专利名称：吡嗪酰胺药敏培养基及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种结核菌的培养基及其制备方法，尤其属于吡嗪酰胺药敏培养基及其制备方法。
背景技术：
结核病是一种传染性疾病，随着对病人的治疗，其耐药性病人在逐渐增多，因此，对菌阳患者作药敏测试必不可少。在此之前，多偏重于监测流行病学的耐药趋势，只作一线药为主(不含吡嗪酰胺)的6种药敏测试。当耐药特别是耐多药患者增加后，逐渐强调个体化治疗，因此增列药敏品种势在必行。吡嗪酰胺(PZA)是具有灭菌、杀菌活性的一线药，过去排除在常规药敏测试以外，其原因在于它只能在酸性培养基中测试，如匡铁吉1990年在《中国防痨通讯》上发表的《92号土豆汤琼脂培养基用于吡嗪酰胺药敏实验初步探讨》曾就酸性培养基数次作过配制，都很有效，但其不足一是由于其操较繁琐；二是当用土豆淀粉作为原料时，由于其它相配成分不易得到。进入基因时代以来，虽然对吡嗪酰胺(PZA)的耐药基因pncA在5年前已有阐明，如，但Davies等和Mitchison等阐述除pncA之外尚有其它未发现的耐药机理，只查基因型法如pncA是不够、不可靠的，还要靠表型法如BACTEC460解决之。但BACTEC设备昂贵，培养基和试剂全赖进口，费用高，不能推广使用，另外放射核素处理难度大，污染环境。
(三)、技术内容本发明的目的在于克服上述不足，提供一种成分简单、易于配置、酸碱度值(PH)稳定、能满足吡嗪酰胺活性需要、使结核菌生长良好并具有易制备和推广的吡嗪酰胺药敏培养基及其制备方法。
其技术内容吡嗪酰胺药敏培养基，由下述容积百分比的成分制备成的培养基磷酸二氢钾0.15、硫酸镁＞0.015～0.03、枸橼酸镁0.0375、天门冬素0.225、甘油0.75、全蛋液62.5，为使吡嗪酰胺药敏培养基的酸碱度值(PH)稳定，故采用氧化还原电位在1100毫伏以上，酸碱度值(PH)在2.7以下的酸化离子水，其加入量36.25～38.13，2％孔雀绿水溶液0.5～0.625、吡嗪酰胺0.005或0.01。
吡嗪酰胺药敏培养基的制备，其步骤如下(1)、将磷酸二氢钾0.15、硫酸镁＞0.015～0.03、枸橼酸镁0.0375、天门冬素0.225、甘油0.75、全蛋液62.5、2％孔雀绿水溶液0.5～0.625、吡嗪酰胺0.005或0.01与36.25～38.13酸化离子水进行混合，其酸化离子水氧化还原电位在1100毫伏以上，酸碱度值(PH)在2.7以下；(2)、对上述混合物进行加热至沸腾，直至上述混合物完全溶解；(3)、采用自然冷却法将混合液体冷却至室温；(4)、将经消毒纱布过滤后的全蛋液加入并搅拌至均匀；(5)、将2％孔雀绿水溶液加入并使其混匀；(6)、用当量的盐酸调节其培养基液的酸碱度值(PH)在5.2～5.4范围内；(7)、将吡嗪酰胺加入到培养基液中使其浓度达到要求的值；(8)、分装经121℃高压灭菌的试管内，每管加含药培养基5毫升；(9)、斜置血清凝固器内，斜面高度占试管的三分之二，在90℃、1.5小时或85℃、1小时间歇两次；(10)冷却后，37℃无菌试验24小时。
培养基斜面颜色鲜艳，表面光滑无泡。
药物敏感性测定按照1996年中国防痨协会制定的《结核病诊断细菌学检验规程》进行测定。
结果PZA药敏培养基(凝固前)的最适pH。
