使用肠细菌科菌株发酵生产l-氨基酸的方法

专利名称：使用肠细菌科菌株发酵生产l-氨基酸的方法
技术领域：
本发明涉及使用肠细菌科菌株发酵生产L-氨基酸尤其L-苏氨酸的方法，所用菌株中至少pckA基因是弱化的。
现有技术L-氨基酸用于人用药物和制药工业，食品工业，特别是动物营养。
已知可通过肠细菌菌株，尤其大肠杆菌和粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)发酵生产L-氨基酸。由于其极其重要性，已持续进行改良生产方法的尝试。生产方法的改良可涉及发酵措施，如搅拌和供氧，或营养培养基的组成如发酵期间的糖浓度，或产物形式的加工方法，例如通过离子交换层析，或微生物本身的固有生产性质。
为改良这些微生物的生产性质，可使用诱变，选择及突变体选择等方法，以此方法可获得对抗代谢物例如苏氨酸类似物α-氨基-β-羟戊酸(AHV)有抗性，或重要的调节代谢物缺陷的并产生氨基酸的菌株。
一段时间以来，重组DNA技术的方法也用于肠细菌科生产L-氨基酸的菌株的改良，通过扩增各个氨基酸生物合成基因并研究对生产的作用而进行。
发明目的本发明人目的在于为改良氨基酸尤其是L-苏氨酸的发酵生产而提供新措施。
发明概述本发明提供了使用尤其已经生产L-苏氨酸的肠细菌科微生物发酵生产L-氨基酸，尤其L-苏氨酸的方法，所用细菌中编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEP羧激酶)(EC4.1.1.49)的核苷酸序列(pckA基因)被弱化。
发明详细描述以下提及的L-氨基酸是指一或多种氨基酸，包括其盐，选自L-天冬酰胺，L-苏氨酸，L-丝氨酸，L-谷氨酸，L-甘氨酸，L-丙氨酸，L-半胱氨酸，L-缬氨酸，L-甲硫氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-酪氨酸，L-苯丙氨酸，L-组氨酸，L-赖氨酸，L-色氨酸，L-高丝氨酸和L-精氨酸。L-苏氨酸是特别优选的。
文中术语“弱化”是指微生物中由相应DNA编码的一或多种酶(蛋白质)的胞内活性的降低或抑制，例如通过用弱启动子或编码低活性相应酶的基因或等位基因，或失活相应酶(蛋白质)，及如果需要组合使用这些方法。
通过弱化措施，相应蛋白质的活性或浓度一般降低至野生型蛋白质或起始微生物中蛋白质的活性或浓度的0-75％，0-50％，0-25％，0-10％或0-5％。
本发明方法的特征在于进行以下步骤a)发酵肠细菌科微生物，其中至少pckA基因是弱化的，b)富集培养基中或肠细菌科微生物细胞中所需的L-氨基酸，及c)分离所需的L-氨基酸。
本发明的微生物可从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、任选地淀粉、任选地纤维素或从甘油和乙醇中生产L-氨基酸。此微生物可以是肠细菌科的代表菌，选自埃希氏菌属，欧文氏菌属(Erwinia)，普罗威登斯菌属(Providencia)和沙雷氏菌属。优选埃希氏菌属和沙雷氏菌属。在埃希氏菌属和沙雷氏菌属中分别尤其应提及的是大肠杆菌和粘质沙雷氏菌。
适当的埃希氏菌属尤其大肠杆菌菌株、特别是生产L-苏氨酸的菌株的例子是大肠杆菌TF427
大肠杆菌H4578大肠杆菌KY10935大肠杆菌VNIIgenetika MG442大肠杆菌VNIIgenetika M1大肠杆菌VNIIgenetika 472T23大肠杆菌BKIIM B-3996大肠杆菌kat 13大肠杆菌KCCM-10132沙雷氏菌属，尤其粘质沙雷氏菌的适当的生产L-苏氨酸菌株例如是粘质沙雷氏菌HNr21粘质沙雷氏菌TLr156粘质沙雷氏菌T2000。
肠细菌科的生产L-苏氨酸的菌株优选具有选自以下的一或多种遗传或表型特征α-氨基-β-羟戊酸抗性，硫代赖氨酸(thialysine)抗性，乙硫氨酸抗性，α-甲基丝氨酸抗性，二氨基琥珀酸抗性，α-氨基丁酸抗性，疏螺旋体素抗性，利福平抗性，缬氨酸类似物如氧肟酸缬氨酸抗性，脯氨酸类似物如6-二甲基氨脯氨酸抗性，需要L-甲硫氨酸，任选地部分及可补偿地需要L-异亮氨酸，需要间-二氨基庚二酸，含苏氨酸的二肽的辅源营养，L-苏氨酸抗性，L-高丝氨酸抗性，L-赖氨酸抗性，L-甲硫氨酸抗性，L-谷氨酸抗性，L-天冬氨酸抗性，L-亮氨酸抗性，L-苯丙氨酸抗性，L-丝氨酸抗性，L-半胱氨酸抗性，L-缬氨酸抗性，氟丙酮酸敏感性，缺陷的苏氨酸脱氢酶，任选地蔗糖利用能力，苏氨酸操纵子的扩增，高丝氨酸脱氢酶I-天冬氨酸激酶I的扩增，优选反馈抗性形式，高丝氨酸激酶的扩增，苏氨酸合酶的扩增，天冬氨酸激酶的扩增，任选地反馈抗性形式，天冬氨酸半醛脱氢酶的扩增，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的扩增，任选反馈抗性形式，磷酸烯醇丙酮酸合酶的扩增，转氢酶的扩增，RhtB基因产物的扩增，RhtC基因产物的扩增，YfiK基因产物的扩增，苹果酸醌氧化还原酶的扩增，和丙酮酸羧化酶的扩增及乙酸形成的弱化。
已经发现在编码PEP羧激酶(EC4.1.1.49)的pckA基因弱化尤其关闭后，肠细菌科微生物生产L-氨基酸尤其L-苏氨酸得以增加。
大肠杆菌pckA基因的核昔酸序列已经由Medina等公布(细菌学杂志172，7151-7156(1990))，并还可以得自由Blattner等公布的大肠杆菌基因组序列(科学277，1453-1462，(1997))。大肠杆菌pckA基因的核苷酸序列示作SEQ ID NO1，相应基因产物的氨基酸序列示作SEQ ID NO2。
根据本发明可以使用上述参考文献中所述pckA基因。还可以使用pckA基因的等位基因，所述等位基因得自遗传密码的简并或中性有义突变。
弱化例如可以通过降低或关闭pckA基因的表达或所述酶蛋白的催化性质而实现。可任选组合使用这两种措施。
可通过合适的培养方法，通过遗传修饰(突变)用于基因表达的信号结构，或通过反义RNA技术，而降低基因表达。用于基因表达的信号结构例如是阻遏基因、激活基因、操纵子、启动子、弱化子、核糖体结合位点、起始密码子和终止子。本领域技术人员可在如下文献中发现此方面的信息，例如Jensen和Hammer(生物技术和生物遗传58，191-195(1998))，Carrier和Keasling(生物技术进展，58-64(1999))，Franch和Gerdes(微生物学通用观点3，159-164(2000))，以及已知的遗传学和分子生物学教科书如Knippers的教科书(分子遗传学，第6版，Georg Thieme Verlag，德国斯图加特，1995)，或Winnacker的教科书(基因和克隆，VCHVerlagsgesellschaft，Weinheim，德国，1990)。
导致酶蛋白催化活性的变化或降低的突变是现有技术中已知的，可提及的例子如Qiu和Goodman的论文(生物化学杂志2728611-8617(1997))，Yano等(美国科学院院报95，5511-5515(1998))及Wente和Schachmann(生物化学杂志266，20833-20839(1991))。Sugimoto等(生物科学生物技术和生物化学611760-1762(1997))。综述可参见遗传学和分子生物学的已知教科书，如Hagemann的教科书(″普通遗传学″，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1996)。
可以考虑的突变是转换、颠换、插入和缺失。根据交换氨基酸对酶活性的影响，使用术语错义突变或无义突变。在基因中插入或缺失至少一个碱基对导致移码突变，其结果是插入不正确的氨基酸或者翻译过早终止。缺失两个或多个密码子典型地导致酶活性的完全丧失。产生此类突变的指导属于现有技术并可在遗传学和分子生物学的已知教科书中找到，如Knippers的教科书(分子遗传学，第6版，Georg Thieme Verlag，德国斯图加特，1995)，Winnacker的教科书(基因和克隆，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，德国，1990)或Hagemann的教科书(″普通遗传学″，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1996)。
通过位点特异性诱变对大肠杆菌pckA基因进行弱化尤其关闭的质粒，例如是pMAK705ΔpckA(

图1)。其只含有pckA基因的部分5′区和部分3′区，编码区的一个349bp节段丢失(缺失)。可用于诱变pckA基因的这个DNA序列示作SEQ ID NO3。
pckA基因的缺失突变可以通过基因或等位基因交换掺入适当菌株中。
