专利名称：一种从人体组织中获得人铜锌超氧化物歧化酶基因的方法
技术领域：
本发明涉及一种生物技术，尤其是一种从人体组织中提取人铜锌超氧化物歧化酶基因的方法。
(2)背景技术超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)是超氧阴离子自由基的专一清除剂，在维持生物体内自由基的动态平衡中起着重要的作用(Kushleika J.Checkoway H.Woods J.S.et al.Ann Neurol，1996，39(3)378-381；Noda J.Otagiri M.Akaike T et al.J PharmacolExp Ther，1996，279(1)162-171)。SOD在医疗、保健、食品等方面有着广泛的应用前景。
重组人SOD的研究，一方面可以解决人SOD的来源问题，另一方面也可以避免非人源SOD在应用中可能带来的安全性问题。目前获得hCu，Zn-SOD基因的方法主要有两种一种是人工合成法(Takeshima，Y，Takasugu N.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1994，919685～9689)，即先用亚磷酰胺法化学合成由双链35～60个碱基组成的17个寡核苷酸，经HPLC纯化后，磷酸化除寡核苷酸1和17外的各个寡核苷酸的5′末端，借T4DNA连接酶连接3～4个寡核苷酸，使其组合为一个模块(block)，最终用同样的方法将这些模块组合为完整的hSOD基因。此法难度大，成本高。另一种是从健康人肝组织中用异硫氰酸胍/酚/氯仿提取总RNA，RNA经AMV逆转录酶逆转录获得的cDNA用作PCR扩增的模板，经30个PCR热循环，扩增出hCu，Zn-SOD cDNA(向华，卫文仲，谭华荣等.人铜锌超氧化物歧化酶的克隆和在乳酸乳球菌中的表达.生物工程学报，2000，16(1)6～9)，但健康人体肝组织很难获得。
(3)发明内容本发明旨在提供一种简便有效的从人体组织提取人铜锌超氧化物歧化酶(hCu，Zn-SOD)基因的方法。
从人体组织获得人铜锌超氧化物歧化酶(hCu，Zn-SOD)基因的方法的步骤为从人体胚胎组织提取总RNA；用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增出人铜锌SOD(hCu，Zn-SOD)的cDNA，cDNA经PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检查和测序证明为hCu，Zn-SOD基因。
从人体胚胎组织提取总RNA的方法可以是取刚流产出的人体胚胎组织放入液氮容器；水相取新鲜人胚胎组织，放入玻璃匀浆器中，加入1ml TRIZOL试剂，研磨；将组织匀浆移至离心管中；往组织匀浆中加入氯仿，振荡；离心后移至另一离心管中，并加入异丙醇，再离心；弃上清，加入乙醇，洗涤；再离心；弃上清，沉淀晾干，加入DEPC处理的水，抽吸；水浴后，产物分装。
将总RNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定。
用RT-PCR技术获得hCu，Zn-SOD cDNA可按照cDNA合成试剂盒推荐的方法反转录合成hCu，Zn-SOD cDNA。按照Sherman，L.等发表的序列(Sherman L，Dafni N，Lieman-HurwitzJ et al.Nucleotide sequence and expression of human chromosome 21-encodedsuperoxide dismutase mRNA.Pro.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1983，80(18)5465-5469)，设计2条引物引物1为5-TTACATGTAGATGGCGACGAAGGCCG-，含BanHI位点；引物2为5-GCAAGCTTCTAGATTTATTGGGCCATCC-，含HindIII位点。
