专利名称：编码对映选择性酰胺酶的核酸序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码对映选择性酰胺酶的核酸序列。本发明还涉及载体，以及包括本发明核酸序列的宿主细胞，和用于生产和使用所述核酸序列的表达产物的方法。
酰胺酶是具有酰胺酶活性的多肽，并且是具有催化羧酸酰胺水解形成相应的羧酸和氨的能力的酶。对映选择性酰胺酶是优选羧酸酰胺的对映体之一作为底物的酰胺酶。已知对映选择性酰胺酶在生产对映体富集的羧酸的商业化生物工艺中具有价值。例如，羧酸包括α-H-α-氨基酸，α，α-二烷基氨基酸，α-羟酸和/或它的衍生物以及它的肽。对映体富集的羧酸和/或它的衍生物以及它的肽被用于各种行业，例如，用于制药工业，农药工业等。例如，氨基酸L-缬氨酸非常适合用作环孢菌素A发酵的前体，α-羟基丙酸被用于生产除草剂，某些α-N-羟基氨基酸可以用作抗肿瘤制剂，而D-p-羟基苯基甘氨酸和D-苯基甘氨酸被用于生产某些半合成的广谱性β-内酰胺抗生素。在EP 494716 B1中，提供了具有酰胺酶活性的微生物的两种例子人苍白杆菌NCIB 40321(又被称作NCIMB 40321)和克雷伯氏菌NCIB 40322。
本发明特别涉及编码其氨基酸序列与SEQ IDNO.2具有至少70％同一性的对映选择性酰胺酶的核酸序列。在SEQ IDNO.1中，提供了编码来自人苍白杆菌NCIMB 40321的L-酰胺酶的核酸序列。在SEQ IDNO.2中，提供了相应于SEQ IDNO.1的核酸序列的氨基酸序列。业已令人吃惊地发现，在发酵培养基中进行的能表达具有与SEQ IDNO.2有至少70％的同一性的氨基酸序列的对映选择性酰胺酶的核酸的微生物的包括分批阶段和补料阶段的发酵，导致了对映选择性酰胺酶活性的产量的提高，前提是在补料阶段在每升发酵培养基中补充0.5-50毫克Zn2+。
对映选择性酰胺酶活性的产量的这种提高，可能是由于对映选择性酰胺酶本身活性的增强，以及所产生的对映选择性酰胺酶数量的增加。在EP1,174,499中，业已披露了编码来自阴沟肠杆菌N-7901的对映选择性酰胺酶的核酸序列；相应的氨基酸序列与相应于SEQ IDNO1的核酸序列的氨基酸序列有68％的同一性。因此，编码本发明的对映选择性酰胺酶的核酸序列是新的。在EP1,174,499中尚未披露表达编码阴沟肠杆菌N-7901的对映选择性酰胺酶的核酸序列的微生物发酵的Zn2+依赖性。
本发明优选涉及编码其氨基酸序列与SEQ ID NO.2具有至少大约75％的同一性程度的对映选择性酰胺酶的核酸序列，同一性更优选为80％，更优选至少大约85％，最优选至少大约90％，更优选至少95％，更优选至少97％，特别优选至少98％，更特别优选至少99％，最特别优选100％。
对于本发明来说，两种氨基酸序列之间的同一性程度，是通过BLASTP成对比对程序(NCBI)确定的，采用以下同一性表和比对参数错配＝-15，罚分＝-3，空位-延伸＝1，配对-奖分＝1，空位x-droff＝50，预期值＝10，字长＝3。
本发明还涉及编码对映选择性酰胺酶的核酸序列，所述核酸序列优选在中等，更优选在高严格条件下，最优选在极高严格性条件下与(i)SEQ ID NO.1，(ii)包括SEQ ID NO.1的基因组DNA序列或(iii)(i)或(ii)的互补链杂交。
杂交实验可以通过多种方法进行，这些方法为技术人员所熟知。例如，从多种方法中进行选择的一般指南，可以参见以下文献的第9章，Sambrook，J.，Fritsh，E.F.，and Maniatis，T.MolecularCloningA Laboratory Manual.2nd ed.，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，1989。
杂交条件的严格性表示进行杂交的条件，所述杂交由实际杂交和洗涤步骤组成。洗涤步骤被用于洗掉没有与固定在诸如硝酸纤维素滤膜上的靶核酸杂交的核酸。例如，杂交条件的严格性，可以通过改变洗涤溶液的盐浓度和/或改变进行洗涤步骤的温度(洗涤温度)而改变。通过降低洗涤溶液中的盐浓度或提高洗涤温度，可以提高杂交的严格性。对于本申请来说，杂交在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，在大约45℃下进行大约12小时。在1X SSC，0.1％SDS中，在50℃下进行两个连续的30分钟的洗涤步骤是低严格性的例子，在55℃下进行的洗涤是中等严格性的例子，在60℃下的洗涤是高严格性的例子，在65℃下的洗涤是极高严格性的例子。
本发明还涉及编码具有SEQ IDNO.2的氨基酸序列的对映选择性酰胺酶的核酸序列，在所述氨基酸序列的大约15或更少的氨基酸位置上具有改变，优选至少10个或更少的氨基酸位置，更优选大约5个或更少，更优选大约3个或更少的氨基酸位置，其中，所述改变独立地是(i)氨基酸的插入(ii)氨基酸的缺失(iii)氨基酸的取代。