一个常用的方法是使用条件复制pSC101衍生物pMAK705进行基因交换的方法，如Hamilton等所述(细菌学杂志174，4617-4622(1989))。也可以使用本领域已知的其它方法，例如Martinez-Morales等(细菌学杂志7143-7148(1999))或Boyd等(细菌学杂志182，842-84792000))所述方法。
当进行交换时，SEQ ID NO4所示ΔpckA等位基因形式存在于提及的菌株中，所述等位基因也是本发明的一方面。
pckA基因中的突变或涉及pckA基因表达的突变，也可以通过接合或转导移至不同菌株中。
另外，为用肠细菌科菌株生产L-氨基酸尤其L-苏氨酸，除了弱化pckA基因之外，扩增已知苏氨酸生物合成途径的一或多种酶，或回补代谢的酶，或生产还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的酶，也是有益的。
文中术语“扩增”是指微生物中由相应DNA编码的一或多种酶(蛋白质)的胞内活性的提高，例如通过提高基因的拷贝数，或用强启动子或编码高活性相应酶(蛋白质)的基因，及如果需要组合使用这些方法。
通过扩增措施，尤其通过过表达，相应蛋白质的活性或浓度基于野生型蛋白质或起始微生物中蛋白质一般提高至少10％，25％，50％，75％，100％，150％，200％，300％，400％或500％，直至最多1000％或2000％。
因此，例如选自以下的一或多个基因可以同时扩增，尤其过表达·编码天冬氨酸激酶，高丝氨酸脱氢酶，高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶的thrABC操纵子(US-A-4278765)，·编码丙酮酸羧化酶的pyc基因(DE-A-19 831 609)，·编码磷酸烯醇丙酮酸合酶的pps基因(分子和普通遗传学231，332(1992))，·编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因(基因31，279-283(1984))，
·编码转氢酶的pntA和pntB基因(欧洲生物化学杂志158，647-653(1986))，·编码高丝氨酸抗性的rhtB基因(EP-A-0994190)·编码苏氨酸抗性的rhtC基因(EP-A-1013765)，·编码谷氨酸脱氢酶的gdhA基因(基因27193-199(1984))。
另外，为生产L-氨基酸尤其L-苏氨酸，除了弱化pckA基因之外，弱化尤其关闭选自以下的一或多个基因或降低其表达是有益的·编码苏氨酸脱氢酶的tdh基因(Ravnikar和Somerville，细菌学杂志169，4716-4721(1987))，·编码苹果酸脱氢酶(EC1.1.1.37)的mdh基因(Vogel等，微生物学公文149，36-42(1987))，·开放读框(orf)yjfA的基因产物(国立生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD，美国)，登记号AAC77180，SEQ ID NO5)，·开放读框(orf)ytfP的基因产物(国立生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD，美国)，登记号AAC77179，SEQ ID NO5)。
优选弱化开放读框yjfA和/或开放读框ytfP。
根据本发明还可以独立于pckA基因而弱化开放读框yjfA和/或开放读框ytfP，以实现氨基酸尤其L-苏氨酸生产的改良。
本发明因此还提供了一种方法，特征在于进行以下步骤a)发酵肠细菌科微生物，其中至少开放读框yjfA和/或ytfP是弱化的，b)收集所述培养基或肠细菌科微生物细胞中的L-氨基酸，及c)分离L-苏氨酸，发酵肉汤的成分及全部或部分生物量任选地作为固体产物与L-氨基酸一起分离。
通过位点特异性诱变可以弱化尤其关闭大肠杆菌开放读框yjfA和ytfP的质粒例如是质粒pMAK705ΔyjfA(图2)。其只含有ytfP-yjfA区的5′和3′侧翼，包括开放读框yjfA和ytfP的极少残基。ytfP-yjfA区一个337bp长的部分丢失(缺失)。可用于诱变ytfP-yjfA区的这个DNA序列示作SEQ ID NO6。
通过位点特异性诱变可以弱化尤其关闭大肠杆菌开放读框yjfA和ytfP的质粒另外例如是质粒pMAK705Δ90bp(图5)。其也只含有ytfP-yjfA区的5′和3′侧翼，包括开放读框yjfA和ytfP的极少残基。ytfP-yjfA区一个90bp长的部分丢失(缺失)。可用于诱变ytfP-yjfA区的这个DNA序列示作SEQ ID NO7。
这种缺失突变可以通过基因或等位基因置换掺入适当菌株中。还可以通过接合或转导将开放读框yjfA和/或ytfP中的突变或影响这些开放读框表达的突变移至各种菌株中。
当进行置换时，在所提及的菌株中存在SEQ ID NO6或SEQ IDNO7所示的ΔytfP和ΔyjfA等位基因形式，所述等位基因也是本发明的一方面。
另外，除单独或联合弱化pckA基因或开放读框yjfA和/或ytfP之外，抑制非所需的二级反应对L-氨基酸特别是L-苏氨酸的生产也是有益的(Nakayama“生产氨基酸的微生物的育种”，微生物产物的过量产生，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(编辑)，学术出版社，伦敦，英国，1982)。
根据本发明制备的微生物还可通过分批方法或补料分批法培养。已知的培养法由Chmiel(生物加工技术学1，生物工程指导)(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991)所著教材，或由Storhas(生物反应器和外周设备)(Vieweg Verlag，Brunswick/Wiesbaden，1994))所著教材中提供。
所用培养基必须以适当方式符合各菌株的需求。关于各种微生物培养基的阐述见于美国细菌学会的“细菌学通用方法手册”(华盛顿D.C.，USA，1981)。
可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉和任选地纤维素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸，醇如甘油和乙醇，及有机酸如乙酸，这些物质可单独或混合使用。
可使用的氮源包括含氮的有机化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麦芽提取物，玉米浸液、大豆粉和尿素，或无机化合物如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。氮源可单独或混合使用。
可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，或相应钠盐。培养基另外还必须含有为生长所需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，可使用生长必需物质如氨基酸和维生素，此外，可将适当前体加入培养基中上述物质可以单批形式或在培养期间以适当方式加入培养物中。
可以适当方式加入碱性化合物如NaOH，KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以调节培养物的pH值，抗泡沫剂例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫产生。适当的选择性作用物质例如抗生素，可加入培养基中以保持质粒的稳定性。氧气或含氧混合气，例如空气，可充入培养物中以保持有氧条件。培养温度通常在25℃～45℃，优选30℃～40℃，持续培养直至L-氨基酸或L-苏氨酸形成最大量。此目的通常在10～160小时范围达到。
L-氨基酸的分析方法是现有技术中已知的，分析可通过阴离子交换层析，随后经如Speckman等(分析化学，30，(1958)，1190)所述茚三酮衍生化作用进行，或通过反相HPLC，如Lindroth等(分析化学(1979)511167-1174)。
大肠杆菌K-12菌株DH5α/pMAK705的纯培养物根据布达佩斯条约，于2000年9月12日保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，不伦瑞克，德国)，保藏号DSM 13720。
大肠杆菌K-12菌株MG442ΔpckA的纯培养物根据布达佩斯条约，于2000年10月2日保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，不伦瑞克，德国)，保藏号DSM 13761。
