专利名称：整肠剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及整肠剂。
背景技术：
已知在人和动物的肠道内存在着各种微生物，形成微生物菌丛。这种微生物中，有给宿主带来有害作用的称为有害菌的微生物和给宿主带来有益作用的有用菌。而且，这些微生物保持着共生或者对抗关系。作为有害菌，可以举出产生氨、硫化氢、胺等有害产物、由此给肝功能带来过度的负担或者和致癌有关联的有害菌等，作为具体的菌种，例如可以举出梭状芽孢杆菌属的菌种等。
作为通过改善肠内微生物菌丛给宿主带来的有益效果，例如(1)改善以腹泻、便秘为主的消化系统症状，(2)通过免疫赋活来预防癌症、提高抗感染能力等，(3)抑制有害酶等有害微生物的代谢产物的产生等，与宿主维持健康生活所必需的良好的肠内环境相关的各种效果。而且，为了宿主的健康而有效利用微生物菌丛是所谓益生菌(probiotics)的想法。
所谓益生菌提出下述定义“通过控制肠内菌丛，给宿主带来有益影响的微生物和物质”(Parker，R.BAn.营养健康，29，4-8(1974))、“通过改善肠内菌丛的平衡，给宿主带来有益作用的活微生物”(Fullar，R.J.应用细菌学，66，365-378(1989))、“单菌或者混合培养菌中，通过改善与宿主肠内菌丛平衡有关系的因素，给宿主带来有益作用的微生物”(Havenaar，R.和Huisin’t Veld，J.H.概述，In The Lactic Acid Bacteria in Health andDisease/Wood，B.J.B.ed.，pp.151-170(1992)Elsevier，London)、“活菌及其增殖促进物质中，不仅给动物而且给植物、食物固有的菌丛带来有益影响的微生物”(Fullar，R.ProbioticsTheir Development and Use，In Old Herborn University SeminerMonograph 8/van der Waaij，D.，Heidt，P.J.and Rush，V.C.eds.，pp.1-8(1995)Institute for Microbiology andBiochemistry，Herborn-Dill)等(营养学杂志Vol.55 No.4167～1771997)。无论哪种，称为所谓益生菌的物质都具有作为整肠剂的功能。
据报导，在乳酸菌中，有些具有这种益生的性质。具体地说，已知保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、各种双歧杆菌、干酪乳杆菌、以及加氏乳杆菌的各菌种的菌株具有益生的性质。更具体地说，已知植物乳杆菌299DSM6595、鼠李糖乳杆菌271DSM6594(专利第2742962号)、嗜酸乳杆菌PN-RI-2-4(特开平5-292947号公报)、嗜酸乳杆菌F-133(专利3052208号)、双歧杆菌BB536株和干酪乳杆菌Shirota株具有益生的性质。
特别是关于乳杆菌属的乳酸菌，目前认为嗜酸乳杆菌、敏捷乳杆菌、鸟乳杆菌、嗜淀粉乳杆菌、短乳杆菌、干酪乳杆菌、卷曲乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、鸡乳杆菌、加氏乳杆菌、约氏乳杆菌、鼠乳杆菌、哈氏乳杆菌、肠乳杆菌、植物乳杆菌、路氏乳杆菌、瘤胃乳杆菌、唾液乳杆菌18种菌种具有益生的性质(Probiotics A CriticalReviewGerald W.Tannock(1997)p47)。
可是，据报导，瑞士乳杆菌(1)蛋白质分解活性高，因此肽生成能力高，(2)瑞士乳杆菌发酵乳具有降血压作用等效果(专利第3028411号)。因而，已知用瑞士乳杆菌使乳发酵得到的菌体外产物可用于抑制乳酸酸度上升的乳酸菌发酵乳材料(特开平10-99018号公报)、增强干扰素的产生(特开昭57-1237号公报)、脂质代谢改善剂(特开平10-229841号公报)等用途。但是，尚不知道把瑞士乳杆菌作为活的菌体给与人等宿主，用作具有益生功能的整肠剂。
发明公开本发明的目的在于提供通过给人等施用，带来增加排便次数等效果，对改善肠内环境有用的整肠剂。
根据本发明，提供含有属于瑞士乳杆菌菌种的菌株的活菌体的整肠剂。