用PCR扩增cDNA可在一处离心管中混合如下试剂10×Reaction Buffer，25mM MgCl2，Deocynucleotide Mix，Upstueam Primer，Downstream Primer，Taq DNA Polymerase，H2O，Template cDNA。
其反应参数为首先94℃预变性，然后94℃变性，50℃退火，72℃延伸，如此循环；最后再72℃延伸。
PCR产物的鉴定可将PCR产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定。
PCR产物的克隆可从琼脂糖凝胶中回收DNA片段；再进行PCR产物的连接，在离心管中加入DNA，PMD18-T，T4DNA Ligase Buffer，T4DNA Ligase，H2O混匀，反应。转化大肠杆菌JM101；并进行重组子的鉴定，随机挑取若干单菌落，分别接种于培养液中，加入Amp抗性，振荡培养过夜；提取质粒；质粒经BamHI和HindIII双酶切，电泳鉴定。
Cu，Zn-SOD DNA的测序以证明为hCu，Zn-SOD基因。
与已有的人工合成法等方法相比，本发明提供一种十分简便有效，成本较低的从人体组织中提取人铜锌超氧化物歧化酶基因的方法。本发明中所提取的总RNA完整，PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果中扩增条带清晰，在重组质粒径BamHI和HindIII两位点酶切后的电泳结果中可说明SOD基因连入载体，hCu，Zn-SOD序列由上海生物工程技术服务有限公司测定，所测序列与文献报道的序列比较，仅有1处不同，即第165个碱基C替成T，其余序列均一致，同源性达到99.8％。
(4)
图1为人胚胎总RNA。
图2为人Cu，Zn-SOD cDNA PCR产物。
图3为重组子质粒限制性内切酶酶切分析。
图4为hCu，Zn-SOD基因的克隆示意图。
(5)
具体实施例方式
1、总RNA的制各1.1 总RNA的提取取刚流产出的人体胚胎组织(约28周)放入液氮容器；水相取新鲜人胚胎组织，放入玻璃匀浆器中，加入1ml TRIZOL试剂，研磨；将组织匀浆移至离心管中；往组织匀浆中加0.2ml氯仿，振荡，放置；4℃，12000g离心15min；移至另一离心管中，并加入0.5ml异丙醇，放置；4℃，12000g离心10min；弃上清，加入1ml 75％乙醇，振动洗涤；4℃，7500g离心5min；弃上清，沉淀晾干，加入50μl DEPC处理的水，抽吸；55℃，水浴10min；产物分装，放置-20℃保存。
1.2 总RNA的电泳鉴定1)电泳槽的处理用去污剂把电泳槽洗净，用流水冲洗，再用75％7醇干燥，然后用3％H2O2灌满浸泡10min，最后用DEPC处理的水荡洗。
2)凝胶的制备称取0.187g琼脂粉于一处理过的烧环中，加入12.5ml DEPC处理的水，溶解，冷却至60℃，加入3.6ml 37％的甲醛和4.0ml 5倍甲醛凝胶电泳缓冲液，混合，灌胶。
3)样品的处理按如下比例混合试剂RNA4.5μl5倍甲醛凝胶电泳缓冲液 2.0μl甲醛 3.5μl甲酰胺 10.0μl总 20.0μl离心收集，65℃水浴15min，冰浴冷却，离心收集。
4)电泳50V预电泳5min，取10μl处理过的样品和1μl加样缓冲液，点样枪头沾上少许溴化乙锭，点样，40V电泳2～3h。
5)凝胶成像分析系统扫描分析图1为总RNA1.5％琼脂糖凝胶电泳结果，可清晰地见到18S和28S两条核糖体RNA条带，说明所提取的总RNA是完整的。
2、RT-PCR获得hCu，Zn-SOD cDNA 2.3按照cDNA合成试剂盒推荐的方法反转录合成hCu，Zn-SOD cDNA，以此为模板，进行PCR反应。
2.1 cDNA的合成在一处理过的0.5ml离心管中混合如下试剂10×Reaction Buffer2.0μl25mM MgCl2 4.0μlDeoxynucleotide Mix2.0μlRandom Primer P(dN)6 2.0μlRnase Inhihitor1.0μlAMV reverse Transcriptase 0.8μlSterile Water 7.2μlRNA sample 1.0μl总20.0μl分别按如下温度和时间反应25℃ 10min；42℃ 60min；99℃ 5min；4℃ 5min；反应结束后于-20℃保存。
