专利名称：巴曲酶基因的合成及其表达产物的纯化制备的制作方法
技术领域：
本发明是有关采用重组DNA技术生产一种源于蝮蛇属毒蛇毒液中的巴曲酶(Batroxobin)蛋白，特别是巴曲酶基因的合成、表达以及表达产物的纯化制备和性质确证。
背景技术：
1963年奥地利学者Von Klobusitzky从巴西矛头蛇(Bothrops atrox)毒液中分离得到一种丝氨酸蛋白水解酶，也就是所谓的巴曲酶。从那以后，研究者已经从蝮蛇属不同毒蛇的毒液中得到了不下于二十种丝氨酸蛋白酶类分子，它们都能够酶切哺乳动物的血浆纤维蛋白原，使之转变为纤维蛋白，从而影响动物的出血-凝血过程。在这些蛋白酶中，尤其对巴曲酶的物理、化学性质与临床应用研究的较为清楚(Stocker K.，Barlow G.H.，Methods Enzymol.45214～223，1976)。
巴曲酶的特异性作用底物是纤维蛋白原，与凝血酶不同的是，它只切割纤维蛋白原的A链，而不作用B链。当它水解血浆纤维蛋白原A链中的Arg16-Gly17位肽键时，能够释放出纤维蛋白肽A，从而快速地将血液中的纤维蛋白原转变成纤维蛋白，接着这些纤维蛋白就能聚集成疏松的易于被纤维蛋白酶水解的血栓来封闭伤口，实现快速止血的功效。不过，在使用较大剂量的时侯，巴曲酶有降低血中纤维蛋白原浓度，改善血液黏度和血液的流体力学特性，从而起到降纤酶的功效(US Pat.No3849252，1974)。基于这样一些生物化学特性，巴曲酶已经被成功地开发成止血药(商品名Reptilase或Hemocoagulase)和降纤药(商品名Defibrase)。在欧洲，巴曲酶正在替代人凝血酶作为止血药物。
在国内，考虑到其分子的功能有类似凝血酶(Thrombin)之处，现中译名称为‘血凝酶’。早先也有‘蝮蛇血凝酶’、‘蛇凝血素酶’等说法。由沈阳赛诺、长春斯达、北京赛生和蓬莱华泰四家制药公司联合研制的‘立止血’仿制品‘巴曲亭’也已于2001年8月开发成功，该药(保护期为2001.8.21～2007.8.21)也是从蛇毒中提取制备而成。不过需要说明的是，根据英国药典(增补版)(MARTINDALE The Extra Pharmacopoeia，Thirty-first Edition，Edited by James E F Reynolds，Royal Pharma-ceutical Society，London，1996，P756)和默克索引(The Merck Index，1989，P1017)中描述，商品名为Reptilase(中文商品名为“立止血”)或Hemocoagulase的药物，其主要成分是巴曲酶，另外还含有凝血因子X激活物(Factor-X Activator，例如，RVV-X蛋白等成分)。
虽然研究者对巴曲酶的性质有了比较多的了解，但是，对这种蛇毒成分的分子生物学研究一直进展缓慢，直到1987、1988年才由日本的研究者完成对巴曲酶基因的cDNA和基因组DNA测序工作(Nobuyuki Itoh etalJ.Biol.Chem.262(7)3132～3135，1987；J.Biol.Chem.，2637628～7631，1998)。1991年日本藤泽制药公司(Fujisawa Pharmaceutical)的研究者采用基因重组方法，在E.coli中，采用融合表达系统，以包涵体(Inclusion Body)的形式表达出该成分，再通过制备电泳和凝血酶切割开融合蛋白的方法据报道得到所谓有生物学活性巴曲酶(Maeda M etal，J Biochem(Tokyo)，109(4)632-637，1991)，而且还为此申请了专利(Pat.No.JP2124092，1990)。但是，自此后，只有从蛇毒中提取制备的巴曲酶用于治疗多种临床适应症(如，心肌梗死、老年痴呆、中风、突发性耳聋等等)的专利(USPat.No5595974，5869044，6106830，6399576，6416717；Eur.Pat.No0984279，0826374，0750912，0719791)和研究报告，再也没有重组巴曲酶用于动物试验和临床研究工作的任何相关研究报导。目前，国内对于巴曲酶药效学方面的研究报道颇多，尚未见对该成分进行重组表达的文献或报告。
