此下降。结构上，所述的双重阻断构建体(BCs)与目标转基因(TGI)相连接，优选地，从所述基因的两侧连接。所述的阻断构建体(BCs)可由在相同或不同启动子控制下的相同或不同的基因组成。当两个不同的阻断基因在两个不同的启动子驱动下，并置于包含一个或多个目标转基因(TGIs)的转基因插件(TI)远侧位置时，即获得所述DNA构建体复合物的优选排列。如果阻断构建体(BCs)包含相同功能的基因，一个恢复构建体(RC)就足够了(实施例6)。如果所述的阻断构建体(BCs)包含不同的功能基因，双重可恢复的功能阻断(D-RBF)可以包含两个不同的恢复构建体(RCs)。所述的恢复构建体(RCs)可置于相同或不同的转基因插件(TI)中。由此，诱导或分离可恢复的功能阻断(RBF)可作为双重可恢复的功能阻断(D-RBF)的基础。带有单一的恢复构建体(RC)的可诱导双重可恢复的功能阻断(D-RBF)已在实施例6中进行了描述。术语＂多重可恢复的功能阻断(M-RBF)系统＂或特定地，三重可恢复的功能阻断(RBF)是目前最高等的可恢复的功能阻断(RBF)系统。所述的三重可恢复的功能阻断(RBF)综合了双重、倒转可恢复的功能阻断(RBF)系统的所有的最优特性。其赋予比分离可恢复的功能阻断(RBF)更强的负筛选。三重可恢复的功能阻断(RBF)除支持类似于在分离的可恢复的功能阻断(S-RBF)系统中的纯合条件的系内杂交外，不需要其它特殊的处理。由于所述的保护是双重的，其阻止任何转基因构建体流入环境。所述的三重可恢复的功能阻断(RBF)系统非常容易构建，这是由于不同的可恢复的功能阻断(RBF)基因置于不同非等位染色体的三个不同的转基因插件(TIs)。为方便起见，所述的分离如下所述。所述的目标转基因(T)以与在双重可恢复的功能阻断(D-RBF)中同样的方式置于两个不同的阻断构建体(B1和B2)之间，形成标记为B1TB2的系统。两个不同的恢复构建体(R1和R2)分别置于两个不同的非等位(非姊妹)染色体上。附加的阻断构建体以下述顺序与恢复构建体相连接R1+B2和R2+B1。所述的插件克隆到纯合的条件下的受体植物系非等位(非姊妹)染色体中。另外，不含目标转基因(TGI)的倒转可恢复的功能阻断(RBF)整合到受体有性繁殖多细胞生物(SRMO)系中，双重-阻断有性繁殖多细胞生物(SRMO)转化载体带有位于所述的两阻断构建体(BCs)之间的多克隆位点。可利用这一载体将不同的目标转基因克隆到受体有性繁殖多细胞生物(SRMO)系的第三个非等位染色体(图10)上。三重可恢复的功能阻断(RBF)作用机制以与分离的可恢复的功能阻断(S-RBF)相同的方式发挥作用。其从第二杂种子代开始起作用。在包含目标转基因(TGI)的构建体的第一杂种子代中及能进行有性还原的植物仅占全部杂种子代的12.5％，或者占带有目标转基因(TGI)的杂合体的25％。图11中以图示的方式表示的所述植物的杂交。所述多重可恢复的功能阻断(M-RBF)系统的一个优选的实施方案是在实施例7中所述的＂三重可恢复功能阻断(RBF)系统＂，但本领域的技术人员依照本发明所公开内容的一般原则可以构建更复杂的可恢复的功能阻断(RBF)系统。术语＂恢复方式＂或＂恢复工具＂指使有性繁殖多细胞生物(SRMO)宿主从有害的阻断构建体(BCs)作用结构中恢复过来的方法。所述的恢复工具可以包含一种或多种干预或处理。所述的使用者控制的操作步骤导致被阻断功能的直接外部补偿，其可使特定功能的缺乏得以恢复。所述的恢复工具也可以是外部的刺激，激活一个或多个已插入到有性繁殖多细胞生物(SRMO)基因组中的恢复构建体(RCs)。因而，所述的恢复工具包含至少一种与一个或多个可任选的＂恢复构建体(RCs)＂结合的外界的使用者控制的干预。术语＂恢复构建体(RC)＂与已在本领域的出版物中使用的术语＂阻遏物基因＂是同义词，指DNA构建体或核酸(DNA或RNA)序列，其恢复，去阻断或释放被阻断构建体(BC)阻断的功能。所述的恢复构建体(RC)单独地，或与阻断构建体(BC)和目标转基因(TGI)或目标转基因(TC-Is)一起引入有性繁殖多细胞生物体(SRMO)基因组中。所述的恢复构建体(RC)的作用总是使用者可控制的和外部调节的。所述的恢复构建体(RC)在未处理的、非操作的、天然条件下，在有性繁殖多细胞生物体(SRMO)的生命周期中不表现，换言之，即缺乏功能。术语＂使用者控制的干预＂指对“恢复工具”功能的外部控制，其可通过对可应答启动子的外部刺激提供。当使用此处称为＂分离的可恢复的功能阻断(S-RBF)系统＂的可恢复功能阻断(RBF)系统时，所述的外部调节暗示转基因有性繁殖多细胞有机体(SRMOs)的系内杂交以支持可恢复的功能阻断(RBF)系统的纯合条件。术语＂SRMO＂指有性繁殖或可繁殖多细胞生物，包括植物和动物。优选的植物是开花植物，其依照分类学级别包括被子植物和裸子植物，特别是农作物，如谷类。尤其所述的有性繁殖多细胞生物(SRMOs)可以进行异种交配或与其它相关的野生型或培养的转基因和非-转基因生物杂交的生物。优选的动物是，例如鱼，虾，蜗牛，家禽，家畜等。术语＂目标转基因(基因或核酸序列)或目标转基因(TGI)″指DNA或核苷酸序列，包括编码所需基因产物的RNA序列，所述的基因产物即蛋白或酶或其他物质，包括代谢物，激素，毒素，抗体等，其可作为直接基因产物作用的终产物而获得。通过可得的遗传转化和/或转移系统将所述的目标转基因(TGIs)引入到有性繁殖多细胞生物(SRMO)的基因组中。DNA序列或目标转基因(TGIs)通常编码产物或在农业，园艺，林业和/或其它工业应用中有用的分子。另外，所述的基因产物还有一些其他的可行用途。一般，所述的DNA序列对有性繁殖多细胞生物(SRMO)而言是外来或异源的，但有时候也可以使用或插入同源的核酸或DNA序列，如多拷贝，未获得可选择的有用产物数量的串联插入。换言之，所述的DNA序列可由一个基因或核酸序列或多拷贝的基因组成。另外为使复杂的代谢途径易于表达，几个不同的基因可以多拷贝或串联插件的形式引入。在本发明的特定实施方案中，所述的阻断构建体(BC)本身作为目标转基因(TGI)。术语＂阻断＂是一种分子控制机制，例如某种核苷酸序列的表达阻断，阻止或对存活，生长，发育和/或有性繁殖至关重要的功能，并能在DNA，mRNA，蛋白或代谢水平上抑制分子机制的发展。如果所述的分子机制在一个发育循环中的敏感或脆弱的时刻应用将导致死亡，表型改变，早期或晚期种子萌发或开花，不能形成花序，花或果实，形成矮化表型或一些其他抑制转基因的有性繁殖多细胞生物(SRMOs)在天然条件下自由杂交或杂种繁殖的形态改变。术语＂天然条件下＂指生长条件，其通常是在有性繁殖多细胞生物(SRMO)的生长或产生过程中的环境参数，包括温度，湿度，照射，土壤的化学组分，包括在农业，园艺，林业以及自然条件下生长的动植物。术语＂转基因向环境中的逃逸”指阻止转基因通过杂交，或亲代的转基因生物与其野生型的、或培养的非转基因亲缘生物的杂交，而使转基因向自然界泄露。换言之，避免通过有性杂交转移不需要的基因，并禁止转基因的释放。防止所述的转基因生物生长，有性繁殖或发育有活力的后代。这是通过使阻断构建体(BC)在正常的，天然的，非操纵的，无处理或干预的条件下行使功能来实现的。所述的天然的，非操纵的条件阻断，抑制，破坏或自毁对有性繁殖多细胞生物(SRMO)存活和繁殖至关重要的功能。通过分离，所述的有性繁殖多细胞生物(SRMO)的上述重要功能将导致转基因在自然界中消失。＂恢复阻断的功能＂指对被阻断的功能去阻断，或使被阻断的功能得以恢复以便使用于农业，园艺，林业，工业或其他目的的生产的有性繁殖多细胞生物(SRMO)能进行正常的生长和有性繁殖。去除被阻断的功能，优选地通过从外界施用的人工的，使用者控制或使用者调节来获得。所述的外部施用是指包括下述操作步骤，即自身应用或通过恢复构建体(RC)应用的处理或干预。术语＂外部处理＂和＂外部操作＂是指一些不同于自然状态下在作物生长地所出现的，人工的干预或活动。优选地，其在限定的条件下应用。发明简述本发明与分子生物学相关，提供一中改进的控制转基因分离和向自然种群，或环境中另一转基因或非转基因种群中散播的控制方法和系统。一种与现有技术中已知的不可恢复的阻断系统相反的DNA构建体复合物，此处称作可恢复的功能阻断(RBF)系统是本发明的关键。所述的阻断对包括动植物的有性繁殖多细胞生物(SRMOs)生理或发育极其重要的功能的核苷酸序列。所述的被阻断的功能或导致逃逸的转基因消失，即所述的阻断是转基因的存活所必需的。另外，其导致动植物生理上显著的变化，使所述动植物不能在繁殖。动植物中被阻断实质上可以是分子的生化的或生理的。被阻断功能的恢复包括外界的人工的使用者控制的干预，所述的干预包括化学的物理的或机械的处理，其可以通过或不通过使动植物克服功能阻断的DNA构建体进行。所述技术的一种应用是防止转基因通过在自然条件下的杂交逃逸。本发明可应用于分子生物学，转基因技术，植物生理生化和特定的DNA合成和反义
技术领域：
。因此，本发明涉及对转基因表达或非故意地向环境中逃逸的具有提高的安全性水平的分子控制系统。所述的分子控制系统通过本发明请求保护的可恢复的功能阻断(RBF)系统发挥作用，这意味着这样一种思路，即将目标转基因(TGI)与载体，或包含一个或多个能阻断动植物中的特定功能的DNA构建体的DNA框相连接。所述的阻断导致动植物灭绝或死亡，或以阻止有性繁殖的方式，在自然条件下阻止动植物的发育，改变其表型或生理机能。所述的功能阻断可通过恢复工具的作用得以恢复，所述的恢复工具包括外部的、人为控制的处理，并可选择的包括至少一种编码受外部理化刺激诱导表达、或组成型表达的mRNA，蛋白或酶的DNA构建体。因此，在不应用任何使用者控制的干预的自然条件下，每一种包括带有与可恢复的功能阻断(RBF)系统相连接的目标转基因(TGI)的有性繁殖多细胞生物(SRMO)亲本系，或在例如非故意地泄露或异型杂交的情况下出现的后续子代杂种，将死亡或保持不育。带有可恢复的功能阻断(RBF)系统可以进行修复，即可通过在发育特定阶段的外部操作去除阻断。可恢复的功能阻断(RBF)系统不仅仅是特定的分子构建体，也可以是一种更广泛意义上的工具，其与三个概念构建体，即目标转基因(TGI)，阻断构建体(BCs)和恢复构建体(RCs)以及使用者控制的干预一起发挥作用。所述的目标转基因(TGI)是一种由可恢复的功能阻断(RBF)系统控制的DNA序列。它赋予宿主生物一个或多个在农业，工业生产，林业或园艺中有用的特性。所述的阻断构建体(BCs)和恢复构建体(RCs)属于可恢复的功能阻断(RBF)系统并用于控制转基因有性繁殖多细胞生物(SRMOs)中的目标转基因(TGI)。所述的阻断构建体(BC)阻断特定的生理或分子功能，并阻止带有至少一种与阻断构建体(BC)相连接的目标转基因(TGI)的宿主动植物的杂交或异型杂交。所述的阻断构建体(BC)包含与目标转基因(TGI)相连接的DNA构建体，编码能阻断特定分子或生理功能的因子。这种阻断导致有性繁殖多细胞生物(SRMO)死亡或表型或生理特性改变，使其不能进行有性繁殖。所述的阻断构建体(BC)可以通过产生DNA-重组酶，反义mRNA，RNA酶，毒素，激素，酶促反应或一些其他的分子机制发挥作用。所述的特定功能的阻断还可以包括任何导致在自然条件下阻止有性繁殖多细胞生物(SRMO)有性繁殖的一些表型或生理改变。其可以是例如早期或晚期种子萌发或开花，不能形成花序或果实，形成矮化表型或一些其他形态改变。优选的在阻断构建体(BCs)中行使的分子机制的优选实施例是下述表达-非正常的器官-或发育特异性的酶-在发育中起重要作用的酶或有性繁殖多细胞生物(SRMO)的功能相关的酶的反义mRNA；-毒素；-产生有毒代谢物的酶；或-以有性繁殖多细胞生物(SRMO)所不期望的方式与DNA，RNA或蛋白相结合的酶。在所述阻断构建体(BC)中所出现的核酸序列，优选地表达以破坏或过量产生某种化学物质，如非正常器官的或发育特异性的代谢产物，为特征的酶。这样的酶，例如L-天冬酰胺酶或L-谷酰胺酶。所述的阻断构建体(BC)还可以包含编码对宿主生物发育和/或功能至关重要的酶的反义mRNA的核酸序列，编码核酸酶或核酸重组酶的核苷酸序列。优选的实施例是编码对宿主植物的发育或果实形成(fruitation)非常重要的内向-贝壳杉烯(ent-kaurene)合酶的核苷酸序列。所述的阻断构建体(BC)可以包含编码蛋白酶或毒素的核苷酸序列，例如NPK15蛋白激酶或产生有毒物质或代谢产物，如抗生素的酶。