专利名称：一株用于生产聚羟基脂肪酸酯的工程菌及其构建方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程及微生物发酵领域中一株生产聚羟基脂肪酸酯的工程菌及其构建方法与应用，特别涉及一株生产高比例3-羟基己酸(3HHx)的3-羟基丁酸(3HB)和3-羟基己酸(3HHx)共聚物(PHBHHx)的重组菌株及其构建方法与应用。
背景技术：
聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates，PHA)是一类由微生物合成的高分子聚酯，其分子量一般由几万至几百万，广泛存在于自然界的多种微生物体内。它的某些物理性质与传统的、由石油合成的塑料如聚乙烯、聚丙烯类似，可以由可再生的能源合成，并且能够完全降解，进入自然界的生态循环，被认为是一种可能替代不可降解的传统塑料的“生物可降解塑料”，引起了世界各国科学界和产业界的广泛关注。
聚-R-3-羟基丁酸酯(poly-R-3-hydroxybutyric acid，PHB)是PHA家族中最简单的成员，也是研究得最多、最透彻的成员。纯化后的PHB在某些性能上相似于热塑性塑料，力学性质与聚丙烯(PP)相似，结晶度为55-80％。但是这种产品具有性脆、易折裂、伸长率低等缺点，且在加热温度高于熔点(180℃)10℃时就会裂解的，这些缺点增加了PHB后处理加工的难度，大大限制了它的应用范围。共聚物中其他单体的掺入对PHA的物理性能有较大的影响，如HV(3-羟基戊酸)单体的掺入使羟基丁酸和羟基戊酸共聚物(PHBV)的结晶结构明显改变，导致其硬度、强度和熔点下降，但分解温度没有下降；而且随着HV的加入，结晶的晶体规整性下降且呈现不同的结晶形态，这些改变对PHA性能都有很大改进。
3-羟基丁酸(3HB)和3-羟基己酸(3HHx)的共聚物(PHBHHx)是近年来发现的新型PHA共聚物。PHBHHx的物理性能随着3HHx含量的变化而有很大的改变，当3HHx由0mol％增加到17mol％时，其拉伸强度由43MPa降低至20MPa，而相应的断裂伸长率由5％增加到850％，其结晶度由60％下降到18％，这表明PHBHHx的柔性和韧性比PHB都有很大的提高。野生型嗜水气单胞菌4AK4在以月桂酸作为培养基时可以合成PHBHHx，其3HHx的含量在12～18mol％之间。用野生型嗜水气单胞菌生产的PHBHHx，其3-羟基丁酸(3HB)和3-羟基己酸(3HHx)的比例几乎恒定，且3HHx的比例较低。
基因yafH(通过PCR的方法由大肠杆菌JM109基因组中克隆得到)编码酯酰辅酶A脱氢酶，催化脂肪酸β-氧化途径中酯酰辅酶A脱氢生成烯酰辅酶A的反应。yafH基因还可称为fadE。yafH基因可调节嗜水气单胞菌生产的PHBHHx的3-羟基己酸(3HHx)含量。
发明内容
本发明的目的是提供一种生产高比例3-羟基己酸(3HHx)的3-羟基丁酸(3HB)和3-羟基己酸(3HHx)共聚物(PHBHHx)的重组菌株。
本发明提供的重组菌株为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)WQ CGMCC №0911。
该菌株是一种生产高比例3-羟基己酸的3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物的重组菌株，导入了yafH基因，具有以脂肪酸为底物合成PHA的能力。其中，yafH基因一般来自大肠杆菌JM109。
本发明提供的菌株已于2003年03月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏编号为CGMCC №0911。
重组嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)WQ的菌体形态为短杆状，两端圆，直径一般1.0-4.4微米，菌落为淡黄色圆形不透明菌落，适宜培养温度为25-45℃，适宜培养pH值为5.5-8.5。
嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)WQ CGMCC №0911的构建方法，包括以下步骤1)将yafH基因插入载体质粒中，构建重组质粒；2)用所构建的重组质粒转化具有以脂肪酸为底物合成PHA能力的嗜水气单胞菌，得到重组菌株WQ CGMCC №0911。
其中所述重组质粒的构建包括1)含有yafH基因的DNA片段的PCR扩增；2)限制性内切酶切割载体质粒和基因yafH；3)将yafH基因插入所述载体质粒中。
所构建的重组质粒转化出发菌株的方法是多种多样的，例如接合转化法、电击法、冷冻法、化学转化法等。
本发明的另一个目的是提供一种生产含高比例3-羟基己酸(3HHx)的3-羟基丁酸(3HB)和3-羟基己酸(3HHx)共聚物(PHBHHx)的方法。
一种生产含高比例3-羟基己酸的3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物的方法，是发酵嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)WQ CGMCC №0911，并自发酵液中获得共聚物。
所述发酵的温度为25-45℃，发酵的pH值为5.5-8.5。
所述发酵可以为分批培养的方式，也可以是流加培养的方式，还可以采用其它常规的工业发酵方法。
本发明创造性地采用基因重组微生物发酵生产高3HHx比例的PHBHHx，产品中的3HHx含量在11.7mol％之间，同时并没有增加抗生素和诱导物IPTG的使用，也没有增加设备及生产流程的复杂程度，具有广阔的实际应用前景。
图1、含有yafH基因的质粒pBBRH的结构图及其构建2、重组嗜水气单胞菌生产高比例3HHx的3HB和3HHx共聚物(PHBHHx)具体实施方式