巴曲酶蛋白虽然只有一条肽链，但是由于分子内二硫键多，还有糖基化修饰等，所以采用基因工程手段生产这种蛋白有很大的技术难度。这也应该是这一直没有重组产品问世的主要原因之一。
成熟的巴曲酶分子是由231个氨基酸残基组成的单链蛋白，理论计算出其分子量为25.5kD，等电点为7.39，国外从Bothrops atrox毒液中生物提取的巴曲酶的实际分子量为42kD，这种分子量的偏差是由于糖基化修饰缘故。从巴曲酶蛋白质一级结构中可以发现，其分子内有两个N-糖基化位点Asn146-Asn147-Thr148和Asn225-Lys226-Thr228。此外，Bothrops atrox的其它亚种以及其它种类毒蛇的毒液中也能提取到具有巴曲酶活性的蛋白，不过其分子量从29.1kD到42kD不等，这可能是由于不同亚种之间氨基酸组成上差别或糖基化的程度不同所引起的。巴曲酶分子中有12个半胱氨酸，根据已知的丝氨酸蛋白酶类分子的研究结果，推测这12个半胱氨酸可能有Cys7-Cys139、Cys26-Cys42、Cys74-Cys230、Cys118-Cys184、Cys150-Cys168和Cys174-Cys199这六种分子内二硫键的形成。考虑到从蛇的毒液中提取巴曲酶的生产成本以及进一步研究其结构的需要，我们采用基因工程的方法生产重组巴曲酶。
采用基因工程的手段生产富含二硫键的蛋白一直都是一个技术难题，尤其是生产有多对二硫键的丝氨酸蛋白水解酶类分子。这是因为二硫键配对错误率很高，在原核中得到的几乎全是包涵体，虽然通过对包涵体的变性-复性能得到少量有活性的目的蛋白，但是其成本决定了不具备实际生产意义。真核细胞表达系统(酵母、CHO和昆虫细胞等)中能保证较高二硫键配对正确率，因此本专利是采用甲醇酵母系统。我们在甲醇酵母(Pichiapastoris，Pichia methanolica)中成功地表达出了有生物学活性的巴曲酶蛋白，产量能达到每毫升发酵液20克氏单位(20KU/ml)，这一产量已经初步具备生产意义。
根据美国Genebank中公开的巴曲酶(X12747)的氨基酸序列资料，选择酵母或E.coli都能较喜好的遗传密码子，人工合成巴曲酶全基因序列，分别将该基因插入到E.coli表达载体(如pET、pGEX类载体，用IPTG诱导；或pLY、PBV200载体，用热诱导；pLEX载体，用色氨酸诱导)中进行融合或非融合表达的研究；或插入到Pichia pastoris的分泌型表达载体pPIC9，pPIC9K，pPICZa类载体或pPIC3K类胞内表达载体，或插入到Pichia methanolica的分泌型表达载体pMETa类载体或pMET类胞内表达载体中进行分泌表达的研究。另外，也完全采用甲醇酵母喜好的密码子人工全合成巴曲酶基因，比较研究了这两个巴曲酶基因在表达产量上的差别。
虽然在E.coli中表达某些蛋白已经是较为常规的生产药用蛋白的基本手段，但是在对巴曲酶蛋白的实际研究中发现，无论采用融合(同GST、Trx或Nus融合)或是非融合表达(N端多一个蛋氨酸)巴曲酶蛋白，所得到的都是不溶的、无活性的包涵体，虽然表达量可以达到比较高的水平(约占菌体总蛋白的20～30％)。将表达载体转入Novagen公司新推出的适合表达多二硫键蛋白的宿主菌AD494和Origami中也无济于事。这种包涵体经变性-复性过程后，得到的可溶性蛋白并没有检测到任何活性。
巴曲酶一级结构中有三个可能的酵母膜蛋白酶Kex2敏感位点(Arg44-Arg45、Lys77-Lys78-Lys79、Arg203-Lys204)，一般情况下，这会可能会导致分泌的目的蛋白发生降解，降低有效表达量，从诱导后的上清中的确发现有降解的蛋白条带。不过通过优化发酵过程中的一系列条件，最终目的蛋白的表达量还是能够满足规模化生产需要的(图3)。所以，我们选择在在甲醇酵母Pichiapastoris和Pichia methanolica中对巴曲酶的高效表达。
