专利名称：水稻根系磷饥饿诱导特异表达启动子及其培养植物的方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地讲，本发明涉及一种水稻根系磷饥饿诱导特异表达启动子及其培养植物的方法。更具体地说，本发明涉及水稻OsIPS1的启动子序列，该序列含两个磷元件，为水稻根系中受磷饥饿诱导特异表达启动子。本发明还涉及由启动子中的磷元件及其旁邻序列的应用，以及由此得到的包含上述启动子和磷元件的GUS融合转基因植物。
背景技术：
磷是植物生长大量必须营养元素三要素之一(氮、磷、钾)。由于磷素(PO43-，HPO42-，H2PO4-)在酸性与碱性土壤中的强烈固定作用，植物利用磷肥及土壤磷素的效率极低(作物当季利用率仅5％左右)。我国及世界大部分耕地为酸性与碱性土壤，大量土壤已成磷库。因此提高作物自身磷利用能力，开发巨大的土壤磷库是具有重大经济价值的育种工程。植物自身已进化形成适应磷胁迫的机制，包括根系发生与构型适应，生理代谢适应。如何通过分子育种加强这种适应性是提高植物磷利用能量的关键。因此根系特异性磷饥饿诱导表达基因的启动子开发具有重要应用前景。
从水稻中克隆的OsIPS1基因属于植物Mt4/TPSI1基因家族。Mt4/TPSI1家族已经有4个成员，包括TPSI1(番茄)，Mt4(苜蓿)，At4(拟南芥)，AtIPS1(拟南芥)(Liu et al.，1997；Burleigh et al.，1999；Martín et al.，2000)。它们具有如下特征皆受磷饥饿的高度特异诱导表达；属于转录体长度为0.5～0.7kb的单拷贝基因；均不具有明显的编码阅读框；在转录体中部存在有22bp(GGGCAACTTSKATCCTTTGGCA)的高度保守序列；基因启动子中均具有“GNATATNC”(P1BS)的磷饥饿调控元件。Mt4/TPSI1家族基因可能以短肽或非编码RNA的形式发挥作用，但功能到目前为止还没有被揭示。在本发明之前，还没有在单子叶植物中发现该类型基因。OsIPS1在水稻磷饥饿库中被筛选并克隆。该基因为根系特异表达基因，受磷饥饿特异性诱导。该启动子可在磷诱导调控表达基因工程及磷高效分子育种中具有极大的应用潜力。
Burleigh S.H.and Harrison M.J.(1999)The Down-Regulation of Mt4-LikeGenes by Phosphate Fertilization Occurs Systemically and Involves PhosphateTranslocation to the Shoots.Plant Physiol.119241-248。
Liu CM，Muchhal U.S.andRaghothama K.G.(1997)Differential expression ofTPS11，a phosphate starvation-induced gene in Tomato.Plant Molecular Biology 33867-874。
Martín A.C，Pozo J.C del，Iglesias J.(2000)Influence of cytokinins on theexpression of phosphate starvation responsive genes in Arabidopsis The PlantJournal，24，5559。
发明内容
本发明的目的是提供一种水稻根系磷饥饿诱导特异表达启动子及其培养植物的方法。
包含SEQ ID NO1的OsIPS1基因启动子共2100位碱基的核酸，该核酸编码一个水稻根系磷饥饿特异诱导表达的启动子，中部含有两拷贝的高度保守序列。
方法步骤如下1)将包括SEQ ID NO1或其功能性部分并与结构基因连接在一起的分离的DNA构建到载体上，通过转基因技术转化进入作物或植物细胞中；2)从该细胞中再生出植物，结构基因产物或组织培养物；3)在转基因植物处于磷饥饿或低磷条件下，诱导该结构基因的特异表达。
本发明利用启动子或及其磷元件可以构建提高植物或其细胞的耐磷饥饿能力的融合基因。例如，利用过表达转基因技术将该启动子与侧根发生相关基因融合转化作物如水稻、小麦等，通过提高在磷饥饿胁迫下诱导侧根发生，从而提高作物磷吸收能力，可达到在不影响产量的前提情况下减少磷肥的施加，从而降低粮食生产成本。