另外，根据本发明，提供一种控制肠功能的方法，包括给需要控制肠功能的对象施用有效量的前述整肠剂的步骤。
实施发明的方式本发明的整肠剂含有属于瑞士乳杆菌菌种的菌株的活菌体。
前述属于瑞士乳杆菌菌种的菌株优选具有胆汁酸抗性。具体地说，在胆汁酸抗性试验中，可优选使用显示干燥胆汁固形物的最小生长抑制浓度为0.8％以上，优选1.3％以上的菌株。
前述干燥胆汁固形物的最小生长抑制浓度是指，能够抑制前述菌株生长的干燥胆汁固形物的最小浓度。具体地说，可如下测定，例如在前述属于瑞士乳杆菌菌种的菌株能够生长的液体培养基(例如MRS培养基)中，添加各种浓度的干燥胆汁固形物(例如0、0.05、0.1、0.3、0.5、1.0、1.5、2.0％)，在其中培养菌株，用吸光光度计等测定经过一定时间后(例如0、4、8、12小时后)的浊度(例如在650nm)，求出对数增殖期的比增殖度(OD/小时)，进一步从胆汁固形物浓度和比增殖度的关系外推求出比增殖度为零时的胆汁固形物浓度。再有，作为前述干燥胆汁固形物，具体地说，可以使用例如Bacto-oxgall(商品名，Difco社制)等。
前述属于瑞士乳杆菌菌种的菌株优选是下述菌株，即前述菌株在肠道上皮细胞粘着试验中，2.8×106细胞/孔以上，优选4.5×106细胞/孔以上粘附到在底面积1.8cm2的柱状孔中单层培养的Caco-2细胞上。
对肠道上皮细胞的粘着性，具体地说，例如可以按照Greene和Klaenhammer的方法(Greene，J.D.和Klaenhammer，T.R.Appliedand Environmental Microbiology 60，4487-4494(1994))进行试验。具体地说，例如将1ml细胞数为1×105/ml的Caco-2细胞的培养液注入到底面积为1.8cm2的柱状孔中，进行培养直至成为单层。测定能够与该单层培养的Caco-2细胞粘着的每孔的前述菌株的个数。另外，优选使用显示出前述优选个数以上的个数的菌株作为前述菌株。
前述属于瑞士乳杆菌菌种的菌株优选是给人施用1.0×1011细胞时，可以从粪便中回收4.0×107细胞以上的菌株。
前述菌株在粪便中的回收量的测定例如可以如下进行按照常规方法，赋予前述菌株利福平抗性等抗生素抗性，给人受试者施用具有抗性的菌株，施用后，回收受试者的粪便，利用抗生素抗性观察粪便中的菌数。另外，前述菌株在粪便中的回收量的测定，也可以按照常规方法，通过检测粪便中的来源于前述菌株的基因进行测定。
作为前述属于瑞士乳杆菌菌种的菌株，可以使用瑞士乳杆菌CP53株(独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，保藏号FERM BP-5770)等各种菌株，但特别优选使用瑞士乳杆菌CP53株。
瑞士乳杆菌CP53株于1996年1月11日保藏在工业技术院生命工学工业技术研究所(目前是独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心)，保藏号FERM BP-5770，现在公众可以利用。
本发明的整肠剂的剂型没有特别的限定，粉末状、颗粒状、片剂等固体；以及糊状、凝胶状、液状等流体都可以。
本发明的整肠剂中的前述菌株的活菌体的含量没有特别的限定，每次施用，以可以摄取1.0×1011个以上活菌体的量为优选。具体地说，例如可以为1.0×106个/g～1.0×1011个/g，优选1.0×108个/g～1.0×1011个/g。
本发明的整肠剂的制造方法没有特别的限定，可通过用属于瑞士乳杆菌的菌株使乳发酵，得到属于瑞士乳杆菌的菌株的活菌体来制造。作为前述乳，可以举出牛乳、马乳、山羊乳、羊乳等兽乳以及豆乳等植物乳等。发酵温度可以为20℃～50℃，优选30℃～45℃，发酵时间可以为3～48小时，优选6～24小时。用属于瑞士乳杆菌的菌株使乳发酵，所得发酵物可以直接或者与其它添加剂、食品原料等其它材料混合，进一步根据需要，加工成粉末状、颗粒状、片剂等剂型，作为本发明的整肠剂加以利用。另外，从培养基回收前述发酵或者用其它方法培养的瑞士乳杆菌的活菌体，可以将其直接或者与其它添加剂、食品原料等其它材料混合，进一步根据需要，加工成粉末状、颗粒状、片剂等剂型，作为本发明的整肠剂加以利用。
本发明整肠剂的施用对象没有特别的限定，可以给包括人在内的哺乳类等动物施用。
