专利名称：胞苷5'－二磷酸胆碱的制备方法
技术领域：
本发明涉及胞苷5′-二磷酸胆碱的制备方法。
背景技术：
胞苷5′-二磷酸胆碱(以下简写为CDP-胆碱)是磷脂的一种磷脂酰胆碱(卵磷脂)的生物合成中间体，用于治疗头部外伤、伴随脑手术所出现的意识障碍、帕金森病以及脑中风偏瘫等。
CDP-胆碱的制备法已知的有化学合成法、利用微生物菌丝体的通过胞苷5′-三磷酸(以下简写为CTP)、胞苷5′-二磷酸(以下简写为CDP)或胞苷5′-一磷酸(以下简写为CMP)等的制备法(特公昭48-2358、特公昭48-40758、特公昭48-2359)，但是无论哪一种方法，都具有收率低、原材料价格高等问题。
利用微生物进行的生产方法中，报道有利用基因重组微生物通过乳清酸以及胆碱或磷酸胆碱的制备方法(特开平5-276974)、通过尿苷5′-一磷酸(以下简写为UMP)以及胆碱(或磷酸胆碱)的制备方法(WO99/49073)、通过CMP以及胆碱的制备方法(特开2001-103973)。由于乳清酸的价格较低，以此作为反应底物的制备原料是相当良好，但如果可以利用更廉价的原材料的话，生产成本可以进一步下降。但是，到目前为止利用作为更低价的底物-尿嘧啶的方法并未被人们所了解。
发明内容
本发明目的是提供一种CDP-胆碱的高效率的制备方法。
本发明涉及以低价的胆碱、磷酸胆碱或它们的盐以及尿嘧啶作为底物的CDP-胆碱的新的制备方法。
即，本发明涉及以下(1)～(8)个方面。
(1)CDP-胆碱的制备方法，其特征在于将具有通过胆碱、磷酸胆碱或它们的盐以及尿嘧啶生成CDP-胆碱活性的生物催化剂在水溶性介质中，接触胆碱、磷酸胆碱或其盐以及尿嘧啶，在所述水溶性介质中使CDP-胆碱生成积累，并从所述水溶性介质中回收(获取)CDP-胆碱。
(2)上述(1)的制备法，其中所述生物催化剂为含有选自由微生物、动物细胞、植物细胞、昆虫细胞组成的组的细胞、所述细胞的培养液或所述细胞的处理物的生物催化剂。
(3)上述(2)的制备法，其中所述细胞选自属于由埃希氏杆菌属(Escherichia)、沙雷氏菌属(Serratia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链球菌属(Streptococcus)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、节杆菌属(Arthrobacter)、金杆菌属(Aurebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、棍状杆菌属(Clavibacter)、棒杆菌属(Corynebacterium)、短小杆菌属(Curtobacterium)、微杆菌属(Microbacterium)、脂肪杆菌属(ピメロバクタ一属)(Pimerobacter)、糖酵母属(Saccharomyces)、裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)、克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)、丝孢酵母属(Trichosporon)、许旺氏酵母属(Schwanniomyces)、毕赤氏酵母属(Pichia)以及假丝酵母属(Candida)组成的组的1个或2个属以上的微生物。
(4)上述(2)的制备法，其中所述细胞选自属于由埃希氏杆菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、棒杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)以及糖酵母属(Saccharomyces)组成的组的1个或2个属以上的微生物。
(5)上述(2)的制备法，其中所述细胞是属于棒杆菌属(Corynebacterium)的微生物以及埃希氏杆菌属(Escherichia)的微生物。
(6)上述(3)～(5)中任一项的制备法，其中所述棒杆菌属的微生物是产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)。
(7)上述(3)～(5)中任一项的制备法，其中所述埃希氏杆菌属的微生物是大肠杆菌(Escherichia coli)。
(8)上述(2)的制备法，其特征在于所述细胞是转导了编码具有从尿苷5′-三磷酸(以下简写为UTP)生成CTP活性的胞苷5′-三磷酸合成酶(以下简写为PyrG)的DNA、编码具有通过胆碱生成磷酸胆碱的活性的胆碱激酶(以下简写为CKI)的DNA、或者编码具有通过CTP和磷酸胆碱生成CDP-胆碱活性的胆碱磷酸胞苷转移酶(以下简写为CCT)的DNA而得到的转化体。
本发明中所使用的生物催化剂，只要是具有通过胆碱、磷酸胆碱或它们的盐以及尿嘧啶生成CDP-胆碱的活性(以下简写为CDP-胆碱生成活性)的生物催化剂，都可以使用。
如此的生物催化剂可以列举具有CDP-胆碱生成活性的细胞、所述细胞的培养液、所述细胞的处理物等。