另外，所述的阻断构建体(BC)可以包含编码核酸酶或核酸重组酶核酸序列。所述的用于阻断构建体(BCs)核苷酸序列优选合成的，或利用编码宿主生物中所需产物的基因或核苷酸序列的内含子调节为适合于宿主或内含子偏嗜的。在本发明的实施方案中，优选的合成序列是包括SEQIDNO1的合成的barnase的核苷酸序列。在这种情况下它被改造为植物宿主偏嗜的，而SEQIDNO3被改造为植物基因内含子偏嗜的。在下述信息的基础上可以演化出一种有用的、应用于可恢复的功能阻断(RBF)的构建体和/或技术。可以通过表达负责关键功能的特定酶反义的mRNA，利用反义技术阻断植物的关键功能。反义mRNA可以阻断在特定发育阶段的植物的表达。例如阻断拟南芥(Arabidopsis)合酶A内向-贝壳杉烯(ent-kaurene)的表达可以导致植物的矮化表型(Sun和Kamiya，1994，PlantCell，61509-1518)。内向-贝壳杉烯(ent-kaurene)合酶是赤霉素生物合成途径中的关键分子，赤霉素是一种重要的植物激素。内向-贝壳杉烯(ent-kaurene)合酶A是单拷贝基因编码的，可以通过反义技术阻断。如果反义mRNA分子在萌发阶段表达，可以通过外加施用GA3来弥补赤霉素的缺乏(实施例2)。另一个实施例是由反义mRNA阻断萌发的种子中的谷氨酰胺合酶的表达。所述的谷氨酰胺合酶是萌发的种子中所有氨基酸转化的关键酶(Temple，etal.，1993，Mol.Gen.Genet.236315-325)。阻断有性繁殖多细胞生物(SRMO)尤其是植物的发育可以通过表达一些来源于细菌的酶例如，L-天冬酰胺酶(Filpula，etal.，1988，Nucl.AcidRes.1610385)或L-谷酰胺酶(Ramakrishnan和Joseph，1996，CanadianJ.Microbiol.42316-325)来实现，所述的酶可以阻断植物细胞中的氮代谢。所述的谷氨酰胺生物合成的阻断可以通过外部施用这一氨基酸来弥补(实施例1)。也可以在更广泛的范围内施用这一技术。可应用的技术例如阻断植物激素的合成，包括阻断植物激素，细胞激动素或ABA的合成，阻断氨基酸的产生或阻断代谢途径。几组不同的意欲控制转基因逃逸的专利申请和出版物描述了几种不同类型的不可恢复的功能阻断。本发明中也应用了许多早期公开的分子机制。例如通过表达经修饰的在napin启动子控制下的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)外毒素A可以在欧洲油菜(Brassicanapus)中实现胚发育的不可恢复的阻断(Koning等1992，PlantMol.Biol.，18247-258)。用在LAT52启动子控制下的白喉毒素A链的表达可以实现花粉不育。可以应用毒素表达实现发育的花粉中的细胞脱离(Twell，1995，Protoplasma，187144-154)。美国专利US5,498,533公开了通过表达正义和反义钙调蛋白构建体可以调节马铃薯的发育。正向的钙调蛋白基因的表达可以提高枝条和块茎的生长，而带有反义构建体的植物表现出枝条和块茎生长的下降。因此，反义钙调蛋白基因的表达可以用作阻断生理功能的因子。有许多毒素或致死基因，它们能阻断植物中的特定功能。几种核酸酶可以摧毁mRNA合成机制。所述Barnase和核糖核酸酶A已成为集中研究的目标。Barnase来源于解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)(Hartley，1989，TrendsBiochem.Sci.14450-454)自从Mariani，等(1990，Nature347737-741)用它在转基因植物用作工程化的可育性控制，其已成为一种最为著名的致死基因。Barnase系统的优势特性在于可有效地阻断植物中RNA酶作用的特定的抑制剂(Mariani，etal.，1992，Nature，357384-387)。因此所述的在植物中通过表达barnase实现的致死功能阻断能通过barstar基因的表达得以恢复(WO94/03619，WO00/37660)。几种催化或溶胞致死蛋白可阻断特定的功能。来自肥皂草(Saponariaofficinalis)的saporin6RIP基因(Barthelemy，等1993，J.Biol.Chem.2686541-6548；GenBankIDSOSAPG，accessionNo.X15655)核糖体抑制剂蛋白(RIP)直接干扰植物细胞中的蛋白表达，而对其他生物没有毒性。在本领域中被广泛评论的是白喉毒素A，它是另一种有效的阻断。它曾多次被用作植物中的条件致死标记基因(Czako和An，1991，PlantPhysiol.(Bethesda)95687-692；Nillson，etal.，1998，PlantJ.15799-804)，这是因为它导致细胞脱离(VanDerGeest，etal.，1996，PlantPhysiol.(Rockville)1091151-1158)。可以通过反义技术的作用去除RIP或白喉毒素A；另外也有通过曼宋酮-D(Madhusoodana，etal.，1998，J.Cell.Physiol.17640-49.)有效地抑制白喉毒素的有关报道。曼宋酮-D一种抑制篦麻毒细胞毒性，Modeccin，假单胞菌属毒素和白喉毒素的倍半萜类orthonaphthoquinone，推定其可用于恢复由在植物中的毒素表达所造成的阻断。已表明铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)外毒素A能特异地抑制烟草胚的发育(Koning，等1992，PlantMol.Biol.18247-258)。本领域中还有一些其他具有潜在应用价值的基因的例子。美国专利US6,022,720公开了调节程序化哺乳动物细胞凋亡的Bax蛋白。Erwiniaamylophlora的hrpN基因产物Harpin在烟草中引起HR，用一种蛋白激酶抑制剂处理可将其阻断(Popham，等1995，Physiol.Mol.PlantPathology，4739-50)。NPK15，一种烟草蛋白-丝氨酸/苏氨酸激酶作为自杀基因阻断宿主细胞的增殖(Ito，等1994，Mol.Gen.Genet.2451-10)。来自土壤杆菌T-DNA负责细胞激动素或植物激素过量产生的基因已用于改变植物表型，即ipt(Redig,etal.，1997，Physiol.Plantarum9989-96)或aux1和aux2基因(Beclin，等1993，TransgenicRes.248-55；Hamza，等1993，Theor.Appl.Gen.86657-664)。上述提及的基因用作致死标记或自杀基因，但没有对其恢复功能阻断的描述。在本发明中，当利用反义技术，或通过在可被恢复基因编码的蛋白所抑制的启动子控制下的阻断构建体(BC)基因表达进行阻断的恢复时，可用几种基因制备用于组装可恢复的功能阻断(RBF)系统的转基因插件(TIs)。这些技术对本领域的技术人员来说都是已知的。制备来在阻断构建体(BCs)中应用的核苷酸序列，优选的是合成的和已改造为宿主偏嗜的，例如编码所需产物的目标转基因(TGI)中存在的合适的、足够大的内含子的植物偏嗜的和/或内含子偏嗜。所述的恢复构建体(RC)，其根据在本发明中应用的可恢复的功能阻断(RBF)系统，当应用外部处理时且不在自然条件下工作时，可任选地恢复被阻断的功能。所述的恢复构建体(RC)包含提供激活或沉默恢复构建体(RC)中的基因或核苷酸序列表达机制的核苷酸序列。所述的核苷酸序列能表达，例如所述阻断核苷酸序列的反义RNA。所述的恢复构建体(RC)中的核苷酸序列可以是，例如基本上与NPK15基因类似的反义RNA，或能够表达可以灭活由阻断构建体(BC)表达的蛋白的核苷酸序列。在一个典型的实施例中，所述的灭活蛋白是Barstar蛋白，其可通过与Barnase核酸酶结合灭活同样的对象。所述的恢复构建体(RC)可以包括能表达产生代谢物的酶的核苷酸，所述的代谢物能补偿由于阻断构建体(BC)的作用所造成的缺陷。另外，所述的恢复构建体(RC)可以包含能表达一种可以将有毒物质或由阻断构建体(BC)产生的代谢物转化成无害产物的酶的核苷酸序列。这样的例子，如编码能转化抗生素，如潮霉素的磷酸转移酶的核苷酸序列。除可选择的恢复构建体(RC)之外的恢复方法和恢复工具包括，使用者控制的干预，用例如用化学物质，如代谢产物，进行外部补偿；对能够利用反义RNA技术，使阻断基因mRNA表达沉默的阻断构建体的启动子的抑制；能够通过特异性结合，蛋白水解或其他蛋白-蛋白相互作用，灭活阻断构建体(BC)的蛋白的表达；能将有毒物质转化为无毒物质的酶的表达；能够补偿或灭活、或与阻断毒性物质、代谢物相互作用的物质或代谢物的表达，以及一些其他可以进行外部调节的分子机制。所述的恢复因子或去除功能阻断的方法可能是外部的使用者控制的干预，包括化学的、物理的和机械的手段。有用的化学手段是例如氨基酸，激素，水杨酸，四环素，等。物理手段或因素包括温度，光照，渗透，重力，湿度。机械手段包括例如系间繁殖或支持纯合的条件。具有在使用者控制下应用的去阻断功能的所述的恢复因素或手段可以包括外部的，调节的转基因序列，如受体，反义RNA，边界，抑制物或经蛋白水解的蛋白，包括酶或它们的产物。所述的外部控制可以是激活应答启动子的刺激物，或对于分离的可恢复的功能阻断(S-RBF)系统可以是一种用于支持纯合条件的系间杂交。依可恢复的功能阻断(RBF)系统的特定模型的不同，恢复被阻断的功能可以由多种途径完成。方便起见，将所述工具或手段依照恢复的类型分为几组，如下被阻断功能的外部补偿，通过在DNA水平上抑制阻断构建体(BC)的作用恢复，用反义RNA技术恢复，在蛋白-蛋白相互作用的水平上恢复，在酶或其他代谢水平上恢复。所述的外部的使用者控制的手段优选地包括下述的干预-外部诱导应答恢复基因/蛋白；-组成型表达所述恢复构建体的核苷酸序列；-外部应用物质或代谢物补偿由阻断构建体的影响造成的缺陷；-利用系内杂交支持恢复构建体(RC)、阻断构建体(BC)和目标转基因(TGI)的纯合条件；-利用化学激活可诱导的恢复构建体(RC)启动子诱导恢复构建体(RC)；和/或-利用物理因素(热，冷，渗透等)可诱导的恢复构建体(RC)启动子诱导恢复构建体(RC)。恢复阻断的手段包括外部应用某种物质，代谢物或激素以补偿由阻断构建体(BC)的影响所产生的缺陷。所述的物质例如可通过外部向植物施用的赤霉素，或内向-贝壳杉烯(ent-kaurene)合酶A的反义mRNA。与操纵子序列结合的控制阻断核苷酸序列表达的阻遏物肽或蛋白，也可以用作恢复被阻断功能的手段。有用的阻遏物和操纵基因的实施是Tnl0tet阻遏物蛋白和tet-操纵基因DNA序列。所述的阻断核苷酸序列的反义RNA的表达可用于激活阻断构建体(BC)表达的沉默机制。上述的表达包括，例如NPKIS基因反义RNA的表达。激活由阻断构建体(BC)表达的蛋白的蛋白的表达可进一步用作恢复被阻断功能的手段。灭活由阻断构建体(BC)表达的蛋白的蛋白是例如，Barstar蛋白，其通过与Barnase核酸酶结合将其灭活。表达能够补偿下述缺陷的代谢物的酶是一种有用的恢复手段，所述的缺陷是由阻断构建体(BC)的作用而造成的。能将有毒物质或阻断构建体(BC)产生的代谢物转化成无害产物的酶的表达是一种可能的恢复手段。有用的例子是由能转化抗生素特性的酶提供的。一个可提及的例子是潮霉素磷酸转移酶。被阻断功能的外部补偿可应用于导致缺乏物质，代谢物或激素的可恢复的功能阻断(RBF)中。物质或分子的缺乏可用外部添加相同的或类似物分子来弥补，例如阻断内向-贝壳杉烯(ent-kaurene)合酶在萌发的种子中的表达(实施例2)。L-天冬酰胺酶或L-谷酰胺酶的表达导致天冬酰胺/谷氨酰胺的缺乏(Temple等，1993，Mol.Gen.Genet.236315-325)，但可以通过在种子萌发过程中从外部添加谷氨酰胺得到补偿(实施例1)。通过在在DNA水平抑制阻断构建体(BC)的作用的恢复可应用于任何阻断基因。所述表达的抑制由具有边界阻遏物元件的特定DNA序列进行。阻遏物元件可以是蛋白RNA或DNA。其可以是任意DNA序列，该DNA序列的表达可以阻止阻断构建体(BC)的表达。所述阻遏物分子应由置于可诱导启动子控制下的恢复构建体(RC)表达。