专利名称：一种利用大肠杆菌发酵制备小干扰rna分子的方法
技术领域：
本发明领域属于分子生物学与生物医药领域。具体涉及一种利用大肠杆发酵制备RNA干扰用小干扰RNA分子的方法。
对RNAi原理的研究始于在线虫(C.elegans)中的遗传学分析，用这种方法找到了一系列与RNAi相关的基因。1999年，Hamilton和Baulcombe在发生RNAi现象的植物中检测到了长度为21-25个核苷酸(nt)的RNA片段，这些RNA片段被证明是RNAi所必需的，称为小干扰RNA(short interfering RNA，“siRNA”)。在果蝇中的研究，使RNAi的机制被基本阐明当长链的dsRNA进入细胞时，它被一种被称为Dicer的核酸水解酶所识别并被剪切成21-25nt的siRNA，双链的siRNA被RNA解链酶解链，以单链的形式与另一核酸水解酶结合形成RNA酶复合体，复合体中的单链RNA象向导一样引导酶复合体识别序列与之互补的mRNA并将其水解，从而特异性地抑制基因的翻译表达。在线虫和植物中，单链的siRNA除了起“向导”作用之外，还可作为聚合反应的引物。在RdRP的作用下，以mRNA为模板，单链的siRNA为引物合成互补链，使得单链的mRNA成为双链RNA，新合成的dsRNA则又被核酸酶Dicer剪切成siRNA。RdRP的作用使RNAi的信号得到放大，只要极微量的dsRNA就能引起强烈的基因表达抑制。
RNAi高效而专一地抑制基因表达的特性使其在基因功能研究方面得到了广泛的应用。与反义核酸、核酶和利用同源重组进行小鼠基因敲除等技术相比，RNAi技术具有无法比拟的优越性。在利用反义核酸技术和核酶技术抑制基因的表达时，如何从目的基因中选择有效的抑制序列，到目前为止仍没有精确的理论指导，只能通过不断的尝试和改进，是一个比较费时费力的过程。而利用RNAi技术则没有这个问题，研究表明目的基因mRNA的二级结构和GC含量都不会影响RNAi的效率。在线虫和植物中，RdRP的作用能够使RNAi的信号得到放大，只要极微量的dsRNA就能引起强烈的基因表达抑制。尤其在线虫中，只要用能够表达目的基因dsRNA的大肠杆菌喂养线虫，该基因的表达就会被抑制。这种优越性使得RNAi技术首先在线虫功能基因组研究中得到广泛的应用，并极大地推进了线虫的功能基因组研究。
在哺乳动物细胞中，超过30bp的dsRNA会通过激活PKR系统和RNase L，导致翻译起始的抑制以及非特异的RNA降解，最终导致非特异性的基因表达抑制。这种机制阻碍了RNAi技术在哺乳动物细胞中的应用。Elbashir等人的工作解决了这一问题。他们用人工合成的21nt的互补双链siRNA在多种哺乳动物细胞中诱发了RNAi机制，并避开了PKR系统和RNase L，专一性地抑制了目的基因的表达。他们的工作首次证明了RNAi技术可以应用于哺乳动物细胞。
RNAi技术不仅在功能基因组研究中显示出无法替代的优越性，而且也为某些目前难以治疗的疾病提供一种新的治疗手段成为可能。病毒性疾病，尤其是反转录病毒感染导致的疾病，象HIV感染引起的AIDS病和HBV、HCV感染引起的病毒性肝炎严重影响着人们的健康，而且目前的治疗手段无法达到根治，RNAi技术的应用，可能会提供更好的治疗和预防手段。目前已经在体外培养细胞体系中实现了利用RNAi技术抑制HIV、HCV、HBV、以及流感病毒的感染复制。可以预见RNAi技术同样可以为肿瘤、心血管疾病和糖尿病等现代高发性疾病提供新的治疗手段。