酸化离子水配制的不含马铃薯淀粉的改良L-J培养基，在不同pH时，结核菌生长及对PZA的敏感性见表1。表1 人型结核分支杆菌(H37Rv)在不同pH的PZA药敏培养基中4周生长情况凝固前pH不含PZA10ug/ml50ug/ml4.4 - - -4.8 - - -5.2 + + -5.4 ++ + -5.6 ++ + +-6.8(常规条件下) +++++++++注+-为50％阳性结果显示，在不同pH时含PZA(10、50μg/ml)或不含PZA的培养基上，接种人型结核分支杆菌H37Rv，4周观察结果。当培养基凝固前pH5.2～5.4时，人型结核分支杆菌在对照管上生长良好，在含PZA50μg/ml的培养基上不生长。因此选择pH5.2～5.4为PZA药敏试验的最适酸碱度，含PZA50μg/ml为低浓耐药管。
某些标准分支杆菌在含PZA培养基上的生长情况，见表2。
表2、标准菌株对PZA的药敏试验 4周观察情况含PZA药敏培养基pH5.3(凝固前)菌株10ug/ml 50ug/ml 100ug/ml不含PZAH37Rv+- - ++牛型结核分支杆菌+++ ++ ++ ++鸟分支杆菌 ++++ ++++++++++++胞分支杆菌 ++++ ++++++++++++偶发分支杆菌+++ +++ +++ +++耻垢分支杆菌+++ +++ +++ +++瘰疠分支杆菌+++ +++ +++ +++人型结核分支杆菌(H37Rv)在含PZA50μg/ml的酸化离子水配制的培养基上受抑制，牛型结核分支杆菌及其它5株非结核分支杆菌在100μg/ml药物浓渡下仍生长良好。
接种量用10-3mg/ml，在不含药的对照管上生长的菌落不呈融合状，菌落大且粗糙。
用酸化离子水配制的PZA药敏培养基，对120株临床分离株进行测定，其中60株门诊分离株中，有3株在低浓度管内(50μg/ml)生长，5株在高浓度管内(100μg/ml)生长，PZA耐药率为13。3％。1株标准的耐INH低浓度株，对PZA敏感，1株耐5种药的标准株，对PZA耐药。从患者中分离的60株中，其中15株完全耐药株，对PZA呈高浓度耐药。
有关细菌的接种量，我们采用了1996年中国防痨协会制定的《结核病诊断细菌学检验规程》所规定的10-3mg，与其它的药敏试验相同的菌量，有利于批量操作。4周报告结果显示超过4周后pH会有所升高，到第8周。高浓度管呈阳性生长。在酸化离子水配制药敏测试的不含吡嗪酰胺(PZA)培养基上生长的结核分支杆菌菌落较改良L-J培养基上生长的大且粗糙。H37Rv在含PZA10μg/ml的培养基上呈阳性生长，因此采用50μg/ml为低浓管，这与方松[9]的报道一致。
本发明配置简单、由于不采用马铃薯淀粉而采用的是酸化离子水，使得培养基不沉淀结块、2％孔雀绿水溶液用量仅为改良罗氏培养基的二分之一或不到，能满足吡嗪酰胺活性需要、结核菌生长良好、可在任何实验室做吡嗪酰胺(PZA)药敏实验，易制备和推广应用，由于不采用BACTEC检测，所以没有放射核素，不会存在环境污染问题。
(四)、具体实施方案吡嗪酰胺药敏培养基，由下述容积百分比的成分制备成的培养基磷酸二氢钾0.15、硫酸镁0.02、枸橼酸镁0.0375、天门冬素0.225、甘油0.75、全蛋液62.5、酸化离子水37.25、2％孔雀绿水溶0.5。