例如，在负责与阻遏物蛋白结合的tet操纵子DNA序列位于阻断构建体(BC)启动子内的情况下，已知的Tnl0tet阻遏物蛋白(Gatz和Quail，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，851394-1397；Gatz，etal.，1991，Mol.Gen.Genet.227229-237)可作为恢复元件(实施例7)。所述的表达阻遏物蛋白的恢复构建体(RC)可整合到另一非等位染色体中用于分离的可恢复的功能阻断(S-RBF)系统(实施例7)。利用反义RNA技术恢复应用于多数已报道的，作为由反义技术恢复的可恢复的功能阻断(RBF)系统条件致死标记基因。已表达的阻断基因负链mRNA引发沉默机制，其将宿主有性繁殖多细胞生物(SRMO)从特定的功能阻断中挽救出来。如果所述毒素蛋白具有抑制剂蛋白或酶促产生的抑制剂代谢物，所述的恢复是在蛋白水平上进行的。所述的抑制剂可以是与所述毒素结合的蛋白或通过蛋白水解将所述毒素灭活的蛋白。对这种相互作用最著名的实例是Barnase-Barstar机制(实施例3-7)。依照本发明所述的抑制剂可以是一些酶促产生的能灭活毒素的影响的分子。例如，如果所述的阻断因素是过量产生物质或代谢物，可用能阻断过量产生物质或代谢物的酶的类似物分子进行恢复。如果所述的毒素是由阻断基因编码的酶所产生的物质或代谢物，所述的抑制剂可以是灭活所述有毒物质的酶。例如可能由于抗生素的表达造成所述的阻断，则通过这种抗生素的特定磷酸转移酶的作用可以实现抑制上述作用使所述的阻断得以恢复。所述的恢复被阻断的功能的手段可由下述方式提供，即通过外部应用某种物质以补偿由阻断构建体造成的缺陷。一个优选的实施方案是向表达内向-贝壳杉烯(ent-kaurene)合酶A的反义mRNA的DNA构建体提供赤霉素，或表达与操纵子序列结合的阻遏物肽/蛋白，其控制阻断基因表达，可以是，例如Tnl0tet阻遏物蛋白和tet-操纵基因DNA序列。为提供提高的控制安全性水平，即本发明的主要目的，本发明的三个概念构建体即目标转基因(TGI)，阻断构建体(BC)和恢复构建体(RC)之间的相互作用是非常重要的。所述的阻断构建体(BC)和目标转基因(TGI)应彼此紧密连接。因为所述的阻断构建体(BC)控制目标转基因(TGI)的逃逸，所述的构建体应紧密连接，以尽可能地缩小或完全排除杂交。构建体应当置于至少同一个体生物中的同一转基因插件(TI)，优选地位于目标转基因(TGI)的内含子。如果使用多于一个阻断构建体(BCs)直接置于含目标转基因(TGIs)置于两阻断构建体(BC)之间的转基因插件(TI)的两侧。它们应该尽可能极端接近地连接。为了使阻断构建体(BC)和目标转基因(TGI)相分离的可能性降到最低，可将阻断基因插入到目标转基因(TGI)的内含子中。这在实施例5中已有描述。在这种情况下，在不同时破坏目标转基因(TGI)在转基因的情况下阻断构建体(BC)的大量突变几乎是不可能的。barnase基因(阻断构建体(BC))以相反的方向插入到目标转基因(TGI)(uidA或GUS)的内含子已在图5和6中示出。阻断构建体(BC)的启动子与目标转基因(TGI)多聚腺苷酸信号一致。所述uidA基因的第二外显子与barnase的3′UTR一致。Barnase的编码序列位于uidA基因的内含子中。Barnase的多聚腺苷酸信号的一部分与uidA基因的内含子一致，一部分与uidA基因的外显子一致。所述内含子-插入式的阻断构建体(BC)作为提高转基因逃逸安全性的分子控制手段。所述的DNA构建体可以包含，例如经改造适合于插入到目标转基因(TGI)内含子中的阻断构建体(BC)的合成核苷酸序列。所述的目标转基因(TGI)的内含子是，例如经改造适合于以与有用基因相反的方向置于所述内含子中的阻断构建体(BC)的核苷酸序列。当将与barnase基因序列基本同一且具有SEQIDNO3的核苷酸序列的插入时即提供了这样的一个例子。一个用于本发明的DNA构建体的优选的实施例是经改造后适合于植物表达的合成的barnase和barstar基因序列序列，分别是SEQIDNO1和SEQIDNO2。所述的DNA构建体复合物进一步以如SEQIDNO4中所示的，与一适应在PUC19克隆载体中的β-半乳糖苷酶表达的开放阅读框(ORF)一起设计的多克隆位点为特征。在本发明的优选实施方案中，所述的双重可恢复的功能阻断(D-RBF)和三重可恢复的功能阻断(T-RBF)，包含一个或多个目标转基因(TGIs)的转基因插件(TI)置于带有便于不同的目标转基因(TGIs)插入到合适的受体细胞中的多克隆位点两个阻断构建体(BCs)之间。所述的阻断构建体(BC)或引起阻断的因素可以包含任意编码受体，反义RNA，核酸酶，毒素，酶或其他产物的核苷酸序列。当阻断基因具有在工业上有用的特性时，所述的阻断核苷酸序列可处于与形成自我支撑的个体的目标转基因(TGI)相同的独特的位置。通常所述的阻断构建体(BC)和目标转基因(TGIs)是不相同的。所述的恢复构建体(RC)优选地置于相同的生物或有性繁殖多细胞生物(SRMO)中，而非象一些现有技术中的实施方案一样位于不同的个体生物中。所述的恢复构建体(RC)和阻断构建体(BC)依照可恢复的功能阻断(RBF)的类型不同，可处于紧密相连或反向-位置，甚至不同的染色体上。当所述的可恢复的功能阻断(RBF)的恢复包含对缺失的特定代谢物的外部补偿时，则不需要恢复构建体(RC)。在分离可恢复的功能阻断(RBF)系统中，所述的恢复构建体(RC)应位于与带有阻断构建体(BC)不同的非等位染色体上。阻断构建体(BC)的表达可以是组成型的或由器官或发育特异性暂时性的。所述的恢复构建体(RC)的表达可以是对外部刺激的应答，或如同在分离的可恢复的功能阻断(S-RBF)系统中那样组成型表达。阻断构建体(BC)组成型表达导致对转基因最高等的控制。所述的恢复机制依赖于外部的处理和刺激。如果所述的阻断包括缺乏物质，代谢物或激素，则对所述组成型表达的阻断的恢复可通过外部补偿所述化合物的缺陷来进行(实施例1)。如果所述的恢复包括在可诱导的启动子控制下的产物的表达，则对启动子的诱导应当是连续的。这意味着人工恢复因素应在转基因植物的整个生命循环的过程中应用。停止所述的处理后，由于阻断构建体(BC)的作用，所述的植物将立即死亡。阻断因素的表达可以是组成型的或时空性的，即器官或发育特异性的。恢复因素的组成型表达可应用于分离的可恢复的功能阻断(S-RBF)系统。所述恢复因素的表达也可以是依赖所应用的特定可恢复的功能阻断(RBF)系统机制，受外部刺激诱导的。阻断构建体(BC)可在宿主生物中组成型地或器官-或发育-特异性的或时空性的方式表达，由于下述情况出现所述的恢复，所述的情况为外部补偿由所述阻断所造成的缺陷，或通过外部诱导可应答恢复基因/或蛋白，或组成型或瞬时表达恢复基因。位于不同的非等位染色体阻断构建体(BC)和恢复构建体(RC)组成的，及发育-或器官特异性地表达产生分离的可恢复的功能阻断(S-RBF)，起包含对转基因最方便的控制(实施例5-7)构建此种控制最显然的方式是多重，即双重或转化。首先，组成型表达的恢复构建体(RC)转化到有性繁殖多细胞生物(SRMO)中。第二，含与阻断植物特定功能的目标转基因(TGI)相连的构建体转化到另一非等位染色体。经证明转化子或它们与非转基因植物的杂种具有单拷贝的基因，并且所述的构建体位于不同的染色体上。两构建体的纯合体在田地里生长。如果转基因有性繁殖多细胞生物(SRMO)或植物与任何其他的有性繁殖多细胞生物(SRMO)或植物杂交，则第一杂种子代将存活下来，这是由于对所有的植物而言，可恢复的功能阻断(RBF)中的基因均是杂合的。从第二杂种世代开始，每一带有阻断基因的第二杂种植物均将死亡，这是由于可恢复的功能阻断(RBF)的恢复和阻断基因在减数分裂过程中将分离到不同的细胞中。因而，分离的可恢复的功能阻断(S-RBF)的恢复包含有性繁殖多细胞生物(SRMO)系间杂交的支持(WO00/37660)。阻断构建体(BC)仅在第二杂种子代中开始工作，并导致转基因构建体的50％负筛选。适于组成型表达的启动子是来自CaMV的35S(Condit，etal.，1983，J.Mol.Appl.Gen.(USA)，2301-314；Zaitlin，etal.，1985，Biotechnologyinplantsciencerelevancetoagricultureintheeighties.Orlando，Fla.(USA).Academicpress，227-235；Williamson，etal.，1989，PlantPhysiol.，901570-1576)，NOS(Depicker，etal.，1982，J.Mol.Appl.Gen.(USA)，1561-573)，OCS(DeGreve，etal.，1985J.Mol.Appl.Gen.(USA)，1499-511)等。用于器官或发育-特异性表达的启动子可由广泛的组中获得。对于分离的可恢复的功能阻断(S-RBF)与启动子是否泄露无关。阻断和恢复构建体(BCs和RCs)均在使得所述在宿主植物的同一组织中并行的构建体表达的同种启动子控制下表达非常重要。可恢复的功能阻断(RBF)基因的器官，发育和诱导特异性表达，导致转基因植物生命周期的关键阶段的时序控制，而需要外部刺激来恢复被阻断的特定功能。所述的时序表达涉及的发育阶段可以是种子萌发，开花，胚或果实，花序形成，茎或根的延长等。阻断构建体(BC)仅在转基因植物发育发育的特定阶段表达，使得恢复过程比组成型表达的情况更短，更容易(实施例3)。阻断基因的表达可通过器官或发育-特异性的启动子调节，恢复基因的表达应由可诱导的启动子调节，特别是如果当所述的恢复不基于特定代谢物缺乏的外部补偿的情况。因而带有时序表达的可恢复的功能阻断(RBF)的作物只有在特定的发育阶段或特定的器官中才需要人工恢复。如果没有所述的恢复，该植物将死亡或天然条件下在特定的发育阶段具有改变的表型。所述的器官或发育特异性的启动子的重要特性是其把分离的可恢复的功能阻断(S-RBF)排除在外的高特异性。换言之，所述的启动子应当正确表达，而非“泄露”启动子，因为若在所不期望的阶段表达所述的阻断构建体会杀死植物或妨碍其发育。阻断构建体(BC)在天然条件下的组成型表达是构成可恢复的功能阻断(RBF)的可行方式。如果阻断构建体(BC)在有性繁殖多细胞生物(SRMO)或植物发育的特定阶段，在特定的启动子控制下表达，所述的恢复构建体(RC)在可以致的启动子，例如经修饰的CaMV的35Sp或带有Tnl0tet阻遏物的NOSP(Gatz和Quail，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，851394-1397；Gatz，etal.，1991，Mol.Gen.Genet.227229-237)的控制下表达。所述的启动子在生命周期中被位于组成型的启动子控制下的第三个基因所表达的蛋白抑制(实施例4)。恢复元件的启动子只有当外部刺激(化学的或物理的)去除了阻遏物元件之后才能启动。对tet阻遏物的情况，在四环素存在下所述的结合蛋白改变其自身的构象，并激活被阻遏的构建体的表达。在这种情况下，所述的恢复是在阻断构建体(BC)表达过程中四环素对转基因植物的处理。另一种可能的方案上在相同的器官特异性启动子的控制下三个基因全部表达。在这种情况下，应将所述的Tnl0tet操纵子引入所述的恢复基因启动子中(Lanzer，etal.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，858973-8977)。为发展或构建时序表达的可恢复的功能阻断(RBF)系统，应研究用于阻断构建体(BC)可能的表达的器官或发育特异性启动子。几种启动子在表达中表现种子萌发特异性。不幸的是每一启动子在其他发育阶段也表现出一定的“星”表达。SH-EP或EP-C1半胱氨酸内肽酶特异地使贮存蛋白降解。它们是在萌发的种子中高表达的蛋白。也可以观察到在衰老的组织子叶，豆荚和甚至茎中中的附加表达。这些基因具有约1200-1700bp的大启动子区域。EP-C1半胱氨酸内肽酶已从菜豆(Phaseolusvulgaris)(Ogushietal.，1992，PlantMol.Biol.19705-706)中克隆出来并和在缺失分析系列的转基因烟草幼苗(Yamauchietal.，1996，PlantMol.Biol.30321-329)中表达。