RNAi技术应用于哺乳动物体系的关键是制备siRNA。目前大约有3种制备方法化学合成法、细胞内表达法和体外转录长片段dsRNA后用大肠杆菌III型RNase或Dicer水解制备siRNA。最初只能用化学合成法制备siRNA。很多生物技术公司都提供RNA合成服务。只要从目的基因mRNA序列中选择出合适的碱基序列，就能由生物技术公司合成此序列的正义RNA链及其互补链，经变性退火后就得到双链siRNA。这一方法比较简单直接，但由于RNA合成的价格相当昂贵，限制了化学合成法的推广应用。2002年4月，国际上数个研究小组几乎同时报道了利用哺乳动物细胞III型RNA聚合酶启动子表达短片段的(19-21bp)带茎环结构的双链RNA可以在哺乳动物细胞体系中产生RNAi，对特定基因表达的抑制率达到90％以上，优于人工合成的siRNA。这一技术的产生使得哺乳动物体系的RNAi技术变得更为简便更为成熟。然而要将这种方法应用于临床，类似于基因治疗，而且比基因治疗难度更大。除了需要克服基因治疗所需克服的靶向性、安全性等困难以外，它对整合效率的要求更高，因为它同一般的基因治疗是要增加某一基因的功能相反，它需要抑制特定基因的表达。安全有效而简便的方法是给病人服用或注射siRNA，这类似于以往的反义核酸药物。用大肠杆菌Rnase III或Dicer水解体外转录的长片段dsRNA来制备siRNA是目前已有的最方便的制备方法。
本发明提出的制备RNAi用siRNA分子的方法，包括构建长链dsRNA表达载体，并转化大肠杆菌宿主菌，通过工业化规模发酵，用碱-SDS法抽提发酵菌体得到全RNA和质粒DNA的混合物；该混合物用CF-11柱进行纯化得到dsRNA；最后利用大肠杆菌RNaseIII将长链的dsRNA切成12-30bp的小干扰RNA。
本发明中提出了两种可在大肠杆菌中表达长链dsRNA的表达载体。具体方法如下1.茎环结构dsRNA的表达载体的构建带颈环结构的dsRNA的表达载体的构建方法是将目的基因片段以相反的方向将基因的3’端连接到第三段DNA片段的两侧，然后克隆到带有一个T7启动子的载体中去。质粒示意图见附
图1。当把此表达质粒转化到能表达T7 RNA聚合酶的宿主菌内后，目的基因的正反两个方向的DNA链以及两者之间的第三段DNA链就能被依次转录，成为一条连续的RNA链。由于这条RNA链中的目的基因部分是完全互补的序列，在生理条件下整条RNA链就会形成茎环结构，结构中的双链部分就是目的基因的dsRNA。
2.双向启动子表达载体的构建双向启动子表达载体的构建是利用带有大肠杆菌复制起点的表达载体，在合适的位置加入抗性基因和多克隆位点，并在多克隆位点两侧分别加入方向相对的两个启动子以及终止子(如图2所示)。当在多克隆位点中插入目的DNA片段后以正反两个方向转录RNA，由于转录出来这两条RNA链是完全互补的序列，所以在生理条件下会形成双链，这就是目的基因的双链RNA。
本发明中提出的利用大肠杆菌发酵生产与分离纯化dsRNA的步骤如下1.菌体发酵将dsRNA表达载体通过常规的氯化钙法转化到大肠杆菌中，然后将含有表达载体的大肠杆菌菌落接种到含相应筛选抗生素的培养液中，培养8-12小时，转接到的发酵罐中，培养3-5小时后，加入乳糖或IPTG，继续培养3-5小时后放罐，以连续式离心机收集菌体，准备进行dsRNA抽提和纯化。
2.RNA抽提每1g菌体中加入10-20ml的暴浮液(50mM葡萄糖，25mMTris·HCl，10mM EDTA，pH8.0)中，充分悬浮后加入2倍于悬浮液体积的裂解液(含0.2NNaOH，1％SDS)，搅拌混匀后加入1.5倍于悬浮液体积的乙酸钾溶液(含5M醋酸根，3M钾离子)，搅拌混匀后冰浴放置10-20分钟后，10000-12000g离心10分钟，将上清液转移到另一离心管中。加入与上清液等体积的酚·氯仿·异戊醇(三者的质量比为25∶24∶1)，振荡混匀后10000-12000 g离心10分钟，收集上清液。准备用于CF-11吸附纯化。
3.用CF-11的吸附层析分离dsRNA在上述2中得到的离心上清液中向抽提液加入乙醇至终浓度为17-30％，上样到用含同样比例酒精的STE溶液(0.1M NaCl，10mM Tris·HCl，1mM EDTA，pH8.0)预平衡的CF-11层析柱中；用含有17-20％乙醇的STE溶液连续洗CF-11柱以除去单链RNA和DNA，直至洗脱液OD260无吸收时停止。然后用STE溶液洗脱双链RNA，收集流出液，至OD260无吸收时结束。所收集的含dsRNA的溶液或以酒精沉淀或以正丁醇进行浓缩，备用。