作为细胞，只要是具有CDP-胆碱生成活性的细胞，任何细胞都可以使用。例如，可以列举微生物、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等，微生物优选使用。
微生物可以列举属于埃希氏杆菌属(Escherichia)、沙雷氏菌属(Serratia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链球菌属(Streptococcus)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、节杆菌属(Arthrobacter)、金杆菌属(Aurebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、棍状杆菌属(Clavibacter)、棒杆菌属(Corynebacterium)、短小杆菌属(Curtobacterium)、微杆菌属(Microbacterium)、脂肪杆菌属(Pimerobacter)、糖酵母属(Saccharomyces)、裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)、克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)、丝孢酵母属(Trichosporon)、许旺氏酵母属(Schwanniomyces)、毕赤氏酵母(Pichia)以及假丝酵母属(Candida)等属的微生物。
属于埃希氏杆菌属(Escherichia)的微生物可以列举大肠杆菌(Escherichiacoli)MM294、大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue、大肠杆菌DH1、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌KY3276、大肠杆菌W1485、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌No.49、大肠杆菌W3110、大肠杆菌NY49、大肠杆菌GI698、大肠杆菌TB1等属于大肠杆菌(Escherichiacoli)的微生物。沙雷氏菌属(Serratia)的微生物可以列举属于无花果沙雷氏菌(Serratia ficaria)、居泉沙雷氏菌(Serratiafonticola)、解凝(液化)沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)等的微生物。芽孢杆菌属(Bacillus)的微生物可以列举属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefacines)等的微生物。假单胞菌属(Pseudomonas)可以列举属于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的微生物。链球菌属(Streptococcus)的微生物可以列举属于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)等的微生物。中华根瘤菌属(Sinorhizobium)的微生物可以列举属于苜宿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)等的微生物。嗜血杆菌属(Haemophilus)的微生物可以列举属于猪流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)等的微生物。节杆菌属(Arthrobacter)的微生物可以列举属于柠檬节杆菌(Arthrobacter citreus)、球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)等的微生物。金杆菌属(Aurebacterium)的微生物可以列举属于浅黄金杆菌(Aureobacterium flavescens)、天牛金杆菌(Aureobacteriumsaperdae)、砖红色金杆菌(Aureobacterium testaceum)等的微生物。短杆菌属的微生物可以列举属于短杆菌(Brevibacteriumimmariophilum)、解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)、黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)、乳发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)的微生物。纤维单胞菌属的微生物可以列举属于产黄纤维单胞菌(Cellulomonas flavigena)、强壮纤维单胞菌(Cellulomonas carta)等微生物。棍状杆菌属的微生物可以列举属于密执安棍状杆菌(Clavibacter michiganensis)、拉氏棍状杆菌(Clavibacter rathayi)等的微生物。