图1是OsIPS1在水稻根中受磷饥饿4天特异诱导表达RT-PCR分析图；图2是OsIPS1Pr∷GUS在水稻愈伤中受磷饥饿诱导表达图，图中-P为无磷培养，+P为正常磷培养；图3OsIPS1Pr∷GUS在水稻根中受磷饥饿4天诱导表达图；图4是OsIPS启动子中磷元件串联载体与GUS的融合基因在水稻愈伤中受磷饥饿诱导表达图，图中-P为无磷培养。
具体实施例方式
阐述了一种新的水稻磷饥饿诱导表达基因OsIPS1的启动子。OsIPS1基因属于Mt4/TPSI1家族成员，是从水稻日本晴(Nipponbare)磷饥饿4天cDNA扣除文库中筛选得到的。经5’RACE与3’RACE克隆出全长基因。该基因位于水稻第三条染色体分子标记C725上，属于单拷贝基因，中部含有22碱基的高度保守序列，与该家族其他成员一致。OsIPS1基因启动子上具有两个拷贝的磷饥饿调控元件“GNATATNC”(P1BS)。通过RNA Blotting、RT-PCR以及构建启动子GUS融合表达表明，OsIPS1基因在禾本科模式植物水稻中受磷饥饿的高度诱导，而且在根部特异表达。
在构建了水稻品种Kasalath磷饥饿4天的抑制性差异扣除杂交cDNA文库后，通过利用扣除探针进行筛选，获得一个在水稻根系磷饥饿诱导增强表达的克隆，根据该克隆的序列设计上游引物进行基因组DNA扩增，获得2100个碱基序列(SEQ ID No1)，我们命名为OsIPS1P。该启动子与GUS基因，及该启动子中第-567bp位的元件(GGATATCC)，第-432bp位的元件(GCATATCC)与GUS构建的融基因转基因研究表明，带有上述两个元件的启动子受磷饥饿诱导在水稻根中特异表达(图1，2)。
由这些结果表明，我们克隆的水稻OsIPS1P启动子具有很高的应用价值。我们可以通过利用该启动子与根系发生发育基因构建融合基因对不耐低磷的作物品种进行转基因改造，通过该启动利用提高根系发生发育关键基因对磷饥饿反应的加强，促进根系磷饥饿诱导发生发育来提高作物耐低磷胁迫能力，从而减少对农作物磷肥的施加量。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。
实施例1，水稻抑制性扣除杂交文库的构建水稻Kasalath品种于37℃浸种催芽后播种到黄沙钵中，7天后移栽到溶液培养(溶液培养配方为国际水稻所标准配方)。等苗培养到三叶期后开始分组处理，一组正常培养，一组磷饥饿培养。培养4天后取材，分别取根系材料用Gibco公司的Trizol提取总RNA。用Qiagen公司的Oligotex mRNA Mini Kit提取250μg总RNA中的mRNA，两份材料的mRNA各取1μg用于cDNA合成，cDNA合成采用Clontech公司的SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit。取正常培养根组织的cDNA作为Driver，饥饿处理材料的cDNA作为Tester。采用Clontech公司的PCR-Select cDNA Subtraction Kit进行扣除杂交，最终产物用该公司的PCRCloning Kit进行克隆，并转化TOP 10F’大肠杆菌菌株。挑选转化子培养保菌。
实施例2，水稻OsIPS1Pr的cDNA序列的克隆和测定用构建抑制性扣除杂交文库的cDNA材料，采用PCR-Select DifferentialScreening试剂盒筛选抑制性扣除杂交文库，获得受磷饥饿强烈诱导基因片段克隆。对该克隆测序获得该基因为植物Mt4/TPSI1基因家族。该基因家族成员为磷诱导特异表达。设计引物用于扩增该基因的启动子OsIPS1Pr。引物1GAGGAGAGAAGTTTTTCGGTGGAG用于3‘端扩增，引物2AGTTCTAGATGGGTGCTTTTATTTGGAAGTATTG用于5‘扩增。PCR产物采用Clontech公司的PCR Cloning Kit克隆于pT-Adv载体，转化后提取质粒进行测序，获得2100bp序列。详细序列见SEQ ID No.1.