编码具有包括多种改变的SEQ IDNO.2所示氨基酸序列的对映选择性酰胺酶的核酸序列，可以按本领域已知方法制备，例如，核酸序列的定点诱变。在该方法中，将编码所需突变，如在特定氨基酸位置上的取代，插入或缺失的诱变寡核苷酸与感兴趣的DNA的一条链退火，并且用作启动DNA合成的引物。通过DNA合成，将诱变寡核苷酸掺入新合成的DNA链上。通常，本领域已知的方法还具有诱变核酸序列的阳性选择技术，以便提高定点诱变方法的效率。某些定点诱变技术使用PCR，其中，将诱变寡核苷酸用作引物用于实现定点诱变的方法，披露于很多公司的产品手册中，例如，Stratagene和Invitrogen公司的产品手册，并且，用于实现定点诱变的试剂盒可以通过商业渠道获得。
本发明还涉及编码对映选择性酰胺酶的核酸序列，这种酰胺酶与抗SEQ IDNO.2的氨基酸序列片段的抗体具有免疫交叉反应性。每一个片段的长度优选至少20个氨基酸。所述免疫学交叉反应性可以使用抗具有酰胺酶活性的本发明分离的多肽的至少一个表位或者与其反应的抗体测定。所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，可以用本领域所公知的方法生产，例如，披露于以下文献中的方法Hudson等，Practical Immunology，Third Edition(1989)，BlackwellScientific Publications。所述免疫化学交叉反应性可以通过本领域已知的测定方法测定，所述方法的一种例子是Western印迹，例如，在以下文献中所披露的Hudson等，Practical Immunology，ThirdEdition(1989)，Blackwell Scientific Publications。
本发明还涉及编码对映选择性酰胺酶的融合蛋白的核酸序列，它由可操作地与编码标记多肽的一种或多种核酸序列连接的编码本发明多肽的核酸组成。可操作地连接表示两种核酸序列是这样连接的如果表达的话，能产生对映选择性酰胺酶的融合蛋白，所述标记多肽存在于它的N-和/或C-末端。所述标记多肽可用于多种目的，例如，可以用它提高融合蛋白的稳定性或可溶性，还可以用它作为分泌信号，它是指导融合蛋白进入细胞的某些区室的信号，或者可将它用于促进融合蛋白的纯化。用于促进融合蛋白纯化的标记多肽的例子是MBP-和GST-标记。例如，具有MBP-标记或GST-标记的融合蛋白的纯化披露于以下文献中F.M.Ausubel，R.Brent，R.E.Kingston，D.D.Moore，J.G.Seidman，J.A.Smith，和K.Struhl eds.，Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，New York，NY，USA，1990。例如，可以在pMAL载体中生产具有MBP-标记的融合蛋白(New England Biolabs，Beverly，MA，USA)，而具有GST-标记的融合蛋白可以在pGEX载体(Amersham Biosciences，Inc.，Piscataway，NJ，USA)中生产，采用各自供应商的方法。
本发明的核酸序列，例如，具有SEQ IDNO.1的序列的核酸序列可以用标准分子生物学技术和其中所提供的序列信息分离。例如，将SEQ IDNO.1的全部或部分核酸序列作为杂交探针用于人苍白杆菌NCIB 40321上，可以通过标准杂交和克隆技术分离本发明的核酸序列(例如，披露于以下文献中Sambrook，J.，Fritsh，E.F.，and Maniatis，T.Molecular CloningA Laboratory Manual.2nd，ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。
另外，包括SEQ IDNO.1的全部或一部分的核酸序列可以通过聚合酶链式反应(PCR)使用根据SEQ IDNO.1或SEQ IDNO.2所包含的序列信息设计的合成寡核苷酸引物分离，在人苍白杆菌NCIB40321上采用PCR，并且，如果将所述寡核苷酸引物用于具有对映选择性酰胺酶活性的微生物的话，也可以分离。
本发明的核酸序列还可以使用诸如来自具有对映选择性酰胺酶活性的微生物的基因组DNA，cDNA或者合适的mRNA作模板，和基于按照标准(RT)-PCR扩增技术提供的序列信息的合适的寡核苷酸引物扩增。可以将由此扩增的核酸克隆到合适的载体上，并且通过DNA序列分析表征。
另外，相当于本发明核酸序列或者能与本发明核酸序列杂交的寡核苷酸可以通过标准合成技术制备，例如，使用自动DNA合成仪。
可以按照本领域技术人员所公知的标准克隆和表达技术将本发明的核酸序列克隆到合适载体上，并且在导入合适的宿主之后，该序列能够表达，以便产生相应的对映选择性酰胺酶(例如，在以下文献中所披露的Sambrook，J.，Fritsh，E.F.，and Maniatis，T.MolecularCloningA Laboratory Manual.2nd，ed.，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，1989)。本发明还涉及包括本发明核酸序列的载体。