大肠杆菌K-12菌株B-3996kurΔtdhΔpckA/pVIC40的纯培养物根据布达佩斯条约，于2001年3月9日保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，不伦瑞克，德国)，保藏号DSM 14150。
大肠杆菌K-12菌株MG442Δ90yjfA的纯培养物根据布达佩斯条约，于2001年5月9日保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，不伦瑞克，德国)，保藏号DSM 14289。
根据本发明还可以单独弱化开放读框ytfP和yjfA，以改良L-氨基酸的生产。
本发明的方法用于发酵制备L-氨基酸，例如L-苏氨酸，L-异亮氨酸，L-甲硫氨酸，L-高丝氨酸和L-赖氨酸，尤其L-苏氨酸。
本发明借助于以下提供的实施例得以更详述阐述。
从大肠杆菌中分离质粒DNA及所有限制，Klenow处理和碱性磷酸酶处理方法，均如Sambrook等所述进行(分子克隆实验指导(1989)，冷泉港实验室出版社)。除非特别说明，大肠杆菌转化方法如Chung等所述进行(美国科学院院报86，2172-2175(1989))。
制备菌株和转化体的温育温度是37℃。Hamilton等所述基因交换方法中使用的稳定为30℃和44℃。
实施例1构建pckA基因的缺失突变体将大肠杆菌K12的pckA基因的5′和3′区的一部分使用聚合酶链反应(PCR)和合成的寡核苷酸扩增。基于大肠杆菌K12 MG1655中的pckA基因的核苷酸序列(SEQ ID NO1)，合成以下PCR引物(MWG Biotech，Ebersberg，德国)pckA′5′-15′-GATCCGAGCCTGACAGGTTA-3′pckA′5′-25′-GCATGCGCTCGGTCAGGTTA-3′pckA′3′-15′-AGGCCTGAAGATGGCACTATCG-3′
pckA′3′-25′-CCGGAGAAGCGTAGGTGTTA-3′用于PCR的大肠杆菌K12 MG1655染色体DNA用“QiagenGenomic-tips 100/G”(QIAGEN，Hilden，德国)，根据厂商指导分离。pckA基因5′区的-个大约500bp DNA片段(示为pck1)和pckA基因3′区的一个大约600bp DNA片段(示为pck2)，可以使用Taq DNA聚合酶(Gibco-BRL，Eggenstein，德国)，在标准PCR条件下(Innis等(1990)，PCR方案，方法和应用指导，学术出版社)用特异引物扩增。将PCR产物根据厂商指导与载体pCR2.1TOPO(TOPO TA克隆试剂盒，Invitrogen，Groningen，荷兰)连接，并转化入大肠杆菌菌株TOP10F′中。在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。在分离质粒DNA后，将载体pCR2.1TOPOpck2用限制酶StuI和XbaI酶切，并在0.8％琼脂糖凝胶中分离后，将pck2片段借助于QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN，Hilden，德国)分离。在分离质粒DNA后，将载体pCR2.1TOPOpck1用酶EcoRV和XbaI酶切，并与分离的pck2片段连接。将大肠杆菌菌株DH5α用所述连接混合物转化，并在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。在分离质粒DNA后，用酶SpeI和XbaI控制酶切，用于检测含有克隆形式的SEQID NO3所示突变DNA序列的质粒。将一个这种质粒称为pCR2.1TOPOΔpckA。
实施例2构建交换载体pMAK705ΔpckA在用酶SpeI和XbaI限制及在0.8％琼脂糖凝胶中分离后，将实施例1所述pckA等位基因从载体pCR2.1TOPOΔpckA中分离，并连接进已经用酶XbaI消化的质粒pMAK705(Hamilton等，细菌学杂志174，4617-4622(1989))。将DH5α用所述连接混合物转化，并在含有20μg/ml氯霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。在分离质粒DNA及用酶HpaI，KpnI，HindIII，SalI和PstI酶切后，检测成功克隆情况。形成的交换载体pMAK705ΔpckA(＝pMAK705deltapckA)示于图1。
实施例3在大肠杆菌菌株MG442中位点特异性诱变pckA基因L-苏氨酸生产菌株MG442在专利US-A-4278765中阐述，并保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM，俄罗斯莫斯科)，保藏号CMIM B-1628。
菌株MG442具有α-氨基-β-羟戊酸抗性，并任选地部分和可补偿地需要L-异亮氨酸。
为用所述质粒编码的缺失构建体交换染色体pckA基因，用质粒pMAK705ΔpckA转化MG442。通过Hamilton等所述选择方法进行基因交换(细菌学杂志174，4617-4622(1989))，并使用以下寡核苷酸引物通过标准PCR方法核实(Innis等(1990)，PCR方案，方法和应用指导，学术出版社)pckA′5′-15′-GATCCGAGCCTGACAGGTTA-3′pckA′3′-25′-CCGGAGAAGCGTAGGTGTTA-3′。
获得的菌株称为MG442ΔpckA。
实施例4用菌株MG442ΔpckA生产L-苏氨酸将MG442ΔpckA在具有以下组分的培养基中培养3.5g/lNa2HPO4.2H2O，1.5g/l KH2PO4，1g/l NH4Cl，0.1g/l MgSO4.7H2O，2g/l葡萄糖和20g/l琼脂。在100ml Erlenmeyer烧瓶中含有的10ml分批培养物中检测L-苏氨酸的形成。将这些分批培养物接种于具有以下组分的10ml预培养基2g/l酵母膏，10g/l(NH4)2SO4，1g/l KH2PO4，0.5g/l MgSO4.7H2O，15g/l CaCO3和20g/l葡萄糖，并在37℃及以180rpm在得自Kuhner AG(Birsfelden，瑞士)的ESR温育器上温育16小时。将250μl此预培养物移至10ml生产培养基中(25g/l(NH4)2SO4，2g/l KH2PO4，1g/l MgSO4.7H2O，0.03g/l FeSO4.7H2O，0.018g/l MnSO4.1H2O，30g/l CaCO3，20g/l葡萄糖)，在37℃温育48小时。在温育后，用得自Dr.Lange(德国柏林)的LP2W光度计测定培养物悬浮液的光密度(OD)，测定波长为660nm。
随后在过滤灭菌的培养上清中，用得自Eppendorf-BioTronik(Hamburg，德国)的氨基酸分析仪，通过离子交换层析和用茚三酮检测柱后反应，测定形成的L-苏氨酸浓度。
实验结果示于表1。
表1
实施例5用菌株MG442ΔpckA/pMW218gdhA生产L-苏氨酸5.1gdhA基因的扩增和克隆使用聚合酶链反应(PCR)和合成的寡核苷酸扩增大肠杆菌K12的谷氨酸脱氢酶基因。基于大肠杆菌K12 MG1655的gdhA基因的核苷酸序列(基因文库登记号No.AE000270和No.AE000271)合成PCR引物(NWG Biotech，Ebersberg，德国)Gdh15′-TGAACACTTCTGGCGGTACG-3′Gdh25′-CCTCGGCGAAGCTAATATGG-3′根据厂商指导，用“QIAGEN Genomic-tips 100/G”(QIAGEN，Hilden，德国)分离用于PCR的大肠杆菌K12 MG1655染色体DNA。包含gdhA编码区和大约350bp 5′-侧翼序列和大约450bp 3′-侧翼序列的一个大约2150bp的DNA片段，可以用特异引物在标准PCR条件下(Innis等，PCR方案，方法和应用指导，1990，学术出版社)，用Pfu-DNA聚合酶(Promega公司，Madison，美国)扩增得到。将所述PCR产物克隆在质粒pCR2.1TOPO中并转化大肠杆菌菌株TOP10(Invitrogen，Leek，荷兰，产品描述TOPO TA克隆试剂盒，Cat.No.K4500-01)。用限制酶EcoRI和EcoRV酶切质粒pCR2.1TOPOgdhA证实成功克隆。为此，所述质粒DNA通过“QIAprepSpin质粒试剂盒”(QIAGEN，Hilden，德国)分离，并在酶切后在0.8％琼脂糖凝胶中分离。