发明内容
1.巴曲酶基因(Batroxobin gene，Bg)的合成、测序以及表达载体的构建为使目的基因能插入pPICZaA或pMETaA载体，在Bg的5`-端添加限制酶XhoI的切点，3`-端添加TAA TGA双终止密码以及NotI切点，另在XhoI切点与巴曲酶蛋白N-端第一个氨基酸Val密码子之间加入KEX2蛋白酶识别序列Lys-Arg对应的密码子AAA AGA，这就确保目的蛋白在分泌到发酵上清液中时能够顺利地切除a-信号肽(图1)或巴曲酶自身的信号肽序列，使工程菌表达的巴曲酶具有同蛇毒中提取的该蛋白一样的N-端氨基酸序列。
基因的拼接过程采用递归式PCR(Recursive PCR)方法，将最终PCR产物柱回收，经XhoI、NotI双酶切，再胶回收符合设计Bg长度的DNA片段，插入到pPICZaA或pMETaA载体中(图2)，挑选LZ(LB+25ug/mlZeocin)平板上的单克隆，LZ培养基液体培养，提取质粒，XhoI-NotI双酶切筛选含有Bg长度的克隆6个，用进行a-factor priming和3`-AOX1priming测序引物分别从Bg基因的5`-端和3`-端进行测序，最终得到一个完全合乎原设计要求的克隆，该克隆中含有表达载体pPICZaA-Bg可以用来转化Pichia pastoris X-33和GS115His+宿主菌。
将测序正确的Bg基因从pPICZaA-Bg表达载体中用XhoI-NotI双酶切切出，再转插入pMETaA载体的XhoI-NotI限制酶位点之间，构造pMETaA-Bg表达载体，该表达载体用来转化Pichia methanolica PMAD11宿主菌。碱解法大量制备上述两种表达质粒载体，供转化酵母之需。
2.巴曲酶的表达及表达产物的活性测定
1.1.pPICZaA-Bg线性化后转化Pichia pastoris X-33用DNA限制性内切酶SacI将pPICZaA-Bg线性化，按照Invitrogen公司P.methanolica Expression Kit Version B中的方法(P21～23)制备酵母宿主菌的感受态并进行电转化，将转化后的细胞铺在YPD+500ug/ml Zeocin琼脂糖平板(1％Yeast extract，2％Polypeptone，2％Glucose，1.5％Agar，500ug/ml Zeocin)上铺板，30℃下放置3～4天，可见有酵母单克隆长出。在500ug/ml～600ug/ml Zeocin浓度条件下，平均每个转化约有200～400个克隆不等。如果将Zeocin的浓度减低，克隆数将极成倍增加，采用此方法进行的电转时，用500～600ug/ml的Zeocin，也适合该表达载体插入其他基因。挑选菌落大而饱满的克隆进行表达筛选。
2.2.pMETaA-Bg线性化后转化Pichia methanolica PMAD11用DNA限制性内切酶KpnI将pMETaA-Bg线性化，采用与上相同的方法，转化PMAD11(Pichia methanolica)，并将转化后的酵母在MD琼脂糖(1.34％YNB，4×10-5％Biotin，2％Glucose，1.5％Agar)平板上铺板，30℃下放置3～4天，待长出单克隆后，转入4℃～8℃下放置3~4天，可见有少量酵母单克隆微微带点红色，这是转化不成功的，仅挑大而饱满呈乳白色的克隆进行表达筛选。平均每个转化大约克得到500～1000个克隆。
2.3.工程菌的筛选将上述2.1、2.2中得到的克隆按照Invitrogen公司操作手册中要求进行表达、筛选，得到高表达的菌株。
2.4.表达产物的活性测定参照从蛇毒中提取的巴曲酶的测活方法，用加入了柠檬酸钠的人标准血浆可以对发酵上清液中表达出的酶活性进行测定，这即可以对克隆进行筛选，也可以对工程菌的产量高低进行测评。具体测定活性的标准就是37℃下，将100ul的发酵上清液加入到300ul含柠檬酸钠的人标准血浆中，混匀后，观察凝固所需的时间。
