专利名称：一种新琼四、六糖的制造方法
技术领域：
本发明涉及一种琼胶寡糖，特别是涉及一种新琼四、六糖的制造方法。
一种新琼四、六糖的制造方法，包括将琼脂糖水解为不同大小的新琼寡糖，并用色谱分离不同聚合度的新琼寡糖，其特征在于所述的水解使用的琼胶酶由大肠杆菌重组株DH5α-pET24-agaA表达。
本发明使用的琼胶酶为转基因产物，可大量获得，酶解产物85％-95％集中于聚合度为4、6的新琼寡糖，作用时间短，条件温和，成本低廉，适于大规模生产。
1 能高效表达琼胶酶的大肠杆菌重组株DH5α-pET24-agaA的构建根据琼胶酶基因agaA全序列设计上游引物(5’GGAATTCCATATGAAAGGATTCACTAAG3’)和下游引物(5’CCGCTCGAGCTGGAATTTAAAACGTTG3’)，以假别单胞菌CY24的总DNA为模板，利用PCR扩增得到琼胶酶基因全序列。该PCR的条件为94℃预变性3min，随后以94℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 60s进行30个循环，最后在72℃延伸10min。琼脂糖电泳显示1.36kb处有一特异条带，将其从琼脂糖凝胶上切下回收后与将大肠杆菌表达载体pET-24a(+)连接，按照标准的氯化钙法将连接产物转入大肠杆菌E.coli DH5α中，筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子。用标准的碱裂解法提取质粒，经NdeI和XhoI酶切得到1.36kb和5.3kb两个片段，分别与琼胶酶基因agaA全长片段与表达载体pET-24a(+)大小相同，证明琼胶酶全长序列已克隆到表达载体pET-24a(+)中，获得了能高效表达琼胶酶的大肠杆菌重组株DH5α-pET24-agaA。
2 琼胶酶的制备挑取上述的大肠杆菌重组株DH5α-pET24-agaA单克隆接种在2ml含有浓度为30μg/ml卡那霉素的液体LB培养基中，37℃ 200r/min振荡培养过夜。按1∶50的体积比接种至100ml含有浓度为50μg/ml卡那霉素的液体LB培养基中，37℃ 200r/min振荡培养至OD600为0.4-1.0，加入IPTG至终浓度为1mM，继续培养3h，4℃ 5000×g离心30min收集上清液。于冰水浴中逐步加入饱和度为60％的固体硫酸铵粉末，并加转子搅拌，加完后继续搅拌1小时，于12000×g，4℃离心15min，收集沉淀用原发酵液十分之一体积的0.2M磷酸盐缓冲液(pH7.0)溶解即得琼胶酶酶液，保存于-20℃。
3 新琼四、六糖的制造将琼脂糖用水配成重量百分浓度为0.1-0.5的溶胶，加入0.5％-2％(体积百分比)上述琼胶酶酶液，于25℃-40℃温育1-12小时，于4℃过夜后以10000×g，4℃离心10min，将上清液过孔径为0.22μm或0.45μm微孔滤膜，旋转蒸发至干后用0.2-0.5M碳酸氢氨水溶液溶解，在Bio-Gel-P2上进行色谱分离，洗脱缓冲液为0.2-0.5M碳酸氢氨水溶液，得到不同聚合度的新琼寡糖，经分别脱盐、冻干后，即为本发明的寡糖产品，其中新琼四糖产率为30％，新琼六糖产率为32％，纯度均达95％以上。
权利要求
1.一种新琼四、六糖的制造方法，包括将琼脂糖水解为不同大小的新琼寡糖，并用色谱分离不同聚合度的新琼寡糖，其特征在于所述的水解使用的琼胶酶由大肠杆菌重组株DH5α-pET24-agaA表达。
2.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于将所述的琼脂糖配成0.1％-0.5％的溶胶，加入琼胶酶酶液后于水浴中反应。
3.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于所述的一琼胶酶为转基因琼胶酶的初步纯化产物，其用量为琼脂糖溶胶体积的0.5％-2％。
4.如权利要求1所述的制造方法，所述的色谱分离以Bio-Gel-P2为填料，以碳酸氢氨为洗脱液。
5.如权利要求1所述的制造方法，其特征是所述的酶解反应温度为25℃-40℃，反应时间1-12小时。
全文摘要
一种新琼四、六糖的制造方法，包括将琼脂糖水解为不同大小的新琼寡糖，并用色谱分离不同聚合度的新琼寡糖，其特征在于所述的水解使用的琼胶酶由大肠杆菌重组株DH5α－pET24－agaA表达。本发明使用的琼胶酶为转基因产物，可大量获得，酶解产物85％－95％集中于聚合度为4、6的新琼寡糖，作用时间短，条件温和，成本低廉，适于大规模生产。
文档编号C12P19/04GK1472328SQ03112579
公开日2004年2月4日 申请日期2003年6月17日 优先权日2003年6月17日
发明者于文功, 李京宝, 褚艳, 韩峰, 路新枝, 宫倩红 申请人:中国海洋大学