高效表达两种不同类型肝细胞生长因子的杂合肝细胞生长因子基因的制作方法

文档序号:447806阅读:183来源:国知局
专利名称:高效表达两种不同类型肝细胞生长因子的杂合肝细胞生长因子基因的制作方法
技术领域
本发明涉及高效的肝细胞生长因子(HGF),其同时表达两种不同类型的HGF。
背景技术
本发明涉及通过在HGF cDNA的外显子4和5之间插入一个固有的或外源的内含子来制备杂合HGF基因,具有比HGF cDNA更高的表达效率并且同时表达两种不同类型的HGF和dHGF(缺失突变的HGF)。
HGF是一种称作分散因子的肝素结合糖蛋白。编码HGF的基因位于染色体721.1上,包含18个外显子和17个内含子,具有SEQ ID NO1的核苷酸序列(Seki T等,基因102213-219,1991)。从HGF基因中转录得到一个约6kb的转录本,然后由此合成由728个氨基酸组成的HGF前体多肽。同时,由HGF基因的另一种剪接还合成由723个氨基酸组成的dHGF前体多肽。无生物活性的前体被血清中的蛋白酶转化成活性形式的二硫键连接的异二聚体。在异二聚体中,高分子量的α链形成四个三环域结构域和类似激活前(preactivated)的血纤维蛋白溶酶原的肽区域的N末端发卡环。三个二硫键环结构的三环结构域由约80个氨基酸组成,在蛋白-蛋白相互作用中起重要作用。低分子量的β链形成无活性的丝氨酸蛋白酶样结构域。由723个氨基酸组成的dHGF是在α链的第一个三环域结构域中缺失5个氨基酸的多肽,即F、L、P、S和S。
最近报道,HGF和dHGF都具有一些生物学功能,如促进上皮细胞、黑素细胞和内皮细胞的生长和形态发生。但是,它们在免疫学和生物学特征方面是不同的。
例如,在促进人脐带内皮细胞、动脉平滑肌细胞和NSF-60(鼠成髓细胞)的DNA合成方面,HGF的活性比dHGF分别高20倍、10倍和2倍。在促进LLC-PKI(猪肾脏上皮细胞)和OK(负鼠肾脏上皮细胞)和小鼠间质细胞的DNA合成方面,dHGF的活性比HGF分别高3倍和2倍。HGF在PBS的溶解性比dHGF高70倍。一些抗dHGF的单克隆抗体仅识别dHGF,而不识别HGF或还原形式的dHGF,这暗示HGF和dHGF的结构是不同的。因此,体内同时合成HGF和dHGF表明它们在生物学上相互影响(Shima,N.等,生物化学和生物物理学研究通讯(Biochemical and Biophysical Research Communications)200808-815,1994)。
由来自中胚层的细胞分泌的HGF具有多种生物学功能,如1)诱导上皮细胞形成管状结构;2)在体内外刺激内皮细胞形成血管;3)由于其抗凋亡的活性,再生肝脏和肾脏;4)形成肾脏、卵巢和睾丸;5)控制骨生成;6)刺激造血前身红细胞的生长和分化;和7)神经细胞萌发轴突(Stella,M.C.和Comoglio,P.M.,国际生物化学和细胞生物学杂志(The International Journal of Biochemistry & CellBiology)311357-1362,1999))。基于这些不同的功能,HGF或编码HGF的基因可以被开发成用于治疗缺血性的或肝脏的疾病的治疗剂。实际上,体内HGF可能以HGF或dHGF形式存在,因此,共表达HGF和dHGF对于最大化治疗效果来说是重要的。因此,本发明目的在于开发杂合HGF基因,能够同时表达具有高度基因治疗效果的HGF和dHGF。
发明概述因此,本发明的第一个目的在于提供同时表达两种不同类型的HGF的杂合HGF基因。
按照本发明的一个方面,提供在HGF cDNA的外显子4和5之间插入一个固有的或外源的内含子的杂合HGF。
本发明的另一个目的在于提供包含杂合HGF基因的重组载体和用上述载体转化的微生物。
本发明还有一个目的在于提供一种用于治疗或预防缺血性的或肝脏的疾病的药物组合物,其包含HGF基因。
附图描述当结合附随的附图,根据对发明的描述,本发明的上述和其他的目的及特征将是显而易见的,这些附图分别表示附

图1说明基因片段的位置的HGF-X原型的示意图,附图2从HepG2基因组DNA中克隆基因片段的过程,附图3从人胎盘cDNA中克隆基因片段的过程,附图4A和4B制备表达载体pCK-HGF-X的过程,附图5制备表达载体pCK-cHGF和pCK-dHGF的过程,附图6制备表达载体pCP-HGF-X家族的过程,附图7制备表达载体pCP-cHGF和pCP-dHGF的过程,附图8pCP-cHGF、pCP-dHGF和pCP-HGF-X的基因表达水平,附图9通过在12%聚丙烯酰胺凝胶上电泳观察pCP-cHGF、pCP-dHGF和pCP-HGF-X的基因表达模式,附图10体内pCP-cHGF、pCP-dHGF和pCP-HGF-X7的基因表达水平,附图11分别被施用pCP和pCP-HGF-X7的两组兔子的大脑血管发生。