本发明的整肠剂的施用量例如在给人施用时，作为活菌体的个数，每日可以为1.0×1011个以上。对于施用，既可以是单次施用，也可以是多次施用。
本发明整肠剂在给包括人在内的动物施用时，可以带来显示排便次数增加或者排便量增加等的整肠作用。
本发明的整肠剂通过给包括人在内的动物施用，带来增加排便次数等效果，对改善肠内环境是有用的。
实施例下面，参照实施例更详细地说明本发明，但本发明不受这些实施例的限定。
再有，在下面的实施例中，对Caco-2细胞的粘着性如下进行试验。
对Caco-2细胞的粘着性试验对Caco-2的粘着活性的测定按照Greene和Klaenhammer的方法进行。在37℃，5％CO2培养箱中，用添加了5％牛胎儿血清(GibcoBethesda Research Laboratory)的MEM培养基(Gibco BRL)培养从American Type Culture Collection购得的Caco-2细胞(HTB-37)，其中，牛胎儿血清已在55℃加热30分钟灭活。将1ml细胞数为1×105/ml的培养液移至24孔的培养板(住友Bakelite社制，商品名MS-80240)，每48小时进行培养基交换，进行培养直至成为单层。添加0.1ml 20％的戊二醛(和光纯药)，将细胞固定在培养板上。将板在室温下静置30分钟后，用PBS洗涤2次，添加0.5ml(1×109细胞)同位素标记的试验对象的菌体的菌液。在37℃培养1小时后，洗涤3次，除去游离的菌体。添加200μl1％SDS、1N的NaOH，放置30分钟后，从孔回收Caco-2细胞和菌体的混合物，悬浮在闪烁剂鸡尾酒(Scintisol EX-H，和光纯药)中，用液体闪烁计数器LSC-900(Aloka)测定放射活性。基于预先计数的菌体的比放射能力来计算粘着的菌体的菌数。测定进行2次，将平均值作为测定结果。
实施例1瑞士乳杆菌CP53株已知瑞士乳杆菌CP53株在菌体内具有作为质粒DNA的pCP53(Yamamoto，N.和Takano，T.生物科学、生物技术、生物化学，60(12)，2069-2070(1996))。在含有各种浓度的粉末胆汁固形物(Bacto-oxgall(Difco))的MRS培养基上培养瑞士乳杆菌CP53株，测定最小生长抑制浓度，为1.31％。另外，对Caco-2细胞的粘着性进行试验，确认为4.5×106细胞/孔以上粘着。
赋予利福平抗性摄食试验时为了从粪便进行分离回收，按照常规方法，赋予CP53株对抗生素利福平的抗性。将CP53株涂抹到以100μg/ml的浓度添加了利福平的MRS平板培养基上，在37℃培养2天。选择在该平板培养基上生长的利福平抗性株作为CP53-R株。
CP53-R株的性质在不含利福平的MRS培养基上继代培养CP53-R株7代。在含有各种浓度的粉末胆汁固形物的MRS培养基上培养该继代培养株，测定最小生长抑制浓度，为0.86％。另外，对Caco-2细胞的粘着性进行试验，确认2.8×106细胞/孔以上的粘着性。而且，也确认了该继代培养株具有质粒pCP53。
志愿者的摄食回收试验通过离心分离收集在MRS培养基(Difco)上培养的CP53-R株，用PBS洗涤2次后，悬浊于牛乳中，达到1×1011细胞/100ml。把悬浊了该CP53-R株的牛乳作为摄食回收试验的摄食试样。让从25岁到41岁的7名健康受试者一次饮用100ml前述摄食试样，全部回收其后5天排泄的粪便。记录摄取前述摄食试样后的各受试者的排便次数、排便量以及大便的硬度。结果示于表1中。回收的粪便立刻在4℃冷藏，第二天分别如下所述进行分析。
瑞士乳杆菌的存活性用含有利福平的MRS平板培养基，对粪便试样中所含活菌数，即具有利福平抗性的细菌的细菌数进行计数，求出回收的全部粪便中所含的细菌数。结果，每名受试者回收的菌数的平均数为1.2×108细胞。再有，确认了含有利福平的MRS平板培养基上生长的细菌都具有质粒pCP53，是CP53-R株。
瑞士乳杆菌的肠内增殖用PBS洗涤CP53株菌体两次后，供给采用10mg/ml溶菌酶(生化学工业)和1mg/ml变溶菌素(生化学工业)的碱性溶菌法，制备pCP53质粒DNA。通过根据CsCl密度梯度的超高速离心分离，将其纯化，用[α-32P]dCTP(222TBq/mmol，NEW Life Products Inc.)，通过RandomPrimer DNA Labeling Kit ver 2.0(宝酒造)，进行放射性同位素标记，得到用32P放射标记的pCP53质粒DNA。