在成熟的豆荚中表达使得用该启动子在萌发的种子中表达阻断构建体(BC)成问题。SH-EPsulfhydril内肽酶(1676bp.)启动子已从短弹毛豇豆(Vignamungo)(AKASOFUetal.，1990，Nucl.AcidRes.181892)中克隆出来并作为SH-EP-半胱氨酸内肽酶(Yamauchietal.，1996，PlantMol.Biol.30321-329)进行了研究。它只在萌发的幼苗中表达。在成熟的豆荚中只检测到低附加量的表达。表达的萌发开始的第二天后开始。在萌发的种子中mRNA的表达峰出现在第三天，蛋白水平的表达峰出现在第四天。酶活性一直持续到第五天到第六天，然后减弱。克隆的带有其自身启动子的基因构建体在转基因烟草中比在短弹毛豇豆(Vignamungo)中产生更多的蛋白。在烟草的胚中也发现了所述启动子的作用。因此，依照本发明，在种子发育和种子萌发过程中，这一启动子可特别应用于双重可恢复的功能阻断(D-RBF)系统。LEA在胚发育的晚期阶段(Hughes和Galau，1989；Galau，etal.，1992，PlantPhysiol.99783-788；Devic，etal.，1996，PlantJ.9205-2015)表达。LEA启动子不“泄露”且对晚期胚发育具有高特异性，因此，是用于RBF时序表达的有用启动子。编码咖啡酸O-甲基转移酶(COMT)酶的基因的启动子以一种极端特异的方式在多年生的黑麦草(Loliumperenne)的茎中表达一种蛋白(McAlister，etal.，1998，AustralianJ.PlantPhysiol.25225-235)。在这种启动子控制下的阻断构建体(BC)的表达可阻止花序茎的形成，以及在天然条件下禾本植物的繁殖。620bpMTIA(金属硫蛋白样)基因启动子片段足以指导在转化的棉花根中的表达(Hudspeth，etal.，1996，PlantMol.Biol.31701-705)。依照本发明，其可用于阻断根的发育。有用的启动子的实施例是在萌发中具有活性，在幼苗中被蔗糖抑制、被GA3灭活的苹果酸盐合酶(MS)和异柠檬酸裂合酶(ICL)启动子。已知在开始衰老的器官和萌发的花粉中有附加表达。在黄瓜(Reynolds和Smith，1995，PlantMol.Biol.27487-497)，油菜籽(Zhangetal.，1994，PlantPhysiol.104875-864)和番茄(Janssen，1995，PlantPhysiol.1081339)启动子控制下的时空表达已在烟草和油菜籽中进行了详细的研究。苹果酸盐合酶(MS)具有广泛的表达谱，但在萌发特异性表达方面欠理想(Sarahetal.，1996，Mol.Gen.Genet.250153-161)。异柠檬酸裂合酶(ICL)和苹果酸盐合酶(MS)启动子在花粉中具有活性且在双重可恢复的功能阻断(D-RBF)系统中有用。与在幼苗中的表达相比，欧洲油菜(B.napus)的MS和ICL启动子在花粉中具有1％平均活性(Zhangetal.，1994，PlantPhysiol.104857-864)。这些启动子在开始衰老的器官，如子叶中的表达微弱(Grahametal.，1992，PlantCell4349-357)。它们可在黑暗中被灭活并可被蔗糖，葡萄糖和其他的糖所抑制(Grahametal.，1994，PlantCell6761-772)异柠檬酸裂合酶(ICL)在成熟的种子中的表达可在幼苗中实现显著的表达水平(-5-10％)(Turley和Trelease，1990，PlantMol.Biol.14137-146)。MS和ICL作为顺势作用元件已进行了详尽的研究(Sarah等1996，Mol.Gen.Genet.250153-161)。可对赤霉素产生应答的小麦catepsinB-样蛋白(Cejudoetal.，1992，PlantMol.Biol.20849-856)启动子的17bp片段已有报道。AMY(高P1)-α-淀粉酶在萌发过程中的胚乳中具有活性。所有已知的淀粉酶启动子也在菜豆(Phaseolusvulgaris)和短弹毛豇豆(Vignamungo)植物的不同的器官中具有活性(Minamikavaetal.，1992，PlantCellPhysiol.33253-258)。存在已知的来自大麦的GA3诱导的P1淀粉酶(Rahmatullahetal.，1989，Plantmol.Biol.12119-121)β-1，3葡聚糖酶在萌发过程中的胚乳中具有活性。这是一种由GA4诱导的抗真菌蛋白。它在叶和其他器官中也有活性并且是可诱伤的(Vogeli-Langeetal.，1994，PlantJ.5273-278)。也存在许多其他用于时序表达的备选启动子并且其数量每年递增。负责恢复阻断构建体(BC)作用的基因需要对外部刺激产生应答的启动子。所述的外部刺激可以是化学或物理的。化学刺激可以是任何可以调节启动子活性的分子。物理刺激可以是温度，渗透，光照，重力或其他。下述两种类型的启动子可以作为对外部刺激进行应答的实例水杨酸盐和热激诱导启动子。水杨酸盐诱导启动子包括在病毒或其他病原和其他应激反应之中。发病机理-相关的Pala蛋白基因的启动子已在转基因烟草5′缺失实验中进行了研究(Ohshima，etal.，1990，PlantCell295-106)。在另一缺失实验中，在902bpPR-LA启动子中发现了几个调节元件(VandeRHEE，etAL.，1990，PlanMol.Biol.21451-461；Payne，etal.，1988，PlantMol.Biol.1189-94；Pfitzner，etal.，1988，Mol.Gen.Genet.211290-295)。所述启动子的活性在经水杨酸诱导24-48小时后提高接近由TMV诱导所得结果。热激启动子在不同的植物中以不同的深度进行了研究。它们的活性常比35S启动子高几倍。HS启动子的诱导通常发生在周围环境的温度升高到35-45℃的时候(Ainley和Key，1990，PlantMol.Biol.14949-967)。热激启动子的负面特性是它们在幼苗中表达，且其活性也受物理条件的刺激。另一有用的启动子是玉米谷胱苷肽-S-转移酶基因启动子(GSTII-27)，其可被除草剂SafenersR-25788(WO94/03619)激活。美国专利US5，880,333报道了化学控制的启动子表达。Tnl0tet阻遏物系统(Gatz和Quail，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，851394-1397)被化学试剂四环素激活，但其机制与标准的诱导相反。这一系统需要两个基因。第一，在含tet操纵基因的启动子控制下的恢复基因。第二置于组成型的或器官和/或发育应答性的、编码与tet操纵基因DNA信号序列结合的阻遏物蛋白的启动基因控制下的基因。在外部施用四环素激活所述的恢复基因前，所述的系统处于抑制状态下。本发明涉及包含一个或多个转基因插件(TIs)的载体和质粒，其可用于组装形成本发明的DNA构建体复合物或可恢复的功能阻断(RBF)系统；还涉及所述可恢复的功能阻断(RBF)系统在转基因转移到有性繁殖多细胞生物(SRMO)，包括植物和非人动物后，提供在控制基因分离和基因逃逸中提高的安全性水平方面的应用。所述的载体，质粒和DNA框可以转移到有性繁殖多细胞生物(SRMO)的细胞中，一形成转基因的植物或动物细胞或细胞系，以及最终的转基因动物或植物。分离和/或向环境中逃逸的控制水平可通过可恢复的阻断构建体提高，只要经过适当的指导农民或其他最终使用者均可使用并再次使用所述的阻断构建体。在实际的应用中带有可恢复的功能阻断(RBF)系统转基因植物可以在大田中生长，与非-转基因植物没有区别。带有可恢复的功能阻断(RBF)系统的作物植物通常在特定的发育阶段需要外部的处理以恢复被阻断的功能。该方法仅对应用于植物的情况进行了详细地描述，但对应用于动物的情况也是等同的。上述分析使得侯选的构建体和机制能在不同的可恢复的功能阻断(RBF)系统的控制基因分离和逃逸的范围、可靠性和方便程度方面进行比较。本发明的可恢复的功能阻断(RBF)系统的优越性在于其排除阻断构建体(BC)的能力和同时进行的目标转基因(TGI)的作用。有些情况下，通过交换或阻断构建体(BC)突变或通过特定的沉默机制进行的阻断失败。当对于这些基因宿主植物的基因型是杂合的情况，交换能分离阻断构建体(BC)和所控制的目标转基因(TGI)。所述的阻断构建体(BC)和所控制的目标转基因(TGIs)越接近，所述构建体分离的可能性越小。在不损害目标转基因(TGI)的前提下，阻断构建体(BC)在目标转基因(TGI)内含子中的定位大体上减少了阻断构建体(BC)分离或突变的可能性，这是因为所述基因的信号和编码序列一致。阻断构建体(BC)组成型的表达导致对阻断的持续的压力。因此，优选地，阻断构建体(BC)在器官-或发育-特异性的启动子控制下表达。分离的可恢复的功能阻断(S-RBF)系统可以提高分离的可能性，或使对阻断构建体(BC)和目标转基因(TGI)的抑制相分离，这是因为几种与其他植物的杂交，而两种在目标转基因(TGIs)两侧的不同的阻断构建体(BCs)，即双重可恢复的功能阻断(RBF)系统彻底地降低了阻断失败的可能性。这些预防手段的使用排除了阻断构建体(BCs)功能衰竭的可能性。多重或三重可恢复的功能阻断(M-RBF或T-RBF)系统与所有的双重倒转可恢复的功能阻断(RBF)系统的最优特征相结合。它赋予了比分离的(单一或倒转)可恢复的功能阻断(SR-RBF)系统更强的负筛选。三重可恢复的功能阻断(T-RBF)与分离的可恢复的功能阻断(S-RBF)系统一样，除系内杂交或交换外不需要特别地处理。与倒转可恢复的功能阻断(SR-RBF)系统一样，它阻止任何转基因构建体流入环境中。与双重可恢复的功能阻断(D-RBF)系统一样，通过双重方式阻止，因此更为安全。因为用于组装可恢复的功能阻断(RBF)系统转基因插件(TIs)所需的不同的核苷酸序列处在置于不同的非等位染色体三个不同的转基因插件(TIs)上，因此构建起来非常容易。它能使用预先制备好的受体有性繁殖多细胞生物(SRMO)系以克隆目标转基因(TGI)。概述所评述的模型，目前最最方便，可靠和安全的可恢复的功能阻断(RBF)系统是三重可恢复的功能阻断(T-RBF)系统。可使用带有不同且能在不同的启动子控制下表达的基因作为阻断基因。它们应置于所述转基因或目标转基因(TGI)的两侧。下述实施例中描述了不同的可恢复的功能阻断(RBF)系统的构建和应用它们只作为说明，不应用于对请求保护的范围的限定。实施例1组成型表达阻断构建体(BC)L-天冬酰胺酶L-谷酰胺酶排除的代谢物的连续补偿；通过外部应用L-天冬酰胺酶/L-谷氨酰胺进行恢复所述基因的图解位置如图1A中所示。可恢复的功能阻断(RBF)系统是该系统在代谢物水平-在这里即氨基酸或氮代谢水平上，如何工作的一个实施例。这是控制性最强的可恢复的功能阻断(RBF)系统。氮代谢的阻断由于缺乏氨基酸导致致死的结果，尤其在种子萌发的过程中。所述的L-天冬酰胺酶在富含天冬酰胺的衰老组织中具有活性。该酶在生理活性的组织中表达能一直正常的氮代谢。阻断构建体(BC)置于紧邻有用基因或有用基因之间的位置。来自狭叶羽扇豆(Lupinusangustifolius)(Dickson，etal.，1992，PlantMol.Biol.20333-336)菊欧文氏菌(Erwiniachrysanthemi)(Filpula，etal.，1988，Nucl.AcidRes.1610385)，拟南芥菜(Arabidopsisthaliana)(Casado，etal.，1995，PlantPhysiol.1081321-1322)或其它来源的L-天冬酰胺酶可在NOS，OCT，35S或其它组成型启动子的控制下表达。所述酶的组成型表达的导致宿主植物持续地依赖外界提供的天冬酰胺。当目标转基因对人或环境造成真正的威胁则需要对所述细菌进行严谨的控制。所述的分子构建体在图1A中进行了描述。实施例2内向-贝壳杉烯(ent-kaurene)合酶A的反义mRNA在turniprape萌发的种子中中的时序表达通过外部施用赤霉素恢复所述基因的图解位置如图1B所示。所述的可恢复的功能阻断(RBF)系统在RNA沉默水平工作，所述的阻断在激素水平工作。在编码内向-贝壳杉烯(ent-kaurene)合酶A单拷贝基因中的突变导致拟南芥菜(Arabidopsisthaliana)的矮化表型。