本专利中巴曲酶的表达产量和纯化中各阶段的活力测定均用使血浆凝固所用的分钟数表示，其含义是100ul的发酵液或含巴曲酶的溶液使300ul的人标准血浆凝固所需时间。
3.巴曲酶工程菌的上罐发酵及表达产物的纯化制备3.1工程菌的上罐发酵用在试管中筛选出的高表达的工程菌(表达量为15～20mins)，接种到摇瓶中增殖作为种子液，再转接至30L发酵罐，按甲醇酵母发酵的常规方法进行中试规模的发酵。诱导50小时后，表达量为40secs～1min。
3.2发酵上清液的纯化制备将发酵上清液大体积稀释或超滤浓缩脱盐，使上样液的PH和离子强度(即电导率)适合离子交换层析的要求。第一步进行阳离子交换层析，我们选择强阳离子交换介质，洗脱出的目的蛋白再上样至强阴离子交换介质，最后经过一步分子筛，即可以得到纯度合乎要求的巴曲酶(见图3)。
图1巴曲酶基因同信号肽序列之间连接关系SEQ-2是适合在酵母和E.coli中表达的巴曲酶结构基因部分；SEQ-3是适合在酵母中高表达的巴曲酶结构基因部分；SEQ-5为巴曲酶天然信号肽序列所对应的DNA序列。Aa-信号肽同巴曲酶结构基因连接；B巴曲酶天然信号肽同其结构基因连接，中间插入了KEX2识别序列。
图2巴曲酶基因表达载体(pPICZaA-Bg)的构造图3巴曲酶蛋白的SDS-PAGE电泳1.未诱导时的发酵上清液；2.诱导72小时后的发酵上清液；3.纯化出的巴曲酶；M蛋白中分子量标准(LMW Marker Kit，Amersham Pharmacia Biotech)图4酶切除去巴曲酶的糖链A.未经PNGase F酶切处理的巴曲酶；B.PNGase F酶切处理1小时后的巴曲酶，其中B1条带是尚未切除糖链的，而B2条带是切去N-糖链的巴曲酶；M.蛋白中分子量标准(LMW Marker Kit，Amersham Pharmacia Biotech)具体实施方式
实施例1递归PCR法获得巴曲酶基因(Bg-EP；Bg-P)根据Genbank X12747中公布的巴曲酶蛋白的氨基酸序列，人工合成了巴曲酶的全基因。为了实现巴曲酶在不同宿主菌(E.cili和酵母)中的高效表达，分别合成了两种巴曲酶基因(SEQ-2，SEQ-3)一个是兼顾E.coli和甲醇酵母喜好密码子的巴曲酶基因(Bg-EP)，一个是完全选择甲醇酵母喜好密码子组成的基因(Bg-P)。利用DNA分析软件分析全长的Bg基因，将整个基因分割成22条片段，合成这些片段，每相邻引物间互补的粘端长度不低于15个碱基对，巴曲酶基因的5`-端引物上带有XhoI切点和Kex2识别序列氨基酸所对应的密码子，3`-端引物上带有双终止密码子(TAA和TAG)以及EcoRI切点。通过PCR法拼接Bg-EP和Bg-P基因。各引物片段之间连接次序参见图1。
实施例2巴曲酶基因Bg-EP、Bg-P的表达1.酵母中表达巴曲酶基因Bg-EP、Bg-PBg-EP插入到pPICZaA载体的多克隆位点Xho-NotI之间，转化Pichia pastoris宿主菌X-33。按照Invitrogen公司Pichia pastorisExpression Kit中的方法进行表达筛选。活性测定是利用巴曲酶能酶切纤维蛋白原，使含柠檬酸钠的人血浆凝固这一方法来进行的。挑取含500ug/ml抗生素Zeocin的YPD平板生长出的酵母菌落，实际总共筛选了80个克隆，表达量从40mins到15mins不等。将筛出的40min、30min、25min和15min的菌种上罐发酵，在甲醇诱导50hrs后，表达量差别并不显著。同样将Bg-P插入到pPICZaA中，所得到的工程菌表达产量同Bg-EP并没有显著的差别。单从表达产物的活性来看，Bg基因(Bg-EP、Bg-P)在酵母中的表达产量有明显的极限现象，试管中筛选出的40min产量和15min产量的菌种在发酵罐中的活性表达量差别不显著。虽然在相当于巴曲酶蛋白位置的条带明显变浓，但是活性没有增加。
