用己糖基转移酶制备麦芽糖浆的方法

专利名称：用己糖基转移酶制备麦芽糖浆的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备麦芽糖浆的方法，其中用己糖基转移酶和β-淀粉酶和/或麦芽糖淀粉酶、或它们的变体来处理淀粉。此外，本发明还涉及一种适用于制备麦芽糖的原料。
背景技术：
麦芽糖麦芽糖是一种双糖，其化学结构为4-O-α-D-吡喃葡萄糖基-D-吡喃葡萄糖(C12H22O11)，并且其是麦芽糖浆的主要成份。
麦芽糖浆的应用麦芽糖被用来替代许多食品和糖果中的蔗糖，麦芽糖还被用作为氢化成麦芽糖醇的起始原料。
麦芽糖不易结晶，而象葡萄糖即使在高浓度的杂质的存在下也能结晶。麦芽糖不能结晶而因此能被进一步纯化，除非用作起始原料的麦芽糖的纯度为90％以上。此外，麦芽糖不易结晶的事实是麦芽糖成为糖果工业中的有价值的原料的原因之一。
麦芽糖还有其它的应用，如作为为病人提供糖的静脉注射液的活性成份、及作为冷冻甜点中(由于麦芽糖的低结晶能力)、焙烤及酿造工业中的成份、及用于制备麦芽糖醇，麦芽糖醇和山梨糖醇一样能被用作为甜味剂，参见Glycose Sirups，科学与技术，ElsevierApplied Science出版社1984，117-135页。
因此，本发明的目的是提供一种制备麦芽糖浆的方法。

发明内容
本发明的目的是提供一种制备高浓度麦芽糖浆(high maltose syrup)的方法。
至少在本发明的上下文中，所述高浓度麦芽糖浆是麦芽糖含量至少是80％、优选至少是90％的糖浆。
制备麦芽糖的传统方法用于制备麦芽糖的起始原料为玉米淀粉、土豆淀粉、甘薯淀粉(sweetpotato starch)、木薯淀粉(manioc starch)、米淀粉及木薯淀粉(cassava starch)，对于制备药用级麦芽糖(medical grade maltose)来说，其浓度为约10-20％，对于制备食用级麦芽糖(food grade maltose)来说，其浓度为20-40％。
各种制备麦芽糖的方法是已知的，且由这些方法得到的麦芽糖的纯度为75-90％。这些方法中的一个典型的实例包括加热并用α-淀粉酶处理淀粉淤浆，由此使淀粉液化，然后用β-淀粉酶和支链淀粉酶(α-1，6-葡萄糖苷酶)水解该液化后的淀粉得到麦芽糖溶液，然后可以纯化该麦芽糖溶液。
在该麦芽糖溶液中的大部分“杂质”包括葡萄糖、低聚糖如麦芽三糖、和有限量的糊精，该糊精由三个或更多的葡萄糖单体组成。
本发明的方法本发明的发明人发现与用α-淀粉酶液化淀粉相比，通过用己糖基转移酶(E.C.2.4.1)及随后用β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)和/或麦芽糖淀粉酶(maltogenicamylase)、或它们的变体来处理淀粉淤浆能够得到麦芽糖含量更高的麦芽糖浆。
因此，本发明的第一方面涉及一种制备麦芽糖的方法，其中用以下酶处理淀粉i)己糖基转移酶(E.C.2.4.1)，和然后ii)β-淀粉酶和/或麦芽糖淀粉酶、或它们的变体。
本发明的方法优选包括下列步骤a)用己糖基转移酶(E.C.2.4.1)处理淀粉直至得到的产物具有i)如果使用分支酶(branching enzyme)，增加的分支度(ADB)为10-150％，和/或ii)粘度相当于用野生型地衣芽孢杆菌α-淀粉酶处理30％DS淀粉直至DE值为8-15、优选至DE值为10-12所获得的液化淀粉的粘度，b)用β-淀粉酶和/或麦芽糖淀粉酶、或它们的变体来处理步骤a)中得到的产物，和可选择地c)从步骤b)中得到的产物中回收和/或纯化麦芽糖。
葡萄糖当量值(DE)和增加的分支度(ADB)