制备步骤如下(1)、将磷酸二氢钾0.15、硫酸镁＞0.015～0.03、枸橼酸镁0.0375、天门冬素0.225、甘油0.75、全蛋液62.5、2％孔雀绿水溶液0.5、吡嗪酰胺0.005(0.01)与37.25酸化离子水进行混合，酸化离子水的氧化还原电位在1174毫伏，酸碱度值(PH)在2.65；(2)、对上述混合物进行加热至沸腾，直至上述混合物完全溶解；(3)、采用自然冷却法将混合液体冷却至室温；(4)、将经消毒纱布过滤后的全蛋液加入并搅拌至均匀；(5)、将2％孔雀绿水溶液加入并使其混匀；(6)、用当量的盐酸调节其培养基液的酸碱度值(PH)在5.2～5.4范围内；(7)、将吡嗪酰胺加入到培养基液中使其浓度达到要求的值；(8)、分装经121℃高压灭菌的试管内，每管加含药培养基5毫升；(9)、斜置血清凝固器内，斜面高度占试管的三分之二，在90℃、1.5小时；(10)冷却后，在37℃培养箱内做无菌试验24小时。
配置出的吡嗪酰胺药敏培养基斜面颜色鲜艳，表面光滑无泡。
权利要求
1.吡嗪酰胺药敏培养基，由下述容积百分比的原料制备成的培养基磷酸二氢钾0.15、硫酸镁＞0.015～0.03、枸橼酸镁0.0375、天门冬素0.225、甘油0.75、全蛋液62.5、酸化离子水36.25～38.13、2％孔雀绿水溶液0.5～0.25、吡嗪酰胺0.005或0.01
2.根据权利要求1所述的吡嗪酰胺药敏培养基，其特征在于酸化离子水的氧化还原电位应在1100毫伏以上，酸碱度值(PH)在2.7以下。
3.权利要求1所述的吡嗪酰胺药敏培养基的制备方法，其步骤如下(1)、将磷酸二氢钾0.15、硫酸镁＞0.015～0.03、枸橼酸镁0.0375、天门冬素0.225、甘油0.75、全蛋液62.5、2％孔雀绿水溶液0.5～0.625、吡嗪酰胺0.005或0.01与36.25～38.13酸化离子水进行混合；(2)、对上述混合物进行加热至沸腾，直至上述混合物完全溶解；(3)、采用自然冷却法将混合液体冷却至室温；(4)、将经消毒纱布过滤后的全蛋液加入并搅拌至均匀；(5)、将2％孔雀绿水溶液加入并使其混匀；(6)、用当量的盐酸调节其培养基液的酸碱度值(PH)在5.2～5.4范围内；(7)、将吡嗪酰胺加入到培养基液中使其浓度达到要求的值；(8)、分装经121℃高压灭菌的试管内，每管加含药培养基5毫升；(9)、斜置血清凝固器内，斜面高度占试管的三分之二，在90℃、1.5小时或85℃、1小时间歇两次；(10)冷却后，在37℃的培养箱内做无菌试验24小时。
全文摘要
本发明公开了吡嗪酰胺药敏培养基及其制备方法。解决目前利用酸性培养基制备时的操作较繁琐、配制成分多、不宜在任何实验室进行、检测设备昂贵，且放射核素处理难度大，污染环境等问题。其技术方案吡嗪酰胺药敏培养基，由磷酸二氢钾、硫酸镁、枸橼酸镁、天门冬素、甘油、全蛋液、酸化离子水、2％孔雀绿水溶液、吡嗪酰胺。其制备方法对上述混合物加热直至完全溶解；自然冷至室温；加入全蛋液并搅匀；加入2％孔雀绿水溶液并混匀；用盐酸调节其培养基的pH在5.2～5.4；加入吡嗪酰胺使其浓度达要求值；分装经121℃高压灭菌试管内，每管加5毫升；斜置血清凝固器内，在90℃、1.5小时或85℃、1小时间歇两次；冷却后在37℃无菌条件下试验24小时。
文档编号C12N1/20GK1392249SQ0213871
公开日2003年1月22日 申请日期2002年6月26日 优先权日2002年6月26日
发明者程冬娥, 黄乔蓉, 陈明, 曹雁阁, 黄莉红, 陈瑛, 梁莉, 张天民 申请人:武汉钢铁(集团)公司