实施例3，OsIPS1的RT-PCR分析与OsIPS1Pr与GUS融合基因的转基因表达正常培养到三叶期的水稻日本晴(Nipponbare)品种开始磷饥饿胁迫，处理方式与构建抑制性扣除杂交文库过程一致。胁迫4天后，分别取正常苗的根、叶及饥饿处理的苗的根、叶材料。用Gibco公司的Trizol试剂分别提取总RNA。用OsIPS1克隆做探针对Northern印迹分析(图1)。
利用上述引物以日本晴基因组DNA为模板，TAQ酶58℃扩增OsIPS1启动子，长度为2100bp。经T4聚合酶末段平滑化，与SmaI酶切过的Cambia1391z相连接，构建OsIPS1Pr∷GUS融合基因，然后转化大肠杆菌DH5a。筛选阳性克隆，提取质粒，电击转入农杆菌EHA105。
挑选饱满光洁无菌斑的种子，加入20％(v/v)NaClO溶液(有效氯约1～1.2％)消毒30min。用无菌水清洗5遍，置于无菌滤纸上吸干。转入诱导培养基中，28℃，光照培养3-4周。将自然分裂的胚性愈伤转到新鲜的诱导培养基上，28℃，光照培养7天。7天后将愈伤置于22℃，暗培养3-30天。挑取单菌落(EHA105带有OsIPS1Pr∷GUS质粒)于2mlYEP培养液(含50mg/L Kan和50mg/L Str)中，28℃，220rpm振荡培养24-28h，至OD600＝1.0-1.5。将培养完毕的农杆菌液离心(4000rpm，4℃，15min)，弃上清，用适量的AAM培养液(含200μM As)重悬，稀释成OD600＝0.01-0.05的菌悬液。与愈伤组织共培养。将愈伤转入共培养基上，22℃，暗培养3天后，再转入选择培养基(含50mg/L潮霉素，500mg/L头孢拉定或羧苄青霉素)，28℃光培养4-5周。每两周换一次选择培养基。挑取抗性愈伤置于分化培养基上，28℃培养。当分化绿芽长至1cm左右，转入生根培养基中，28℃光照培养(14h光照，光强为60umolm-2s-1)。10-15天后开盖炼苗，转入水培或土培中继续培养。
将得到的转基因阳性苗在无磷培养基上培养4天后GUS染色10小时，同时染供磷培养基上培养4天后的转基因愈伤作对照(图2)。OsIPS1Pr与GUS融合基因的转基因根系特异表达也得到确证(图3)。实施例4，SEQ ID NO2磷饥饿调控元件“GNATATNC”(P1BS)的启动子磷元件串联启动子构建及转基因试验分别克隆OsIPS1启动子上的两个磷饥饿调控元件“GNATATNC”(P1BS)，构建串联人工启动子，与GUS基因融合转化植物。
人工分别合成下列寡核苷酸序列(5’磷酸化)P1 5′GGGGTACCTCAGCTCggatatccTCAAGATGCCGC 3′P2 5′CCCGCGGCATCTTGAggatatccGAGCTGAGGTAC 3′P3 5′GGGCTAATGCTCGCCgcatatccTTTGGTAGATAC 3′P4 5′CCCGTATCTACCAAAggatatgcGGCGAGCATTAG 3’其中GGG和CCC表示接头。将合成的每对互补寡核苷酸等量混合于PCR管中，通过两步PCR(95℃，2min；降1℃/min至25℃)，便可退火形成双链，由于接头的作用，短的双链之间可通过T4连接酶进行串连，并随机形成2～多个拷贝，纯化后连到pBSSK(smaI酶切)载体中，测序，分别得到DS1(6copy)和DS2(7copy)两个正向的多拷贝和DS3(2copy)和DS4(4copy)的低拷贝克隆。将连有目的片段的pBSSK用BamHI和XbaI酶切后，把mini35S(-46 CaMV35S启动子)+GUS连入。mini35S+GUS是通过BamHI和XbaI酶切pWS31得到的。再将连有mini35S+GUS和目的片段的pBSSK用HindIII和XbaI酶切，回收纯化含有目的片段+mini35S+GUS的条带，连到p1300(HindIII和XbaI酶切)载体中。将构建好的载体通过电击法转入农杆菌。利用基因枪法用DS1(6copy)和DS2(7copy)两个片段转化水稻愈伤，GUS染色10小时，分别得到瞬时表达(轰完基因枪后48小时)(图4)。