2.2 引物设计按照Sherman，L.等发表的序列(Sherman，L.，Dafni，N.，Lieman-Hurwitz，J.et al.Nucleotide sequence and expression of humar chromosome 21-encoded superoxidedismutase mRNA.Pro.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1983.80(18)5465-5469)，在SOD序列两端设计2条引物引物1为5`-TTACATGTAGATGGCGACGAAGGCCG-，含BanHI位点；引物2为5`-GCAAGCTTCTAGATTTATTGGGCCATCC-，含HindIII位点。
2.3 PCR扩增cDNA在一处0.5ml离心管中混合如下试剂10×Reaction Buffer 8.0μl25mM MgCl22.0μlDeocynucleotide Mix 1.0μlUpstueam Primer 1.0μlDownstream Primer 1.0μlTaq DNA Polymerase1.0μlH2O 76.5μlTemplate cDNA 10.0μl总100.0μl反应参数首先94℃预变性5min；然后94℃变性1min；50℃退火1min；72℃延伸1.5min如此循环40次；最后再72℃延伸10min。
2.4 PCR产物的鉴定PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定。图2为PCR产物1.5％琼脂糖凝胶电泳结果，可清晰见到一条大小约为490bp的扩增条带。
3、PCR产物的克隆3.1 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段1)PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下，切下含有所需DNA的凝胶，置一管中称重；2)加入三倍量(V/W)的6mol/L Nal溶液，55℃温浴至胶完全溶解(约10min)；3)加入20μl石英粉，混合后室温放置5min；4)10000rpm离心10s；5)弃上清液，加入500μl预冷的70％乙醇，混匀，10000rpm离心10s；6)重复步骤5)两次；7)沉淀干燥后，加入20μl dH2O悬浮，置50℃水浴5min，15000rpm离心3min；8)取上清于-20℃保存备用。
3.2 PCR产物的连接和转化1)在一0.5ml离心管中加入DNA 5.0μlPMD18-T 1.0μlT4DNA Ligase Buffer 2.0μlT4DNA Ligase 0.1μlH2O11.9μl总 20.0μl2)混匀，置于37℃反应1h。
3.3 感受态细胞的制备1)挑菌JM101于培养液37计划调节振荡培养0.5～3h，为达到高效转化，活细胞数务必少于108细胞/ml；2)取4ml菌液在无菌条件下转移到一个无菌、用并冰预冷的离心管中；3)4000rpm离心10min，回收细胞；4)倒出培养液，将管倒置1min以后使最后残留的痕量培养液流尽；5)加2ml预冷的0.1mol/L CaCl2重悬细胞沉淀；
6)4000rpm离心10min，弃上清液；7)加400μl预冷的0.1mol/L mol/L CaCl2重悬细胞沉淀，4℃保存过夜。
3.4 转化1)取过夜的感受态细胞150μl，加入7～10μl连接产物(浓度约为200～600mg)，混匀；2)冰浴30min；3)42℃水浴90min(严格控制此温度和时间)；4)冰浴2min；5)加入800μl培养液，于37℃振荡培养1h；6)离心浓缩菌液，并涂布于LB平板(含Ap100ug/ml)，37℃培养10h左右。