在15ml离心管中，将5ml的30％蔗糖溶液、2ml的20％蔗糖溶液、2ml的10％蔗糖溶液轻轻地层叠，得到不连续的蔗糖密度梯度溶液。将从前述受试者回收的粪便试样用蒸馏水悬浮成20倍(w/w)，将得到的悬浮液0.5ml层叠在该不连续的蔗糖密度梯度溶液上。以1,500×g将其离心分离5分钟，回收10％和20％的蔗糖级分，用灭菌水洗涤2次，然后用Leenhouts等人的方法(Leenhouts，K.J.，Kok，J.，和Venema，G.(1990)Appl.Environ.Microbiol，56，2726-2735)制备DNA级分。将所得DNA级分溶解在10mMTrisCl pH8.0、1mM EDTA中，进一步用相同的缓冲液制备10倍和100倍的稀释物。将该DNA级分加热3分钟后，每10μl，在尼龙膜(Hybond-N+，AmershamPhermacia Biotech)上进行斑点印迹。用蒸馏水洗涤印迹的尼龙膜后，干燥，固定DNA。
按照Maniatis等人的方法(Maniatis，T.，Frish，E.F.和Sambrook，J.(1987)分子克隆；实验室手册，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor)，使前述放射标记的pCP53质粒DNA与该膜上固定的DNA杂交。此时，为了抑制非特异性杂交，添加甲醛和另外制备的不含CP53株的粪便中的细菌类染色体DNA，分别达到50％(W/W)和10μg/ml。
为了将pCP53质粒DNA定量，对杂交后的膜施加放射自显影，切掉各样品斑点部分(0.5×0.5mm)，用液体闪烁计数器LSC-900(Aloka)测定放射活性。
另外，为了制作标准曲线，在8.5×103-2.0×105细胞的范围内，将CP53株菌体与粪便混合，将其作为粪便试样，用前述方法制备DNA级分，进行斑点印迹，与放射标记的pCP53质粒DNA反应。结合的放射能力与粪便中混合的CP53株菌数在8.5×103-2.0×105细胞/g(粪便重量)的范围内成线性比例，由此可以得到标准曲线。用该标准曲线，在1×104-2.0×105细胞/g(粪便重量)的范围内，测定摄食回收试验的受试者的粪便试样中的CP53株菌数。
结果，在所有从7名受试者回收的粪便试样中，均检测出CP53株。各受试者的总粪便试样中的总CP53株菌数分别是4.0×109、1.0×109、3.0×109、1.0×109、1.0×109、4.0×107和4.0×108细胞。进一步，在各受试者中，在摄取前述摄食试样后第1次、第2次和第3次的粪便中的粪便试样中，均检测出CP53株，进一步，在第3次以后的排便的粪便试样中的CP53株的菌数比第1次、第2次排便的粪便试样中的多。由此认为，CP53株即使在粪便中生长困难，但在消化道中也可以生长和增殖。
另外，把没有摄取CP53-R活菌体的受试者的粪便用作粪便试样，对同样制备的DNA级分和纯化的pCP53质粒DNA同样进行斑点印迹，与放射标记的pCP53质粒DNA反应，放射标记的pCP53质粒DNA与纯化的pCP53质粒DNA强烈反应，但与来源于没有摄取CP53-R活菌体的受试者粪便试样的DNA级分完全不反应。
比较例1作为摄食试样，除了让受试者饮用将实施例1中制备的摄食试样加热灭菌后的试样之外，和实施例1一样进行操作，记录各受试者的排便次数、排便量及粪便的硬度。结果示于表1中。
表1
*与比较例1相对，显著大(p＜0.1，Wilcoxon的符号排序检验)a)用1；硬，2；一般，3；柔软3个等级进行评价，求出平均值。
配方例1用8.415kg精制水还原脱脂奶粉(Yotsuba乳业(株)社制)1.485kg，在95℃加热灭菌30分钟后，快速冷却至32℃。往所得灭菌后的还原脱脂乳中无菌添加瑞士乳杆菌CP53株的散装引酵物0.1kg，充分搅拌后，在32℃发酵16～20小时。确认发酵乳的酸度(乳酸的重量％)在1.5～2.1的范围内时结束发酵。发酵结束后，通过将发酵乳快速冷却到10℃以下，得到原料用发酵乳10kg。此时，CP53株的活菌数至少达到15亿个/g。