棒杆菌属的微生物可以列举属于谷氨酸棒杆菌ATCC13032、谷氨酸棒杆菌ATCC13869等的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，产氨棒杆菌ATCC6872、产氨棒杆菌ATCC21170等的产氨酸棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)，嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870等的嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)等的微生物。短小杆菌属的微生物可以列举白色短小杆菌(Curtobacterium albidum)、柠檬色短小杆菌(Curtobacteriumcitreum)、藤黄短小杆菌(Curtobacterium luteum)等的微生物。微杆菌属的微生物可以列举属于嗜氨微杆菌ATCC15354等的嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)、乳微杆菌(Microbacteriumlacticum)、蛾微杆菌(Microbacterium imperiale)等微生物。脂肪杆菌属的微生物可以列举属于简单脂肪杆菌(Pimerobacter simplex)等的微生物。
糖酵母属的微生物可以列举属于啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)等的微生物。裂殖糖酵母属的微生物可以列举属于栗酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)等的微生物。克鲁维氏酵母属的微生物可以列举属于乳克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)等的微生物。丝孢酵母属的微生物可以列举属于茁芽丝孢酵母(Trichosporon pullulans)等的微生物。许旺氏酵母属的微生物可以列举属于河岸许旺氏酵母(Schwanniomyces alluvius)等的微生物。毕赤氏酵母的微生物可以列举属于金合欢毕赤氏酵母(Pichia acaciae)等的微生物。假丝酵母属的微生物可以列举属于产朊假丝酵母(Candidautilis)等的微生物。
微生物可以列举上述的微生物，但优选使用属于埃希氏杆菌属、芽孢杆菌属、棒杆菌属、短杆菌属、糖酵母属的微生物，更优选使用属于棒杆菌属或短杆菌属的微生物。
动物细胞可以列举人细胞的Namalwa细胞、猴细胞的COS细胞、中国仓鼠细胞的CHO细胞或HBT5637(特开昭63-299)等。
昆虫细胞可以列举，例如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)的卵巢细胞Sf9、Sf21(棒状病毒表达载体，实验室手册(BaculovirusExpression Vectors，A Laboratory Manual)W.H.Freeman andCompany，New York，1992)、粉纹夜蛾(Trichoplusiani)的卵巢细胞High 5(Invitrogen公司制造)等。
植物细胞可以列举为烟草、马铃薯、西红柿、胡萝卜、大豆、甘蓝、苜宿、稻、小麦、大麦等的植物细胞。
当细胞不具有CDP-胆碱生成活性时，在所述细胞中通过常规方法转导编码与CDP-胆碱生成活性有关的酶的DNA，或者可以通过与具有所述活性的其它细胞进行融合，制备成具有所述活性的细胞，并可以使用该细胞。优选使用通过以下所示方法在细胞中转导编码与CDP-胆碱生成活性有关的酶的DNA而得到的转化体。
与CDP-胆碱生成活性有关酶可以列举为，例如，具有从尿嘧啶反应生成尿苷活性的尿苷磷酸化酶(EC 2.4.2.3)、具有从尿苷生成UMP活性的尿苷激酶(EC 2.7.1.48)、具有从UMP生成尿苷5′-二磷酸(以下简写为UDP)活性的尿苷酸·胞苷酸激酶(EC 2.7.4.14)、具有从UDP生成UTP活性的核苷二磷酸激酶(EC 2.7.4.6)、具有从UTP生成CTP活性的胞苷5′-三磷酸合成酶(EC 6.3.4.2)(PyrG)、具有从胆碱生成磷酸胆碱活性的胆碱激酶(EC 2.7.1.32)(CKI)、具有从CTP和磷酸胆碱生成CDP-胆碱活性的胆碱磷酸胞苷转移酶(EC 2.7.7.15)(CCT)等。
作为编码与CDP-胆碱生成活性有关的酶的DNA，可以列举编码上述酶的DNA，适合使用编码PyrG、CKI或CCT的DNA。
编码PyrG的DNA是由大肠杆菌染色体被克隆化，其全部碱基序列已被确定(J.Biol.Chem.，261，5568(1986))。编码PyrG的DNA的来源可以列举为在大肠杆菌载体pUC8(Gene，19，259(1982))的多克隆位点的SmaI-PstI位点上插入包含编码大肠杆菌由来的PyrG的DNA的2426bpNruI-PstI片段的质粒pMW6。