2.E.coli中表达巴曲酶基因Bg-EP分别合成了Bg-EP基因的如下三条5`-端引物，它们分别带有BglII、BamH1和EcoRI酶切位点引物1(P1)5`-CATAGATCTAGAT GAT GAC GAT AAA GTT ATC GGT GGT GAT GAA TG-3`引物2(P2)5`-CATGGATCCGAT GAT GAC GAT AAA GTT ATC GGT GGT GAT GAA TG-3`引物3(P3)5`-CATGAATTCATG GTT ATC GGT GGT GAT GAA TG-3`以pPICZa-Bg-EP为模板，分别用上述三条5`-端引物与前面基因拼接时用的引物BP22，经过PCR就可以将变换基因两端的切点，把Bg-EP插入到不同的表达载体之中。上述三条引物中下划线的部分为DNA限制性内切酶识别序列，粗体字母部分为巴曲酶基因Bg-EP的5`-端互补配对序列，其中引物-1(P1)、引物-2(P2)的限制酶位点与Bg-EP之间为肠激酶(Enterkinase)识别序列，用肠激酶可以将以融合蛋白表达出的巴曲酶切开，释放出巴曲酶蛋白。引物-3(P3)的限制酶位点与Bg-EP间是蛋氨酸起始密码子，插入到载体中将产生N-端多一个蛋氨酸残基的巴曲酶蛋白。
2.1利用Novagen公司的PET系列表达系统以P1、BP22为引物，pPICZaA-Bg-EP质粒为模板，PCR出长度约为730bp的基因片段，经BglII-NotI双切后插入到同样经这两种酶双切的PET32a(+)载体中，转化感受态的NovaBlue宿主菌，双酶切筛选插入目的片段的克隆，用质粒抽提试剂盒抽提质粒，转化BL21(DE3)或Origami(DE3)，在LA+Agar板上铺板，挑阳性克隆接种到LA培养液增殖培养，IPTG诱导就可以表达出Trx-Batroxoboin融合蛋白。
2.2利用Amersham Pharmacia Biotech公司的pGEX系列表达系统以P2、BP22为引物，pPICZaA-Bg-EP质粒为模板，PCR出长度约为730bp的基因片段，经BamHI-NotI双切后插入到同样这两种酶切的pGEX4T-1中，直接转化BL21宿主菌，挑阳性克隆，接种到LA培养液中，用IPTG诱导，SDS-PAGE电泳检测表达出合乎理论大小融合蛋白的克隆，即是含有目的基因的工程菌。为进一步确认，可抽提质粒再双酶切，琼脂糖凝胶电泳验证。
2.3利用热诱导型表达载体pLY表达系统pLY表达载体是PBV系列载体的变异体，它最大的特点是带有cIt568，使表达载体对宿主菌没有特别的要求。用EcoRI，NotI双切pLY载体。以P3、BP22为引物，pPICZaA-Bg-EP质粒为模板，PCR出长度约为710bp的基因片段，经EcoRI、NotI双切后插入到上面处理过的pLY载体中，转化BL21，在LA培养液中增殖，43℃~45℃的条件下进行热诱导，SDS-PAGE电泳表达出分子量约为26kD蛋白条带的克隆就是筛选出的工程菌，从中抽提。
上述在E.coli中表达的产物都是包涵体蛋白，几乎没有可溶性的目的蛋白或目的蛋白融合蛋白。破菌液中未能测出巴曲酶活性。PET32a-Bg-EP表达载体表达的Trx-Batroxobin中含有His-Tag，可以采用Ni2+Chelating HP介质进行纯化。按照Life Science News 8，2001 Innovations Forum，AmershamPharmacia Biotech发布的包涵体纯化-复性方法，得到了可溶性融合蛋白，用肠激酶酶切后，释放出了目的蛋白，但是目的蛋白也没有活性。另外两种表达系统表达的产物也都如此。总之，未能在E.coli中表达出有活性巴曲酶蛋白。据此，推测日本藤泽制药公司的研究者所得到的有活性的成分可能是残留的凝血酶。
