专利名称：一种构建转基因大型海藻的方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种构建转基因大型海藻的方法。
背景技术：
大型海藻是藻胶(琼脂、卡拉胶、褐藻酸等)生产的主要来源，目前已经实现大规模人工栽培的大型海藻包括红藻(紫菜、江蓠、石花菜、麒麟菜)、绿藻(石莼)与褐藻(海带、裙带菜)，全球栽培面积达3百万亩，年产量达635万吨鲜重，除部分作为营养食品外，主要用于藻胶的提取。近年来，由于对藻胶产量与质量改进的需求迅速提高，基因工程技术被引入大型海藻的研究领域，用于定向改造海藻种质。转基因大型海藻还可用于外源高值产品的表达生产以及海洋环境的修复。
现有的构建转基因植物的成熟技术均是针对高等植物的，主要采用的技术工艺流程为1.转化方法利用农杆菌Ti质粒系统导入外源基因，或利用电击法向原生质体内导入基因，或利用基因枪法向组织细胞中导入基因；2.载体元件广泛使用高等植物来源的启动子(如CaMV35S)用于驱动外源基因的表达；3.转化受体及植株再生利用了植物细胞的全能性，或培养原生质体再生植株，或诱导组织去分化形成愈伤组织，再诱导愈伤组织分化并再生植株；4.筛选标记大多以Npt II基因为选择标记基因，通过卡那霉素或新霉素筛选，获得转基因植株。
大型海藻是生活在海洋环境中的低等植物，不同于上述高等植物，表现在1.转化方法不具有类似于农杆菌的转化系统；2.载体元件至今未克隆到自身启动子；3.转化受体及植株再生不同种类的细胞及组织培养研究差别大，个别种类(如紫菜)能实现原生质体再生植株，很多种类(如海带、裙带菜)的原生质体难以再生植株，组织培养再生植株的效率也很低；4.筛选标记大型海藻敏感的抗生素种类及敏感程度不同于高等植物。
目前绝大多数研究完全借鉴高等植物的技术，利用大型海藻的组织切块或原生质体为转化受体，仅实现了外源基因的瞬间表达，在原生质体再生的新植株中未检测到外源基因的稳定表达；由于只使用了一种高等植物来源的启动子(CaMV35S)，效率较低；大型海藻对抗生素的敏感性实验尚未涉及。
发明内容
针对上述技术难点，根据大型海藻的生活史特点，经过多年研究，本发明的目的是提供一种效率高、能实现外源基因稳定表达的构建转基因大型海藻的方法。
为实现上述目的，本发明技术方案如下将报告性外源基因重组于或将功能性外源基因与抗生素或除草剂抗性基因融合后重组于高等植物或藻类来源的启动子下游，构建成转化用的载体。以大型海藻的孢子为转化受体，用基因枪将重组后的质粒DNA导入大型海藻的孢子中，经自然发育途径生成新植株；采用功能性外源基因途径生成新植株后可经筛选获得抗生素或除草剂抗性的转基因大型海藻；并可进一步获得外源基因产品(例如表达的疫苗、防御素、抗体、药物蛋白)。
其中所述功能性外源基因为藻胆蛋白基因、生长因子基因、抗体基因、疫苗基因、防御素基因或抗菌肽基因等；所述抗性基因为cat基因、hpt基因或bar基因；所述抗生素为氯霉素或潮霉素，所述除草剂为草丁膦；所述的启动子为SV40启动子、CaMV35S启动子、ubiquitin启动子或藻类自身fcp启动子等；其中选择标记基因-选择压力组合为cat基因-氯霉素、hpt基因-潮霉素或bar基因-草丁膦。
与现有技术相比，本发明属全面的创新，具有如下有益效果1、本发明在所用转化方法上，采用的基因枪法虽然是适用范围广且可实现透过细胞壁转化的通用方法，但本发明首创性地将大型海藻的孢子作为基因枪新的应用领域。
2、本发明在载体元件上，广泛试验并验证了多种高等植物来源及微藻来源启动子在大型海藻中的有效性，极大拓展了大型海藻中可应用启动子的范围。