合适的载体是通常被用于克隆和表达的载体，并且为本领域技术人员所公知。例如，用于在大肠杆菌中表达的合适载体的例子披露于以下文献中的表1中Makrides，S.C.，Microbiological Reviews，Vol.60，No.3，(1996)，512-538。所述载体优选包括位于克隆位点上游的启动子，所述克隆位点包括编码具有酰胺酶活性的多肽的核酸序列，所述启动子在所述宿主业已生长到能表达具有酰胺酶活性的相应的多肽时启动，可以启动和关闭的启动子为本领域技术人员所公知，并且，举例来说，包括lac启动子，araBAD启动子，T7启动子，trc启动子，tac启动子和trp启动子。例如，特别适用于本发明范围的是披露于WO 00/66751中的载体，例如，没有插入的青霉素G酰基转移酶基因的pKAFssECtrp或pKAFssECaro。合适的宿主通常是用于克隆或表达的宿主，并且为本领域技术人员所公知。例如，合适宿主菌株的例子是大肠杆菌菌株，例如大肠杆菌TOP10F′，TOP10，DH10B，DH5a，HB101，W3110，BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS。特别适用于本发明范围的是大肠杆菌K-12菌株，例如，DH1，HB101，RV308，RR1，W3110，C600。
有时，载体的选择取决于宿主的选择，反之亦然。例如，如果使用具有araBAD启动子的载体的话，不能破坏阿拉伯糖诱导物(ara-)的大肠杆菌宿主菌株是非常优选的。
另外，可以将本发明的核酸序列整合到正常情况下不包括本发明核酸序列的宿主细胞的基因组中，并且(超量)表达。这一目的可以按照本领域技术人员所公知的方法实现。本发明还涉及正常情况下不包括本发明核酸序列，现在包括本发明核酸序列的宿主细胞，优选包括含有本发明核酸序列的载体的宿主细胞。
本发明还涉及用于制备权利要求1-5中任意一项的核酸序列的表达产物的方法，其中，在第一个步骤中，将所述核酸序列导入合适的宿主，该宿主正常情况下不包括本发明的核酸序列，并且，其中，所述核酸序列随后在所述宿主中表达。核酸序列的导入和随后的表达是本领域技术人员所公知的标准技术。
本发明还涉及包括分批和补料阶段的在发酵培养基中对微生物进行发酵的方法，其中，所述微生物表达本发明的核酸，并且，在发酵期间向每升发酵培养基中添加0.5-50毫克的Zn2+(相当于7.7μM-770μM)。
通常，所述补料阶段是在大约10小时之后开始。0.5-50毫克/升发酵培养基的Zn2+用量可以一次补充到发酵培养基中。不过，优选分次补充，因为一次添加Zn2+会导致在发酵培养基上形成泡沫，并且导致随后在发酵中分解微生物。例如，Zn2+可以分成5-10个相等的部分添加，不过，当然还可以将Zn2+分成不同的部分在补料阶段添加。优选将Zn2+连续补充到发酵培养基中，如果采用连续补料方法的话，将Zn2+与其他成分组合在一种补料中是非常实用的。
例如，Zn2+存在于锌盐中。在本发明的方法中，优选使用能很好地溶解在水中的锌盐(高于0.1摩尔/升)，例如Zn(NO3)2，Zn(CH3COO)2，ZnSO4，ZnCl2，ZnBr2，ZnI2。
用于发酵的微生物可以是本身就具有并且能表达本发明核酸序列的微生物，不过优选是能表达本发明核酸序列，更优选超量表达所述核酸序列的宿主。
业已发现，在存在0.01mM-100mM Zn2+的条件下，也能提高本发明核酸序列的表达产物的对映选择性酰胺酶活性。因此，本发明还涉及用于制备对映体富集的羧酸和/或对映体富集的羧酸酰胺的方法，其中，在存在0.01mM-100mM Zn2+的条件下，让相应的D-和L-羧酸酰胺的混合物与权利要求1-5中任意一项的表达产物接触，以便对所述羧酸酰胺的一种对映体进行对映选择性水解，形成相应的对映体富集的羧酸，而所述羧酸酰胺的其他对映体保持不变。如果必要，可以水解其余的对映体富集的羧酸酰胺，以便形成相应的对映体富集的酸。所述其余羧酸酰胺的水解可以用本领域已知方法进行，例如，在碱性或酸性条件下进行，或通过酶促进行。
通过本发明核酸序列的表达产物催化的对映选择性水解优选是在存在0.5-50，更优选0.5-20mM Zn2+的条件下进行的。
进行由本发明核酸序列的表达产物催化的对映选择性水解的pH并不重要，所述对映选择性水解优选是在5-9，更优选6.5-8.5的pH下进行的。
在存在本发明表达产物的条件下进行的对映选择性水解的温度优选为10-75℃，更优选30-65℃，特别优选40-60℃。
作为混合物，可以使用D-和L-羧酸酰胺的消旋混合物，不过，当然也可以使用随机选择的D-和L-羧酸酰胺的混合物。