本发明中，利用大肠杆菌III型RNA酶水解长链dsRNA制备小干扰RNA的方法具体步骤如下经CF-11纯化得到的dsRNA经定量后，按每微克ds RNA用0.02-0.03微克大肠杆菌来源的RNaseIII在37℃水解2-4小时。反应溶液中含1mM DTT，20mMTris-HCl，0.5mM EDTA，5mM MgCl2，140mM NaCl，2.7mM KCl，pH7.9。
本发明的优点与化学合成法和体外转录法相比，本发明提供的siRNA制备方法更为简便，成本更加低廉，尤其适合用于药物制造目的的大规模siRNA制备。
图6dsRNA的RNaseIII水解。图中1、24 bp分子量Marker；2、水解0小时；3、水解2小时；4、水解4小时。
图7pST质粒图谱。
上述载体pST的构建方法如下人工合成寡核苷酸5’-ggccgcaacggtaccaccaagcttagtggatccgaattccggct-3’，将此片段连接到pSectag2a(Invitrogen公司)质粒的SfiI/NotI酶切位点之间，即得到pST质粒，如图7。
2.构建双向启动子表达载体pET-2P，具体过程如下已知pET-22b(Novagen公司)表达载体上有T7的启动子和T7终止子，用PCR引物(p55’-ccgctcgagttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgcggccgcaagcttgtc-3’；p35’-aagatctggcccacccgtgaaggtgagccc gatcccgcgaaattaatacg-3’)以pET-22b为模板扩增出的DNA片断中引入了tac启动子和T3终止子，将此片断用XhoI和BglII酶切克隆进入pET-22b，得到的重组质粒具有双向启动子和终止子，将此质粒命名为pET-2P，如图4。
3.dsRNA的发酵表达，提取与纯化过程如下菌体发酵将含有pET-HBXII(其中含有一个可转录出发夹结构的RNA的基因SEAP2)的BL21(DE3)菌株接种到200ml升含氨卞青霉素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜，转接到25升的小发酵罐培养8-9小时后再转入装液300升(溶积500升)的大发酵罐中，37℃发酵培养3小时后加入6kg乳糖诱导表达dsRNA，继续发酵3小时后以上海离心机研究所产的GL105型离心机收集菌液，备用。
RNA抽提将100克菌体以1000ml的悬浮液(组份同前所述)中，加入2000ml的裂解液(组份同前所述)，轻轻搅拌混匀后加入1500ml乙酸钾溶液(组份同前所述)，轻轻搅拌混匀后分装在数个三角烧瓶中后在冰上放置10分钟，以10000g离心10分钟，将上清液回收在数个三角烧瓶中后，加入等体积的酚·氯仿·异戊醇(25∶24∶1)，激烈振荡混匀后以10000g离心10分钟，再回收上清液，备用。
dsRNA的纯化将1kg CF-11粉末用含20％7醇STE溶液浸泡平衡后装在一根直径为8cm的玻璃柱中，放置在4℃冷库中。将酚·氯仿·异戊醇抽提后离心得到的上清液中补加乙醇至终浓度20％，在冰上放置20分钟后在冷库中上样到CF-11柱上。用5L含17％乙醇的STE溶液进行洗涤除去单链RNA和质粒DNA后，在用2L预热到55℃的不含乙醇的STE溶液回收dsRNA。下图为纯化前后的DNA样品的琼脂糖凝胶电泳(泳道A与C)，与普通质粒进行的对照试验结果(泳道B和D)相比可知，纯化得到的样品(泳道C)为长链dsRNA。
4.利用RNaseIII水解长链dsRNA制备siRNA的过程如下取4微克经CF-11纯化得到的dsRNA，用0.1微克RNaseIII37℃，在不同时间取样，电泳检测结果如图6所示。
权利要求