编码CCT的DNA其全部碱基序列是已确定的(Eur.J.Biochem.，169，477(1987))。作为编码CCT的DNA的供应源，可以列举为在大肠杆菌载体pUC18(Gene，33，103(1985))的多克隆位点SmaI位点上插入含有编码酵母由来的CCT的DNA 1296碱基对(以下简写为bp)的DraI片段的质粒pCC41((日本)生化学，60，701(1988))等。
编码CKI的DNA也同样通过酵母染色体克隆化而得到，其全部碱基序列是已确定的(J.Biol.Chem.，264，2053(1989))。作为编码CKI的DNA的供应源，可以列举酵母以及大肠杆菌的穿梭载体YEpM4(Mol.Cell.Biol.，7，29(1987))中插入含有编码酵母由来的CKI的DNA 2692bp的PstI-HindIII片段的质粒pCK1D。
根据上述编码有关CDP-胆碱生成活性酶的DNA的碱基序列的信息，例如，根据《分子克隆实验手册》(Molecular Cloning，A LaboratoryManual)，第3版，Sambrook等编辑，Cold Spring Harbor Laboratory(2001)(以下简写为分子克隆第3版)，获得这样的DNA，并在表达载体中整合所述DNA，制备重组体DNA，以上述细胞作为宿主细胞进行转化，通过获得的转化体可以容易地获得具有CDP-胆碱生成活性的生物催化剂。
例如，通过上述质粒pMW6、质粒pCC41或质粒pCK1D获得编码PyrG、CCT或CKI的DNA，以所得到的DNA为基础，根据需要制备包括编码该多肽部分的合适长度的DNA片段。
另外，根据需要，制备碱基取代的DNA，使其编码有关CDP-胆碱生成活性的酶部分的碱基序列成为在宿主细胞的表达中最适合的密码子。将所述DNA在有关CDP-胆碱生成活性酶的有效表达中是有用的。
通过将编码与CDP-胆碱生成活性有关酶的DNA片段、或全长DNA插入到合适的表达载体的启动子的下游，制备成重组载体。这时，各DNA片段可以分别各自插入到表达载体中，也可以将多个DNA插入同一个表达载体中。
将所述重组载体转导到适合所述表达载体的宿主细胞中。
宿主细胞可以列举为上述的细胞。
作为表达载体，由于所述宿主细胞中可以自我复制以致可以整合至染色体中，也可以使用在编码与CDP-胆碱生成活性有关酶的DNA的可转录位置中含有启动子的表达载体。
当使用细菌等原核生物作为宿主细胞时，由含有编码本发明多肽的DNA组成的重组载体在原核生物中可以自我复制，同时，优选由启动子、核糖体结合序列、本发明的DNA、转录终止序列构成的载体。也可以含有控制启动子的基因。
表达载体可以列举，例如，pBTrp2、pBTac1、pBTac2(均由BoehringerMannheim公司市售)、pKK233-2(Pharmacia公司生产)、pSE280(Invitrogen公司生产)、pGEMEX-1(Promega公司制造)、pQE-8(QIAGEN公司制造)、pKYP10(特开昭58-110600)、pKYP200(Agric.Biol.Chem.，48，669(1984))、pLSA1(Agric.Biol.Chem.，53，277(1989))、pGEL1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，4306(1985))、pBluescript II SK(-)(Stratagene公司制造)、pTrs30(由大肠杆菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制备)、pTrs32(由大肠杆菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)制备)、pGHA2(由大肠杆菌IGHA2(FERM B-400)制备，特开昭60-221091)、pGKA2(由大肠杆菌IGKA2(FERM BP-6798)制备，特开昭60-221091)、pTerm2(US4686191、US4939094、US5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400(J.Bacteriol.，172，2392(1990))、pGEX(Pharmacia公司制造)、pET系统(Novagen公司制造)等。
作为启动子只要在宿主细胞中发挥功能的都可以。可以使用例如，trp启动子(Ptrp)、lac启动子、PL启动子、PR启动子、T7启动子等的来自大肠杆菌或噬菌体等的启动子。此外，也可以使用如将Ptrp成为2个直列的启动子(Ptrp×2)、tac启动子、lacT7启动子、letI启动子那样的人为设计改变的启动子等。
优选使用将核糖体结合序列Shine-Dalgarno序列与起始密码子间距调节为适当距离(如6-18碱基)的质粒。
本发明的重组载体中，编码CDP-胆碱生成活性有关的酶的DNA的表达中，转录终止序列并不一定是必要的，但优选在结构基因的正下方设置有转录终止序列。
作为转导重组载体的方法，只要是将DNA转导入上述宿主细胞的方法均可以使用，可以列举如，使用钙离子的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69，2110(1972))、原生质体法(特开昭63-248394)、或Gene，17，107(1982)或Molecular & General Genetics，168，111(1979)中记载的方法等。