3、在所用转化受体上，本发明采用大型海藻孢子作为转基因的受体以获得纯系转基因大型海藻是本发明的第二个独创之处。很多可人工栽培的大型海藻都建有孢子阶段的纯培养种质库，如海带、裙带菜的雌、雄配子体，紫菜的丝状孢子体，从单个孢子细胞生成新植株的技术也已具备，从而为海藻孢子介导转化方式的实施提供了可靠的材料来源。
4、在筛选标记方面，本发明的实验证明大型海藻中海带、裙带菜对氯霉素敏感，对潮霉素更加敏感，对草丁膦极敏感，采用三种可行的选择标记基因-选择压力组合(cat基因-氯霉素、hpt基因-潮霉素、bar基因-草丁膦)是本发明的又一技术特点。
5、本发明能实现外源基因的稳定表达，lacZ报告基因转化海带雄配子体，在受精发育的二倍体孢子体中检测到转化率最高可达50％，表达率可达30％。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明的方法及该方法所达到的效果作进一步详细说明。
实施例1用报告基因实证对海带雌配子体有效采用fcp启动子(来自海洋硅藻的墨角藻黄素叶绿素a/c结合蛋白基因)-GUS报告基因质粒，基因枪法转化海带雌配子体，在孤雌生殖的海带孢子体中检测到GUS基因的稳定表达。具体工艺流程如下
1.基因枪微粒子的制备称取60mg金粉(美国Bio-Rad公司基因枪配套耗材，直径1.0μm)，加入1ml无水乙醇，剧烈振荡1分钟；10000转/分离心10秒，除去上清液；加入1ml无菌水重新悬浮、离心分离去上清液，共重复3次，最后将金粉悬浮于1ml无菌水中，按每份50μl进行分装，4℃存放备用。
转化时取1份(1份是50μl)转移到1.5ml离心管，连续振荡过程中依次加入5μl DNA(1μg/μl)、50μl CaCl2(2.5mol/L)、20μl亚精胺(0.1mol/L)，振荡3分钟；10000转/分离心10秒，弃上清液；250μl乙醇漂洗，离心去上清，重复1次；60μl无水乙醇重悬金粉。
2.海带雌配子体的转化转化前1-2天，取2片无菌载玻片轻柔对磨海带丝状雌配子体，使其松动散开并断裂，至镜检每段配子体不超过5个细胞；用血球计数板计数，遮光恢复培养备用。转化时用圆形无菌筛绢(400目，直径4cm)做为靶细胞的承载体，将雌配子体均匀平铺于中央，形成直径约2cm的圆形有效轰击范围，作为样品。每个样品轰击一次，每次轰击约用12μl金粉悬浮液，转化1.0×106雌配子体细胞。
转化用高压氦气式基因枪(型号PDS1000/He)为美国Bio-Rad公司产品，轰击过程在无菌室或超净台中进行；操作台面、基因枪表面及内部均用70％乙醇擦拭消毒，轰击用耗材为可裂膜(Rupture disk)、DNA载片(Macrocarrier)与阻挡网(Stopping screen)，预先在70％无水乙醇中浸泡20分钟，紫外灯下晾干待用；转化参数为受体细胞距离阻挡网6.0cm，真空度28(英寸汞柱)。
另设用不含质粒DNA的金粉轰击的对照组，操作方法相同。
3.转化后的培养转化后，将转化组和对照组的海带雌配子体转入含铁海水培养基(消毒海水配制，含NaNO30.71mmol/L；KH2PO40 0.032mmol/L；柠檬酸铁0.0019mmol/L；VB120.5μg/L)，培养温度10.0±0.5℃，光暗周期10h/14h，光强约为100μmol·m-2·s-1；孤雌生殖海带出苗后仍采用该培养基培养、同样培养条件，每周更换一次。
4.GUS基因的整合与表达检测采用标准的组织化学原位染色方法在孤雌再生海带孢子体中检测到GUS基因的表达，PCR扩增得到阳性结果，提示GUS基因已发生整合。而用不含质粒DNA的金粉轰击的对照组未检测到基因表达。