3.5 重组子的鉴定1)随机挑取4个单菌落，分别接种于4ml培养液中，加入4μl Amp抗性，37℃振荡培养过夜；2)提取质粒；(碱变性法)①取4m1菌液，15000rpm离心1min；倒掉培养液，并尽量吸干；②加入200μl溶液；剧烈振荡；③加入400μl新配的溶液，迅速温和颠倒数次，置冰上5min；④加入300μl溶液，迅速温和颠倒数次，冰浴10min；⑤15000rpm离心15min，上清液移入另一新管中；⑥加入等量的酚振荡10s，1200rpm离心2min，移水相至另一管中；⑦加入2倍体积无水乙醇，颠倒混合，冰上30mim；⑧加入30μl无菌水溶解，转移到另一管中；⑨加入30μl无菌水溶解，转移到另一管中；⑩加入1μl Rmase，置37℃ 30min；取2μl电泳检查浓度。
3)质粒经BamHI和HindIII双酶切鉴定每一0.5ml离心管中分别加入质粒 3.0μlBuffer E 2.0μl内切酶(BamHI/HindIII) 0.1μlH2O 14.9μl总 20.0μl
混匀，置于37℃反应1h；电泳鉴定。图3为重组质粒经BamHI和HindIII两位点酶切后的电泳结果，可见一条490bp左右的条带，即为SOD片段，说明SOD基因已经连入载体。
4、Cu，Zn-SOD DNA的测序hCu，Zn-SOD序列由上海生物工程技术服务有限公司测定，结果如下AATGTTTATTGGGCGATCCCAATTACACCACAAGCCAAACGACTTCCAGCGTTTCCTGTCTTTGTACTTTCTTCATTTCCACCTTTGCCCAAGTCATCTGCTTTTTCATGGACCACCAGTGTGCGGCCAATGATGCAATGGTCTCCTGAGAGTGAGATCACAGAATCTTCAATAGACACATCGGCCACACCATCTTTGTCAGCAGTCACATTGCCCAAGTCTCCAACATGCCTCTCTTCATCCTTTGGCCCACCGTGTTTTCTGGATAGAGGATTAAAGTGAGGACCTGCACTGGTACAGCCTGCTGTATTATCTCCAAACTCATGAACATGGAATCCATGCAGGCCTTCAGTCAGTCCTTTAATGCTTCCCCACACCTTCACTGGTCCATTACTTTCCTTCTGCTCGAAATTGATGATGCCCTGCACTGGGCCGTCGCCCTTCAGCACGCACACGGCCTTCGTCGCCAT所测序列与文献报道的序列比较，仅有1处不同，即第165个碱基C替成T，其余序列均一致，同源性达到99.8％。
图4给出Cu，Zn-SOD基因的克隆示意图。
实施例2其方法步骤与实施例1类似。在总RNA的提取中，取刚流产出的人体胚胎组织迅速放入液氮容器，水相取新鲜人胚胎组织100mg，迅速放入玻璃匀浆器中。将组织匀浆移至离心管中后可在室温放置5min；往组织匀浆中加0.2ml氯仿后猛烈振荡15s，室温放置3min；4℃，15000g离心20min再移至另一离心管中，并加入0.5ml异丙醇，室温放置10min；4℃，12000g离心15min。弃上清，加入1ml 75％乙醇，振动洗涤；于4℃10000g离心8min。在加入DEPC处理的水，抽吸后，于55℃水浴12min。
权利要求
1.一种从人体组织中获得人铜锌超氧化物歧化酶基因的方法，其特征在于从人体组织获得人铜锌超氧化物歧化酶基因的方法的步骤为从人体胚胎组织提取总RNA；用逆转录-聚合酶链式反应方法扩增出人铜锌SOD的cDNA；cDNA经PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检查和测序证明为hCu，Zn-SOD基因。
2.如权利要求1所述的一种从人体组织中获得人铜锌超氧化物歧化酶基因的方法，其特征在于所说的从人体胚胎组织提取总RNA的方法是取刚流产出的人体胚胎组织放入液氮容器；水相取新鲜人胚胎组织，放入玻璃匀浆器中，加入1ml TRIZOL试剂，研磨；将组织匀浆移至离心管中；往组织匀浆中加入氯仿，振荡；离心后移至另一离心管中，并加入异丙醇，再离心；弃上清，加入乙醇，洗涤；再离心；弃上清，沉淀晾干，加入DEPC处理的水，抽吸；水浴后，产物分装。