通过在用异淀粉酶(假单胞菌异淀粉酶，得自Hayashibara，日本)脱支后测量淀粉产物的DE值来确定淀粉产物的分支度(degree of branching)。DE值(脱支后)越高，分支度就越高。由己糖基转移酶带来的增加的分支度(ADB)以下式计算 X是天然淀粉(即起始原料)脱支后的DE值。
用己糖基转移酶处理淀粉的方法为了获得对淀粉的有效酶处理，在优选实施方案中，该淀粉可以经凝胶化的(gelatinized)。根据酶的热稳定性和具体淀粉的凝胶化温度，所述凝胶化能够与酶处理一起进行，或在酶处理前进行。凝胶化可以在间歇式体系中进行或在蒸汽加压锅(jet-cooker)中连续进行。能够使用实验室用简单的加热装置如油浴、加压蒸煮锅(pressure cooker)或高压锅(autoclave)。随后的酶处理或凝胶化/酶联合处理的具体反应条件即温度、pH、％DS、剂量和培养时间取决于所用酶和淀粉源的性质。
在一实施方案中，在本发明的方法的步骤a)中处理淀粉淤浆的温度是50-150℃、优选50-100℃。在用1，4-α-葡聚糖分支酶作为己糖基转移酶时，该处理温度为50-70℃、优选约65℃。在一实施方案中，当使用1，4-α-葡聚糖分支酶时，先通过在105-140℃下喷射使淀粉凝胶化，然后使淀粉冷却至约65℃。
在使用4-α-葡聚糖转移酶(淀粉麦芽酶或D-酶)和CGT酶的情况下，凝胶化步骤是可选择性的并可以省略。因此，处理淀粉(直接用这些酶培养)的温度为80-100℃，优选约90℃。
在步骤b)中可加入支链淀粉酶。通常，所述淀粉原料为10-50％DS淀粉淤浆、优选为20-40％DS淀粉淤浆、特别优选约30％DS的淀粉淤浆。
本发明还涉及一种产品，该产品是通过用己糖基转移酶(E.C.2.4.1)处理淀粉直至产物具有以下特征而得到的i)当使用分支酶时，增加的分支度(ADB)为10-150％，和/或ii)粘度相当于用野生型地衣芽孢杆菌α-淀粉酶处理30％DS淀粉直至DE值为8-15、优选至DE值为10-12所获得的液化淀粉的粘度。
该产品适合作为加工麦芽糖的原料。该产品是稳定的并且具有降低的老化(retrograde)倾向，及能溶于水溶液中。
本发明的另一方面涉及一种由本发明的方法得到的含麦芽糖的产品。由此方法得到的产品的麦芽糖(DP2)含量为大于80％、优选85％、特别优选大于90％。
进而，本发明还涉及本发明的产品作为制备麦芽糖的起始原料(底物)的用途，该产品是通过用己糖基转移酶处理淀粉得到的。
己糖基转移酶己糖基转移酶(E.C.2.4.1)的实例包括1，4-α-葡聚糖分支酶(E.C.2.4.1.18)；4-α-葡聚糖转移酶(淀粉麦芽糖酶或D-酶)(E.C.2.4.1.25)；环麦芽糊精葡聚糖转移酶(CGT酶)(E.C.2.4.1.19)。
1，4-α-葡聚糖分支酶在一实施方案中，己糖基转移酶为1，4-α-葡聚糖分支酶，该酶形成支链淀粉的附加的1，6-糖苷键并将直链淀粉转化为支链淀粉。支链淀粉分支酶通常被称为Q-酶。
特别提到的1，4-α-葡聚糖分支酶得自于红嗜热盐菌属(Rhodotherums)、优选Rhodothermus obamensis、尤其是包含来自Rhodothermus obamensis的glgB基因的被保藏的菌株E.coli DSM 12607。
4-α-葡聚糖转移酶(淀粉麦芽糖酶或D-酶)在一实施方案中，己糖基转移酶为4-α-葡聚糖转移酶，该酶将1，4-α-D-葡聚糖转移至受体中的新的4-位置，该受体可以是葡萄糖或1，4-α-D-葡聚糖。4-α-葡聚糖转移酶通常被称为D-酶。
特别提到的4-α-葡聚糖转移酶是得自Thermococcus litoralis(Jeon，Beong-Sam等得自超嗜热Thernococcus litoralis的4-α-葡聚糖转移酶(1997)，Eur.J.Biochem.248171-178.)。