当使用酵母细胞作为宿主细胞时，表达载体可以列举为YEP13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)、pHS19、pHS15等。
作为启动子，只要在酵母菌株中可以表达的都可以使用，例如可以列举己糖激酶等的糖降解体系基因的启动子、PH05启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子、gal1启动子、gal10启动子、热休克多肽启动子、MFα1启动子、CUP1启动子等。
作为重组载体的转导法，只要是将DNA转导至酵母中的方法都可以使用，例如可以列举电穿孔术(Methods Enzymol.，194，182(1990))、原生质球法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1929(1978))、乙酸锂法(J.Bacteriology，153，163(1983))、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1929(1978)中所记载的方法等。
当使用动物细胞作为宿主细胞时，作为表达载体可以列举为例如，pcDNAI、pcDM8(フナコシ公司制造)、pAGE107(特开平3-22979、Cytotechnology，3，133(1990))、pAS3-3(特开平2-227075)、pCDM8(Nature，329，840(1987))、pcDNAI/Amp(Invitrogen公司制造)、pREP4(Invitrogen公司制造)、pAGE103(J.Biochem.，101，1307(1987))、pAGE210等。
作为启动子，只要在动物细胞中能行使功能的均可以使用，可以列举例如，细胞肥大病毒(CMV)的IE(立即早期)基因的启动子、SV40的初期启动子、逆转录病毒启动子、金属硫蛋白启动子、热休克启动子、SRα启动子等。另外，人CMV的IE基因的增强子也可以与启动子一起使用。
向动物细胞中转导重组载体的方法，只要是将DNA转导至动物细胞的方法均可以使用，可以列举例如，电穿孔术法(Cytotechnology，3，133(1990))、磷酸钙法(特开平2-227075)、脂质转染法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413(1987))、Virology52，456(1973)等。
当使用昆虫细胞作为宿主细胞时，根据如现代分子生物学方法(Current Protocols in Molecular Biology)、杆状病毒表达载体实验手册(Baculovirus Expression Vectors，A LaboratoryManual)，W.M.Freeman and Company，New York(1992)、Bio/Technology，6，47(1988)等记载的方法，可以表达多肽。
即，可以在昆虫细胞中共同转导重组基因载体以及杆状病毒，在昆虫细胞培养上清液中得到重组病毒后，进一步将该重组病毒在昆虫细胞中感染，从而表达多肽。
可以在该方法中使用的基因转导载体可以列举为，如pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII等(均为Invitrogen公司制造)。
杆状病毒可以使用例如，夜盗蛾科昆虫中感染的病毒-苜宿银纹夜蛾多核型多角体病毒等。
为制备重组病毒，在昆虫细胞中将上述重组基因转导载体以及上述杆状病毒的共同转导法，可以列举为如，磷酸钙法(特开平2-227075)、脂质转染法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413(1987))等。
当使用植物细胞作为宿主细胞时，表达载体可以列举，如T1质粒、烟草花叶病病毒等。
作为启动子可以列举，如花椰菜病毒(CaMV)35S启动子、稻肌动蛋白1启动子等。
重组载体的转导方法，只要将DNA转导至植物细胞的方法均可以使用，例如，可以列举使用农杆菌属(Agrobacterium)(特开昭59-140885、特开昭60-70080、WO94/00977)、电穿孔法(特开昭60-251887)、基因枪(日本特许第2606856，特许第2527813)等方法。
当细胞不具有CDP-胆碱生成活性时，为获得CDP-胆碱生成活性，可以将适当的不同的2种以上细胞进行组合，将其作为具有CDP-胆碱生成活性的细胞使用。
即使当细胞具有CDP-胆碱生成活性时，也可以通过常规方法在该细胞中转导编码与CDP-胆碱生成活性有关的酶的DNA，从而获得CDP-胆碱生成活性增强的细胞。
此外，即使当细胞具有CDP-胆碱生成活性时，也可以组合使用不同的2种以上的细胞。
组合可以列举为，例如，组合属于棒杆菌属的微生物和埃希氏杆菌属的微生物。