3.如权利要求2所述的一种从人体组织中获得人铜锌超氧化物歧化酶基因的方法，其特征在于从人体胚胎组织提取总RNA的方法是取刚流产出的人体胚胎组织放入液氮容器；水相取新鲜人胚胎组织100mg，放入玻璃匀浆器中，加入1ml TRIZOL试剂，研磨；将组织匀浆移至离心管中；往组织匀浆中加0.2ml氯仿，振荡，放置；4℃，12000g离心15min；移至另一离心管中，并加入0.5ml异丙醇，放置；4℃，12000g离心10min；弃上清，加入1ml 75％乙醇，振动洗涤；4℃，7500g离心5min；弃上清，沉淀晾干，加入50μl DEPC处理的水，抽吸；55℃，水浴10min；产物分装，放置-20℃保存。
4.如权利要求3所述的一种从人体组织中获得人铜锌超氧化物歧化酶基因的方法，其特征在于往组织匀浆中加0.2ml氯仿，振荡15s，室温放置2～3min；4℃，12000g～15000g离心15～20min；移至另一离心管中，并加入0.5ml异丙醇，放置；4℃，12000g离心10～15min；弃上清，加入1ml 75％乙醇，振动洗涤；4℃，7500g～10000g离心5～8min；弃上清，沉淀晾干，加入50μl DEPC处理的水，抽吸；55℃，水浴10min；产物分装，放置-20℃保存。
5.如权利要求1所述的一种从人体组织中获得人铜锌超氧化物歧化酶基因的方法，其特征在于所说的用逆转录-聚合酶链式反应方法扩增出人铜锌SOD的cDNA是按照cDNA合成试剂盒推荐的方法反转录合成hCu，Zn-SOD cDNA，设计2条引物引物1为5-TTACATGTAGATGGCGACGAAGGCCG-，含BanHI位点；引物2为5-GCAAGCTTCTAGATTTATTGGGCCATCC-，含HindIII位点。
6.如权利要求4所述的一种从人体组织中获得人铜锌超氧化物歧化酶基因的方法，其特征在于所说的2条引物设计在SOD序列两端。
7.如权利要求1所述的一种从人体组织中获得人铜锌超氧化物歧化酶基因的方法，其特征在于所说的用PCR扩增cDNA可在一处离心管中混合如下试剂10×Reaction Buffer，25mM MgCl2，Deocynucleotide Mix，Upstueam Primer，Downstream Primer，Taq DNAPolymerase，H2O，Template cDNA；其反应参数为首先94℃预变性，然后94℃变性，50℃退火，72℃延伸，如此循环；最后再72℃延伸。
8.如权利要求6所述的一种从人体组织中获得人铜锌超氧化物歧化酶基因的方法，其特征在于所说的用PCR扩增cDNA可在一处离心管中混合如下试剂10×Reaction Buffer8.0μl，25mM MgCl22.0μl，Deocynucleotide Mix 1.0μl，Upstueam Primer 1.0μl，Downstream Primer 1.0μl，Taq DNA Polymerase 1.0μl，H2O 76.5μl，TemplatecDNA 10.0μl。
全文摘要
涉及一种生物技术，尤其是一种从人体组织中提取人铜锌超氧化物歧化酶基因的方法。从人体组织获得人铜锌超氧化物歧化酶基因的方法的步骤为从人体胚胎组织提取总RNA；用逆转录－聚合酶链式反应方法扩增出人铜锌SOD的cDNA；cDNA经PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检查和测序证明为hCu，Zn－SOD基因。提供一种十分简便有效，成本较低的从人体组织中提取人铜锌超氧化物歧化酶基因的方法。所提取的总RNA完整，PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果中扩增条带清晰，在重组质粒径BamHI和HindIII两位点酶切后的电泳结果中可说明SOD基因连入载体，所测序列同源性达到99.8％。
文档编号C12P19/00GK1490411SQ02147660
公开日2004年4月21日 申请日期2002年10月19日 优先权日2002年10月19日
发明者刘仁海, 章军, 周克夫, 徐虹, 楼士林 申请人:厦门市厦大建南抗性基因有限公司