发明详述本发明的杂合肝细胞生长因子(HGF)基因包含对应于外显子1-18和在其外显子4和5之间插入固有的或外源的内含子cDNA的cDNA。该内含子包含固有的内含子片段或者重组序列。
本发明的包含固有内含子的杂合HGF基因的一个实施方案长7112bp,具有SEQ ID NO2的序列。杂合HGF基因同时表达HGF和dHGF,具有比HGF cDNA更高的表达效率。密码子简并性使得本发明的杂合HGF基因的编码区和/或非编码区能够被修饰或改变,而不改变蛋白质的氨基酸序列和基因的表达。
因此,与SEQ ID NO2的杂合HGF基因实质上相同的多核苷酸及其片段落入本发明的保护范围内。“实质上相同”是指序列同源性不低于80%,优选不低于90%,和更加优选的不低于95%。
杂合HGF基因可能包含可选择地具有被插入到HGF cDNA的外显子4和5之间的小重组序列的固有内含子片段。在此,这种包含固有内含子片段的杂合HGF基因命名为“HGF-X”。分别具有SEQ ID No19-21的HGFX-6、HGF-X7和HGF-X8是优选的。
按照已知的遗传工程方法,本发明的杂合HGF基因被合成和插入到表达载体中。然后该载体被导入到合适的宿主细胞如大肠杆菌和酵母中。例如,大肠杆菌ToplOF用本发明的HGF-X7基因转染。然后得到的大肠杆菌ToplOF’pCK-HGFX7和大肠杆菌ToplOF’pCP-HGFX7在2002年3月12日被保藏,保藏号分别为KCCM-10361和KCCM-10362。
采用被转化的细胞,高水平地制备本发明的基因及其编码的蛋白质。
根据宿主细胞,本发明的载体可选择性地包含调控基因表达的序列如启动子或终止子、自我复制序列和分泌信号。
此外,本发明包含用于治疗或预防缺血性和肝脏疾病的药物组合物,其包含作为活性成分的杂合HGF基因或包含该基因的载体。优选地,该组合物被配制成用于注射。
本发明的组合物还包含药学上可接受的载体。制药领域中的任何常规操作被用于制备口服制剂如片剂、胶囊、药丸、颗粒、悬浮液和溶液;注射剂型如溶液、悬浮液、或注射前与蒸馏水混合的干粉;局部应用制剂如药膏、面霜和洗液;以及其他制剂。
通常用于制药领域的载体可以被应用于本发明的组合物中。例如,口服施用的制剂包括黏合剂、乳化剂、分解剂、赋形剂、溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、着色剂和香味剂。注射制剂包括防腐剂、拮抗剂(unagonizing agents)、溶解剂或稳定剂。制备局部施用的制剂包括碱、赋形剂、滑润剂或防腐剂。任何本领域知晓的适宜制剂(雷名顿药物科学(最新版),Mack出版公司,Eaton PA))可被用于本发明。
本发明的组合物可以作为多种口服和胃肠外制剂在临床中应用。适宜的制剂可以采用这种赋形剂如添加剂、加强剂、黏合剂、润湿剂、分解剂和表面活性剂或稀释剂来制备。用于口服施用的固体制剂包括药丸、片剂、隔离剂、颗粒和胶囊。这些固体制剂可以通过将一种或多种赋形剂如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖和凝胶与二苯基丁基化的(dibenzylbuthyllacton)木脂体衍生物混合来制备。另外,本发明的制剂中包括滑润剂如硬脂酸镁和滑石粉。用于口服施用的液体制剂包括悬浮液、溶液、乳剂和糖浆。除了常规的简单稀释剂如水和液体石蜡外,这些制剂可以含有润湿剂、甜味剂、芳香剂和防腐剂。胃肠外施用的制剂包括灭菌的水溶液、悬浮液、乳剂、可选择的冻干处理和栓剂。不溶液水的赋形剂和悬浮剂包括植物油如丙二醇、聚乙二醇和橄榄油和可注射的酯如乙基油酸盐。Witepsole、Macrogol、Tween61、可可油、甘油月桂酸酯和甘油明胶可以用作栓剂的基础。
本发明的组合物可以口服施用或者通过胃肠外途径如静脉内、肌肉内、皮下、腹腔内、动脉内注射或灌注施用或者局部地通过直肠、鼻内、呼吸或眼内施用。
应当理解,本发明的组合物的常规日剂量应该根据不同的相关因素包括治疗的疾病、选择的施用路径、年龄、性别和各个患者的体重、患者症状的严重程度来确定,可以一次施用或者分开施用。因此,日剂量无论如何不应当被解释为对本发明的保护范围的限制。