合适的羧酸酰胺的例子有具有2-20个C原子的α-H-α-氨基酸酰胺或它的衍生物，例如，丙氨酸酰胺，苯基甘氨酸酰胺，苯丙氨酸酰胺，对羟基苯基甘氨酸酰胺，脯氨酸酰胺，缬氨酸酰胺，亮氨酸酰胺，叔亮氨酸酰胺，甲硫氨酸酰胺，脯氨酸酰胺，谷氨酸酰胺，具有2-20个C原子的α-H-α-羟酸酰胺，例如，扁桃酸酰胺，具有2-20个C原子的α-α-二烷基-氨基酸酰胺，例如α-甲基缬氨酸酰胺，α-甲基苯基甘氨酸酰胺，α-乙基苯基甘氨酸酰胺，α-丁基苯基甘氨酸酰胺，α-甲基苯丙氨酸酰胺，α-乙基苯丙氨酸酰胺，α-乙基-α-丁基甘氨酸酰胺。叔亮氨酸或α-甲基苯基甘氨酸优选是按照本发明的方法制备的。
为了说明本发明，补充了以下实施例。
实施例实施例1通过在补料阶段向发酵培养基中添加Zn2+对能表达SEQ IDNO.1所示核酸序列的大肠杆菌K-12进行发酵。
制备了以下种子培养基酵母提取粉(DIFCO，BactoTM) 38gNa2HPO417.8gKH2PO413.6gNH4Cl 4.8g蒸馏水 1500ml用NaOH水溶液将pH调整到6.8。将100和200ml的等分样品放入500和2000ml的三角烧瓶中，并且消毒(121℃，20分钟)。在无菌条件下将1.1ml的50％(w/v)葡萄糖和2.2ml的青霉素(1.2g/l)溶液添加到500ml烧瓶中(接种阶段1)。将1和2ml的50％(w/v)葡萄糖和新霉素(1.2g/l)溶液添加到2000ml烧瓶中(接种阶段2)。
然后，用能表达SEQ IDNO.1所示核酸的大肠杆菌K-12菌株的1.8ml 50％v/v甘油/水悬浮液，接种所述接种阶段1的三角烧瓶，并且在稳定的定轨振荡条件下，在27℃的温度下培养并且温育22小时。为了在大肠杆菌K12菌株308中表达SEQ IDNO 1所示的核酸序列，使用具有包括限制位点(对于正向引物来说为Ndel，而对于反向引物来说为SmaI)的5’延伸部分的酰胺酶特异性引物通过PCR扩增所述核酸序列。使用限制酶Ndel和SmaI，将所获得的片段克隆到大肠杆菌表达载体pKECtrp的衍生物的大肠杆菌青霉素G酰基转移酶编码序列的位点上。所使用的衍生的表达载体与构建体pKECtrp类似，它的构建披露于WO00/66751中，所不同的是，它包括大肠杆菌aro启动子而不是trp启动子。将整个接种阶段1三角烧瓶用于接种接种阶段2的2000ml三角烧瓶。在稳定定轨振荡条件下，在27℃的温度下将接种阶段2培养和温育3小时。
将2％(v/v)的接种阶段2的培养物用于接种20L玻璃发酵罐中的6.4L分批阶段培养基。所述分批阶段培养基具有以下组分Gistex_LS pasta 24.6g/l柠檬酸10g/lFeSO4·7H2O0.2g/lMgSO4·7H2O3.1g/lCaCl2·2H2O1.5g/lMnSO4·H2O 0.169g/l(NH4)2SO49.0g/lCoCl2·6H2O0.006g/lNaMoSO4·2H2O 0.004g/lH3BO30.004g/l消泡剂Basildon 86/013 数滴
K2HPO418.1g/l葡萄糖211.4g/l新霉素20.012g/l硫胺素20.014g/l在将pH调整到4.5(用NaOH)之后，在121℃下将所述分批阶段培养基消毒65分钟。用1和2标注各自是分别溶解的培养基成分，并且将包括用1标注的成分的溶液在121℃下消毒65分钟，而包括用2标注的成分的溶液进行过滤消毒。这两种成分都是在无菌条件下添加到所述培养基中的。在转移接种阶段1之前，将分批阶段培养基的pH调整到pH7.0。发酵是在27℃下，在稳定搅拌和最佳通气条件下进行的。在50-54小时之间，发酵温度在4小时内从27℃线性降低到25℃，并且直到发酵结束都一直保持在该温度下。
在发酵期间(分批和补料阶段)，pH可以在7.00和7.30之间变动。分批阶段随着补料1和补料2的开始而结束(补料阶段的开始)，此时，pH达到7.15。此时，碳源被耗尽。分批阶段持续大约9小时。补料1具有以下组分葡萄糖 670g/l硫氨素10.18g/lMgSO4·7H2O114.4g/l脯氨酸16.1g/l谷氨酸一钠112.2g/lZnSO4·7H2O10.022g/l补料1是按以下方法制备的。首先溶解葡萄糖。将大约0.4ml/l4N HCl添加到葡萄糖溶液中。对该溶液进行消毒(121℃，30分钟)。硫氨素，MgSO4·7H2O，脯氨酸和谷氨酸一钠和ZnSO4·7H2O是分别溶解的，并且在添加(无菌)到葡萄糖溶液中之前，对它们的溶液进行过滤消毒。在下面的表1中提供了用于将补料1导入分批阶段培养基的参数。
表1.用于导入补料1的补料参数
补料2具有以下组分Gistex_LS pasta 300g/l补料2是按以下方法制备的。首先将酵母提取膏溶解在水中。然后，将pH调整到4.5+/-0.1。对该溶液进行消毒(121℃，30分钟)。在下面的表2中提供了用于将补料2导入分批阶段培养基的参数。在表1和2中的参数中的‘时间’表示‘补料开始之后的小时数’。
表2.用于导入补料2的参数
补料1和补料2构成了补料阶段培养基。发酵在120小时之后结束。
所述发酵是重复进行的，所不同的是，在补料1中没有添加ZnSO4·7H2O。
在补料阶段开始之后，用下文所披露的方法测定两种发酵的发酵液(发酵培养基和细胞)L-酰胺酶活性。
