专利名称：耐酸诱变浸矿菌种的选育方法
技术领域：
本发明涉及一种耐酸诱变浸矿菌种的选育方法，特别是一种能够耐pH在0.9-1.5之间的耐酸诱变浸矿菌种的选育方法。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案进行耐酸诱变浸矿菌种的选育，其特征在于它包括以下几个步骤(1)获得原始菌种从矿山酸性矿坑水中取回含有氧化亚铁硫杆菌，氧化硫硫杆菌和氧化亚铁微螺菌等混合菌的带菌水样，将上述水样以6-9K培养基进行分离和培养，得到以含氧化亚铁硫杆菌为主，菌浓度在108个/ml以上的较纯混合菌种；(2)在6-9K无铁培养基中加入粒度小于76微米占95％的所需浸出的矿石粉末，矿浆浓度为5％-40％(重量百分)递增，细菌接种量为10％(体积百分数)，进行驯化、培养，得到以含氧化亚铁硫杆菌为主，菌浓度108-1010个/ml的驯化混合菌；(3)将上述获得的驯化混合菌用He-Ne激光器进行辐照诱变，将激光发生器对准塑料小管，先预热至少30min，随后小管内加入(2)中培养24-72小时的驯化菌液，光束从侧面照射菌液，λ＝633nm，扩束光斑直径1.0cm，照射距离30-50cm，辐照时间5-20min，诱变后将小管在黑暗环境中放置至少4小时后转接入装有10ml pH＝1.8的含有Cu2+离子或Zn2+离子或Cu2+离子、Zn2+离子、Co2+离子的6-9K培养基中，30℃的摇床培养，摇床速度50-250转/分钟，获得突变菌株；(4)将突变菌株在低pH＝1.2-1.5下进行筛选，5-8次连续活化转接，得到耐低pH值的诱变菌；(5)将获得的耐低pH值的诱变菌在对应的pH值且含有Cu2+离子或Zn2+离子或Cu2+离子、Zn2+离子、Co2+离子的培养基中培养48小时的菌液，按10％接种量接入对应的pH值需要进行细菌浸出的矿浆中于30℃的摇床中进行浸矿适应性驯化、培养，过程需进行5-8次后，即获得耐酸诱变浸矿细菌，该菌生长周期为24-48小时，将44.43g/LFe2+完全(100％)氧化成为Fe3+的氧化时间为9-15小时。
本发明中，选取酸性矿坑水的来源与所要浸出的矿石为同一类金属矿，但该金属的含量可以不同。
所述的6-9K培养基的成分为硫酸铵2-3.0克/升、磷酸氢二钾0.3-0.5克/升、七水合硫酸镁0.3-0.5克/升、氯化钾0.06-0.1克/升、硝酸钙0.01克/升、七水合硫酸亚铁29.62-44.43克/升，6-9K无铁培养基的成分为硫酸铵2-3.0克/升、磷酸氢二钾0.3-0.5克/升、七水合硫酸镁0.3-0.5克/升、氯化钾0.06-0.1克/升、硝酸钙0.01克/升。
把从某硫化铜矿酸性矿坑水中采集的含有氧化亚铁硫杆菌、氧化硫硫杆菌和氧化亚铁微螺菌等混合菌的带菌水样，用9K培养基进行分离和培养，得到以含氧化亚铁硫杆菌为主、菌浓度在108个/毫升以上的较纯混合菌种。
然后在9K无铁培养基中加入粒度为小于76微米占95％的某铜矿矿石粉，矿浆浓度由5％-40％(重量百分数)递增，细菌接种量为10％，在30℃的摇床中进行驯化、培养，得到以含氧化亚铁硫杆菌为主、菌浓度在108个/毫升以上的驯化混合菌。
之后将获得的驯化混合菌用He-Ne激光器进行辐照诱变。将激光发生器对准固定小管架上的塑料小管，调整好光照角度，尽量减少光束折射造成的损失，照射30min进行预热。取培养48小时的驯化混合菌液各1.5ml置于直径为8mm的8支塑料小管内，将塑料小管置于激光束前方，使光束从侧面照射菌液，激光波长λ＝633nm，扩束光斑直径1.0cm，照射距离40cm。8支小管内的菌液分别用1、3、5、7、9、11、13、15min等不同时间进行辐照诱变。诱变后将小管在黑暗环境中放置至少4小时后，将菌液转接入含Cu2+离子浓度35g/L的装有10ml pH＝1.8的9K培养基的8支试管中于30℃的摇床培养，获得抗Cu2+离子浓度35g/L的突变混合菌株。