CGT酶在一实施方案中，CGT酶或CGT酶变体得自于芽孢杆菌菌株、短杆菌菌株、梭菌菌株、棒杆菌菌株、克雷伯氏菌菌株、微球菌菌株、热厌氧菌(Thermoanaerobium)菌株、热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter)菌株、热厌氧杆菌菌株(Thermoanaerobacterium)、热厌氧杆菌菌株(Thermoanaerobacterium)、或高温放线菌菌株(Thermoactinomyces)。
在一优选实施方案中，CGT酶或CGT酶变体得自于自溶芽孢杆菌(Bacillus autolyticus)菌株、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)菌株、环状芽孢杆菌嗜碱变种的(Bacillus circulans var.alkalophillus)菌株、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)菌株、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)菌株、嗜盐芽孢杆菌(Bacillus halophilus)菌株、浸麻芽孢杆菌(Bacillus macerans)菌株、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株、Bacillusohbensis菌株、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)菌株、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)菌株、乙醇热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)菌株、鳍栖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter finnii)菌株、 热解淀粉热厌氧杆菌(Clostridiumthermoamylolyticum)菌株、 热解糖热厌氧杆菌(Clostridiumthermosaccharolyticum)菌株、或热产硫磺热厌氧杆菌(Thermoanaerobacteriumthermosulfurigenes)菌株。
在更优选的实施方案中，CGT酶或CGT酶变体得自芽孢杆菌菌株l011、芽孢杆菌菌株38-2、芽孢杆菌菌株17-1、芽孢杆菌菌株1-1、芽孢杆菌菌株B1018，环状芽孢杆菌菌株8、环状芽孢杆菌菌株251、或热厌氧杆菌菌株ATCC53627、或它们的突变体或变体。
在WO96/33267(Novozymes A/S)和WO99/15633(Novozymes A/S)中公开了所述的CGT酶变体，在此引入这些文献作为参考。
可商购得到的CGT酶是得自Novozymes A/S的Toruzyme。
β-淀粉酶β-淀粉酶的实例(E.C.3.2.1.2)包括农作物β-淀粉酶，如大麦β-淀粉酶、小麦β-淀粉酶、大豆β-淀粉酶，和得自芽孢杆菌种的β-淀粉酶如US4,970,158(Novozymes A/S)中公开的β-淀粉酶。
可商购得到的β-淀粉酶包括来自Genencor公司的SpezymeBBA和SpezymeDBA。
支链淀粉酶支链淀粉酶(E.C 3.2.1.41)的实例包括来自如热球菌属(Pyrococcus)的热稳定的支链淀粉酶，或蛋白质工程化(protein engineered)的支链淀粉酶，来自如芽孢杆菌菌株如Bacillus acidopullulyticus或Bacillus deramifican(如基因库入藏号为Q68699的Bacillus deramificans支链淀粉酶)。
可商购得到的支链淀粉酶包括来自Novozymes A/S的PromozymeD和来自Genencor公司的Optimax.