5.2在质粒载体pMW218中克隆gdhA基因将质粒pCR2.1TOPOgdhA用酶EcoRI酶切，并将酶切混合物在0.8％琼脂糖凝胶中分离，借助于“QIAquick凝胶提取试剂盒”(QIAGEN，Hilden，德国)分离大小为2.1kbp的gdhA片段。质粒pMW218(Nippon基因，日本富山)用酶EcoRI酶切，并与gdhA片段连接。大肠杆菌菌株DH5α用所述连接混合物转化，并铺板于加入20μg/l卡那霉素的LB琼脂(Lennox，病毒学1955，1190)上选择携带pMW218的细胞。
在分离质粒DNA及用EcoRI和EcoRV控制酶切后，可以证实gdhA基因的成功克隆。该质粒称为pMW218gdhA(图3)。
5.3菌株MG442ΔpckA/pMW218gdhA的制备将实施例3中获得的菌株MG442ΔpckA和菌株MG442用质粒pMW218gdhA转化，并在补加20μg/l卡那霉素的LB琼脂上选择转化体。以此方式形成菌株MG442ΔpckA/pMW218gdhA和MG442/pMW218gdhA。
5.4生产L-苏氨酸如实施例4所述测试菌株MG442ΔpckA/pMW218gdhA和MG442/pMW218gdhA生产L-苏氨酸情况。基本培养基和预培养基额外补加20μg/l卡那霉素。实验结果示于表2。
表2
实施例6用菌株MG442ΔpckA/pMW219rhtC生产L-苏氨酸6.1rhtC基因的扩增使用聚合酶链反应(PCR)和合成的寡核苷酸扩增大肠杆菌K12的rhtC基因。基于大肠杆菌K12 MG1655的rhtC基因的核苷酸序列(基因文库登记号No.AE000458，Zakataeva等(FEBS通讯452，228-232(1999))，合成PCR引物(MWG Biotech，Ebersberg，德国)RhtC15′-CTGTTAGCATCGGCGAGGCA-3′RhtC25′-GCATGTIGATGGCGATGACG-3′根据厂商指导，用“QIAGEN Genomic-tips 100/G”(QIAGEN，Hilden，德国)分离用于PCR的大肠杆菌K12 MG1655染色体DNA。一个大约800bp的DNA片段，可以用特异引物在标准PCR条件下(Innis等，PCR方案，方法和应用指导，1990，学术出版社)，用Pfu-DNA聚合酶(Promega公司，Madison，美国)扩增得到。
6.2在质粒载体pMW219中克隆rhtC基因将质粒pMW219(Nippon基因，日本富山)用酶SamI酶切，并与rhtC-PCR片段连接。大肠杆菌菌株DH5α用所述连接混合物转化，并铺板于加入20μg/l卡那霉素的LB琼脂(Lennox，病毒学1955，1190)上选择携带pMW219的细胞。在分离质粒DNA及用KpnI，HindIII和NcoI控制酶切后，可以证实成功克隆。质粒pMW219rhtC示于图4。
6.3菌株MG442ΔpckA/pMW219rhtC的制备将实施例3中获得的菌株MG442ΔpckA和菌株MG442用质粒pMW219rhtC转化，并在补加20μg/l卡那霉素的LB琼脂上选择转化体。以此方式形成菌株MG442ΔpckA/pMW219rhtC和MG442/pMW219rhtC。
6.4生产L-苏氨酸如实施例4所述测试菌株MG442ΔpckA/pMW219rhtC和MG442/pMW219rhtC生产L-苏氨酸情况。基本培养基和预培养基额外补加20μg/l卡那霉素。
实验结果示于表3。
表3
实施例7用菌株B-3996kurΔtdhΔpckA/pVIC40生产L-苏氨酸生产L-苏氨酸的大肠杆菌菌株B-3996在US-A-5175107中阐述，并保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM，俄罗斯莫斯科)。
菌株B-3996特别具有α-氨基-β-羟戊酸抗性，具有弱化的尤其关闭的或缺陷的苏氨酸脱氢酶，具有反馈抗性形式的增强的高丝氨酸脱氢酶I天冬氨酸激酶I，任选地部分和可补偿地需要L-异亮氨酸，及具有蔗糖利用能力。
7.1制备菌株B-3996kurΔtdhΔpck/pVIC40在无抗生素的完全培养基中培养大约10代后，分离不再含有质粒pVIC40的菌株B-3996衍生物。形成的菌株是链霉素敏感的，称为B-3996kur。
使用Hamilton等所述方法(细菌学杂志(1989)1714617-4622)，在tdh基因中掺入缺失，所述方法基于使用具有温度敏感复制子的质粒pMAK705。质粒pDR121(Ravnikar和Somerville，细菌学杂志(1987)1694716-4721)含有编码tdh基因的一个大小为3.7kbp的大肠杆菌DNA片段。为产生tdh基因区缺失，将pDR121用限制酶ClaI和EcoRV酶切，在用Klenow酶处理后，连接分离的大小为5kbp的DNA片段。将连接混合物转化大肠杆菌菌株DH5α，并在加入50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。
在分离质粒DNA及用EcoRI控制酶切后，可以证实tdh基因的成功缺失。分离大小为1.7kbp的EcoRI片段，并与用EcoRI部分消化的质粒pMAK705连接。将连接混合物转化DH5α并在加入20μg/ml氯霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。在分离质粒DNA及用EcoRI酶切后，证实克隆成功。形成的pMAK705衍生物称为pDM32。
为进行基因置换，B-3996kur用质粒pDM32转化。用所述质粒编码的缺失构建体置换染色体tdh基因通过Hamilton等所述选择方法进行，并使用以下寡核苷酸引物通过标准PCR方法(Innis等(1990)，PCR方案，方法和应用指导，学术出版社)核实Tdh15′-TCGCGACCTATAAGTTTGGG-3′Tdh25′-AATACCAGCCCTTGTTCGTG-3′对形成的菌株测试其卡那霉素敏感性，并称为B-3996kurΔtdh。
为进行pckA基因的位点特异性诱变，B-3996kurΔtdh用实施例2所述置换载体pMAK705ΔpckA转化。染色体pckA基因由所述质粒编码的缺失构建体的置换如实施例3所述进行。获得的菌株称为B-3996kurΔtdhΔpckA。
B-3996kurΔtdh和B-3996kurΔtdhΔpckA用分离自B-3996的质粒pVIC40转化，并在具有20μg/ml链霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。各自选择的一个菌落称为B-3996kurΔtdh/pVIC40和B-3 996kurΔtdhΔpckA/pVIC40。
7.2生产L-苏氨酸如实施例4所述测试菌株B-3996kurΔtdh/pVIC40和B-3996kurΔtdhΔpckA/pVIC40生产L-苏氨酸情况。基本培养基和预培养基额外补加20μg/l链霉素。
实验结果示于表4。
表4
实施例8用菌株TOC21RΔpckA生产L-赖氨酸生产L-赖氨酸的大肠杆菌菌株pDA1/TOC21R在专利申请F-A-2511032中阐述，并保藏于国立微生物保藏中心(CNCM，Pasteur研究所，法国巴黎)，保藏号I-167。所述菌株及无质粒宿主也由Dauce-Le Reverend等所述(欧洲应用微生物学和生物技术学杂志15227-231(1982))，名称为TOCR21/pDA1。
8.1大肠杆菌菌株TOC21R的pckA基因的位点特异性诱变在无抗生素的LB培养基中培养大约6代后，分离不再含有质粒pDA1的菌株pDA1/TOC21R衍生物。形成的菌株是四环素敏感的，并称之为TOC21R。
为了用所述质粒编码的缺失构建体置换染色体pckA基因，TOC21R用质粒pMAK705ΔpckA(实施例2)转化。基因置换通过Hamilton等所述选择方法(细菌学杂志(1989)，174，4617-4622)进行，并使用以下寡核苷酸引物通过标准PCR方法(Innis等(1990)，PCR方案，方法和应用指导，学术出版社)核实pckA′5′-15′-GATCCGAGCCTGACAGGTTA-3′pckA′3′-25′-CCGGAGAAGCGTAGGTGTTA-3′获得的菌株称之为TOC21RΔpckA。
8.2用菌株TOC21RΔpckA生产L-赖氨酸菌株TOC21RΔpckA和TOC21R形成L-赖氨酸的情况在100ml锥形瓶中的10ml分批培养物中检测。为此，接种具有以下组分的10ml预培养基2g/l酵母膏，10g/l(NH4)2SO4，1g/l KH2PO4，0.5g/lMgSO4.7H20，15g/l CaCO3，20g/l葡萄糖，并在37℃及以180rpm在得自Kuhner AG(Birsfelden，瑞士)的ESR温育器上温育16小时。将250μl此预培养物转接种于10ml生产培养基中(25g/l(NH4)2SO4，2h/l KH2PO4，1g/l MgSO4.7H2O，0.03g/l FeSO4.7H2O，0.018g/l MnSO4.1H2O，30g/l CaCO3，20g/l葡萄糖，25mg/ml L-异亮氨酸和5mg/ml硫胺素)，在37℃温育72小时。在温育后，用得自Dr.Lange(德国柏林)的LP2W光度计测定培养物悬浮液的光密度(OD)，测定波长为660nm。