实施例1、生产高比例3HHx的3HB和3HHx共聚物(PHBHHx)重组菌株的获得1、含有yafH基因的DNA片段的PCR扩增用引物5’-TATGGTACCGACCTGAAGTGCGGATAA和引物5’-AATCTCGAGGATGTGGTCCGAGAAATCTA自大肠杆菌JM109基因组中扩增yafH基因，具体的技术方案为在PCR体系中加入Ex Taq DNA聚合酶，94摄氏度解链30秒，60摄氏度退火1分钟，72摄氏度延伸2分钟，如此进行30个循环。
2、限制性内切酶切割载体质粒pBBR1MCS-2(R.e)和yafH基因的PCR产物3、用T4连接酶16摄氏度条件下将yafH基因连接入质粒载体中，具体的技术方案为100ng载体质粒pBBR1MCS-2(R.e)片段与150ngyafH基因的PCR产物片段加入T4连接酶后在16摄氏度条件下连接24小时，电击法转化大肠杆菌S17-1并用含有卡那霉素的抗性平板进行筛选验证。
4、接合转化法将质粒转入菌株嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)中，具体的技术方案为将供体菌大肠杆菌S17-1和受体菌嗜水气单胞菌分别培养后各取0.2ml滴加在LB平板的同一点上并正置培养，培养24小时后用pH7.0的磷酸缓冲液将菌苔洗下，洗下的菌液涂布于含氨苄青霉素和卡那霉素的双抗性平板上，24小时后挑取单克隆进行验证，得到重组嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)WQ CGMCC №0911。
实施例2、生产高比例3HHx的3HB和3HHx共聚物(PHBHHx)的小试研究发酵培养基(g/L)4g/L(NH4)2SO4，0.2g/L MgSO4，9.65g/L Na2HPO4·12H2O，2.65g/L KH2PO4，月桂酸和1ml/L微量元素(1mol/L HCl中(g)0.02 FeCl3·6H2O，0.01 CaCl2，0.03 CuSO4·5H2O，0.05 MnCl2·4H2O，0.1 ZnSO4·7H2O)，pH6.8。
以150ml接种量将实施例1得到的重组嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)WQCGMCC №0911接入3升上述发酵培养基发酵罐中，以分批培养的方式在30℃培养48小时。收集菌体，提取共聚物(PHBHHx)。
所得到的产物经分析验证为含3HHx11.7mol％的3-羟基丁酸(3HB)和3-羟基己酸(3HHx)共聚物(PHBHHx)。检测方法如下称取25mg干细胞，加入2ml氯仿和2ml含3％浓硫酸的甲醇100摄氏度酯化4小时，酯化后的液体加入1ml水，震荡后取下层有机相进行气相色谱检测。计算得到PHA含量占细胞干重的56.9％，其中3HHx的摩尔百分含量为11.7mol％。发酵结果见图2。
权利要求
1.重组嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)WQ CGMCC №0911。
2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于所述菌株是一种生产高比例3-羟基己酸的3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物的重组菌株。
3.根据权利要求1或2所述的菌株，其特征在于所述菌株导入了yafH基因，具有以脂肪酸为底物合成PHA的能力。
4.根据权利要求3所述的菌株，其特征在于所述yafH基因来自大肠杆菌JM109。
5.一种构建权利要求1所述菌株的方法，包括以下步骤1)将yafH基因插入载体质粒中，构建重组质粒；2)用所构建的重组质粒转化具有以脂肪酸为底物合成PHA能力的嗜水气单胞菌，得到重组菌株WQ CGMCC №0911。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述重组质粒的构建包括1)含有yafH基因的DNA片段的PCR扩增；2)限制性内切酶切割载体质粒和基因yafH；3)将yafH基因插入所述载体质粒中。
8.一种生产含高比例3-羟基己酸的3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物的方法，是发酵嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)WQ CGMCC №0911，并自发酵液中获得共聚物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述发酵的温度为25-45℃，发酵的pH值为5.5-8.5。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于所述发酵为分批培养的方式或流加培养的方式。
全文摘要
本发明公开了一株用于生产聚羟基脂肪酸酯的工程菌及其构建方法与应用。本发明提供的生产高比例3－羟基己酸(3HHx)的3－羟基丁酸(3HB)和3－羟基己酸(3HHx)共聚物(PHBHHx)的重组菌株是导入了yafH基因的，具有以脂肪酸为底物合成PHA能力的微生物，是重组嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)WQ CGMCC № 0911。该重组菌株的构建方法包括1)将yafH基因插入载体质粒中，构建重组质粒；2)用所构建的重组质粒转化具有以脂肪酸为底物合成PHA能力的嗜水气单胞菌，得到重组菌株WQ CGMCC № 0911。本发明还提供了利用该重组菌株生产含高比例3－羟基己酸(3HHx)的共聚物(PHBHHx)方法。本发明创造性地采用基因重组微生物发酵生产高3HHx比例的共聚物，具有广阔的实际应用前景。
文档编号C12N1/21GK1570085SQ0314666
公开日2005年1月26日 申请日期2003年7月11日 优先权日2003年7月11日
发明者陈国强, 卢晓云 申请人:清华大学