实施例3发酵上清液中巴曲酶的纯化制备用冰醋酸调节发酵上清液使PH为4.0后，再用蒸馏水将发酵液按1∶20稀释使电导率为≤8mS/cm，将此发酵稀释液先上样到经25mM醋酸-醋酸钠缓冲，PH4.0预先平衡过的SP-Sepharose FF(Amersham PharmaciaBiotech)柱，采用梯度洗脱，得到目的蛋白粗品，再用蒸馏水和PH为10.0的1M甘氨酸-氢氧化钠溶液，将含巴曲酶的SP-Sepharose FF洗脱液稀释、调节成50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲，PH10.0，电导率≤3.5mS/cm的上样缓冲液，再上经50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲，PH10.0预平衡的Q-SepharoseFF(Amersham Pharmacia Biotech)柱，采用下调PH的方式，进行梯度洗脱，使目的蛋白在100mM的醋酸-醋酸钠缓冲，PH4.0中洗脱，最后再通过S200(PAmersham Pharmacia Biotech)分步收集就可以得到纯度不低于97％的巴曲酶纯品(图.4)。PH梯度洗脱分别采用如下摩尔浓度及PH的缓冲溶液25mM Na2HPO4-NaH2PO4，PH8.850mM Na2HPO4-NaH2PO4，PH7.0100mM HAc-AcNa，PH5.0采用缓冲液摩尔浓度递增的方式可保证PH梯度变换明显，减少洗脱过程中可能出现的拖尾现象，同时高浓度的缓冲也发挥了盐(离子强度)的洗脱效应。
实施例4发酵上清液中折叠错误巴曲酶蛋白的复性实施例2中描述到酵母表达巴曲酶时发现，随着诱导时间延长，在巴曲酶蛋白分子大小相应位置的蛋白条带明显变浓，但是活性并没有增加。由此推测，这些蛋白似乎是分泌过程中折叠错误的巴曲酶。为确认这一推测的正确与否，特采用下面的试剂对含有这种蛋白的溶液进行复性试验。
具体复性操作复性之前，其巴曲酶活力为30hrs(1800mins)，当向含无活性蛋白条带的溶液中加入如下试剂，使终浓度如后面括弧中所示的浓度，在15℃条件下，隔绝空气，放置12hrs左右之后，测定其巴曲酶活力为30mins。
Na2HPO4-NaH2PO4，PH8.0 (100mM)Histidine(组氨酸)(10mM)GSH(还原型谷胱甘肽) (0.5mM)GSSG(氧化型谷胱甘肽)(0.3mM)含上述成分的水溶液，并未测出活性，这表明活性是由无活性蛋白复性后的产生的，而不是所添加的成分产生的假象。
实施例5巴曲酶蛋白分子中糖基化结构的确定根据巴曲酶氨基酸序列资料计算出该蛋白的分子量为25.5kD，而SDS-PAGE电泳得出的表观分子量在30～32Kd之间。用我们纯化出的巴曲酶，质谱法测出准确的分子量为31.8kD。
参考甲醇酵母表达系统在表达的外源蛋白时，只要蛋白分子一级结构中有N-糖基化的可能位点，一般都会N-型糖基化现象。用New EnglandBioLabs公司的商品蛋白酶PNGase F(切割糖蛋白中N-糖链的酶)，按照使用说明书中的方法进行操作，将处理前后的巴曲酶蛋白SDS-PAGE电泳后发现PNGase F处理后的巴曲酶分子量减小了，大小同大肠杆菌非融合表达的产物相当(图4)。这表明酵母表达出的巴曲酶分子内有N-糖基化等修饰。蛋白质和DNA序列描述SEQ-1序列的资料(1).序列特征a.长度231氨基酸b.类型氨基酸c.拓扑学未知(2).分子类型蛋白质(3).序列描述SEQ-11 VIGGDECDIN EHPFLAFMYY SPRYFCGMTL INQEWVLTAA HCNRRFMRIH51 LGKHAGSVAN YDEVVRYPKE KFICPNKKKN VITDKDIMLI RLDRPVKNSE101 HIAPLSLPSN PPSVGSVCRI MGWGAITTSE DTYPDVPHCA NINLFNNTVC151 REAYNGLPAK TLCAGVLQGG IDTCGGDSGG PLICNGQFQG ILSWGSDPCA201 EPRKPAFYTK VFDYLPWIQS IIAGNKTATC PSEQ-2序列的资料(1).序列特征a.长度693bpb.类型核甘酸c.拓扑学线性(2).分子类型人工合成的DNA(3).序列描述SEQ-21 GTTATCGGTG GTGATGAATG TGATATTAAC GAACATCCAT TCTTGGCCTT51 TATGTATTAT TCTCCACGTT ATTTCTGTGG TATGACCTTG ATTAACCAAG101 AGTGGGTTTT GACCGCCGCC CATTGTAACC GTCGTTTTAT GCGTATTCAT