另外，将0.8kg砂糖粉末和0.03kg果胶YM115-H(CopenhagenPectin制)混合，溶解于4.17kg加热到70℃的精制水中。进一步，对该溶液实施95℃数秒的杀菌后，快速冷却到10℃以下，得到杀菌后的糖·稳定剂溶液5kg。
在5kg杀菌后的糖·稳定剂溶液中无菌添加5kg原料用发酵乳，使用实验室均质器(形式15M-8BA，APV Gaulin社制)，通过在均质压力15MPa，处理流量2.5L/分的条件下，进行无菌均质化，得到10kg乳制品乳酸菌饮料原液。将所得乳制品乳酸菌饮料原液无菌填充到200g大小的聚苯乙烯瓶中，用聚乙烯-铝层压膜热封，得到在冷藏(10℃以下)下保质期为14天的乳制品乳酸菌饮料制品。
所得制品含有至少7.5亿个/g的CP53株，在10℃以下保存时，即使在制造后第14天，也可以维持5亿个/g活菌数。因而，饮用200g本制品时，可以摄取1000亿个以上的CP53株的活菌。
配方例2用1.738g精制水还原0.180kg脱脂粉末豆乳(商品名“Soyafit2000”，不二制油株式会社制)，向得到的产物中添加、混合0.080kg乳糖和0.002kg酵母(商品名“Ebios P2G”，Asahi Breweries株式会社制)。将混合物在95℃杀菌数秒后，快速冷却至25℃。往所得杀菌后的还原脱脂豆乳中无菌添加0.060kg瑞士乳杆菌CP53株的散装引酵物，充分搅拌后，在以100rpm的速度搅拌下，在37℃发酵24～48小时。确认发酵乳的酸度在1.5～2.5范围内时结束发酵。发酵结束后，通过将发酵豆乳快速冷却到10℃以下，得到原料用发酵豆乳2kg。此时，CP53株的活菌数至少达到20亿个/g。
另外，将0.44kg砂糖粉末和0.015kg果胶YM115-H(CopenhagenPectin制)混合，溶解于3.56kg加热到70℃的精制水中。进一步，对该溶液实施95℃数秒的杀菌后，快速冷却到10℃以下，得到杀菌后的糖·稳定剂溶液4kg。
在4kg杀菌后的糖·稳定剂溶液中无菌添加2kg原料用发酵豆乳，使用实验室均质器(形式15M-8BA，APV Gaulin社制)，通过在均质压力15MPa，处理流量2.5L/分的条件下，进行无菌均质化，得到6kg豆乳乳酸菌饮料原液。将所得豆乳乳酸菌饮料原液无菌填充到200g大小的聚苯乙烯瓶中，用聚乙烯-铝层压膜热封，得到在冷藏(10℃以下)下保质期为14天的豆乳乳酸菌饮料制品。
所得制品含有至少6.6亿个/g的CP53株，在10℃以下保存时，即使在制造后第14天，也可以维持5亿个/g活菌数。因而，饮用200g本制品时，可以摄取1000亿个以上的CP53株的活菌。
权利要求
1.一种整肠剂，含有属于瑞士乳杆菌菌种的菌株的活菌体，前述菌株是在胆汁酸抗性试验中显示出干燥胆汁固形物的最小生长抑制浓度为0.8％以上的菌株。
2.权利要求1所述的整肠剂，前述菌株是在肠道上皮细胞粘着试验中，与在底面积为1.8cm2的柱状孔中单层培养的Caco-2细胞有2.8×106细胞/孔以上进行粘着的菌株。
3.权利要求1所述的整肠剂，前述菌株是口服给人施用1.0×1011细胞时，从粪便中可以回收4.0×107细胞以上的菌株。
4.权利要求1所述的整肠剂，前述菌株是瑞士乳杆菌CP53株(独立行政法人产业技术综合研究所，专利生物保藏中心，保藏号FERM BP-5770)。
5.权利要求1所述的整肠剂，进一步含有用属于瑞士乳杆菌菌种的菌株将乳发酵的发酵物。
6.一种肠功能的控制方法，包括将有效量的权利要求1所述的整肠剂给需要控制肠功能的对象施用的步骤。
全文摘要
本发明提供一种含有属于瑞士乳杆菌菌种的菌株的活菌体的整肠剂。前述菌株优选具有特定的胆汁酸抗性、对肠道上皮细胞的粘着性等特性。另外，还提供一种控制肠功能的方法，包括将有效量的该整肠剂给需要控制肠功能的对象施用的步骤。通过给人等施用整肠剂，带来增加排便次数等效果，对改善肠内环境是有用的。
文档编号C12N1/20GK1492764SQ0182292
公开日2004年4月28日 申请日期2001年12月25日 优先权日2000年12月28日
发明者山本直之, 增田治, 子, 辅, 金子京子, 池田渚, 石田优, 楠田大辅, 筱田直 申请人:卡尔皮斯株式会社