将突变混合菌株进行6次的活化转接，9K培养基的pH值由1.8逐渐降低到1.3得到耐pH值为1.3的诱变混合菌。
将获得的耐pH＝1.3的诱变混合菌在pH＝1.3的9K培养基中培养48小时的菌液，按10％(体积百分)接种量接入含某铜矿粉、矿浆浓度为5％、pH＝1.3的矿浆溶液中，并于30℃的摇床中进行浸矿适应性驯化培养，接入某铜矿粉的矿浆浓度逐步提高到40％，共进行6次浸矿适应性驯化培养后，该菌生长周期为30小时，代时为6-8小时，在12小时内能将培养基中Fe2+离子浓度为44.43g/L完全(100％)氧化为Fe3+离子，菌浓度为109个/毫升以上，即获得适合于某铜矿细菌浸出的耐酸诱变浸矿菌种。
采用本菌种与未诱变菌种进行浸矿比较，未诱变菌浸出198天，铜浸出率为60.44％。采用本菌种浸出53天，铜浸出率为60.12％，浸出6个月，浸出率为80.75％。本发明中可以用6K-9K中的任一培养基，该培养基为已知。
实施例2(适用于硫化锌铜矿石浸出的耐酸诱变浸矿菌种的选育)某硫化锌铜矿主要含铜矿物为黄铜矿、斑铜矿、辉铜矿、铜蓝、蓝辉铜矿，含锌矿物主要为闪锌矿，金属硫化物主要为黄铁矿、磁黄铁矿、白铁矿、方铅矿、毒砂等，其它矿物主要为石英、碳酸盐矿物和粘土矿物等。
把从某硫化锌铜矿酸性矿坑水中采集的含有氧化亚铁硫杆菌、氧化硫硫杆菌和氧化亚铁微螺菌等混合菌的带菌水样，用9K培养基进行活化转接培养，得到以含氧化亚铁硫杆菌为主、菌浓度在108个/毫升以上的较纯混合菌种。
然后在9K无铁培养基中加入粒度为小于200目占95％的某硫化锌铜矿矿石粉，矿浆浓度由5％-40％递增，细菌接种量为10％，在30℃的摇床中进行驯化、培养，得到以含氧化亚铁硫杆菌为主、菌浓度在108个/毫升以上的驯化混合菌种。
之后将获得的驯化混合菌种用He-Ne激光器进行辐照诱变。将激光发生器对准固定于小管架上的塑料小管，调整好光照角度，尽量减少光束折射造成的损失，照射至少30min进行预热。取培养48小时的驯化混合菌液1.5ml置于直径为8mm的塑料小管内，将塑料小管置于激光束前方，使光束从侧面照射菌液，激光波长λ＝633nm，扩束光斑直径1.0cm，照射距离40cm，辐照时间11min。诱变后将小管在黑暗环境中放置4-6小时后，将菌液转接入含Cu2+离子浓度30g/L、Zn2+离子浓度30g/L的装有10ml pH＝1.8的9K培养基中于30℃的摇床培养，培养时间24-72小时，获得抗Cu2+离子浓度30g/L、Zn2+离子浓度30g/L的突变菌株。
将突变菌株进行5次的活化转接，9K培养基的pH值由1.8逐渐降低到1.3，得到耐pH＝1.3的诱变菌。在活化转接过程中，培养基均含Cu2+离子浓度30g/L、Zn2+离子浓度30g/L。
将获得的耐pH＝1.3的诱变菌在pH＝1.3的9K培养基中培养48小时的菌液，按10％(体积百分)接种量接入某硫化锌铜矿矿粉，矿粉粒度小于76微米占90％以上，矿浆浓度为5％、pH＝1.3于30℃的摇床中进行浸矿适应性驯化培养，摇床转速150转/分钟，接入的某硫化锌铜矿的矿浆浓度由5％逐步提高到40％，共进行5次浸矿适应性驯化培养后，该菌生长周期为28小时，在12个小时内细菌能够将培养基中含44.43g/LFe2+离子完全(100％)氧化为Fe3+离子，菌浓度为109个/毫升以上，即获得适合于某硫化锌铜矿细菌浸出的耐酸诱变浸矿细菌。