分析在补料1中有Zn2+和在补料1中没有Zn2+的条件下，从能表达SEQIDNO.1所示核酸序列的大肠杆菌K-12的发酵获得的发酵液(具有细胞的发酵培养基)样品的L-酰胺酶活性。
在水浴中将1.5ml的温育试剂(含有1.1w％L-苯基甘氨酸酰胺，0.11M HEPES-NaOH缓冲液，pH8.0和1.1mM MnSO4.1H2O)加热到55℃。10分钟之后，将100微升样品溶液(含有用20mM HEPES-NaOH稀释的发酵液，pH7.5/2mM DTT)添加到加热的温育试剂中。将合并的温育试剂与样品溶液一起温育20分钟。然后通过将100微升的合并的温育试剂添加到1.5ml终止试剂(53mM磷酸)中终止该反应。以14,000rpm的速度将该终止的反应混合物离心5分钟。在以下条件下通过HPLC分析上清液柱nucleosil 120-3C18(125×4mm)波长检测仪220nm流速1.0ml/分钟注入体积20微升洗脱液100mM磷酸缓冲液pH3.0L-苯基甘氨酸和L-苯基甘氨酸酰胺的保留时间分别为大约1.8和2.7分钟计算相当于苯基甘氨酸的HPLC峰下的面积，并且在校正发酵液的稀释系数之后与来自其他样品的苯基甘氨酸峰下面的面积进行比较。来自所述样品的相对峰面积等于相对L-酰胺酶活性，该活性是所述样品彼此比较的活性。在
图1中提供了来自具有含有Zn2+的补料1的发酵样品(A)和不含Zn2+的补料1的发酵样品(B)的相对L-酰胺酶活性(rel.act.)，其中，相对活性业已相对采集样品的时间T(h)(分批阶段开始之后的小时数)进行了作图。
从图1中可以看出，如果在补料阶段将Zn2+添加到发酵液中的话，能够产生更高的L-酰胺酶活性。
从在补料1中使用Zn2+的发酵中制备酶溶液LAM0011。
用4g/l辛醇处理来自在补料1中使用Zn2+的发酵的发酵液，以便杀灭微生物，并且通过高压匀浆(600-700巴)，匀浆2次。在匀浆之后，通过添加根据发酵液体积计算的10v％的C577的10％溶液使之絮凝。添加根据发酵液体积计算的10v％的过滤助剂Dicalite 448。在膜式过滤压力器上过滤所得到的浆，并且用1倍体积的处理水洗涤。然后对生物物质块进行烧灼灭菌。用Seitz过滤平板(大小为5-15微米)过滤滤液，然后用0.1-0.3微米的微生物过滤平板过滤。所得到的滤液在容器中冷冻保存待用。
从在补料1中不使用Zn2+的发酵制备酶溶液LAM0001用4g/l辛醇处理来自在补料1中不使用Zn2+的发酵的发酵液，以便杀灭微生物，并且通过高压匀浆(600-700巴)，匀浆2次。在匀浆之后，通过添加根据发酵液体积计算的10v％的C577的10％溶液使之絮凝。添加根据发酵液体积计算的10v％的过滤助剂Dicalite 448。在膜式过滤压力器上过滤所得到的浆，并且用2.2倍体积的处理水洗涤。然后对生物物质块进行烧灼灭菌。用大小为5-15微米的Seitz过滤平板过滤所述滤液，然后用0.1-0.3微米的微生物过滤平板过滤。然后，使用50kD Polysulphon膜将所得到的滤液浓缩3倍，用1/4保留物体积的RO水洗涤保留物。然后再次用大小为5-15微米的Seitz过滤平板过滤所述保留物，然后用0.1-0.3微米的微生物过滤平板过滤。将所得到的滤液保存在容器中直到在应用反应中使用(实施例2-5)。
实施例2在存在不同浓度的Zn2+的条件下，在pH6.5的条件下用来自人苍白杆菌NCIMB 40321的L-酰胺酶对DL-α-甲基苯基甘氨酸酰胺进行对映选择性水解通过在存在0.1，0.3，1.0，3.0和9.0mM Zn2+的条件下进行反应，确定Zn2+浓度对来自人苍白杆菌NCIMB 40321的L-酰胺酶对DL-α-甲基苯基甘氨酸酰胺的水解反应的影响。作为对照，还进行了进行没有额外Zn2+的反应。
对于本实验来说，在烧瓶中填充25g反应混合物，每一种反应混合物含有2.5g DL-α-甲基苯基甘氨酸酰胺(最终浓度为10wt％)，46微升来自人苍白杆菌NCIMB 40321的批号LAM0011，不另外添加ZnSO4，或添加0.1，0.3，1.0，3.0或9.0mM的ZnSO4，所有反应混合物的pH为6.5。通过添加酶液启动所述反应。
所有反应混合物都是在定轨摇床上，在55℃下以200rpm的速度温度。在添加所述酶之后(t＝0小时)马上，以及在1，4和11小时之后采集1g样品，并且转移到装有4g 1M H3PO4小瓶中，以便马上终止该反应。样品和终止溶液的确切量是通过称重确定的，在用0.22微米的过滤器过滤之后，按照以下方法通过HPLC测定α-甲基苯基甘氨酸和α-甲基苯基甘氨酸酰胺的浓度柱Inertsil ODS-3(3微米)50mm*4.6mm ID洗脱液50mM H3PO4-NaOH，pH＝2.5流速0.8ml/分钟温度40℃Vinj15L检测UV 210nm在表3中提供了该实验的结果，其中，所述反应的转化率(与起始氨基酸酰胺的总量相比所形成的氨基酸的量)是以相对转化率形式提供的；最大转化率被设定为100。
表3.Zn2+浓度对来自人苍白杆菌NCIMB 40321的L-酰胺酶(批号LAM 0011)对DL-α-甲基苯基甘氨酸酰胺的水解反应的影响。