其中外源基因是指转化受体生物以外来源的基因，既包括用于转化体系建立的报告基因，还包括编码特殊功能蛋白质或多肽的基因，如疫苗、抗体等蛋白药物基因；本实施例中外源基因采用一种报告基因；启动子是指一段特殊的核苷酸序列，驱动外源基因的表达。
实施例2用报告基因证明对海带雌雄配子体都有效(实施例1与2是孢子介导的方法学证明)
采用SV40启动子-lacZ报告基因质粒，用基因枪法分别转化海带雌、雄配子体，在受精发育的海带二倍体孢子体中检测到lacZ基因的稳定表达。
转化微粒子的制备及转化操作同实施例1，海带雌、雄配子体的制备过程相同，具体参照实施例1中步骤2。其他步骤为3.转化后的培养转化后，将转化组和对照组的海带雌配子体转入含铁海水培养基，营养盐配方及培养条件同实施例1，分别取未转化的雌配子体与转化的雄配子体等量混合，取未转化的雄配子体与转化的雌配子体等量混合；二倍体海带幼孢子体出苗后仍采用该培养基培养、同样培养条件，每周更换一次。
4.lacZ基因的整合与表达检测采用标准的组织化学原位染色方法在两种途径生成的海带二倍体幼孢子体中均检测到lacZ基因的表达；其中，雄配子体途径的转化率为50％，表达率(阳性个体中的染色面积占叶片总面积的百分比)约30％，较雌配子体途径(转化率20％，表达率4-5％)有很大提高，同时雄配子体途径中1.9％的个体表现为均一性表达，提示lacZ基因的整合发生在单细胞阶段。PCR扩增得到阳性结果，提示lacZ基因已发生整合。
实施例3延伸到应用，同时使用了外源基因与选择标记基因采用SV40启动子-cat选择标记基因-HBsAg基因(编码乙肝病毒表面抗原)质粒，基因枪转化海带雄配子体，经氯霉素筛选，在受精发育的海带二倍体孢子体中检测到HBsAg基因的稳定表达。
其中转化微粒子的制备、海带雄配子体的制备及转化操作同实施例1，转化后的培养同实施例2。其他步骤为3.氯霉素的筛选转化后，当受精发育的海带二倍体孢子体体长达到约2cm时进行氯霉素筛选。向灭菌烧杯中加入海带、N-P营养海水和氯霉素，氯霉素浓度按梯度增加，1-2天为20μg/ml，3-7天为50μg/ml，每天更换一次筛选培养液。
4.HBsAg基因的整合与表达检测应用定量ELISA方法对总共38个样品进行HBsAg定量检测，阳性率为34.21％，即在13株转基因海带二倍体幼孢子体中检测到表达，平均表达量约为0.465μg/(mg可溶性蛋白)，最高表达量约为1.2μg/(mg可溶性蛋白)。PCR扩增得到阳性结果，提示HBsAg基因已发生整合。
5.转HBsAg基因海带的应用有研究表明口服免疫的疫苗用量与注射免疫用量相差不大，一个成人的乙肝疫苗注射量为15μg，只相当于约2.5g转基因海带鲜重的表达水平，提示应用本发明技术获得的转基因海藻具有较高的应用潜力。
筛选标记，也可称为选择标记基因，特指一种抗生素或除草剂的抗性基因，携带标记(即获得成功转化)的植物会在相应的抗生素或除草剂压力下表现抗性而存活，未携带标记的植物则会死掉以达到筛选的目的；本实施例中的外源基因是疫苗基因，选择标记基因是cat基因。
实施例4延伸到应用，同时使用了外源基因与选择标记基因采用SV40启动子-hpt选择标记基因-防御素基因质粒，基因枪转化海带雌配子体，经潮霉素筛选，在存活的孤雌生殖海带孢子体中PCR检测到防御素基因的整合。
其中转化微粒子的制备、海带雌配子体的制备、转化操作及转化后的培养同实施例1，不同步骤是潮霉素的筛选。转化后，当孤雌生殖海带孢子体的体长达到约1-2cm时进行潮霉素筛选。向灭菌烧杯中加入海带、N-P营养海水和潮霉素，潮霉素浓度为50μg/ml，每星期更换一次筛选培养液。