由于阻断了赤霉素在turniprape植物中的合成，所述酶的反义RNA的表达也导致相同的表型改变。由于所述的酶处于短弹毛豇豆(Vignamungo)SH-EP(EP半胱氨酸内肽酶)启动子的控制之下，所以这是一种功能的时序阻断。反义内向-贝壳杉烯(ent-kaurene)合酶A的表达在胚形成晚期开始并在种子萌发的阶段升高。带有可恢复的功能阻断(RBF)的宿主植物发育成一种矮化表型并且不能在自然条件下繁殖。这一功能阻断的恢复包括外部施用赤霉素。已表明可以通过施用赤霉素使正常的植物从拟南芥菜的矮化表型恢复过来(Xu，etal.，1997，PlantPhysiol.(Rockville)1141471-1476；Phillips和Huttly，1994，PlantMol.Biol.24603-615)。实际上，转基因作物的种子应用含有赤霉素的混合物包被以获得具有正常表型的植物。所述的分子构建体如图1B所示。实施例3由SH-EP内肽酶启动子控制的带有barnase的可恢复的功能阻断(RBF)；HS热激启动子控制的barstar基因的恢复所述基因的图解位置如图2所示。所述的可恢复的功能阻断(RBF)系统在蛋白相互作用的水平起作用。它是由来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)的barnase和barstar基因组成的(Hartley，1989，TrendsBiochem.Sci.14450-454)。自从Mariani，等(1990，Nature347737-741)用Barnase在转基因植物用作工程化的可育性控制，其已成为一种最为著名的致死基因。当Barnase在植物中表达时，它通过破坏RNA分子阻断所有基因的表达。作为阻断构建体(BC)barnase基因在由短弹毛豇豆(Vignamungo)克隆的，原先称作巯基-内肽酶启动子(AKASOFUetal.，1990，Nucl.AcidRes.181892；Yamauchietal.，1996，PlantMol.Biol.30321-329)半胱氨酸内肽酶启动子(SH-EPp)的控制下表达。所述的恢复构建体(RC)包含置于大豆热激蛋白启动子(HSp)(AINLEY和Key，1990，PlantMol.Biol.14949-967)控制下的barstar基因。合成的barnase置于SH-EP启动子之下，允许在转基因烟草的胚形成和种子萌发过程中表达。带有四个基因的构建体的图解结构如图2所示。所述的DNA构建体还包含UIDA(GUS)代表有用基因，hpt基因作为筛选标记。UIDA基因克隆在CAMV35S启动子之下，在hpt基因处于植物肥大病菌属、土壤杆菌的NOS启动子之下。所有的四个基因均置于一个基于pBINL9T-DNA(pGPTV-HPT)的载体上(BevanM.，1984，Nucl.AcidRes.12871-8717；FRISHETAL.，1995，PlantMol.Biol.27405-409)。为研究HSp和SH-EPP的表达，用所述启动子驱动下的UIDA基因转化烟草。对转基因烟草的研究表明HS启动子在生殖器官中低水平表达泄露的GUS酶。证明在萌发的第三天出现一个微弱的峰，在没有外界刺激的情况下在其后的几天中衰减。其通过对+37-45℃的高温处理0.5-3小时的应答而被激活。对于所述的HS启动子在+40℃处理1小时做活化处理。在HS启动子控制下的GUS的表达，在头两天中有所升高并在热激后持续至少3-4天。所述的SH-EP启动子在胚和幼苗中表达GUS酶。在SH-EPP控制下的GUS活性的峰值在胚发育的中期或晚期出现并在发芽后的第三到五天再次出现。SH-EP启动子在烟草的其他器官中不表达。用含有UIDA基因有用基因，hpt选择标记基因和带有barnase和barstar基因的可恢复的功能阻断(RBF)进行转化后，几种烟草均得到恢复。所述的带有可恢复的功能阻断(RBF)构建体转基因烟草呈正常表型。它们非常正常地生长，开花，并在自花授粉后产生种荚。所述植物的种子也呈正常的大小。但是它们不能发芽。在萌发过程进行热激处理也不能使转基因种子的发芽功能得到恢复。如所预测的那样胚的发育被在荚成熟时表达的Barnase所抑制。因此，所述种子的胚实际上死亡了。从烟草上切除所有的花序，然后再使所述烟草形成花序。带有新的花和种荚的植物每两天暴露于+40℃下热激处理1小时。从所述烟草上收集成熟的种荚。使所述的种子萌发，在发芽后的第二或第三天用+40℃热激处理至少1小时。经热处理的种子形成正常的幼苗，并长成正常的烟草植株。在没有热激的情况下，所述的种子也开始萌发。但它们中的大多数子叶不能展开。它们表现出苍白的表型并死亡。但部分幼苗可以展开子叶并克服了发育阻断。最明显的，成功萌发的种子积累了相当大量的Barstar蛋白以抑制Barnase在种子萌发过程中的表达。只有对带有种荚-的植物持续进行热激处理才能去除对种子萌发功能的阻断。在从开花到种加变黄的胚发育的不同的阶段，在+40℃下一次热激处理2小时均不能去除对萌发的阻断。对带有种荚和花的植物进行持续的热激处理也没有获得成功。遭受干旱的种荚和种子不能进行适当的发育。非转基因的种子对照在持续的热激处理后萌发了，而带有可恢复的功能阻断(RBF)的种子没有萌发。所述的持续热激处理已使种荚干燥，并且HS启动子也没有在种荚干燥前产生足够量的Barnase。一部分F1萌发的转基因幼苗在GUS实验中有关转基因分离方面并不是阳性，这一转基因系的所有未经热激处理的种子均不发芽。这可以通过下述事实来解释，即尽管在种荚的其他部分也有表达，受SH-EP启动子驱动的GUS的表达在低水平即被记录下来。这意味着不带有可恢复的功能阻断(RBF)的Barnase在胚中也能阻断mRNA的合成。阻断和恢复基因的作用由Northern表达实验得到确证(图3)在SH-EP启动子控制下的bamasemRNA的表达在胚形成的中期(苍白胚)可达到0.1pg/1μg总RNA的峰和在胚形成的晚期阶段(浅黄色胚)下降到0.03PG/μg总RNA。第二个表达缝出现于种子萌发的第三天，在第四天达到0.04pg/1μg总RNA，并于第五天消失。所述的HS启动子在两个发育阶段表现出泄露的barstarmRNA表达，即在0.05-0.2pg/1μg总RNA水平胚和种子萌发。所述的高温处理激活的HS启动子控制下的barstar表达高达1-3pg/1μg总RNA。尤其是，HS启动子活性随后的几次一次性高温处理1到2天而提高。尽管Northern分析表明HS启动子具有高泄露活性，在不经高温处理的情况下，barstar的表达不足以抑制barnase的作用，特别是在胚形成阶段。一般，如果考虑到蛋白表达经常是在其mRNA表达后延迟几小时甚至1天，SH-EP和HS启动子表达的Northern和GUS分析结果是可比较的，可恢复的功能阻断(RBF)构建体如所预期的发挥作用。实际上，可恢复的功能阻断(RBF)系统的恢复包括在种荚发育过程中随后的两天，应用40℃下的1小时热激处理一次，在萌发的过程中至少一次。任何所用到的其他温度处理均不能排除所阻断的种子萌发。可恢复的功能阻断(RBF)可靠地控制目标转基因(TGI)，在此种情况下即uidA的分离和逃逸。如果所述的转基因植物在自然界中也接受同样方式的热处理，则可能不能在接下来的生长季节中重复。所述的转基因植物产生的种子可在易于进行热激的温室条件下生长。在开放的大田中所述的带有可恢复的功能阻断(RBF)系统的转基因植物产生种子，但所述的种子并不萌发。带有可恢复的功能阻断(RBF)的花粉可与相关植物在外界授粉。授粉后产生的种子不萌发。因此，所述的可恢复的功能阻断(RBF)阻止转基因向环境中散播。实施例4利用在一个插件中的目标转基因(TGI)cry9Aa基因和阻断构建体(BC)barnase基因和在其他转基因插件(TI)中的恢复构建体(RC)barstar基因的分离的可恢复的功能阻断(S-RBF)所述基因的图解位置如图4所示。所述的可恢复的功能阻断(RBF)系统包括作为阻断构建体(BC)的由短弹毛豇豆(Vignamungo)克隆的SH-EP内肽酶启动子(SH-EPp)控制下的barnase基因。所述的cry9Aa基因作为目标转基因(TGI)用于所述的构建体。植物转化载体pVK112是在PGPTV-HPT载体(Becker，D.等1992.NewplantbinaryvectorswithselectablemarkerslocatedproximaltotheleftT-DNAborder.PlantMol.Biol.20，1195-1197)的基础上构建的。所述的恢复构建体(RC)，在35Sp或HSp启动子控制下的barstar基因克隆到所述的PGPTV-KAN(Becker，D.etal.，1992.PlantMol.Biol.20，1195-1197)中并转化烟草。以所期望的方式表达barstarmRNA的植物用于带有阻断构建体(BC)和杀虫的有用基因cry9Aa(KuvshinovV.，etal.，2001，PlantSci.160341-353)的PGPTV-HPT载体的第二次转化。带有两个包括HSp-barstar恢复构建体(RC)的插件的植物表现出与具有如实施例3中所述的带有一个插入的可恢复的功能阻断(RBF)的植物相同的特性。带有受35Sp调节的恢复构建体(RC)的转基因烟草表现正常的表型。分离后，如图8所示含一个带有阻断构建体(BC)和单独的cry9Aa基因的插件的种子中的致死表型在与野生型烟草的杂交过程中出现。活着的种子包含两个(BC和RC)构建体或仅一个恢复构建体(RC)或不包含转基因插件。所述的针对含阻断构建体(BC)和cry9Aa基因转基因插入的负筛选在每一子代中为50％。实施例5当阻断基因，barnase位于目标转基因(TGI)内含子中器官特异的启动子下并受器官特异性的(SH-EP)启动子调节时的可分离可恢复的功能阻断(S-RBF)。恢复构建体(RC)是位于不同的非等位染色体上受组成型(35Sp)或热激诱导的(HSp)启动子控制的barstar基因。所述基因的图解位置如图5A和5b所示。所述的可恢复的功能阻断(RBF)在蛋白-蛋白相互作用的水平上发挥作用。阻断基因barnase置于所述的有用基因uidA(GUS)内含子中以组织阻断构建体(BC)和目标转基因(TGI)在交换过程中分离。barnase基因受来自短弹毛豇豆(Vignamungo)的SH-EP启动子的控制。所述的恢复基因barstar，位于不同的非等位染色体上，受相同的启动子控制。用带有内含子诱导的barnase编码序列(图5)的GUS基因的转基因构建体，再转化所述的带有具有受HSp或35Sp启动子控制的barstar基因的恢复构建体(RC)的烟草(如实施例4所述)。由于持续的Barnase表达缺乏，转基因植物与非转基因植物没有区别。当纯合的(BBRR)转基因植物彼此杂交时提供转基因植物的恢复，并且所述的纯合表型在子代中得以延续。当所述的转基因植物与外部的植物杂交，第一代杂种植物也呈正常的表型，但带有杂合的(BbRr)基因型。当阻断和恢复构建体(BCs和RCs)分离到不同的宿主细胞中时，分离的可恢复的功能阻断(S-RBF)从第二杂种世代开始起作用。每一含阻断构建体(BC)的第二杂种胚带有导致植物在胚形成或萌发过程中死亡的Bbrr基因型，上述的阶段依植物种类不同而异。由此，阻断构建体(BC)在与外部植物杂交的过程中进行强烈的负筛选。这种负筛选将在几个世代的过程中从所述种群中排除所述的转基因。带有所述负筛选因子(X)的转基因植物的数量将以下述比例随世代数(n)而减少X＝Y.2-n，其中Y是在大的种群中带有负筛选的起始数字。例如，若杂种植物的起始数字是Y＝1000在n＝10个世代后，带有可恢复的功能阻断(RBF)的植物X将下降到低于1，X＝1000.2-10或X＜1。由于阻断构建体(BC)位于所述目标转基因，(TGI)内部，交换不能使目标转基因(TGI)和阻断构建体(BC)分离到不同的染色体中。带有受热激启动子调节的barstar基因的构建体结合了分离和诱导可恢复的功能阻断(RBF)系统的特性。为了存活和繁殖，所述的转基因植物需要如实施例3中所述的热激处理。将所述目标转基因(UIDA)的序列内含子和多聚腺苷酸信号的序列与启动子，UTR，编码序列和阻断基因(barnase)多聚腺苷酸信号一起考虑。