1.一种制备RNAi用siRNA分子的方法，其特征在于包括构建长链dsRNA表达载体，并转化大肠杆菌宿主菌，通过工业化规模发酵，用碱-SDS法抽提发酵菌体得到全RNA和质粒DNA的混合物；该混合物用CF-11柱进行纯化得到dsRNA；最后利用大肠杆菌RNase III将长链的dsRNA切成12-30bp的小干扰RNA。
2.根据权利要求1所述的制备siRNA分子的方法，其特征在于构建在大肠杆菌中表达长链dsRNA的表达载体的方法如下将目的基因片段以相反的方向将基因的3’端连接到第三段DNA片段的两侧，然后克隆到带有一个T7启动子的载体中去；当把此表达质粒转化到能表达T7 RNA聚合酶的宿主菌内后，目的基因的正反两个方向的DNA链以及两者之间的第三段DNA链就能被依次转录，成为一条连续的RNA链。
3.根据权利要求1所述的制备siRNA分子的方法，其特征在于构建在大肠杆菌中表达长链dsRNA的表达载体的方法如下利用带有大肠杆菌复制起点的表达载体，在合适的位置加入抗性基因和多克隆位点，并在多克隆位点两侧分别加入方向相对的两个启动子以及终止子，在多克隆位点中插入目的DNA片段后以正反两个方向转录RNA。
4.根据权利要求1所述的制备siRNA分子的方法，其特征在于利用大肠杆菌发酵的步骤如下将dsRNA表达载体通过常规的氯化钙法转化到大肠杆菌中，然后将含有表达载体的大肠杆菌菌落接种到含相应筛选抗生素的培养液中，培养8-12小时，转接到发酵罐中，培养3-5小时后，加入乳糖或IPTG，继续培养3-5小时后放罐，以连续式离心机收集菌体。
5.根据权利要求1所述的制备siRNA分子的方法，其特征在于用碱-SDS法抽提发酵菌体得到全RNA和质粒DNA的混合物的步骤如下每1g菌体中加入10-20ml的悬浮液中，充分悬浮后加入2倍于悬浮液体积的裂解液，搅拌混匀后加入1.5倍于悬浮液体积的乙酸钾溶液，搅拌混匀后冰浴放置10-20分钟后，10000-12000g离心10分钟，将上清液转移到另一离心管中；加入与上清液等体积的酚·氯仿·异戊醇，三者的质量比为25∶24∶1，振荡混匀后10000-12000g离心10分钟，收集上清液。
6.根据权利要求1所述的制备siRNA分子的方法，其特征在于用CF-11柱进行纯化的步骤如下在离心上清液中向抽提液加入乙醇至终浓度为17-30％，上样到用含同样比例酒精的STE溶液预平衡的CF-11层析柱中；用含有17-20％乙醇的STE溶液连续洗CF-11柱以除去单链RNA和DNA，直至洗脱液OD260无吸收时停止；然后用STE溶液洗脱双链RNA，收集流出液，至OD260无吸收时结束。
7.根据权利要求1所述的制备siRNA分子的方法，其特征在于利用大肠杆菌III型RNA酶水解长链dsRNA制备小干扰RNA的方法具体步骤如下经CF-11纯化得到的dsRNA经定量后，按每微克ds RNA用0.02-0.03微克大肠杆菌来源的RNaseIII在37℃水解2-4小时。反应溶液中含1mM DTT，20mM Tris-HCl，0.5mM EDTA，5mM MgCl2，140mM NaCl，2.7mM KCl，pH7.9。
全文摘要
本发明涉及一种利用大肠杆菌发酵大规模制备RNA干扰用小干扰RNA分子的新方法。本发明构建了长双链RNA表达载体，并转化大肠杆菌宿主菌，通过大规模发酵，用碱－SDS法抽提发酵菌体得到全RNA和质粒DNA的混合物。该混合物用CF－11柱进行纯化得到长双链RNA。最后利用大肠杆菌III型RNA酶将长双链RNA切成12－30bp的小干扰RNA。得到的siRNA用分光光度法检测其纯度与浓度，OD
文档编号C12N15/70GK1458279SQ0312904
公开日2003年11月26日 申请日期2003年6月5日 优先权日2003年6月5日
发明者钱志康, 宣宝琴, 李琳, 徐剑锋, 谭畅, 闵太善, 王维荣, 谢承光, 沈水源, 程小伟, 史顺成, 黄伟达 申请人:复旦大学, 上海复旦新杨生物科技有限责任公司, 上海恒达科技发展股份有限公司