随后在过滤灭菌的培养上清中，用得自Eppendorf-BioTronik(Hamburg，德国)的氨基酸分析仪，通过离子交换层析和用茚三酮检测柱后反应，测定形成的L-赖氨酸浓度。
实验结果示于表5。
表5
实施例9用菌株B-3996kurΔtdhilvA+Δpck/pVIC40生产L-异亮氨酸
9.1制备菌株B-3996kurΔtdhilvA+ΔpckA/pVIC40将在实施例7.1中获得的需要L-异亮氨酸的菌株B-3996kurΔtdh，借助于噬菌体Plkc转导(Lennox，病毒学1，190-206(1955)；Miller，分子遗传学实验，冷泉港实验室1972)，并分离L-异亮氨酸原养型转导体。
为此，将噬菌体Plkc在菌株MG1655上增殖(Guyer等，数量生物学冷泉港座谈会45，135-140(1981)，及Blattner等，科学277，1453-1462(1997))，并将噬菌体裂解物用于转导菌株B-3996kurΔtdh。感染复数为大约0.2。在含有2g/l葡萄糖和10mg/l L-苏氨酸的基本培养基上选择L-异亮氨酸原养型转导体。分离L-异亮氨酸原养型转导体，涂布于LB琼脂上以纯化或分离，并将其称为B-3996kurΔtdhilvA+。
然后如实施例3所述，将菌株B-3996kurΔtdhilvA+的pckA基因由实施例1和2中制备的ΔpckA等位基因置换。所得菌株称为B-3996kurΔtdhilvA+ΔpckA。
菌株B-3996kurΔtdhilvA+和B-3996kurΔtdhilvA+ΔpckA用分离自菌株B-3996的质粒pVIC40转化，并在补加20μg/ml链霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。各自选择的一个菌落称为B-3996kurΔtdhilvA+ΔpckA/pVIC40和B-3996kurΔtdhilvA+/pVIC40。
9.2生产L-异亮氨酸如实施例4所述在测试条件下测试菌株B-3996kurΔtdhilvA+ΔpckA/pVIC40和B-3996kurΔtdhilvA+/pVIC40生产L-异亮氨酸情况。基本培养基，预培养基和生产培养基额外补加20μg/ml链霉素。
实验结果示于表6。
表6
实施例10用菌株B-12288ΔpckA生产L-缬氨酸生产L-缬氨酸的大肠杆菌菌株AJ11502在专利申请US-A-4391907中阐述，并保藏于国家农业应用研究中心(Peoria，Illinois，美国)，NRRL B-12288。
10.1大肠杆菌菌株B-12288中pckA基因的位点特异性诱变在无抗生素的LB培养基中培养大约6代后，分离菌株AJ11502衍生物。形成的菌株是四环素敏感的，并称之为AJ11502kur。
为用所述质粒编码的缺失构建体置换染色体pckA基因，AJ11502kur用质粒pMAK705ΔpckA(实施例2)转化。基因置换通过Hamilton等所述选择方法(细菌学杂志(1989)，174，4617-4622)进行，并使用以下寡核苷酸引物通过标准PCR方法(Innis等(1990)，PCR方案，方法和应用指导，学术出版社)核实pckA′5′-15′-GATCCGAGCCTGACAGGTTA-3′pckA′3′-25′-CCGGAGAAGCGTAGGTGTTA-3′获得的菌株称之为AJ11502kurΔpckA。专利申请US-A-4391907阐述的质粒，其携带与缬氨酸生产相关的遗传信息，分离自菌株NRRL B-12288。用该质粒转化菌株AJ11502kurΔpckA。将所得的转化体之一称为B-12288ΔpckA。
10.2用菌株B-12288ΔpckA生产L-缬氨酸菌株B-12288ΔpckA和NRRL B-12288形成L-缬氨酸的情况在100ml锥形瓶中的10ml分批培养物中检测。为此，接种具有以下组分的10ml预培养基2g/l酵母膏，10g/l(NH4)2SO4，1g/l KH2PO4，0.5g/l MgSO4.7H2O，15g/l CaCO3，20g/l葡萄糖和50mg/l氨苄青霉素，并在37℃及以180rpm在得自Kuhner AG(Birsfelden，瑞士)的ESR温育器上温育16小时。将250μl此预培养物转接种于10ml生产培养基中(25g/l(NH4)2SO4，2g/l KH2PO4，1g/l MgSO4.7H2O，0.03g/l FeSO4.7H2O，0.018g/l MnSO4.1H2O，30g/l CaCO3，20g/l葡萄糖，5mg/ml硫胺素和50mg/l氨苄青霉素)，在37℃温育72小时。在温育后，用得自Dr.Lange(德国柏林)的LP2W光度计测定培养物悬浮液的光密度(OD)，测定波长为660nm。
随后在过滤灭菌的培养上清中，用得自Eppendorf-BioTronik(Hamburg，德国)的氨基酸分析仪，通过离子交换层析和用茚三酮检测柱后反应，测定形成的L-缬氨酸浓度。
实验结果示于表7。
表7
实施例11ytfP-yjfA基因区缺失突变体的构建将大肠杆菌K12的ytfP-yjfA基因区使用聚合酶链反应(PCR)和合成的寡核苷酸扩增。从大肠杆菌K12 MG1655中ytfP-yjfA基因的核苷酸序列(SEQ ID NO5)开始，合成以下PCR引物(MWGBiotech，Ebersberg，德国)ytfP-15′-GGCGATGTCGCAACAAGCTG-3′ytfP-25′-CTGTTCATGGCCGCTTGCTG-3′用于PCR的大肠杆菌K12 MG1655染色体DNA用“QiagenGenomic-tips 100/G”(QIAGEN，Hilden，德国)，根据厂商指导分离。一个大约1300bp DNA片段可以使用Taq DNA聚合酶(Gibco-BRL，Eggenstein，德国)，在标准PCR条件下用特异引物扩增(Innis等(1990)，PCR方案，方法和应用指导，学术出版社)。将PCR产物根据厂商指导，与载体pCR2.1TOPO(TOPO TA克隆试剂盒，Invitrogen，Groningen，荷兰)连接，并转化入大肠杆菌菌株TOP10F’中。在加入50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。在分离质粒DNA后，用限制酶EcoRI和NsiI检测所述PCR产物的成功克隆。
为在ytfP-yjfA区域中产生一个337bp缺失，将载体pCR2.1TOPOytfP-yjfA用限制酶NdeI和SspI酶切，并在用Klenow酶处理后，连接4.8kbp的DNA片段。
为产生一个90bp缺失，将载体pCR2.1TOPOytfP-yjfA用限制酶NdeI和SplI酶切，并在用Klenow酶处理后，连接5kbp的DNA片段。
用所述连接混合物转化大肠杆菌菌株DH5α，并在加入50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。在分离质粒DNA后，通过用限制酶EcoRI控制酶切检测其中克隆有SEQ ID NO6和SEQID NO7所示突变DNA序列的那些质粒。所述质粒称为pCR2.1TOPOΔyjfA和pCR2.1TOPOΔ90bp。
实施例12置换载体pMAK705ΔyjfA和pMAK705Δ90bp的构建在用酶SacI和XbaI限制及在0.8％琼脂糖凝胶中分离后，从载体pCR2.1TOPOΔyjfA和pCR2.1TOPOΔ90bp中分离实施例11所述ytfP-yjfA等位基因，并与用酶SacI和XbaI消化的质粒pMAK705(Hamilton等(1989)，细菌学杂志174，4617-4622)连接。在DH5α中转化所述连接混合物，并在加入20μg/ml氯霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。在分离质粒DNA及用酶SacI和XbaI酶切后，证实克隆成功。形成的置换载体pMAK705ΔyjfA(＝pMAK705deltayjfA)和pMAK705Δ90bp(＝pMAK705delta90bp)示于图2和图5。