151 TTGGGTAAAC ATGCCGGTTC TGTTGCCAAC TATGATGAAG TTGTTCGTTA201 TCCAAAAGAA AAGTTTATTT GTCCAAACAA GAAAAAGAAC GTTATTACCG251 ATAAAGATAT CATGTTGATT CGTTTGGATC GTCCAGTTAA AAACTCTGAA301 CATATTGCCC CATTGTCTTT GCCATCTAAC CCACCATCTG TTGGTTCTGT351 TTGTCGTATT ATGGGTTGGG GTGCCATTAC CACCTCTGAA GATACCTATC401 CAGATGTTCC ACATTGTGCC AACATTAACT TGTTTAACAA CACCGTTTGT451 CGTGAAGCCT ATAACGGTTT GCCAGCCAAA ACCTTGTGTG CCGGTGTTTT501 GCAGGGTGGT ATCGATACCT GTGGTGGTGA TTCTGGTGGT CCATTGATTT551 GTAACGGTCA GTTCCAGGGT ATTTTGTCTT GGGGTTCTGA TCCATGTGCC601 GAACCACGTA AACCAGCCTT TTATACCAAA GTTTTTGATT ATTTGCCTTG651 GATTCAGTCT ATTATTGCCG GTAACAAAAC CGCCACCTGT CCASEQ-3的资料(1).序列特征a.长度693bpb.类型核甘酸c.拓扑学线性(2).分子类型人工合成的DNA(3).序列描述SEQ-31 GTTATTGGTG GTGATGAATG TGATATTAAC GAACATCCAT TTTTGGCTTT51 TATGTACTAC TCTCCAAGAT ACTTTTGTGG TATGACTTTG ATTAACCAAG101 AATGGGTTTT GACTGCTGCT CATTGTAACA GAAGATTTAT GAGAATTCAT
151 TTGGGTAAGC ATGCTGGTTC TGTTGCTAAC TACGATGAAG TTGTTAGATA201 CCCAAAGGAA AAGTTTATTT GTCCAAACAA GAAGAAGAAC GTTATTACTG251 ATAAGGATAT TATGTTGATT AGATTGGATA GACCAGTTAA GAACTCTGAA301 CATATTGCTC CATTGTCTTT GCCATCTAAC CCACCATCTG TTGGTTCTGT351 TTGTAGAATT ATGGGTTGGG GTGCTATTAC TACTTCTGAA GATACTTACC401 CAGATGTTCC ACATTGTGCT AACATTAACT TGTTTAACAA CACTGTTTGT451 AGAGAAGCTT ACAACGGTTT GCCAGCTAAG ACTTTGTGTG CTGGTGTTTT501 GCAAGGTGGT ATTGATACTT GTGGTGGTGA TTCTGGTGGT CCATTGATTT551 GTAACGGTCA ATTTCAAGGT ATTTTGTCTT GGGGTTCTGA TCCATGTGCT601 GAACCAAGAA AGCCAGCTTT TTACACTAAG GTTTTTGATT ACTTGCCATG651 GATTCAATCT ATTATTGCTG GTAACAAGAC TGCTACTTGT CCASEQ-4序列的资料(1).序列特征a.长度26氨基酸b.类型氨基酸c.拓扑学线性(2).分子类型信号肽(3).序列描述SEQ-41 MVLIRVIANL LILQVSYAQK SSELKR