采用本菌种与未诱变的菌种进行浸矿性能比较，其结果是采用未诱变菌浸出6个月，铜浸出率为48.76％，锌浸出率67.50％；应用本菌种浸出90天，铜浸出率为50.23％，锌浸出率82.59％，浸出8个月，铜浸出率为76.85％，锌浸出率90.02％。
实施例3(适用于硫化铜钴锌矿石浸出的耐酸诱变浸矿菌种的选育)某硫化铜钴铜矿主要含铜矿物为黄铜矿、斑铜矿、黑铜矿、孔雀石和蓝铜矿；含锌矿物主要为闪锌矿；钴主要呈类质同象分布在黄铁矿和磁黄铁矿中，见少量的钴镍黄铁矿和硫铁镍钴矿；含硫金属硫化物主要为黄铁矿和磁黄铁矿；其它脉石矿物主要为方解石、白云石，其次为石英、滑石、蛇纹石及绿泥石等。
把从某硫化铜钴锌矿酸性矿坑水中采集含有氧化亚铁硫杆菌、氧化硫硫杆菌和氧化亚铁微螺菌等混合菌的带菌水样，用9K培养基进行分离和培养，得到以含氧化亚铁硫杆菌为主、菌浓度在108个/毫升以上的较纯菌种。9K培养基的成分为硫酸铵3.0克/升、磷酸氢二钾0.5克/升、七水合硫酸镁0.5克/升、氯化钾0.1克/升、硝酸钙0.01克/升、七水合硫酸亚铁44.43克/升。
然后在9K无铁培养基中加入粒度为小于76微米占95％的某硫化铜钴锌矿矿石粉，矿浆浓度由5％-40％递增，细菌接种量为10％，在30℃的摇床中进行驯化、培养，摇床转速为150转/分钟，得到以含氧化亚铁硫杆菌为主、菌浓度在108个/毫升以上的驯化混合菌种。9K无铁培养基的成分为硫酸铵3.0克/升、磷酸氢二钾0.5克/升、七水合硫酸镁0.5克/升、氯化钾0.1克/升、硝酸钙0.01克/升。
之后将获得的驯化混合菌种用He-Ne激光器进行辐照诱变。将激光发生器对准固定于小管架上的塑料小管，调整好光照角度，尽量减少光束折射造成的损失，照射30min进行预热。取培养48小时的驯化菌液1.5ml置于直径为8mm的塑料小管内，将塑料小管置于激光束前方，使光束从侧面照射菌液，激光波长λ＝633nm，扩束光斑直径1.0cm，照射距离40cm，辐照时间11min。诱变后将小管在黑暗环境中放置至少4小时后，将菌液转接入含Cu2+离子浓度2g/L、Zn2+离子浓度5g/L、Co2+离子浓度0.5g/L的装有10ml pH＝1.8的9K培养基中于30℃的摇床培养，培养时间24-72小时。逐步提高培养基中的Cu2+离子浓度至30g/L、Zn2+离子浓度30g/L、Co2+离子浓度10g/L，直至获得抗Cu2+离子浓度30g/L、Zn2+离子浓度30g/L、Co2+离子浓度10g/L的突变菌株。
将突变菌株进行5次的活化转接，9K培养基的pH值由1.8逐渐降低到1.3，得到耐pH＝1.3的诱变菌。
将获得的耐pH＝1.3的诱变菌在pH＝1.3的9K培养基中培养48小时的菌液，按10％(体积百分)接种量接入某硫化铜钴锌矿矿粉，矿粉粒度小于76微米占90％以上，矿浆浓度为5％的矿浆中，于30℃的摇床中进行浸矿适应性驯化培养，并逐步提高矿浆浓度到40％，共进行5次驯化培养后，该菌生长周期为34小时，在12个小时内细菌能够将培养基中含44.43g/LFe2+离子完全(100％)氧化为Fe3+离子，菌浓度为109个/毫升以上，即获得适合用于细菌浸出某硫化铜钴锌矿矿石的耐酸诱变浸矿细菌。
本菌种与未诱变菌种使用结果的比较是在矿石粒度为小于15mm的条件下，采用未诱变菌，浸出8个月，铜浸出率为48.85％，钴浸出率为68.67％，锌浸出率72.39％；应用本菌种浸出8个月，铜浸出率为68.74％，钴浸出率为85.26％，锌浸出率88.32％。
本发明的优点耐酸诱变浸矿菌株可耐pH0.9-1.5，适用于pH0.9-2.5之间，从而使生物浸矿的浸出速度提高，浸出周期缩短1/3-2/3，金属浸出率提高10-30％，降低生产成本10-30％。
权利要求