当上述细胞是细菌等的原核生物或酵母等的真核生物时，作为所述细胞进行培养的培养基，只要是含有可以使所述细胞同化的碳源、氮源、无机盐类等，使所述细胞的培养能够有效地进行的培养基，无论天然培养基还是合成培养基均可使用。
作为碳源物质，只要可以使所述细胞同化的的均可以使用，可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、含有这些糖的糖蜜、淀粉或淀粉加水分解物质等的碳水化合物、乙酸、丙酸等的有机酸、乙醇、丙醇等的醇类等。
作为氮源物质，可以使用氨、氯化铵、硫酸铵、乙酸铵、磷酸铵等的无机酸或有机酸铵盐；其它的含氮化合物胨、肉提取物、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、大豆粕以及大豆粕的水解物、各种发酵菌体以及其消化物质等。
无机盐，可以使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。
培养是在振荡培养或深部通气搅拌培养等的好氧条件下进行。培养温度以15-50℃为合适，培养时间通常为16小时-7天，培养中的pH值优选保持在3.0～9.0。使用无机或有机酸、碱溶液、尿素、碳酸钙、氨水等进行pH的调整。
当细胞为动物细胞时，可以使用一般常用的RPMI1640培养基(TheJournal of the American Medical Association，199，519(1967))、Eagle氏的MEM培养基(Science，122，501(1952))、Dulbecco改良MEM培养基(Virology，8，396(1959))、199培养基(Proceeding ofthe Society for the Biological Medicine，73，1(1950))或者在这些培养基中添加胎牛血清等的培养基。
通常在pH6～8、30～40℃、5％CO2存在等的条件下进行1～7天的培养。
当所述细胞是昆虫细胞时，可以使用一般常用的TNM-FH培养基(Pharmingen公司制造)、Sf-900 II SFM培养基(Life Technologies公司制造)、ExCel1400、ExCel1405(均由JRH Biosciences公司制造)以及Grace氏昆虫培养基(Nature，195，788(1962))等。
通常在pH6～7、25～30℃等条件下进行1～5天的培养。
当所述细胞是植物细胞时，可以使用一般常用的MS培养基、White培养基、或在这些培养基中添加生长激素、细胞分裂素等、植物激素的培养基。
通常在pH5～9、20～40℃等条件下进行3～60天的培养。
当所述细胞为转化体，且为转化所述细胞所使用的重组体DNA持有抗生素抗性基因的情况下，在培养所述细胞的培养基中可以添加对应于所述重组体DNA所持有的抗生素抗性基因的抗生素。
作为生物催化剂，使用2种以上不同的细胞，所述细胞培养液或处理物的情况下，可以使用按照上述方法各自的细胞分别或者同一的培养基中培养获得的细胞。
2种以上不同细胞在同一培养基中进行培养的情况下，可以这些细胞同时培养，也可以1种细胞培养或者培养结束后将剩余的细胞置于所述培养基中培养。
2种以上细胞的组合，可以选自微生物、动物细胞、昆虫细胞或植物细胞的任何细胞的组合，优选与微生物细胞的组合。例如，可以列举微生物与微生物、微生物与动物细胞、微生物与昆虫细胞、或微生物与植物细胞、微生物和动物细胞和植物细胞、微生物和动物细胞和昆虫细胞的组合等，优选微生物与微生物的组合。
例如，微生物与微生物的组合可以是上述微生物的任何组合，可以列举选自属于由埃希氏杆菌属、沙雷氏菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、链球菌属、中华根瘤菌属、嗜血杆菌属、节杆菌属、金杆菌属、短杆菌属、纤维单胞菌属、棍状杆菌属、棒杆菌属、短小菌属、微杆菌属、脂肪杆菌属、糖酵母属、裂殖糖酵母属、克鲁维氏酵母属、丝孢酵母属、许旺氏酵母属、毕赤氏酵母属以及假丝酵母属组成的2种以上的微生物的组合。
例如，可以列举属于棒杆菌属的微生物与属于埃希氏杆菌属的微生物的组合。
作为一种具有CDP-胆碱生成活性的生物催化剂，上述细胞的处理物，可以列举用浓缩机或干燥机等浓缩或干燥处理上述获得的细胞的培养液而获得所述细胞的培养液的浓缩物或干燥物；用过滤或离心分离等方法固液分离所述细胞的培养液而获得的细胞，用干燥机等干燥处理所述细胞而获得所述细胞干燥物；用表面活性剂或有机溶剂等处理所述细胞而获得所述细胞的表面活性剂或有机溶剂处理物；用溶菌酶等细胞溶解酶处理所述细胞而获得的所述细胞的细胞溶解酶处理物等。
可以将所述细胞处理物进一步进行盐析处理、等电点沉淀处理、有机溶剂沉淀处理、透析处理、各种色谱处理等常用的酶纯化手段所得到的粗酶或纯化酶作为细胞处理物来使用。
在使用2种以上细胞的情况时，可以从2种以上的细胞中分别制备获得的细胞处理物分别作为具有CDP-胆碱生物合成活性的生物催化剂使用，也可以将这些细胞处理物混合，其混合物作为具有CDP-胆碱生物合成活性的生物催化剂使用。
此外，也可以将上述细胞或细胞处理物固定在水不溶性的载体或凝胶等上，作为生物催化剂使用。