用于所述构建体的内含子的信号序列TA比例为55-70％，5′外显子/内含子边界位点AG/GUAUGU(SEQIDNO5)，位于距3′内含子/外显子边界位点GCAG/G(SEQIDNO7)上游20-50nt的分支点序列(UA)CUAAC(SEQIDNO6)。无论其在内含子中的位置如何，U-富含序列刺激剪切。单一或双重U-到-G取代强烈地抑制剪切。内含子第一和最后50nts中需高含量的AU，特别是U。外显子比内含子中GC含量高15％。RNA聚合酶II转录的终止需要靠近上游元件(NUE)AAUAAA(SEQIDNO8)的转录单位转录中存在多聚腺苷酸信号，但植物在该位点存在多种修饰。远距离的上游元件(FUE)更不保守。FUEs的共同特点是位于NUE前10-40nts的富含U-或UG-的序列。最常出现的是UUUGUA(SEQIDNO9)，有时是UGUGUUUUUU(SEQIDNO10)或UGUUGUG(SEQIDNO11)。所述的切割位点也不是高度保守的。通常它由YA核苷酸组成，位于NUE位点后10-30nts。在启动子区域中有两个不同的框位于距转录起点15-60核苷酸的共有序列TCACTATATATAG(SEQIDNO12)中的TATA和位于TATA上游30-100个核苷酸的CAAT框(SEQIDNO13)或AGGA(SEQIDNO14)框。翻译启动距翻译起点，在优选的序列AACAATGGCT(SEQIDNO12)(粗体的核苷酸是高度保守的)中距AUG密码子下游40-80nt。作为实施例，如图5a所示barnase基因序列位于受SH-EP启动子控制之下的UIDA基因的内含子中。包含插入了阻断构建体(BC)的内含子的烟草，以及包含在水杨酸启动子控制之下的GUS基因的控制植物均表达GUS基因并在GUS-实验中给出阳性结果。但是含截短的GUS-基因的控制植物不表现任何GUS-活性。这一结果表明GUS基因的内含子被正确地剪切了。实施例6.双重阻断构建体(BC)和恢复构建体(RC)置于带有有用基因(GUS)的一个转基因插件中，并分离到不同的非等位染色体所述基因的图解位置如图7所示。所述的可恢复的功能阻断(RBF)系统包括第一阻断构建体(BC)受由短弹毛豇豆(Vignamungo)中克隆的SH-EP内肽酶启动子(SH-EPp)驱动的bamase基因和含受来自欧洲油菜(Brassicanapus)的Cruciferin启动子(CRUP)驱动的相同barnase基因第二阻断构建体(BC)。所述的转基因插件仅包含一个含有受热激启动子(HSp)驱动的barnase基因的恢复构建体(RC)。所述的转基因插件还带有GUS基因作为目标转基因(TGI)，潮霉素磷酸转移酶(hpt)作为选择标记。所述的构建体在用于实施例3的载体上演化。在CRUp控制下的所述的第二阻断构建体(BC)barnase转入目标转基因(GUS)的另一边，排列在GUS和HPT基因之间的载体pVK30(图7A)。对CRUPGUS基因表达的初步研究表明所述的启动子以与SH-EPP相同的方式在胚发育阶段表达。所述的来自pVK30的构建体转化到烟草中。收集GUS-阳性的转基因烟草作进一步研究。实验中所述的双重可恢复的功能阻断(D-RSF)与在实施例3中描述的单可恢复的功能阻断(RBF)一般作用。唯一的区别在于双重可恢复的功能阻断(D-RBF)在突变结果和启动子沉默中灭活的可能性比单可恢复的功能阻断(RBF)估计少约为106。用在pVK30中的最终构建体进行第二中方案。所述的恢复barstar基因已从含pVK31的构建体中去除(图7B)。所述的没有barstar基因的双重阻断构建体(BC)转化到带有barstar基因(在35Sp或HSp启动子控制下表达)的烟草中，如实施例4和5中所述。转化的再生苗通过潮霉素筛选。UIDA基因的表达通过GUS实验检测。所述的两阻断构建体(BCs)在胚成熟过程中表达。Barstar基因在35S启动子控制下组成型表达，并在HSp启动子下热激诱导。带有HSp-调节的barstar基因的一个插件和两个插件的可恢复的功能阻断(RBF)构建体以如实施例3中描述的相同的方式其作用。为使种子成功地萌发，应在种荚成熟阶段对转基因烟草进行热激处理。如图8所示，在35Sp-调节的barstar基因的情况下，当含目标转基因(TGI)的插件与含恢复构建体(RC)的插件相分离后阻断构建体(BCs)将杀死胚。实施例7三重可恢复的功能阻断(RBF)双重可恢复的功能阻断(RBF)系统barnase/barstar和NPKLS/tet阻遏物GUS基因作为置于barnase和NPK15阻断系统之间的目标转基因所述基因的图解位置如图9所示。所述的第一可恢复的功能阻断(RBF)由阻断基因NPK15或可选择的如VanOnchelen等，1986，FEBSlett.198，357-360(BI)中所述的受嵌合的SH-EPP启动子调控并带有插入的tet操纵子序列的编码IndoleAcetamideSynthase的癌基因(IAMS)，以及受来自CaMV的35S启动子驱动的编码Tetl0阻遏物蛋白的恢复基因(R1)组成。所述的第二可恢复的功能阻断(RBF)由受CRUP启动子驱动的barnase阻断基因(B2)和受35Sp启动子驱动的编码barstar基因(R2)组成。所述的转基因植物带有三种位于不同的非等位染色体的不同的转基因构建体。第一构建体包含位于不同的阻断构建体(Bl和B2)之间的有用基因(I)。所述的第二构建体包含与所述第二阻断构建体(B2)相连接的第一恢复构建体(R1)。所述的第三构建体与所述第一阻断构建体(Bl)相连接的第二恢复构建体(R2)。阻断构建体主要在胚形成和萌发阶段起作用。图10描绘了受体转基因系和克隆带有不同的目标转基因(TGI)的双重阻断构建体的植物转化载体。在杂交和杂种繁殖过程中的构建体的分离并在图11中进行了详细描述。序列表<110>尤尼克罗普有限公司(UnicropLtd)<120>通过可恢复的功能阻断(RBF)系统对转基因分离及其逃逸的分子控制<130>A0420PC-<140><141><150>US09/617,543<151>2000-07-14<150>PCT/FI01/00670<151>2001-07-16<160>15<170>PatentInVer.2.1<210>1<211>357<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明-<220><223>说明解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)<220><223>适于植物的barnase基因编码序列<220><223>片段类型全长的编码序列<400>1cgcggatccatggcacaagttatcaacacctttgatggagttgctgactaccttcagacc60taccataagcttccagataactacatcaccaagtctgaggctcaggctcttggatgggtt120gcttctaagggaaaccttgctgatgtcgctccaggaaagtctatcggaggtgatatcttc180tctaacagggagggaaagcttccaggaaagtctggaaggacctggagggaggctgatatc240aactacacctctggattcaggaactctgataggatcctttactcttccgactggcttatc300tacaagaccactgaccactaccagaccttcaccaagatccggtgagagctcgagcgc357<210>2<211>299<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明-<220><223>说明解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)<220><223>适于植物的barstar基因编码序列<220><223>片段类型全长编码序列<400>2cgcggatcctgatcatgaagaaggctgttatcaacggtgagcaaattaggtctatctctg60atcttcaccagacccttaagaaggagcttgctcttccagagtactacggagagaaccttg120atgctctatgggattgccttaccggatgggtggagtacccacttgttttggagtggaggc180agtttgagcagtctaagcagcttactgagaatggagctgagagtgttcttcaggttttcc240gggaggctaaggctgagggatgcgatatcaccatcattctttcttgagagctcgagcgc299<210>3<211>856<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明-<220><223>说明Vignamungo(SH-EP启动子)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)(barnase基因)，大肠杆菌(Escherichiacoli)(uidA基因)<220><221>启动子<222>(1)..(352)<223>经修饰的SH-EP启动子<220><221>misc_feature<222>(353)..(404)<223>经修饰的uidA基因5’端外显子<220><221>misc_特征<222>(443)..(778)<223>合成的barnase基因编码序列<220><221>内含子<222>(405)..(830)<223>uidA基因的内含子<220><221>misc_特征<222>(831)..(856)<223>经修饰的uidA基因外显子<400>3cagcatgcaagagaaagatgattcttgaagcatacgataacagattgaatgtgacaaaaa60gtttgtgtctcagcttcagggtcggcacctaatacaaaaggaaaatttgtcaggtttcct120tccgtagtttcattcactattattgaatcctttggctaccattcttgagaaacacaaaca180cttcttatatctgttctacacaattctctgagtgcgtgccacagtttggtatcttcatga240ttgctcattgttcatgcccataaggaacatgtaacttcctcatttatttattattgcttt300tgttttcttctcactagtttacaaacgtttccctatataaaccctcctttgttcactgct360ttcctccctgttgtggcttctctccgaagttcatcccggtccacctgcaaaataagtaat420aagataaagtaaaaaagttagtatggctcaagttattaatacttttgatggagttgctga480ttatcttcaaacttatcataaacttccagataattatattactaaatctgaagctcaagc540tcttggatgggttgcttctaaaggaaatcttgctgatgttgctccaggaaaatctattgg600aggagatattttttcaaatagagaaggaaaacttccaggaaaatctggaagaacatggag660agaagctgatattaattatacttctggatttagaaattcagatagaatcctttattcatc720tgattggcttatttataaaactacagatcattatcaaacttttacaaaaattagataaat780atttgtgttttttgtatgttgtgatcattaataaataaataaatacatacctcttctgca840gcaggaaggcagccga856<210>4<211>249<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明-<220><223>说明合成的质粒DNA多克隆位点<400>4aagcttactagtggtaccaccggtacgcgtgggcccgcatgctgatcaatgcatgtcgac60catatggccggcgctagccaattggacgtccttaagatcgatccgcggctgcaggcgcgc120ggatcccgtacgccatggcggccgggcgccgagctcgtgcactctagacccgggggcgcg180ccctcgagtgtacatcatgagcggccgcagatctggccggcctttaattaatccggacct240agggaattc249<210>5<211>8<212>RNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明-<220><223>5’外显子/内含子边界序列<400>5agguaugu8<210>6<211>7<212>RNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明-<220><223>分枝点序列，位于距边界位点上游20-50nt<400>6uacuaac7<210>7<211>5<212>RNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明-<220><223>3’内含子/外显子边界位点<400>7gcagg5<210>8<211>6<212>RNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明-<220><223>靠近多聚线苷酸位点的上游元件(NUE)<400>8aauaaa6<210>9<211>6<212>RNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明-<220><223>远离多聚线苷酸位点的上游元件(FUE)<400>9uuugua6<210>10<211>10<212>RNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明-<220><223>上游FUE元件<400>10uguguuuuuu10<210>11<211>7<212>RNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明<220><223>上游FUE元件<400>11uguugug7<210>12<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明-<220><223>位于距带有TATA的共有序列的转录起点15-60nt的启动子区域<400>12tcactatatatag13<210>13<211>4<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明-<220><223>位于距TATA框上游30-100nt的框<400>13caat4<210>14<211>4<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明-<220><223>位于距TATA框上游30-100nt的框<400>14agga4<210>15<211>10<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的说明-<220><223>距离AUG起始密码子下游40-80nt的序列<400>15aacaatggct10权利要求1.一种以提高了的安全性水平在有性繁殖多细胞生物(SRMO)中控制转基因分离，和/或自动阻止转基因逃逸的方法，其特征在于所述的方法包括含下述步骤的分子机制(a)除包含一个或多个编码一个或多个所需基因产物的目标转基因(TGIs)的转基因插件(TI)外，构建一个或多个可恢复的功能阻断(RBF)系统或DNA构建体复合物，一个或多个阻断构建体(BC)，并提供至少一种使用者可控制的方式以恢复被阻断的功能；(i)所述的阻断构建体(BC)具有阻断至少一种对有性繁殖多细胞生物(SRMO)存活和繁殖至关重要的分子或生理功能的能力，该阻断构建体(BC)位于与包含一个或多个目标转基因(TGIs)的所述转基因插件相同的染色体上非常接近的位置，优选在目标转基因(TGI)内含子中或所包含的转基因插件(TI)的两侧；(ii)所述的包括一个或多个使用者控制的干预的恢复被阻断的功能的方式可选择地与一个或多个恢复构建体(RC)结合，所述的恢复构建体位于临近在包含一个或多个目标转基因(TGIs)的转基因插件(TI)中，和/或非等位染色体中的阻断构建体(BC)的位置；和b)以为了生产的目的，在所述有性繁殖多细胞生物(SRMO)发育中，或生殖循环中易受影响的阶段，通过应用一个或多个使用者控制的干预，使得所述有性繁殖多细胞生物(SRMO)培育和繁殖起见恢复被阻断的功能以进行正常发育。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于当仅使用单一的阻断构建体(BC)时，所述的阻断构建体(BC)或其中的一部分置于目标转基因(TGI)的内含子中。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于当使用两个或两个以上的阻断构建体(BCs)时，所述的阻断构建体(BCs)位于包含一个或多个目标转基因(TGIs)的转基因插件(TI)的两侧。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的阻断构建体(BC)是形成自我控制实体的目标转基因(TGI)。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的可恢复的功能阻断(RBF)系统是包含至少两个阻断构建体(BCs)的双重可恢复的功能阻断(D-RBF)系统，所述的阻断构建体或相同或不同，并且可通过相同或不同的恢复机制恢复，位于包含一个或多个目标转基因(TGIs)的转基因插件(TI)的两侧。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的可恢复的功能阻断(RBF)系统是多重的，优选包含两个优选三个或更多个位于三个或更多个非等位染色体上的转基因插件(TIs)的三重的可恢复的功能阻断(M-RBF，T-RBF)系统，其中所述的第一转基因插件(TI)包含至少两个不同的阻断构建体(BCs)，所述的第二转基因插件(TI)包含与第一转基因插件(TI)中的阻断构建体(BCs)之一相同或不同的可选择的阻断构建体(BC)相连的一个或多个第一恢复构建体(RCs)，所述的第二转基因插件(TI)还包含第三转基因插件(TI)，该第三转基因插件(TI)包含与第一恢复构建体(RCs)不同的，且与相应于第一转基因插件(TI)中的与第二转基因插件(TI)中的可选择阻断构建体(BC)不同的一个阻断构建体(BC)相连的一个或多个第二恢复构建体(RCs)。7.如权利要求1所述的方法，其中，为获得所述的多重可恢复的功能阻断(M-RBF)系统，所述的受体转基因有性繁殖多细胞生物(SRMO)带有位于两非等位染色体的倒转分离的可恢复的功能阻断(RS-RBF)系统的两个不带有目标转基因(TGI)的转基因插件(TIs)，和含有位于目标转基因(TGIs)位点两侧的阻断构建体(BCs)的转化载体，并意味着该载体转化有性繁殖多细胞生物(SRMO)系到第三非等位染色体上。8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的可恢复的功能阻断(RBF)系统是分离的可恢复的功能阻断(S-RBF)系统，其包含位于不同的非等位染色体上的恢复构建体(RC)和阻断构建体(BC)，所述的阻断构建体(BC)位于包含一个或多个目标转基因(TGIs)的转基因插件(TI)的内含子中。9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，一种可诱导恢复的功能阻断(I-RBF)系统包含位于与阻断构建体(BC)相同染色体上、但处于不同启动子控制下的恢复构建体(RC)，所述的阻断构建体(BC)或其一部分位于包含一个或多个目标转基因(TGIs)的转基因插件(TI)的内含子中。10.如权利要求1所述的方法，其特征在于在阻断构建体(BC)中的至少一个核苷酸序列，所述核苷酸序列的表达以组成型的，器官-特异性的或时空的方式阻断对转基因有性繁殖多细胞生物(SRMO)存活或繁殖至关重要的分子或生理功能。11.如权利要求1所述的方法，其特征在于通过下述方式去除阻断构建体(BC)的作用，即应用使用者控制的干预，所述的干预在所述转基因有性繁殖多细胞生物(SRMO)发育和/或生殖循环的易感阶段提高组成型的，器官-特异性或时空的达到的形态或生理阻断，以阻止所述转基因有性繁殖多细胞生物(SRMO)的杂交和/或有性繁殖。12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的对生存和/或繁殖至关重要的易感阶段选自种子萌发的早期或晚期，开花，矮化表型的形成，不能形成花序花和/或果实，不能萌发，营养生长，生根和光合作用。13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的对生存和/或繁殖至关重要的易感阶段选自种子萌发的早期或晚期阶段。14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，去除被阻断的功能包括，在特定条件下可选择应用的外部的使用者控制或内部调节的分子机制。15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，用于去除被阻断的功能的使用者控制的外部的，或内部调节的分子机制选自(a)添加至少一种外部应用的物质；(b)应用至少一种能激活可选择的恢复构建体(RC)的外部的化学或物理刺激；(c)抑制阻断构建体(BC)的启动子；(d)通过反义RNA技术使所述阻断构建体(BC)的核苷酸序列的mRNA的表达沉默；(e)通过能从外部激活的分子机制使能灭活由所述阻断构建体(BC)的核苷酸序列编码的蛋白的蛋白表达；(f)使某种酶表达以产生能灭活由所述阻断构建体(BC)的核苷酸序列编码的蛋白的物质；(g)使能灭活由所述酶产生的毒性物质的酶表达；(h)使能产生具有下述功能的物质的酶表达，所述的物质能够补偿由所述阻断构建体(BC)的作用所造成的缺陷；(i)使能产生具有下述功能的物质的酶表达，所述的物质能够改变由阻断构建体(BC)产生的作用；(J)使特定的核酸和/或蛋白结合；(k)应用蛋白水解；(l)使蛋白-蛋白相互作用；(m)使能使毒性物质脱毒的酶表达；(n)使能补偿或灭活过量产生的毒性物质的物质表达；(o)使能与毒性物质相互作用的物质表达；(p)提供能转化毒性或由于错误的时空特异性而过表达的物质的酶；(q)外部补偿由所述阻断构建体(BC)产生的缺陷；(r)外部诱导恢复DNA，RNA，蛋白或代谢物的应答；(s)组成型表达所述恢复构建体(RC)的核苷酸序列；(t)时空性表达所述恢复构建体(RC)的核苷酸序列；和(u)当可恢复的功能阻断(RBF)系统是分离的双重或多重可恢复的功能阻断(RBF)系统时进行系内杂交。16.如权利要求1所述的方法，其特征在于用于恢复被阻断功能的、使用者控制的从外部施用的可调节分子机制包括支持纯合条件的系内杂交。17.一种以提高了的安全性水平在有性繁殖多细胞生物(SRMO)中控制转基因分离，和/或自动防止基因渗入的DNA构建体复合物或可恢复的功能阻断(RBF)系统，其特征在于所述的DNA构建体复合物包括(a)转基因插件(TI)，其包含至少一个编码一个或多个所需基因产物的目标转基因(TGI)；(b)一个或多个可通过使用者控制的方式得以恢复的阻断构建体(BC)，所述的阻断构建体(BC)包括至少一个核苷酸序列，该核苷酸序列具有阻止至少一种对有性繁殖多细胞生物(SRMO)存活和繁殖至关重要的分子或生理功能的能力，且该核苷酸分子和包含一个或多个目标转基因(TGIs)的转基因插件(TI)定位于相同的染色体上非常靠近的位置，优选地在所述目标转基因(TGI)的内含子中或位于包含一个或多个目标转基因(TGIs)的转基因插件(TI)的两侧；(c)一个或多个可选择的恢复构建体(RC)，其位于包含一个或多个目标转基因(TGIs)的转基因插件(TI)中的一个阻断构建体(BCs)附近，所述的目标转基因(TGIs)位于一个或多个非等位染色体上。18.