1.耐酸诱变浸矿菌种的选育方法，其特征在于它包括以下几个步骤(1)获得原始菌种从矿山酸性矿坑水中取回含有氧化亚铁硫杆菌、氧化硫硫杆菌和氧化亚铁微螺菌等混合菌的带菌水样，将上述水样以6-9K培养基进行分离和培养，得到以含氧化亚铁硫杆菌为主，菌浓度在108个/ml以上的较纯混合菌种；(2)在6-9K无铁培养基中加入粒度小于76微米占95％的所需浸出的矿石粉末，矿浆浓度为5％-40％递增，细菌接种量为10％，进行驯化、培养，得到以含氧化亚铁硫杆菌为主，菌浓度108-1010个/ml的驯化混合菌；(3)将上述获得的驯化混合菌用He-Ne激光器进行辐照诱变，将激光发生器对准塑料小管，先预热至少30min，随后小管内加入(2)中培养24-72小时的驯化混合菌液，光束从侧面照射菌液，λ＝633nm，扩束光斑直径1.0cm，照射距离30-50cm，辐照时间5-20min，诱变后将小管在黑暗环境中放置至少4小时后转接入装有10ml pH＝1.8的含有Cu2+离子或Zn2+离子或Cu2+离子、Zn2+离子、Co2+离子的6-9K培养基中，30℃的摇床培养，摇床速度50-250转/分钟，获得突变混合菌株；(4)突变混合菌株在低pH值下进行筛选，5-8次连续活化转接，得到耐低pH值的诱变菌；(5)将获得的耐低pH值的诱变菌在对应的pH值且含有Cu2+离子或Zn2+离子或Cu2+离子、Zn2+离子、Co2+离子的培养基中培养48小时的菌液，按10％接种量接入对应的pH值需要进行细菌浸出的矿浆中于30℃的摇床中进行浸矿适应性驯化、培养，过程需进行5-8次后，即获得耐酸诱变浸矿细菌，该菌生长周期为24-48小时，将44.43g/LFe2+完全(100％)氧化成为Fe3+的氧化时间为9-15小时。
2.根据权利要求1所述的耐酸诱变浸矿菌种的选育方法，其特征在于所述的需浸的矿石粉末为硫化铜矿石，照射距离为40cm，以不同的时间下分别进行，再混合，突变菌株进行6次活化转接。
3.根据权利要求1所述的耐酸诱变浸矿菌种的选育方法，其特征在于所述的需浸的矿石粉末为硫化锌铜矿石，照射距离40cm，辐照时间11min，突变菌株进行5次活化转接。
4.根据权利要求1所述的耐酸诱变浸矿菌株的选育方法，其特征在于所述的需浸的矿石粉末为硫化镍钴铜矿石，突变菌株进行6次活化转接。
5.根据权利要求1所述的耐酸诱变浸矿菌种的选育方法，其特征在于所述的需浸的矿石粉末为硫化铜钴锌矿石，照射距离40cm，辐照时间11min，突变菌株进行6次活化转接。
6.根据权利要求1或2或3或4或5所述的耐酸诱变浸矿菌种的选育方法，其特征在于所述的6-9K培养基的成分为硫酸铵2-3.0克/升、磷酸氢二钾0.3-0.5克/升、七水合硫酸镁0.3-0.5克/升、氯化钾0.06-0.1克/升、硝酸钙0.01克/升、七水合硫酸亚铁29.62-44.43克/升；6-9K无铁培养基的成分为硫酸铵2-3.0克/升、磷酸氢二钾0.3-0.5克/升、七水合硫酸镁0.3-0.5克/升、氯化钾0.06-0.1克/升、硝酸钙0.01克/升。
全文摘要
耐酸诱变浸矿菌种的选育方法包括以下步骤从矿山酸性矿坑水中取回含有氧化亚铁硫杆菌、氧化亚铁微螺菌等混合菌的带菌水样，进行分离和培养，得到较纯混合菌种；在6－9K无铁培养基中加入所需浸出的矿石粉末，进行驯化、培养，得到驯化混合菌；驯化混合菌用He－Ne激光器进行辐照诱变，获得突变混合菌株；突变菌株在低pH值下进行筛选，活化转接，得到耐低pH值的诱变菌；进行浸矿适应性驯化、培养，获得耐酸诱变浸矿混合细菌，该菌生长周期为24－48小时，将44.43g/L Fe
文档编号C12N13/00GK1475559SQ0212883
公开日2004年2月18日 申请日期2002年8月15日 优先权日2002年8月15日
发明者温建康, 阮仁满, 孙雪南 申请人:北京有色金属研究总院