序列表浙江大学水稻根系磷饥饿诱导特异表达起动子OsIPS1PLength1862SequenceNameOsIPS1P<212>TypeDNA<213>水稻(Oryza sativa)OsIPS1基因启动子(共2.1kb)caagattgtgttttcgaggagagaagtttttcggtggagctttggaaaattccacatgccacatatttcgtccgtttgagtttattttttacatggttggttcctgtgagttcctaagtgtgaaaaaaatatcaaaaaaataaaataaaaataaaaaagttgcacatctctctcctctgcactagttcggagagaggagaggagaggaaaaattctatatgtcacatattacgtccatttgagttcaatttttctatggttgattcttgtgtgtccctaagcgtgaaaaaaatatcaaacaaataaaacaaaataaaaaatttcggggggagggcgccagccactggggggcgccagtcactctggcgcactccccctagccacctcagcatcgccccgccacgtcggcagggggacggcgccaaagaggctggcgcggcagccactctggcgcctcaaaaaggaccatttttgggataaatttttctaggggtctatttgcgaaataagttttttaaaaggaccaaaatgtgaaaaatccagtacttgtctccgtgtacatcgcgtagctctagcacctccctgttcccaccaagtccgacggcgcgacgctgcgaaggttgacgtgcgggtgtgtgccggtggacgcgtatcgcctcctaccgaggcgacgcagcgaagattggtgaagcgcgtggaggacagcttcaaacaaaactcacacaagcaaactaaaatgaagctcacacaagctcaggggtatattttgttcaaaataaaaaaatgaaatgcaccagccgggaatcgaacccgggtctgtaccgtggcagggtactattctaccactagaccactggtgcttgcttgttgaaatttttctaagaatttatatatcagcagcatcgttcatcaatcaaggcactactcataaaattcagtatcacttcaaaatcaatcatgggttcagatatcactaggctcaagttctgagttacccctaaaccagcccagttctaccctgtaatggtctatatatggggggcatacgactatgctatacacactaccaaggctaccaagtacccagctagtatttctaaatgataaaggtaagcaatatgcactgacacatgtcgacaacctaactgcaaaaacacaaatttgctgatacacatgctccattcatagcaagtggagtacaccttgactaccccaaaaggaagcacatagtatatcagaaagcactcaagccaaactgtagttccacactgaccccccatgacactgaaagtctgaaccatattagttttagagcctagactgacaccaccaccatctcacaagtgatctcacggatcatatttgtcacaccttggcgagcaaagagcaggaggaggttgacgatgacaacacaaagctgctgcccccttctcccccttgtgatcgagttgtggttgtgacattgaagagacgagcacccaaaagaggagcaagaaattgaagttcgcactagtcgcggagtacctcagctcGGATATCCtcaagatgccgctggggaaagagcctagctcatgtggacgccgagggaaagtgcaacaaaagagagaaagccacgccaaagttggtggcatcaccagcctcgaaactcgaaagcgctaatgctcgccGCATATCCtttggtagataccgttccctcttctcctgcacatctccctgaagattgcgtagttgctccctgaactacaccataattgcagagataagcaaagcttaattgcgtcttcaagtatttgctttgctctaactgatgatctgtgcacttggtttatgctaatgttactctgcaaacaggctcagagctgcttctttcagctcaactattttttgctctgttctactggtatgcactctgtactacatacaagtaatacgtgtgcaagaattattacagacatggctcatgagggtgaattcactgaattgtaatcattgagagtattgtggagcaggtttcagttaatggaaagctaatgtctgttgatgCAAAATTgcactgatttaggTACAAAAggcacttttaactaaagaaatgatttcct-567bpGGATATCC-432bpGCATATCC (以最后一个碱基t为-1)为两个低磷胁迫响应元件PIBS(PHR1-binding site)-56bpCAAAATT为预测的CAAT-BOX。
-36bpTACAAAA为预测的TATA-BOX。
权利要求
1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，包含SEQ ID NO1的OsIPS1基因启动子共2100位碱基的核酸，该核酸编码一个水稻根系磷饥饿特异诱导表达的启动子。
2.根据权利要求1所述的一种分离出的DNA分子，其特征在于所说的OsIPS1基因启动子包含有两个拷贝的SEQ ID NO2磷饥饿调控元件“GNATATNC”(P1BS)的启动子
3.根据权利要求1所述的一种分离出的DNA分子，其特征在于所说的“GNATATNC”(P1BS)为-567bpGGATATCC，-432bpGCATATCC，及其旁邻序列。
4.根据权利要求1所述的一种分离出的DNA分子，其特征在于所说的OsIPS1基因启动子启动转录的结构基因是OsIPS1基因，属于植物Mt4/TPSI1基因家族。
5.一种利用OsIPS1基因启动子转化植物的方法，其步骤如下1)将包括SEQ ID NO1或其功能性部分并与结构基因连接在一起的分离的DNA构建到载体上，通过转基因技术转化进入作物或植物细胞中；2)从该细胞中再生出植物，结构基因产物或组织培养物；3)在转基因植物处于磷饥饿或低磷条件下，诱导该结构基因的特异表达。
6.根据权利要求5所述的一种利用OsIPS1基因启动子培养植物的方法，其特征在于所说的结构基因为侧根发生相关基因，根毛发生相关基因和磷高效利用相关基因。
7.根据权利要求5所述的一种利用OsIPS1基因启动子培养植物的方法，其特征在于所说的转基因植物细胞，包含权利要求1的核酸序列的转基因植物细胞。
8.根据权利要求5所述的一种利用OsIPS1基因启动子培养植物的方法，其特征在于所说的作物为水稻，小麦，玉米。
全文摘要
本发明公开了一种水稻根系磷饥饿诱导特异表达启动子及其培养植物的方法。它包含SEQ ID NO1的OsIPSl基因启动子共2100位碱基的核酸，该核酸编码一个水稻根系磷饥饿特异诱导表达的启动子。方法步骤如下1)将包括SEQID NO1或其功能性部分并与结构基因连接在一起的分离的DNA构建到载体上，通过转基因技术转化进入作物或植物细胞中；2)从该细胞中再生出植物，结构基因产物或组织培养物；3)在转基因植物处于磷饥饿或低磷条件下，诱导该结构基因的特异表达。本发明利用启动子或及其磷元件可以构建提高植物或其细胞的耐磷饥饿能力的融合基因。通过提高在磷饥饿胁迫下诱导侧根发生，从而提高作物磷吸收能力，可达到在不影响产量的前提情况下减少磷肥的施加，从而降低粮食生产成本。
文档编号C12N15/09GK1487084SQ0314228
公开日2004年4月7日 申请日期2003年8月13日 优先权日2003年8月13日
发明者吴平, 侯兴亮, 焦芳蝉, 吴运荣, 刘非燕, 吴 平 申请人:浙江大学