麦芽糖淀粉酶麦芽糖淀粉酶(E.C.3.1.133)水解多糖中的1，4-α-D-糖苷键以从链的非还原端除去连续的α-麦芽糖残基。麦芽糖淀粉酶作用于淀粉和相关的多糖和低聚糖。
适用的麦芽糖淀粉酶的一个实例是由在EP120,693(Novo Industri A/S)中公开的嗜热脂肪芽孢杆菌C599制成的麦芽糖淀粉酶。提到的麦芽糖淀粉酶变体公开在WO99/43794和WO99/43793中，在此引入这些文献作为参考。
可商购得到的麦芽糖淀粉酶的商品名为Maltogenase(Novozymes A/S，丹麦)。
材料和方法分支酶在WO00/58445(Novozyme A/S，丹麦)中公开的Rhodothermusobamensis D-酶。
SpezymeBBA1500是大麦β-淀粉酶(得自于Genencor公司，美国)PromozymeD是得自于芽孢杆菌菌株的支链淀粉酶(得自于NovozymesA/S，丹麦)。
异淀粉酶假单胞菌异淀粉酶(得自Hayashibara，日本)。
Toruzyme是得自于热厌氧杆菌菌株的热稳定的环麦芽糊精葡聚糖转移酶(CGT酶)(得自于Novozymes A/S，丹麦)。
TermamylLC是得自于地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶(得自于NovozymesA/S，丹麦)。
Maltogenase(得自于Novozymes A/S，丹麦)。
野生型地衣芽孢杆菌α-淀粉酶是在WO99/19467(Novozymes A/S，丹麦)中公开的SEQ ID No4。
方法β-淀粉酶活性(DP°)SpezymeBBA1500的活性用糖化力度(Degree of Diastatic Power)(DP°)表示。其是包含在0.1ml的5％样本酶制剂溶液中的酶的量，当该样本用100ml底物在20℃下培养1小时时，该量产生足以还原5ml的费林溶液的还原糖。
支链淀粉酶活性(Novo制定的新支链淀粉酶单位(NPUN))Novo制定的新支链淀粉酶单位(NPUN)是内-支链淀粉酶活性单位，是根据Novozymes标准测量的，该标准是基于0.7％红支链淀粉，40℃、pH4.5，反应时间30分钟制定的。详细的分析方法根据请求可以得到(SOP No.EB-SM.0420.02/01)。
分支酶活性分支酶活性是根据改进后的“Takata等，Applied and EnvironmentalMicrobiology(1994)，第3097页(检测A)”所述的方法来测量的将20微升酶溶液与50微升水和50微升底物溶液混合，并在测试温度下培养30分钟。该底物溶液是溶解于Tris缓冲剂中的0.1％的III型淀粉酶。通过加入2ml碘试剂来终止该反应。碘是日常由0.5ml原液(在10ml水中的0.26g I2和2.6g KI)与0.5ml的1N HCl混合并稀释至130ml制成的。将该混合物在室温下培养15分钟以稳定色泽。活性是以测试样与对照样在A660下之差来测量的，在对照样中用水替代细胞抽提物。1单位分支酶活性被定义为在60℃及pH7.0下每分钟能够将直链淀粉-碘复合物的A660降低1％的酶的量。
用己糖基转移酶处理淀粉的方法a)当使用分支酶时，可以采用以下方法在蒸汽加压锅或高压锅中凝胶化10-30％DS、pH7-8的淀粉悬浮液。然后将该淤浆冷却至60-70℃，并加入分支酶。当达到规定的转化时(总时间取决于剂量)，通过加热至100℃并保持15分钟来终止该反应。
b)对于葡聚糖转移酶或CGT’酶，可按以下方法进行制备制备30％DS、pH5-7的淀粉悬浮液并加入酶。然后将该悬浮液加热至70-90℃并培养4-24小时。当达到规定的转化时(总时间取决于剂量)，通过加热至140℃并保持5-15分钟来终止该反应。
实施例实施例1麦芽糖的制备制备经分支酶液化的30％DS土豆淀粉底物。该淀粉淤浆是澄清的和稳定的。然后在60℃及pH5.0下用β-淀粉酶(1DP°/g DS)和支链淀粉酶(1NPUN/g DS)处理该淀粉淤浆。