实施例13ytfP-yjfA基因区在大肠杆菌菌株MG442中的位点特异性诱变为用所述质粒编码的90bp缺失构建体置换染色体ytfP-yjfA区，MG442用质粒pMAK705Δ90bp转化。所述基因置换如Hamilton等所述选择方法进行(细菌学杂志(1989)，174，4617-4622)，并使用以下寡核苷酸引物通过标准PCR方法核实(Innis等(1990)，PCR方案，方法和应用指导，学术出版社)ytfP-15′-GGCGATGTCGCAACAAGCTG-3′ytfP-25′-CTGTTCATGGCCGCTTGCTG-3′所得菌株称为MG442Δ90yjfA。
实施例14用菌株MG442Δ90yjfA生产L-苏氨酸如实施例4所述测试菌株MG442Δ90yjfA生产L-苏氨酸的情况。实验结果示于表8。
表8
实施例15用菌株MG442Δ90yjfAΔpckA生产L-苏氨酸15.1菌株MG442Δ90yjfAΔpckA的制备如实施例3所述，用ΔpckA等位基因(见实施例1和2)置换菌株MG442Δ90yjfA的pckA基因。所得菌株称为MG442Δ90yjfAΔpckA。
15.2L-苏氨酸的生产如实施例4所述用菌株MG442Δ90yjfAΔpckA生产L-苏氨酸。结果示于表9。
表9
本发明包括如下附图图1pMAK705ΔpckA(＝pMAK705deltapckA)图2pMAK705ΔyjfA(＝pMAK705deltayjfA)图3pMW218gdhA图4pMW219rhtC图5pMAK705Δ90bp(＝pMAK705delta90bp)。
长度数据是大约值。所采用的缩写和符号有如下含义cat氯霉素抗性基因rep-ts质粒pSC101的温度敏感性复制区pck1pckA基因的5′区部分pck2pckA基因的3′区部分ytfP’-yjfA’含有ytfP和yjfA截短的编码区的DNA序列kan卡那霉素抗性基因gdhA谷氨酸脱氢酶基因rhtC赋予苏氨酸抗性的基因限制酶缩写具有如下含义BamHI来自Bacillus amyloliquefaciens的限制性内切酶
BglII来自Bacillus globigii的限制性内切酶ClaI来自Caryphanon latum的限制性内切酶EcoRI来自大肠杆菌的限制性内切酶EcoRV来自大肠杆菌的限制性内切酶HindIII来自Haemophilus influenzae的限制性内切酶KpnI来自Klebsiella pneumoniae的限制性内切酶PstI来自Providencia stuartii的限制性内切酶PvuI来自Proteus vulgaris的限制性内切酶SacI来自Streptomyces achromogenes的限制性内切酶SalI来自Streptomyces albus的限制性内切酶SmaI来自粘质沙雷氏菌的限制性内切酶XbaI来自Xanthomonas badrii的限制性内切酶XhoI来自Xanthomonas holcicola的限制性内切酶。
序列表<110>德古萨股份公司<120>用肠细菌利菌株发酵生产L-氨基酸的方法<130>000425 BT<140><141><160>19<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1622<212>DNA<213>Escherichia coli<220><221>CDS<222>(1)..(1620)<223>pckA<400>1atg cgc gtt aac aat ggt ttg acc ccg caa gaa ctc gag gct tat ggt48Met Arg Val Asn Asn Gly Leu Thr Pro Gln Glu Leu Glu Ala Tyr Gly1 5 10 15atc agt gac gta cat gat atc gtt tac aac cca agc tac gac ctg ctg96Ile Ser Asp Val His Asp Ile Val Tyr Asn Pro Ser Tyr Asp Leu Leu20 25 30tat cag gaa gag ctc gat ccg agc ctg aca ggt tat gag cgc ggg gtg144Tyr Gln Glu Glu Leu Asp Pro Ser Leu Thr Gly Tyr Glu Arg Gly Val35 40 45tta act aat ctg ggt gcc gtt gcc gtc gat acc ggg atc ttc acc ggt192Leu Thr Asn Leu Gly Ala Val Ala Val Asp Thr Gly Ile Phe Thr Gly50 55 60cgt tca cca aaa gat aag tat atc gtc cgt gac gat acc act cgc gat240Arg Ser Pro Lys Asp Lys Tyr Ile Val Arg Asp Asp Thr Thr Arg Asp65 70 75 80act ttc tgg tgg gca gac aaa ggc aaa ggt aag aac gac aac aaa cct288Thr Phe Trp Trp Ala Asp Lys Gly Lys Gly Lys Asn Asp Asn Lys Pro85 90 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215 220Leu Lys Gly Ile Ala Ser Met His Cys Ser Ala Asn Val Gly Glu Lys225 230 235 240Gly Asp Val Ala Val Phe Phe Gly Leu Ser Gly Thr Gly Lys Thr Thr245 250 255Leu Ser Thr Asp Pro Lys Arg Arg Leu Ile Gly Asp Asp Glu His Gly260 265 270Trp Asp Asp Asp Gly Val Phe Asn Phe Glu Gly Gly Cys Tyr Ala Lys275 280 285Thr Ile Lys Leu Ser Lys Glu Ala Glu Pro Glu Ile Tyr Asn Ala Ile290 295 300Arg Arg Asp Ala Leu Leu Glu Asn Val Thr Val Arg Glu Asp Gly Thr305 310 315 320Ile Asp Phe Asp Asp Gly Ser Lys Thr Glu Asn Thr Arg Val Ser Tyr325 330 335Pro Ile Tyr His Ile Asp Asn Ile Val Lys Pro Val Ser Lys Ala Gly340 345 350His Ala Thr Lys Val Ile Phe Leu Thr Ala Asp Ala Phe Gly Val Leu355 360 365Pro Pro Val Ser Arg Leu Thr Ala Asp Gln Thr Gln Tyr His Phe Leu370 375 380Ser Gly Phe Thr Ala Lys Leu Ala Gly Thr Glu Arg Gly Ile Thr Glu385 390 395 400Pro Thr Pro Thr Phe Ser Ala Cys Phe Gly Ala Ala Phe Leu Ser Leu405 410 415His Pro Thr Gln Tyr Ala Glu Val Leu Val Lys Arg Met Gln Ala Ala