SEQ-5序列的资料(1).序列特征a.长度78bpb.类型核甘酸c.拓扑学线性(2).分子类型人工合成的DNA(3).序列描述SEQ-51 ATGGTTTTGA TTAGAGTTAT TGCTAACTTG TTGATTTTGC AAGTTTCTTA51 CGCTCAAAAG TCTTCTGAAT TGAAGAGA
权利要求
1.一种采用基因重组的方法，由酵母、CHO细胞等产生的糖基化或部分糖基化的巴曲酶，它具有使含抗凝剂的动物血浆凝固的特性；
2.权利要求1中所述巴曲酶的氨基酸序列(SEQ-1)与Bothrops atrox毒液中巴曲酶(Batroxobin)氨基酸序列相同，但其分子的糖基化等修饰具有酵母或哺乳动物细胞的特点，且这类修饰是其生物活性所必须的；
3.权利要求1中所说的抗凝剂包括肝素、EDTA、柠檬酸盐、草酸盐、水蛭肽和水蛭素等；
4.根据权利要求2，依据Bothrops atrox巴曲酶的氨基酸序列，选择酵母和大肠杆菌都比较偏好的密码子，人工合成的巴曲酶结构基因序列SEQ-2以及由酵母喜好的密码子所组成的巴曲酶结构基因序列SEQ-3；
5.根据权利要求4，将人工合成的巴曲酶基因插入至不同的表达载体中，在酵母、哺乳动物细胞或大肠杆菌中实现分泌表达或胞内表达；
6.根据权利要求5，人工合成的巴曲酶基因能够在甲醇酵母工程菌(菌种保藏号CCTCC NoM203006)中，以分泌表达的方式大量产生有生物学活性的巴曲酶；
7.根据权利要求5，人工合成的巴曲酶基因也能够在CHO细胞或其他哺乳动物细胞中，以分泌表达的方式大量产生有生物学活性的巴曲酶；
8.根据权利要求6，巴曲酶在酵母中分泌表达时可以利用酵母的α-信号肽，PHO1信号肽，也可以利用Bothrops atrox巴曲酶的天然信号肽序列(SEQ-4)，其中信号肽序列与巴曲酶蛋白之间插入了KEX2蛋白酶识别序列；
9.权利要求8中的Bothrops atrox巴曲酶信号肽所对应的多核苷酸序列(SEQ-5)是用甲醇酵母Pichia pastoris所喜好的密码子人工合成的；
10.根据权利要求4、6、7、9，人工合成的巴曲酶基因和Bothrops atrox巴曲酶信号肽中所用的密码子不仅仅只限于序列SEQ-2、SEQ-3和SEQ-5中所选用的密码子，而且还包括不会改变巴曲酶蛋白和其信号肽一级结构的所有同义密码子；
11.根据权利要求6、7，发酵上清液中的巴曲酶以有活性和无活性两种形式存在，含有Na2HPO4-NaH2PO4、Histidine、GSH(还原型谷胱甘肽)和GSSG(氧化型谷胱甘肽)等成分的溶液有助于无活性巴曲酶蛋白转变为有活性的巴曲酶；
12.权利要求10中的GSH与GSSG的比例对活性巴曲酶的结构形成非常关键，实际操作中GSH的浓度在0.1～10mM范围，而GSSG的浓度在10～0.1mM范围的适当组合有利于巴曲酶正确结构的形成；
13.根据权利要求6、7，将发酵上清液进行稀释或超滤脱盐等预处理后，先经过阳离子交换介质(如，Mono-S、SP-Sepharose等)，再经过阴离子交换介质(如，Mono-Q、Q-Sepharose等)，最后再进行一步凝胶过滤层析就可以制备出巴曲酶纯品；
14.根据权利要求13，纯化制备的巴曲酶可作为一种止血药的主要成分，也可以直接作为降纤维药之用。
全文摘要
本发明涉及一种基因重组方法制备的巴曲酶(Batroxobin)，其关键是巴曲酶基因的合成、表达以及表达产物的纯化制备和性质确定。这种重组的巴曲酶既可以作为一种止血药的主要成分，也可以直接用作降纤药物。
文档编号C12N1/19GK1534093SQ0311605
公开日2004年10月6日 申请日期2003年3月28日 优先权日2003年3月28日
发明者黄秀东, 陈佩新, 肖建国, 阮振兴, 曾强松, 潘学工, 曹之舫 申请人:上海万兴生物制药有限公司