从表3可以看出，Zn2+的存在对于人苍白杆菌L-酰胺酶对DL-α-甲基苯基甘氨酸酰胺的活性来说是非常有利的。在不添加Zn2+的情况下，几乎不会发生对该底物的任何水解反应(参见项目F)。
实施例3在存在不同的二价金属离子，pH6.5的条件下，使用来自人苍白杆菌NCIMB 40321的L-酰胺酶对DL-α-甲基苯基甘氨酸酰胺的对映选择性水解作用。
在与实施例2类似的反应设置中，研究了添加的Zn2+是否对来自人苍白杆菌NCIMB 40321的L-酰胺酶对DL-α-甲基苯基甘氨酸酰胺的转化率有有利影响，所述酰胺酶是在没有多余Zn2+的条件下发酵的。所述水解反应是在存在等摩尔数量的Mn2+或Zn2+的条件下进行的。另外，使用在存在过量Zn2+的条件下发酵的来自苍白杆菌NCIMB 40321的L-酰胺酶进行对照反应。
在烧瓶中填充25g反应混合物，每一种反应混合物含有2.5g DL-α-甲基苯基甘氨酸酰胺(最终浓度为10wt％)，240微升来自人苍白杆菌NCIMB 40321制剂LAM0011的L-酰胺酶，和1mM MnSO4或ZnSO4。所制备的第三种反应混合物含有(除了底物之外)1mM Zn2+和92微升来自人苍白杆菌NCIMB 40321制剂LAM0011的L-酰胺酶(92微升LAM0001相当于240微升LAM0011的L-酰胺酶活性)。底物温育，取样和分析都是按实施例2所述方法进行的。在表4中提供了该实验的结果，其中，所述反应的转化率(与起始氨基酸酰胺相比所形成的氨基酸的数量)是以相对转化率形式提供的，将最大转化率设定为100。
表4.添加Zn2+和Mn2+对来自人苍白杆菌NCIMB 40321的L-酰胺酶对DL-α-甲基苯基甘氨酸酰胺的水解反应的影响，所述酰胺酶是在补料1中没有Zn2+的条件下发酵的(批号LAM 0001)和在补料1中有Zn2+的条件下发酵的(批号LAM 0011)。
从表4可以看出，在存在1mM Zn2+的条件下，在有和没有额外Zn2+的条件下发酵的酶对DL-α-甲基苯基甘氨酸酰胺的转化率是类似的，并且这两种转化率都高于在存在1mM Mn2+的条件下的转化率。
实施例4在存在不同二价金属离子的条件下，在pH7.0的条件下来自人苍白杆菌NCIMB 40321的L-酰胺酶对DL-叔-甲基苯基亮氨酸酰胺的对映选择性水解作用。
在与实施例2类似的设置中，测定了等摩尔数量的Mn2+，Zn2+和Mg2+的存在对来自苍白杆菌NCIMB 40321的L-酰胺酶对DL-叔-亮氨酸酰胺的水解反应的影响。作为对照，进行了没有添加任何二价金属离子的反应。
为了进行该实验，用25g的反应混合物填充烧瓶，每一种反应混合物含有3.13g DL-叔-亮氨酸酰胺(最终浓度为12.5wt％)，1.45微升来自人苍白杆菌NCIMB 40321的L-酰胺酶(批号LAM0011)和1.0mM ZnSO4，MgSO4或MnSO4。此外，在没有任何额外二价金属离子的条件下进行了一种独立的反应。所有反应混合物的pH为7.0。所述反应是通过添加所述酶液体启动的。
所有反应混合物是在定轨摇床上在55℃以150rpm的速度温育的。在添加酶之后(t＝0小时)，以及小1，3和6.7小时之后，采集1g的样品，并且转移到装有4g 1M H3PO4的小瓶中，以便马上终止该反应。通过称重确定样品和终止溶液的确切量。在用0.22微米的滤膜过滤之后，按照以下方法通过HPLC测定叔-亮氨酸和叔-亮氨酸酰胺的浓度
柱Inertsil ODS-3(150mm×4.6mm I.D.，5μ)，由VarianChrompack提供洗脱液99v/v％50mM H3PO4，pH＝2.3，使用1N NaOH+1v/v％乙腈流速1.0ml/分钟温度30℃Vinj.20微升检测在柱后衍生化之后用OPA/MCE(a)检测荧光(λex365nm和λem＞420nm)。
(a)柱后衍生化是在反应螺旋管(2m×0.25mmI.D.)中，在环境温度下，用pH10的含有o-邻苯二甲醛(OPA)和2-巯基乙醇(MCE)的0.4M硼酸缓冲液进行的。衍生化试剂的流速为1.0ml/分钟。所述试剂是通过以下方法制备的首先将49.46g H3BO3和35g KOH溶解在2升Milli-Q水中，然后用1M KOH将pH调整到10。然后将1.6g OPA(溶解在20ml乙醇中)和2ml MCE添加到该硼酸缓冲液中。
在表5中提供了该实验的结果，其中，该反应的转化率(与起始氨基酸酰胺的数量相比所形成的氨基酸的数量)是以相对转化率形式提供的，将最大转化率设定为100。
表5.不同二价金属离子的存在对来自人苍白杆菌NCIMB 40321的L-酰胺酶(批号LAM 0011)对DL-叔-亮氨酸酰胺的水解反应的影响。
表5中的数据清楚地表明，在存在1mM Zn2+的条件下，所获得的来自人苍白杆菌NCIMB 40321的L-酰胺酶对DL-叔-亮氨酸酰胺的水解反应，快于在存在等摩尔数量的Mg2+或在缺少额外二价金属离子条件下所获得的水解反应。