经72小时培养后得到89％麦芽糖。与此相比，在相同条件下使用Termamyl LC DE 10麦芽糖糊精仅能得到75％的麦芽糖。
权利要求
1.一种制备麦芽糖的方法，其中用以下酶处理淀粉i)己糖基转移酶(E.C.2.4.1)，和然后ii)β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)和/或麦芽糖淀粉酶(E.C.3.2.1.133)或它们的变体。
2.权利要求1的方法，包括步骤a)用己糖基转移酶(E.C.2.4.1)处理淀粉直至产物具有i)如果使用分支酶，增加的分支度(ADB)为10-150％，和/或ii)粘度相当于用野生型地衣芽孢杆菌α-淀粉酶处理30％DS淀粉直至DE值为8-15、优选DE值为10-12所获得的液化淀粉的粘度，b)用β-淀粉酶和/或麦芽糖淀粉酶或它们的变体处理步骤a)中得到的产物，和可选择地c)由步骤b)中得到的产物回收和/或纯化麦芽糖。
3.权利要求2的方法，其中步骤a)中处理淀粉的温度为50-150℃，优选50-100℃。
4.权利要求1或2的方法，其中在步骤b)中进一步加入支链淀粉酶。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中用10-50％DS的淀粉淤浆、优选用20-40％DS的淀粉淤浆及特别优选用约30％DS的淀粉淤浆作为起始原料。
6.权利要求1的方法，其中己糖基转移酶(E.C.2.4.1)是选自1，4-α-葡聚糖分支酶(E.C.2.4.1.18)、4-α-葡聚糖转移酶(淀粉麦芽糖酶或D-酶)(E.C.2.4.25)、环麦芽糊精葡聚糖转移酶(CGT酶)(E.C.2.4.1.19)中的一种或多种酶。
7.权利要求1-6的方法，其中在步骤a)中，用D-酶和麦芽糖淀粉酶或它们的变体的组合来处理淀粉。
8.权利要求1的方法，其中β-淀粉酶(E.C.2.4.1.2)是大麦β-淀粉酶。
9.权利要求1的方法，其中支链淀粉酶是芽孢杆菌支链淀粉酶。
10.权利要求6的方法，其中1，4-α-葡聚糖分支酶(E.C.2.4.1.18)是得自于红嗜热盐菌，优选Rhodothermus obamensis。
11.通过用己糖基转移酶(E.C.2.4.1)处理淀粉直至产物具有以下特征而得到的产品i)如果使用分支酶，获得增加的分支度(ADB)为10-150％，和/或ii)粘度相当于用野生型地衣芽孢杆菌α-淀粉酶处理30％DS淀粉直至DE值为8-15、优选DE值为10-12所获得的液化淀粉的粘度。
12.权利要求11的产品，其中己糖基转移酶(E.C.2.4.1)是选自1，4-α-葡聚糖分支酶(E.C.2.4.1.18)、4-α-葡聚糖转移酶(淀粉麦芽糖酶或D-酶)(E.C.2.4.25)、环麦芽糊精葡聚糖转移酶(CGT酶)(E.C.2.4.1.19)中的一种或多种酶。
13.权利要求12的方法，其中1，4-α-葡聚糖分支酶(E.C.2.4.1.18)是得自红嗜热盐菌，优选得自Rhodothermus obamensis，特别优选得自包含来自Rhodothermus obamensis的glgB基因的被保藏的菌株E.coli DSM 12607。
14.由权利要求1-10中任一项的方法得到的糖浆产品。
15.权利要求14的糖浆产品，其中麦芽糖(DP2)含量为大于80％、优选85％、特别优选大于90％。
16.权利要求11-13中任一项的产品作为制备麦芽糖的起始原料(底物)的用途。
17.根据权利要求16的用途，其中产品的一部分被用作制备麦芽糖的起始原料(底物)。
全文摘要
本发明涉及一种制备麦芽糖浆的方法，其中用己糖基转移酶(E.C.2.4.1)、及随后用β－淀粉酶和/或麦芽糖淀粉酶或它们的变体来处理淀粉。本发明还涉及一种中间产品，该产品适合作为制备麦芽糖的原料。
文档编号C12P19/18GK1444660SQ01813510
公开日2003年9月24日 申请日期2001年7月17日 优先权日2000年7月28日
发明者巴里·E·诺曼, 汉尼·V·亨德里克森 申请人:诺维信公司