420 425 430Gly Ala Gln Ala Tyr Leu Val Asn Thr Gly Trp Asn Gly Thr Gly Lys435 440 445Arg Ile Ser Ile Lys Asp Thr Arg Ala Ile Ile Asp Ala Ile Leu Asn450 455 460Gly Ser Leu Asp Asn Ala Glu Thr Phe Thr Leu Pro Met Phe Asn Leu465 470 475 480Ala Ile Pro Thr Glu Leu Pro Gly Val Asp Thr Lys Ile Leu Asp Pro485 490 495Arg Asn Thr Tyr Ala Ser Pro Glu Gln Trp Gln Glu Lys Ala Glu Thr500 505 510Leu Ala Lys Leu Phe Ile Asp Asn Phe Asp Lys Tyr Thr Asp Thr Pro515 520 525Ala Gly Ala Ala Leu Val Ala Ala Gly Pro Lys Leu530 535 540<210>3<211>1156<212>DNA<213>Escherichia coli<220><221>misc_feature<222>(1)..(1156)<223>Mutagene DNA<220><221>misc_feature<222>(1)..(35)<223>Technical DNA/多接头序列的残基<220><221>misc_feature<222>(36)..(522)<223>pckA基因的5′区(pck1)的一部分<220><221>misc_feature<222>(523)..(542)<223>Technical DNA/多接头序列的残基<220><221>misc_feature<222>(543)..(1105)<223>pckA基因的3′区(pck2)的一部分<220><221>misc_feature<222>(1106)..(1156)<223>Technical DNA/多接头序列的残基<400>3ctagtaacgg ccgccagtgt gctggaattc ggcttgatcc 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ttaacactgg ctggaacggc actggcaaac gtatctcgat taaagatacc 960cgcgccatta tcgacgccat cctcaacggt tcgctggata atgcagaaac cttcactctg 1020ccgatgttta acctggcgat cccaaccgaa ctgccgggcg tagacacgaa gattctcgat 1080ccgcgtaaca cctacgcttc tccggaagcc gaattctgca gatatccatc acactggcgg 1140ccgctcgagc atgcat 1156<210>4<211>1294<212>DNA<213>Escherichia coli<220><221>misc_feature<222>(1)..(3)<223>delta pckA等位基因的起始密码子<220><221>misc_feature<222>(1)..(598)<223>delta pckA等位基因的5′区<220><221>misc_feature<222>(599)..(618)<223>Technical DNA/多接头序列的残基<220><221>misc_feature<222>(619)..(1291)<223>delta pckA等位基因的3′区<220><221>misc_feature<222>(1292)..(1294)<223>delta pckA等位基因的终止密码子<400>4atgcgcgtta acaatggttt gaccccgcaa gaactcgagg cttatggtat cagtgacgta 60catgatatcg tttacaaccc aagctacgac ctgctgtatc aggaagagct cgatccgagc 120ctgacaggtt atgagcgcgg ggtgttaact aatctgggtg ccgttgccgt cgataccggg 180atcttcaccg gtcgttcacc aaaagataag tatatcgtcc gtgacgatac cactcgcgat 240actttctggt gggcagacaa aggcaaaggt aagaacgaca acaaacctct ctctccggaa 300acctggcagc atctgaaagg cctggtgacc aggcagcttt ccggcaaacg tctgttcgtt 360gtcgacgctt tctgtggtgc gaacccggat actcgtcttt ccgtccgttt catcaccgaa 420gtggcctggc aggcgcattt tgtcaaaaac atgtttattc gcccgagcga tgaagaactg 480gcaggtttca aaccagactt tatcgttatg aacggcgcga agtgcactaa cccgcagtgg 540aaagaacagg gtctcaactc cgaaaacttc gtggcgttta acctgaccga gcgcatgcaa 600gccgaattct gcagatcctg aagatggcac tatcgacttt gatgatggtt caaaaaccga 660gaacacccgc gtttcttatc cgatctatca catcgataac attgttaagc cggtttccaa 720agcgggccac gcgactaagg ttatcttcct gactgctgat gctttcggcg tgttgccgcc 780ggtttctcgc ctgactgccg atcaaaccca gtatcacttc ctctctggct tcaccgccaa 840actggccggt actgagcgtg gcatcaccga accgacgcca accttctccg cttgcttcgg 900cgcggcattc ctgtcgctgc acccgactca gtacgcagaa gtgctggtga aacgtatgca 960ggcggcgggc gcgcaggctt atctggttaa cactggctgg aacggcactg gcaaacgtat 1020ctcgattaaa gatacccgcg ccattatcga cgccatcctc aacggttcgc tggataatgc 1080agaaaccttc actctgccga tgtttaacct ggcgatccca accgaactgc cgggcgtaga 1140cacgaagatt ctcgatccgc 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coli<220><221>misc_feature<222>(1)..(911)<223>携带缺失的ytfP-yjfA区<220><221>misc_feature<222>(1)..(383)<223>ytfP-yjfA区的5′侧翼<220><221>misc_feature<222>(384)..(911)<223>ytfP-yjfA区的3′侧翼<220><221>misc_feature<222>(376)..(378)<223>截短的ORF ytfP的ATG密码子<220><221>misc_feature<222>互补体((388)..(390))<223>截短的的ORF yjfA的ATG密码子<400>6ggcgatgtcg caacaagctg ccttgtctta tttgctacgt ggacaagggc tggagagcga 60tcagagcgac agtgcggcaa tgacctcgat gctgattggt ttgggggttg cgcaaagtgg 120ccagattgtg ggtaaaatcg gcgagacgtt tggcgtaagc aatttagcgc tcgacaccca 180gggagtaggc gactcctccc aggtagtggt cagcggctat gtattgccag gtctgcaagt 240gaaatacggc gtgggtatat ttgactctat agcaacactc acgttacgtt atcgcctgat 300gcctaagcta tatctggaag ccgtgtctgg tgtagaccag gcactggatt tgctctatca 360gttcgagttt tagcaatgcg aattatgcat acgccacctt cgggtggcgt tgttttttgc 420gagacgactc gcattctgtt ttgtaattcc ctcacctttt gcttttctct ccgagccgct 480ttccatatct attaacgcat aaaaaactct gctggcattc acaaatgcgc aggggtaaaa 540cgtttcctgt agcaccgtga gttatacttt gtataactta aggaggtgca gatgcgtatt 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atttgaacgg ggagacattg tgctggttgg ctttgatcca 1140gcaagcggcc atgaacag 