实施例5在存在Zn2+的条件下，在不同pH值下来自人苍白杆菌NCIMB 40321的L-酰胺酶对DL-叔-亮氨酸酰胺的对映选择性水解为了研究pH对来自人苍白杆菌NCIMB 40321的L-酰胺酶对DL-叔-亮氨酸酰胺的对映选择性水解作用的影响，在有和没有1mM Zn2+的条件下，在pH7.0，8.0和9.0的条件下进行反应。
所有实验设置与实施例3中的实验设置相同。在表6中提供了该实验的结果。
表6.在有和没有1mM ZnSO4的条件下，反应混合物的pH对来自人苍白杆菌NCIMB 40321的L-酰胺酶(批号LAM 0011)对DL-叔-亮氨酸酰胺的水解反应的影响。
序列表<110>DSM NV<120>编码对映选择性酰胺酸的核酸序列<130>20594WO<140>
<141>
<160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>945<212>DNA<213>人苍白杆菌(ochrobactrum anthropi)NCIMB 40321<400>1atgtgcaata attgccatta caccattcac ggccggcatc atcatttcgg ctgggacaac 60tcgttccagc cggctgaaac ggtcgcgccc ggctcgaccc tgaaattcga atgtctggac 120agcggcgcag gccactatca tcgcggcagc acagtcgccg atgtgtcgac gatggatttt 180tccaaggtca atccggttac cggccccatc ttcgtcgatg gagccaaacc gggcgatgtc 240ctgaaaatca ccatccacca gttcgagcca tcaggcttcg gctggacggc aaatattccg 300ggcttcggtc ttctcgccga cgacttcaag gaaccggcgc tagcattgtg gaactacaat 360cccacaacgc tggagccagc actcttcgga gagcgtgcgc gcgtgccgct gaagccgttc 420gccggaacca tcggcgtcgc accggcggaa aagggcctgc attcggtcgt accaccgcgt 480cgtgtcggcg gcaatctcga catccgcgat cttgcagccg gaaccacgct ttatctgccg 540atcgaagtcg aaggcgcttt gttctccatt ggtgataccc atgcggcaca gggcgacggc 600gaagtgtgcg gcaccgccat cgaaagcgcg atgaatgtcg ctctgacgct ggatctcatc 660aaggatacgc cactgaagat gccccggttc accacgccgg ggccagtgac gcggcacctc 720gataccaagg gttacgaagt caccaccggt atcgggtccg atctgtggga aggcgcgaaa 780gccgccctct ccaacatgat cgaccttctt tgccagacgc agaacctcaa cccggtggat 840gcctatatgc tctgctcggc ctgcggtgat ctgcgtatca gcgaaatcgt cgatcagccg 900aactgggtcg tatcgttcta cttcccgcgt tccgttttcg aataa 945<210>2<211>314<212>PRT<213>人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)NCIMB 40321<400>2Met Cys Asn Asn Cys His Tyr Thr Ile His Gly Arg His His His Phe1 5 10 15Gly Trp Asp Asn Ser Phe Gln Pro Ala Glu Thr Val Ala Pro Gly Ser20 25 30Thr Leu Lys Phe Glu Cys Leu Asp Ser Gly Ala Gly His Tyr His Arg35 40 45Gly Ser Thr Val Ala Asp Val Ser Thr Met Asp Phe Ser Lys Val Asn50 55 60Pro Val Thr Gly Pro Ile Phe Val Asp Gly Ala Lys Pro Gly Asp Val