以下，对CDP-胆碱的制备方法进行描述。
可以通过将上述生物催化物与底物在水溶性介质中进行接触，在所述水溶性介质中生成蓄积CDP-胆碱，从所述水溶性介质中获得CDP-胆碱。
具体地，上述生物催化剂与底物(胆碱或磷酸胆碱或它们的盐，以及尿嘧啶)在水溶性介质中进行混合获得混合物，根据需要，在其混合物中添加其它的成分，pH保持在5～10，优选为pH6～8，在20～50℃保持2～48小时。
生物催化剂的使用量根据所述生物催化剂的比活性等而有所不同。例如，使用细胞培养液或细胞处理物作为生物催化剂的情况下，以离心分离所述培养液或细胞处理物而得到的湿菌体计，相对于尿嘧啶1mg，使用所得到的湿菌体为5～500mg，优选为10～300mg。
胆碱或磷酸胆碱或它们的盐，可以列举例如，胆碱、氯化胆碱、溴化胆碱、碘化胆碱等卤化胆碱、重碳酸胆碱、重酒石酸胆碱、硫酸甲基胆碱、柠檬酸二氢胆碱、磷酸胆碱、氯化磷酸胆碱等磷酸胆碱的卤化物等。优选使用胆碱或磷酸胆碱的卤化物，更优选使用氯化胆碱、氯化磷酸胆碱。
胆碱或磷酸胆碱或它们的盐、以及尿嘧啶可以由化学合成获得，也可以通过发酵法等由微生物制备获得。此外，并不一定要纯粹纯化而获得的，只要不抑制CDP-胆碱生成反应，即使含有盐等的杂质也可以使用。此外也可以使用市售的。
优选胆碱或磷酸胆碱或它们的盐、以及尿嘧啶的浓度为1mmol/L～1mol/L，更优选10～200mmol/L。
根据需要添加的其它成分，可以列举为能量的供体、磷酸离子、镁离子、铵离子、表面活性剂以及有机溶剂等。如果从生物催化剂等能带入这些成分的必要量的情况下，就不需要再添加。
作为能量供体，可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖等的糖类、糖蜜、淀粉水解物、有机酸(丙酮酸、乳酸、乙酸、α-酮戊二酸等)、氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸等)等。优选使用0.02～2.0mol/L的浓度。
磷酸离子，可以使用正磷酸、焦磷酸、三磷酸、四磷酸等的多聚磷酸、聚偏磷酸、磷酸钾、磷酸二钾、磷酸一钠、磷酸二钠等无机磷酸盐等。这些磷酸离子优选在10～500mmol/L的浓度使用。
镁离子，可以使用硫酸镁、硝酸镁、氯化镁等的无机镁盐、柠檬酸镁等的有机镁盐等。镁离子的浓度优选使用5～200mmol/L。
铵离子，可以使用氨水、氨气、各种无机或有机的氨盐、酵母提取物、玉米浆等中含有的铵离子。另外，可以使用谷氨酸或酪蛋白氨基酸等含有铵离子的有机营养源来代替铵离子。优选使用这些铵离子的浓度为10mmol/L～2mol/L。
表面活性剂，可以使用二辛基磺基琥珀酸钠(例如，ラビゾ一ルB-80、日本油脂公司制造)、十二烷酰肌氨酸等的阴离子表面活性剂、聚氧乙烯十六烷基醚(例如，ノニオンP-208，日本油脂公司制造)等的非离子表面活性剂、烷基二甲基胺(例如，三级胺FB，日本油脂公司制造)等的叔胺类等，只要是促进CDP-胆碱生成的都可以使用。使用的浓度通常为0.1～100g/L，优选为1～50g/L。
有机溶剂，可以列举二甲苯、甲苯、脂肪醇(甲醇、乙醇、丁醇等)、丙酮、乙酸乙酯、二甲基亚砜等。使用的浓度通常为0.1～100ml/L，优选为1～50ml/L。
水溶性介质，可以列举水、磷酸缓冲液、HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N-乙磺酸)缓冲液、Tris(三羟甲基氨基甲烷)的盐酸缓冲液等缓冲液。
另外，水溶性介质，可以使用培养作为生物催化剂使用的细胞的培养基、所述细胞的培养液、所述培养液的培养上清液等。用培养基、培养液以及培养上清液等作为水溶性介质，使用细胞作为生物催化剂时，所述细胞的培养中或培养结束后的任一情况中，使所述细胞与胆碱、磷酸胆碱或它们的盐以及尿嘧啶接触就可以。所述细胞的培养基以及培养条件为上述所列举的。
进行如此的操作，可以在水溶性介质中生成蓄积CDP-胆碱。生成蓄积的CDP-胆碱可以通过离子交换色谱、吸附色谱、盐析等常规的分离纯化方法进行分离纯化。
以下描述本发明的实施例。
具体实施例方式
实施例1将重组有来自酵母的CCT基因和CKI基因与来自的PyrG基因的质粒pCKG55转导入大肠杆菌MM294菌株中，转化获得的大肠杆菌MM294/pCKG55菌株(特开平5-276974、FERM BP-3717)接种于200ml含有50mg/L氨苄青霉素的L培养基[含有10g/L细菌胰蛋白胨(Difco公司制造)、5g/L酵母提取物(Difco公司制造)、5g/L氯化钠、pH调节到7.2]的2L具塞三角瓶中，25℃下，220rpm转速下旋转振荡培养24小时。取该培养液20ml接种于2.5L含有5g/L葡萄糖(另行灭菌)、5g/L胨(极东制药工业公司制造)、6g/L磷酸二钠、3g/L磷酸二氢钾、1g/L氯化铵、250mg/L硫酸镁.7水合物(另行灭菌)以及4mg/L维生素B1(另行灭菌)的液体培养基(未调节pH)的5L的培养罐中，在培养温度为28℃、600rpm下搅拌、通气量为2.5L/分的培养条件下，并用14％(v/v)氨水将pH调节至7.0的同时进行培养。