1158<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物pckA′5′-1<400>8gatccgagcc tgacaggtta 20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物pckA′5′-2<400>9gcatgcgctc ggtcaggtta 20<210>10<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物pckA′3′-1<400>10aggcctgaag atggcactat cg 22<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物pckA′3′-2<400>11ccggagaagc gtaggtgtta 20<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物Gdh1<400>12tgaacacttc tggcggtacg 20<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物Gdh2<400>13cctcggcgaa gctaatatgg 20<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物RhtC1<400>14ctgttagcat cggcgaggca 20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物RhtC2<400>15gcatgttgat ggcgatgacg 20<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物Tdh1<400>16tcgcgaccta taagtttggg 20<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物Tdh2<400>17aataccagcc cttgttcgtg 20<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物ytfP-1<400>18ggcgatgtcg caacaagctg 20<210>19<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物ytfP-2<400>19ctgttcatgg ccgcttgctg 20
权利要求
1.发酵生产L-氨基酸、尤其是L-苏氨酸的方法，其中进行以下步骤a)发酵产生所需L-氨基酸的肠细菌科微生物，该微生物中至少pckA基因或编码其的核苷酸序列被弱化，尤其是被关闭，b)富集所述培养基或细菌细胞中L-氨基酸，及c)分离L-氨基酸，发酵肉汤的组分及全部或部分生物量任选地作为固体产物与L-氨基酸一起分离。
2.权利要求1的方法，其中所用微生物中所需氨基酸生物合成途径的其它基因被额外扩增。
3.权利要求1的方法，其中所用微生物中降低所需L-氨基酸形成的代谢途径至少被部分关闭。
4.权利要求1的方法，其中编码pckA基因的多核苷酸的表达被弱化，尤其被关闭。
5.权利要求1的方法，其中由多核苷酸pckA编码的多肽(酶蛋白)的调节和/或催化性质被降低。
6.权利要求1的方法，其中发酵如下的肠细菌科微生物以生产L-氨基酸，该微生物中选自以下的一或多个基因被同时扩增，尤其是过表达6.1编码天冬氨酸激酶，高丝氨酸脱氢酶，高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶的thrABC操纵子，6.2编码丙酮酸羧化酶的pyc基因，6.3编码磷酸烯醇丙酮酸合酶的pps基因，6.4编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因，6.5编码转氢酶的pntA和pntB基因，6.6编码高丝氨酸抗性的rhtB基因，6.7编码苏氨酸抗性的rhtC基因6.8编码谷氨酸脱氢酶的gdhA基因。
7.权利要求1的方法，其中发酵如下的肠细菌科微生物以生产L-氨基酸，该微生物中选自以下的一或多个基因同时被弱化，尤其是关闭，或表达降低7.1编码苏氨酸脱氢酶的tdh基因，7.2编码苹果酸脱氢酶的mdh基因，7.3开放读框(orf)yjfA的基因产物，7.4开放读框(orf)ytfP的基因产物。
8.发酵生产L-氨基酸、尤其L-苏氨酸的方法，其中进行以下步骤a)发酵产生所需L-氨基酸的肠细菌科微生物，该微生物中至少开放读框(orf)yjfA和/或ytfP或编码其的核苷酸序列被弱化，尤其是关闭，b)富集所述培养基或细菌细胞中L-氨基酸，及c)分离L-氨基酸，发酵肉汤的组分及全部或部分生物量任选地作为固体产物与L-氨基酸一起分离。
9.权利要求1或8的方法，其中生产L-异亮氨酸，L-缬氨酸，L-赖氨酸或L-苏氨酸。
10.生产L-氨基酸的肠细菌科微生物，其中至少pckA基因或编码其的核苷酸序列被弱化，尤其是关闭。
11.权利要求10的生产L-氨基酸的肠细菌科微生物，其额外具有一或多个选自以下一组的特征α-氨基-β-羟戊酸抗性，反馈抗性形式的扩增的高丝氨酸脱氢酶I-天冬氨酸激酶I，任选地可补偿地部分需要L-异亮氨酸，弱化的苏氨酸脱氢酶，及蔗糖利用能力。
12.生产L-氨基酸的肠细菌科微生物，其中至少开放读框yjfA和/或ytfP或编码其的核苷酸序列被弱化，尤其是关闭。
13.权利要求12的生产L-氨基酸的肠细菌科微生物，其额外具有一或多个选自以下一组的特征α-氨基-β-羟戊酸抗性，反馈抗性形式的扩增的高丝氨酸脱氢酶I-天冬氨酸激酶I，任选地可补偿地部分需要L-异亮氨酸，弱化的苏氨酸脱氢酶，及蔗糖利用能力。
14.图1所示质粒pMAK705ΔpckA，其含有相应于SEQ IDNO3的pckA基因的部分5′和3′区域。
15.图2所示质粒pMAK705ΔyjfA，其含有相应于SEQ ID NO6的ytfP-yjfA区的5′和3′侧翼，包括开放读框yjfA和ytfP的极少残基。
16.图5所示质粒pMAK705Δ90bp，其含有相应于SEQ ID NO7的ytfP-yjfA区的5′和3′侧翼，包括开放读框yjfA和ytfP的极少残基。
17.来自肠细菌科微生物的分离的多核苷酸，含有编码pckA基因5′和3′区域的多核苷酸序列，如SEQ ID NO4所示，所述多核苷酸特别适于作为位点特异性诱变pckA基因的质粒的组分。
18.来自肠细菌科微生物的分离的多核苷酸，含有ytfP-yjfA区的5′和3′侧翼，如SEQ ID NO6所示，所述多核苷酸特别适于作为位点特异性诱变开放读框ytfP和/或yjfA的质粒的组分。
19.生产L-苏氨酸的肠细菌科菌株，其含有相应于SEQ IDNO4的pckA基因中的一个缺失突变。
20.生产L-苏氨酸的肠细菌科菌株，其含有相应于SEQ IDNO6或7的开放读框ytfP中的一个缺失突变。
21.生产L-苏氨酸的肠细菌科菌株，其含有相应于SEQ IDNO6或7的开放读框yjfA中的一个缺失突变。
22.权利要求19的生产L-苏氨酸的肠细菌科菌株，其额外含有相应于SEQ ID NO6或7的开放读框ytfP中的一个缺失突变。
23.权利要求19的生产L-苏氨酸的肠细菌科菌株，其额外含有相应于SEQ ID NO6或7的开放读框yjfA中的一个缺失突变。
24.权利要求19，20或21的生产L-苏氨酸的肠细菌科菌株，其中它们具有选自以下一组的一或多个特征α-氨基-β-羟戊酸抗性，反馈抗性形式的扩增的高丝氨酸脱氢酶I-天冬氨酸激酶I，任选地可补偿地部分需要L-异亮氨酸，弱化的苏氨酸脱氢酶，及蔗糖利用能力。
25.大肠杆菌K-12菌株MG442ΔpckA，保藏在德意志微生物保藏中心，保藏号DSM 13761。
26.大肠杆菌K-12菌株MG442Δ90yjfA，保藏在德意志微生物保藏中心，保藏号DSM 14289。
27.大肠杆菌K-12菌株B3996kurΔtdhpckA/pVIC40，保藏在德意志微生物保藏中心，保藏号DSM 14150。
全文摘要
本发明涉及发酵生产L－氨基酸尤其L－苏氨酸的方法，其中进行以下步骤a)发酵产生所需L－氨基酸的肠细菌科微生物，该微生物中至少pckA基因或编码其的核苷酸序列被弱化，尤其是被关闭，b)富集所述培养基或细菌细胞中的L－氨基酸，及c)分离L－氨基酸。
文档编号C12P13/08GK1466630SQ01816550
公开日2004年1月7日 申请日期2001年9月5日 优先权日2000年9月30日
发明者梅希特希尔德·里平, 克里斯蒂娜·巴斯图克, 托马斯·赫尔曼, 格奥尔格·蒂尔巴赫, 赫尔曼, 格 蒂尔巴赫, 梅希特希尔德 里平, 蒂娜 巴斯图克 申请人:德古萨股份公司