如权利要求17所述的DNA构建体复合物，其特征在于，当仅使用一个阻断构建体(BC)时，所述的阻断构建体(BC)或它的一部分位于目标转基因(TGI)的内含子中。19.如权利要求17所述的DNA构建体复合物，其特征在于，当使用两个或两个以上的阻断构建体(BCs)形成自我控制及自我支持的实体时，所述的阻断构建体(BCs)位于包含一个或多个目标转基因(TGIs)的转基因插件(TI)的两侧。20.如权利要求17所述的DNA构建体复合物，其特征在于，所述的阻断构建体(BC)是形成自我控制实体的目标转基因(TGI)。21.如权利要求17所述的DNA构建体复合物，其特征在于，所述的可恢复的功能阻断(RBF)系统是包含阻断构建体(BCs)的双重可恢复的功能阻断(D-RBF)系统，所述的阻断构建体(BCs)至少是两个，或相同或不同、定位于包含一个或多个目标转基因(TGIs)的转基因插件(TI)两侧，并可通过相同或不同的恢复机制恢复。22.如权利要求17所述的DNA构建体复合物，其特征在于，所述的可恢复的功能阻断(RBF)系统是多重可恢复的功能阻断(M-RBF)系统，该系统包含两个，优选三个或更多个置于三个或更多个非等位染色体上的转基因插件(TIs)，其中的第一转基因插件(TI)包含至少两个不同的阻断构建体(BCs)；第二转基因插件(TI)包含一个或多个第一恢复构建体(RCs)，该第一恢复构建体(RCs)与相应于第一转基因插件(TI)中的一个阻断构建体(BCs)的可选择的阻断构建体(BC)相连接；第三转基因插件(TI)包含一个或多个第二恢复构建体(RCs)，所述的第二恢复构建体(RCs)与上述第一恢复构建体(RCs)或相同或不同、并且和与第一转基因插件(TI)中的一个阻断构建体(BC)相同的阻断构建体(BC)相连接，但上述第一转基因插件(TI)中的那个阻断构建体(BC)与上述第二转基因插件(TI)中可选择的阻断构建体(BC)不同。23.如权利要求17所述的DNA构建体复合物，其特征在于，在多重可恢复的功能阻断(M-RBF)系统中，向所述的受体转基因有性繁殖多细胞生物(SRMO)提供了不带有目标转基因(TGI)的、位于两个非等位染色体上的倒转分离的可恢复的功能阻断(RS-RBF)系统中的两个转基因插件(TIs)，和置于所需的目标转基因(TGIs)克隆位点两侧的、含阻断构建体(BCs)的转化载体，并意味着所述的载体转化受体转基因有性繁殖多细胞生物(SRMO)系至第三非等位染色体。24.如权利要求17所述的DNA构建体复合物，其特征在于，所述的可恢复的功能阻断(RBF)系统是经诱导可恢复的功能阻断(I-RBF)系统，其包含位于与所述的阻断构建体(BC)相同染色体上的恢复构建体(RC)，并且所述的阻断构建体(BC)在包含一个或多个目标转基因(TGIs)的转基因插件(TI)的内含子中。25.如权利要求17所述的DNA构建体复合物，其特征在于，所述的可恢复的功能阻断(RBF)系统是分离的可恢复的功能阻断(S-RBF)系统，该系统包含置于不同的非等位染色体上的恢复构建体(RC)和阻断构建体(BC)，阻断构建体(BC)或它的一部分位于包含一个或多个目标转基因(TGIs)的转基因插件(TI)的内含子中。26.如权利要求17所述的DNA构建体复合物，其特征在于，可诱导的恢复构建体(RC)可在对使用者控制的干预的应答中激活，这能恢复对所述转基因有性繁殖多细胞生物(SRMO)的存活和有性繁殖至关重要的功能，并且该功能被在相同或不同的启动子控制下表达的阻断构建体(BC)所阻断。27.如权利要求17所述的DNA构建体复合物，其特征在于，所述的形成双重可恢复的功能阻断(D-RBF)系统的阻断构建体(BC)的两个核苷酸序列可由相同或不同的恢复方式恢复。28.如权利要求17所述的DNA构建体复合物，其特征在于，可诱导的恢复构建体(RC)可在对使用者控制的干预的应答中激活，这能恢复在相同或不同的启动子控制下表达的阻断构建体(BC)所阻断的功能。29.如权利要求17所述的DNA构建体复合物，其特征在于，所述的阻断构建体(BC)包含至少一个核苷酸序列，该核苷酸序列组成型的，器官特异的或时空性的表达在DNA，mRNA，蛋白或代谢物水平阻断重要的分子或生理功能，和/或引起表型、生理或形态的改变，阻止异型杂交的转基因有性繁殖多细胞生物(SRMO)在天然或非控制的条件下导致其灭绝的自由杂交和/或繁殖。30.如权利要求17所述的DNA构建体复合物，其特征在于，所述的被可恢复的功能阻断(RBF)系统的阻断构建体(BC)阻断的功能可通过下述方式恢复，即通过外部施用的使用者控制或可选择的在限定条件下应用的内部调节分子机制。31.如权利要求30所述的DNA构建体复合物，其特征在于，用于恢复被阻断的功能的使用者控制的干预选自(a)添加至少一种外部应用的物质；(b)应用至少一种能激活可选择的恢复构建体(RC)的外部的化学或物理刺激；(c)抑制阻断构建体(BC)的启动子；(d)通过反义RNA技术使所述阻断基因mRNA的表达沉默；(e)通过能从外部激活的分子机制使能灭活由所述阻断构建体(BC)编码的蛋白的蛋白表达；(f)使某种产生能灭活由所述阻断构建体(BC)表达的蛋白的物质的酶表达；(g)使能灭活由所述酶产生的毒性物质的酶表达；(h)使能产生具有下述功能的物质的酶表达，所述的物质能够补偿由所述阻断构建体(BC)的作用所造成的缺陷；(i)使能产生具有下述功能的物质的酶表达，所述的物质能够补偿由阻断构建体(BC)产生的作用所造成的改变；(j)使特定的核酸和/或蛋白结合；(k)应用蛋白水解；(l)使蛋白-蛋白相互作用；(m)使能使毒性物质脱毒的酶表达；(n)使能补偿或灭活过量产生的毒性物质的物质表达；(o)使能与毒性物质相互作用的物质表达；(p)提供产生毒性或过量产生的物质的酶；(q)外部补偿由所述阻断构建体(BC)产生的缺陷；(r)外部诱导恢复DNA，RNA，蛋白或代谢物的应答；(s)组成型表达所述恢复构建体(RC)的核苷酸序列；(t)时空性表达所述恢复构建体(RC)的核苷酸序列；和(u)当可恢复的功能阻断(RBF)系统是多重可恢复的功能阻断(RBF)系统时允许进行系内杂交。32.如权利要求17所述的DNA构建体复合物，其特征在于，所述的用于恢复被阻断功能的、通过使用者控制的外部可调节的分子调节机制包括允许系内杂交。33.如权利要求17所述的DNA构建体复合物，其特征在于，所述的阻断构建体(BC)包含在宿主生物中以组成型的，器官-特异的或时空性的方式表达的核苷酸序列，所述的恢复构建体(RC)包含可通过使用者控制的干预恢复的核苷酸序列，调节处理-应答核苷酸序列或其基因产物，或通过在恢复构建体(RC)组成型表达所述核苷酸序列和/或其基因产物。34.如权利要求33所述的DNA构建体复合物，其特征在于，所述阻断构建体(BC)包含以器官-特异的，发育的或时空性的方式表达一种酶的核苷酸序列，对宿主生物存活或有性生殖至关重要的酶的反义mRNA。35.如权利要求34所述的DNA构建体复合物，其特征在于，所述阻断构建体(BC)包含经改变以适应宿主生物偏嗜的，和/或在宿主生物中编码所需产物的目标转基因(TGI)的内含子偏嗜的合成核苷酸序列。36.如权利要求35所述的DNA构建体复合物，其特征在于，所述的合成的核苷酸序列编码具有SEQIDNO1的酶barnase，且具有经改造以适应植物偏嗜的，和/或经改造以适应植物基因内含子偏嗜的核苷酸序列，所述的序列如SEQIDNO3所示。37.如权利要求17所述的DNA构建体复合物，其特征在于，所述恢复构建体(RC)包含与控制阻断核苷酸序列表达的阻遏物肽/蛋白相结合的操纵子序列。38.如权利要求37所述的DNA构建体复合物，其特征在于，所述阻遏物肽/蛋白是Tnl0tet阻遏物蛋白，所述操纵子序列是tet-操纵基因DNA序列。39.如权利要求17所述的DNA构建体复合物，其特征在于，所述恢复构建体(RC)包含下述核苷酸序列，该核苷酸序列表达阻断核苷酸序列的反义RNA，且能激活补偿由阻断构建体(BC)的作用所导致的缺陷的阻断构建体(BC)表达的沉默机制。40.如权利要求17所述的DNA构建体复合物，其特征在于，所述的恢复构建体(RC)包含表达某种蛋白的核苷酸序列，所述的蛋白灭活由阻断构建体(BC)表达的蛋白。41.如权利要求40所述的DNA构建体复合物，其特征在于，所述恢复构建体(RC)的核苷酸序列表达通过与之结合灭活Barnase核酸酶的Barstar蛋白。42.如权利要求17所述的DNA构建体复合物，其特征在于，所述阻断构建体(BC)包含通过提供内含子核苷酸序列偏嗜而改造以插入到目标转基因(TGI)内含子中的合成的核苷酸序列。43.如权利要求42所述的DNA构建体复合物，其特征在于，所述经改造以适应插入的核苷酸序列是基本上与所述barnase基因序列同一的核苷酸序列，并具有SEQIDNO3所示序列。44.如权利要求42所述的DNA构建体复合物，其特征在于，所述的经改造以适应植物表达的合成barnase和barstar基因序列分别具有SEQIDNO1和SEQIDNO2所示序列。45.如权利要求42所述的DNA构建体复合物，其特征在于其具有合成的多克隆位点(SEQIDNO4)，其与开放阅读框一起设计(ORF)以适应克隆载体上β半乳糖苷酶表达。46.如权利要求17所述的DNA构建体复合物，其特征在于，所述的提高了的安全性水平是指所述阻断构建体(BC)的灭活频率低于10-6，优选低于10-8，更优选低于10-10，最优选低于10-12。47.如权利要求17所述的DNA构建体复合物，其特征在于，所述的提高了的安全性水平指达到对转基因逃逸100％的抑制。48.一种克隆载体，其包含一个或多个用于组装如权利要求17所述的DNA构建体复合物的阻断构建体(BCs)，其特征在于所述的载体上带有便于所述的目标转基因(TGI)转移到有性繁殖多细胞生物(SRMO)染色体上适当位置的多克隆位点。49.如权利要求48所述的载体，其特征在于所述的多克隆位点是(SEQIDNO4)。50.有性繁殖多细胞生物(SRMO)细胞或细胞系，其特征在于其包含一个或多个用于组装如权利要求17所述的DNA构建体复合物的转基因插件(TIs)，以便于通过携带目标转基因(TGIs)的载体进行补偿，所述的目标转基因(TGIs)包含在如权利要求48-49中所述的克隆载体中的一个或多个目标转基因(TGIs)。51.一种转基因植物，其特征在于其包含一个或多个选自下述的转基因插件(TIs)即一个或多个可选择地与一个或多个恢复构建体(RCs)相结合的阻断构建体(BCs)，所述的恢复构建体带有至少一个转基因插件(TI)，所述的转基因插件具有一个或多个目标转基因(TGIs)或用于插入一个或多个用于组装如权利要求17所述的DNA构建体复合物或可恢复的功能阻断(RBF)系统的目标转基因(TGIs)。52.一种转基因非人有性繁殖多细胞生物(SRMO)，其特征在于其包含一个或多个转基因插件(TI)，所述的转基因插件选自一个或多个可选择的与一个或多个恢复构建体(RCs)相结合的阻断构建体(BCs)，所述的恢复构建体携带具有一个或多个目标转基因(TGIs)的转基因插件(TI)或用于插入一个或多个组装如权利要求17所述的DNA构建体复合物的目标转基因(TGIs)的克隆位点。全文摘要本发明涉及以提高了的安全性水平控制有性繁殖多细胞生物(SRMOs)中的转基因分离的方法和DNA构建体复合物，所述的有性繁殖多细胞生物有与其野生型或经培养的亲缘生物异型杂交的倾向。所述的方法和构建体允许农民在没有危险的情况下，再利用转基因作物。所述的RBF系统除一个或多个编码所需基因产物的目标转基因(TGIs)之外，还包含一个或多个阻断构建体(BC)，和一个或多个用于恢复被阻断的功能的使用者控制的恢复方式。所述的BC具有阻断至少一种对所述SRMO的生存和/或繁殖至关重要的功能。优选地，使用不止一个位于所述TGIs两侧的BC。所述的BC可位于TGI临近的位置，优选位于TGIs的内含子或侧翼处。所述的被阻断的功能可通过使用者控制的干预恢复，优选地在限定的条件下应用。所述的干预与一个或多个恢复构建体(RC)相结合。公开了不同类型的RBF系统。所述的双重和三重和分离的RBF系统和内含子－插入的BC是本发明的优选实施方案。所述的三重RBF系统的转基因插件(TI)和它们之间的相互作用如图(10)所示。文档编号C12N15/55GK1446262SQ01812808公开日2003年10月1日申请日期2001年7月16日优先权日2000年7月14日发明者V·库夫施诺夫,K·科伊武,A·卡纳瓦,E·佩胡申请人:尤尼克罗普有限公司