实施例5用报告基因证实在裙带菜中有效采用SV40启动子-lacZ报告基因质粒，基因枪分别转化裙带菜雄配子体，在雄配子体丝状体及受精发育的裙带菜二倍体孢子体中均检测到lacZ基因的稳定表达。
其中转化微粒子的制备、裙带菜雄配子体的制备及转化操作同实施例1，转化后的培养同实施例2；采用标准的组织化学原位染色方法在裙带菜雄配子体及二倍体幼孢子体中均检测到lacZ基因的表达。其中，在幼孢子体中的表达率接近70％，PCR阳性结果提示lacZ基因已发生整合。
本发明所述功能性外源基因还可以为藻胆蛋白基因、生长因子基因、抗体基因或抗菌肽基因等；所述抗性基因亦为bar基因；所述抗生素亦为除草剂草丁膦；所述的启动子也可采用CaMV35S启动子或ubiquitin启动子等；其中选择标记基因-选择压力组合也可采用bar基因-草丁膦；报告基因还可选用luc报告基因或GFP报告基因等。
权利要求
1.一种生产转基因大型海藻的方法，其特征在于将报告性外源基因重组于或将功能性外源基因与抗生素或除草剂抗性基因融合后重组于高等植物或藻类来源的启动子下游，构建成转化用的载体，以大型海藻的孢子为转化受体，用基因枪将重组后的质粒DNA导入大型海藻的孢子中，经自然发育途径生成新植株。
2.按照权利要求1所述生产转基因大型海藻的方法，其特征在于采用功能性外源基因途径生成新植株后可经筛选获得抗生素或除草剂抗性的转基因大型海藻。
3.按照权利要求1或2所述生产转基因大型海藻的方法，其特征在于所述功能性外源基因是藻胆蛋白基因、生长因子基因、抗体基因、疫苗基因、防御素基因或抗菌肽基因。
4.按照权利要求1或2所述生产转基因大型海藻的方法，其特征在于所述的启动子为SV40启动子、CaMV35S启动子、ubiquitin启动子或藻类自身fcp启动子。
5.按照权利要求1或2所述生产转基因大型海藻的方法，其特征在于所述抗性基因是cat基因、hpt基因或bar基因。
6.按照权利要求1或2所述生产转基因大型海藻的方法，其特征在于所述抗生素为氯霉素或潮霉素。
7.按照权利要求1或2所述生产转基因大型海藻的方法，其特征在于所述除草剂为草丁膦。
8.按照权利要求1或2所述生产转基因大型海藻的方法，其特征在于所述的转化方法是直接转化方法中的基因枪法或电击法。
9.按照权利要求1或2所述生产转基因大型海藻的方法，其特征在于其中选择标记基因-选择压力组合是cat基因-氯霉素、hpt基因-潮霉素或bar基因-草丁膦。
10.按照权利要求1所述生产转基因大型海藻的方法，其特征在于其中所述报告基因为GUS报告基因、lacZ报告基因、luc报告基因或GFP报告基因。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种生产转基因大型海藻的方法。它将报告性外源基因重组于或将功能性外源基因与抗生素或除草剂抗性基因融合后重组于高等植物或藻类来源的启动子下游，构建成转化用的载体，以大型海藻的孢子为转化受体，用基因枪将重组后的质粒DNA导入大型海藻的孢子中，经自然发育途径生成新植株；采用功能性外源基因途径生成新植株后可经筛选获得抗生素或除草剂抗性的转基因大型海藻。采用本发明能实现外源基因的稳定表达。
文档编号C12N15/82GK1524955SQ0311106
公开日2004年9月1日 申请日期2003年2月26日 优先权日2003年2月26日
发明者秦松, 姜鹏, 于道展, 李富超, 孙国琼, 秦 松 申请人:中国科学院海洋研究所