65 70 75 80Leu Lys Ile Thr Ile His Gln Phe Glu Pro Ser Gly Phe Gly Trp Thr85 90 95Ala Asn Ile Pro Gly Phe Gly Leu Leu Ala Asp Asp Phe Lys Glu Pro100 105 110Ala Leu Ala Leu Trp Asn Tyr Asn Pro Thr Thr Leu Glu Pro Ala Leu115 120 125Phe Gly Glu Arg Ala Arg Val Pro Leu Lys Pro Phe Ala Gly Thr Ile130 135 140Gly Val Ala Pro Ala Glu Lys Gly Leu His Ser Val Val Pro Pro Arg145 150 155 160Arg Val Gly Gly Asn Leu Asp Ile Arg Asp Leu Ala Ala Gly Thr Thr165 170 175Leu Tyr Leu Pro Ile Glu Val Glu Gly Ala Leu Phe Ser Ile Gly Asp180 185 190Thr His Ala Ala Gln Gly Asp Gly Glu Val Cys Gly Thr Ala Ile Glu195 200 205Ser Ala Met Asn Val Ala Leu Thr Leu Asp Leu Ile Lys Asp Thr Pro210 215 220Leu Lys Met Pro Arg Phe Thr Thr Pro Gly Pro Val Thr Arg His Leu225 230 235 240Asp Thr Lys Gly Tyr Glu Val Thr Thr Gly Ile Gly Ser Asp Leu Trp245 250 255Glu Gly Ala Lys Ala Ala Leu Ser Asn Met Ile Asp Leu Leu Cys Gln260 265 270Thr Gln Asn Leu Asn Pro Val Asp Ala Tyr Met Leu Cys Ser Ala Cys275 280 285Gly Asp Leu Arg Ile Ser Glu Ile Val Asp Gln Pro Asn Trp Val Val290 295 300Ser Phe Tyr Phe Pro Arg Ser Val Phe Glu305 310
权利要求
1.编码一种对映选择性酰胺酶的核酸序列，所述酰胺酶的氨基酸序列与SEQ ID NO2具有至少70％的同一性。
2.编码一种对映选择性酰胺酶的核酸序列，所述核酸优选能在中等严格条件下与(i)SEQ ID NO.1，(ii)包括SEQ ID NO.1的基因组DNA序列或(iii)(i)或(ii)的互补链杂交。
3.编码具有SEQ IDNO.2的氨基酸序列的对映选择性酰胺酶的核酸序列，在所述氨基酸序列的大约15或更少的氨基酸位置上具有改变，其中，所述改变独立地是(i)氨基酸的插入(ii)氨基酸的缺失(iii)氨基酸的取代。
4.编码一种对映选择性酰胺酶的核酸序列，所述对映选择性酰胺酶表现出与抗SEQ ID NO2的氨基酸序列片段的抗体的免疫学交叉反应性。
5.编码一种对映选择性酰胺酶融合蛋白的核酸序列，它由可操作地与一种或多种编码标记多肽的核酸序列连接的编码权利要求1-4中任意一项的多肽的核酸序列组成。
6.包括权利要求1-5中任意一项的核酸序列的载体。
7.正常情况下不具有权利要求1-5中任意一项的核酸序列的宿主细胞，它包括权利要求1-5中任意一项的核酸序列，优选包括权利要求6的载体。
8.用于制备权利要求1-5中任意一项的核酸序列的表达产物的方法，其中，在第一个步骤中，将所述核酸序列导入合适的宿主中，并且，其中，所述核酸序列随后在所述宿主中表达。
9.包括分批和补料阶段的用于在发酵培养基中对微生物进行发酵的方法，其中，所述微生物表达权利要求1-5中任意一项的核酸，并且，其中，在发酵期间向每升发酵培养基中添加0.5-50毫克的Zn2+。
10.用于制备对映体富集的羧酸和/或对映体富集的羧酸酰胺的方法，其中，在存在0.01mM-100mM Zn2+的条件下，让相应的D-和L-羧酸酰胺的混合物与权利要求1-5中任意一项的表达产物接触，以便所述羧酸酰胺的一种对映体被对映体选择性地水解，从而形成相应的对映体富集的羧酸，而所述羧酸酰胺的另一种对映体保持不变。
全文摘要
本发明涉及编码一种对映选择性酰胺酶的核酸序列，该酰胺酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.2具有至少70％的同一性，本发明还涉及一种包括包括分批和补料阶段的用于在发酵培养基中对一种微生物进行发酵的方法，其中，所述微生物能表达本发明的核酸，并且，其中，在发酵期间，在每升发酵培养基中补充0.5－50毫克的Zn
文档编号C12N1/21GK1555416SQ02818136
公开日2004年12月15日 申请日期2002年7月15日 优先权日2001年7月23日
发明者T·桑科, R·F·坦德勒, C·G·N·科雷瓦尔, F·B·J·阿塞马范, R·珀范德, J 阿塞马范, N 科雷瓦尔, T 桑科, 兜, 坦德勒 申请人:Dsm Ip 财产有限公司