下面的实施例被给出仅仅用于说明的目的,而不是用于限定本发明的保护范围。
实施例1制备编码人HGF的杂合基因构建体(1)得自基因组DNA的HGF基因片段的克隆将人HepG2细胞(ATCC保藏号HB-8065)悬浮在TES缓冲液中(10mM Tris-HCl;1mM EDTA;0.7%SDS),并在50℃下用400μg/ml的蛋白酶K处理1h。接着按照本领域常规方法,通过苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀,从细胞悬浮液中提取基因组DNA。
在PCR扩增中,被提取的基因组DNA用作模板DNA。作为引物对,采用合成的SEQ ID NO3和4的核苷酸来获得DNA片段,其分别含有HGF基因片段2(HGF-F2),SEQ ID NO3和5;HGF-F3,SEQ ID NO6和7;HGF-F5,SEQ ID NO8和7;HGF-F7,SEQ ID NO9和7;HGF-F8,SEQ IDNO10和7;HGF-F6,(附图1)。通过将1μl模板DNA、1μl各种引物(10pmol/1μl)、10μl dNTP(10mM)、3.5单位扩增高保真酶(GibcoBRL,美国)和10μl酶缓冲液混合,并用蒸馏水将最终体积调节到100μl来制备PCR扩增混合物。进行30个循环的PCR扩增,每个循环由94℃下1min、55℃下1min和72℃下30sec组成。在此所用的引物和由此得到的被扩增的基因片段示于表1中。
表1
被扩增的HGF-F2包含范围在SEQ ID NO2的人HGF cDNA原型(HGF-X1;由外显子1到4-内含子4-外显子5到18构成)的从392到2247的序列;HGF-F3是范围在从392到727的序列;HGF-5是范围在从2229到5471的序列;HGF-F6是范围从5117到5471的序列;HGF-F7是范围从3167到5471的序列;和HGF-F8是范围从4167到5471的序列。
每个被扩增的HGF基因片段被插入到pGEM-T easy载体(Promega,威斯康星州,美国)的多个克隆位点上来分别得到pGEM-Teasy-HGF-F2、pGEM-T easy-HGF-F3、pGEM-T easy-HGF-F5、pGEM-T easy-HGF-F6、pGEM-T easy-HGF-F7和pGEM-Teasy-HGF-F8(附图2)。通过序列分析来确认被扩增的HGF基因片段的核苷酸序列。
(2)得自cDNA的HGF基因片段的克隆在PCR扩增中,在与实施例1所描述的相同条件下,人胎盘cDNA(Clontech,CA,美国)被用作模板DNA。作为引物对,合成的SEQ IDNO11和12,和SEQ ID NO13和14的寡核苷酸分别用来获得包含在HGF-F1和HGF-F4中的DNA片段。此外,HGF基因(cHGF)和缺失的HGF基因(dHGF)的cDNAs含有的DNA片段分别用合成的SEQ ID NO15和16的寡核苷酸作为引物对进行扩增。dHGF基因是缺失5个碱基序列的HGF基因。
在此所用的引物和由此得到扩增基因片段示于表2中。
表2
被扩增的HGF-F1和HGF-F4分别包含SEQ ID NO2的人HGFcDNA原型范围在从1到402和从6533到7113的核苷酸序列。HGF基因cDNA包含SEQ ID NO1的人HGF基因的范围在从1-2184的核苷酸序列,而dHGF基因cDNA除了缺失范围在从483到495的序列外,具有与HGF基因cDNA相同的序列。
每个HGF基因的扩增片段被插入到pGEM-T easy载体(Promega,威斯康星州,美国)的多个克隆位点上来分别得到pGEM-T easy-HGF-F1、pGEM-T easy-HGF-F4、pGEM-T easy-cHGF和pGEM-T easy-dHGF(附图3)。通过序列分析来确认人HGF基因片段、HGF基因cDNA和dHGF基因cDNA的核苷酸序列。
(3)制备杂合HGF基因构建体通过如下将步骤(1)和(2)中克隆的HGF基因片段组合来制备基因组DNA和cDNA的杂合HGF基因构建体(附图4A和4B)。
质粒pGEM-T-easy-HGF-F1用HindIII/BamHI处理来获得HGF-F1。质粒pCK(见PCT国际
发明者金种默, 朴银珍, 韩熊, 柳承信, 金善荣 申请人:百疗医株式会社
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