培养中，取样培养液，测定经离心分离取样培养液所得到的上清液中的葡萄糖的浓度。当所述上清液中的葡萄糖的浓度达到0时，无菌地采集培养液250ml。
将采集的培养液接种于装有2.5L包含5g/L葡萄糖(另行灭菌)、5g/L胨(极东制药工业公司制造)、6g/L磷酸二钠、3g/L磷酸二氢钾、1g/L氯化铵、250mg/L硫酸镁·7水合物(另行灭菌)以及4mg/L维生素B1(另行灭菌)的液体培养基(不调节pH)的5L培养罐中，在培养温度为28℃、600rpm下搅拌、通气量为2.5L/分的培养条件下，并用14％(v/v)氨水将pH调节至7.0的同时进行培养。
自培养第11小时至第24小时的时间段内，在此培养液中用蠕动移液泵以30ml/小时的添加速度添加含有167g/L葡萄糖和167g/L胨的加料液。
此外，产氨棒杆菌ATCC21170菌株接种于装有200ml含有50g/L葡萄糖、10g/L聚胨(大五营养化学公司制造)、10g/L酵母提取物(大五营养化学公司制造)、5g/L尿素、5g/L硫酸铵、1g/L磷酸二氢钾、3g/L磷酸氢二钾、1g/L硫酸镁·7水合物、0.1g/L氯化钙·2水合物、10mg/L硫酸铁·7水合物、10mg/L硫酸锌·7水合物、20mg/L硫酸锰·4～6水合物、20mg/L L-半胱氨酸、10mg/L D-泛酸钙、5mg/L维生素B1、5mg/L烟酸以及30μg/L生物素的液体培养基(用氢氧化钠调节pH至7.2)的2L具塞三角瓶中，28℃下，以220rpm转速旋转振荡培养24小时。将该培养液20ml接种于装有2.5L含有100g/L葡萄糖、10g/L聚胨、1g/L磷酸二氢钾、1g/L磷酸氢二钾、1g/L硫酸镁·7水合物、0.1g/L氯化钙·2水合物、20mg/L硫酸铁·7水合物、10mg/L硫酸锌.7水合物、20mg/L硫酸锰·4～6水合物、15mg/Lβ-丙氨酸、20mg/L L-半胱氨酸、0.1mg/L生物素、2g/L尿素(另行灭菌)以及5mg/L维生素B1(另行灭菌)的液体培养基(用氢氧化钠调节pH至7.2)的5L培养罐中，在培养温度为32℃、600rpm下搅拌、通气量为2.5L/分的培养条件下，并用浓氨水将pH调节至6.8的同时进行培养。
培养中，取样培养液，测定经离心分离取样培养液所得到的上清液中的葡萄糖的浓度。当所述上清液中的葡萄糖的浓度达到0时，无菌地采集350ml培养液，并将所述培养液接种于装有2.5L的含有180g/L葡萄糖、10g/L磷酸二氢钾、10g/L磷酸氢二钾、10g/L硫酸镁·7水合物、0.1g/L氯化钙·2水合物、20mg/L硫酸铁·7水合物、10mg/L硫酸锌·7水合物、20mg/L硫酸锰·4～6水合物、15mg/Lβ-丙氨酸、1g/L谷氨酸钠、20mg/L L-半胱氨酸、0.1mg/L生物素、2g/L尿素(另行灭菌)以及5mg/L维生素B1(另行灭菌)的液体培养基(用氢氧化钠调节pH至7.2)的5L培养罐中，在培养温度为32℃、600rpm下搅拌、通气量为2.5L/分的培养条件下，并用浓氨水将pH调节至6.8的同时进行培养。培养中，取样培养液，测定经离心分离取样培养液所得到的上清液中的葡萄糖的浓度。当所述上清液中的葡萄糖的浓度达到0时，培养结束。
由此得到的大肠杆菌MM294/pCKG55菌株的培养液500ml和产氨棒杆菌ATCC21170菌株的培养液185ml分别注入2个2L体积的培养罐中，并在培养罐中分别添加60％(w/v)葡萄糖溶液80ml、25％(w/v)硫酸镁·7水合物25ml、25％(w/v)磷酸二氢钾160ml、并进一步添加二甲苯(使其浓度达到20ml/L)以及氯化胆碱(使其浓度达到8.4g/l(60mM))。
在2个培养罐中之一(罐1)添加尿嘧啶(Sigma公司制造)，使其浓度达到44mmol/l，另一罐(罐2)中添加乳清酸(Sigma公司制造)，使其浓度达到44mmol/l。各自的培养罐在32℃、800rpm、通气量为0.2L/分的条件下，并用10当量的氢氧化钠将其pH保持在7.2。22小时后，当用HPLC测定混合液中的CDP-胆碱浓度时，显示为罐1中所生成的CDP-胆碱的浓度为12.1g/l(24.8mmol/l)，罐2中的浓度为11.5g/l(23.6mmol/l)。作为底物，尿嘧啶比乳清酸可以得到更良好的结果。
工业实用性通过本发明，提供了由胆碱、磷酸胆碱或它们的盐以及尿嘧啶制备工业上有用的CDP-胆碱方法。
权利要求
1.CDP-胆碱的制备方法，其特征在于，将具有通过胆碱、磷酸胆碱或它们的盐以及尿嘧啶生成CDP-胆碱活性的生物催化剂在水溶性介质中与胆碱、磷酸胆碱或它们的盐以及尿嘧啶接触，在所述水溶性介质中生成蓄积CDP-胆碱，并从所述水溶性介质中回收CDP-胆碱。
2.根据权利要求1的制备方法，其中所述生物催化剂为选自由微生物、动物细胞、植物细胞、昆虫细胞组成的组的细胞、所述细胞的培养液、或含有所述细胞的处理物的生物催化剂。
3.根据权利要求2的制备法，其中所述细胞选自属于由埃希氏杆菌属(Escherichia)、沙雷氏菌属(Serratia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链球菌属(Streptococcus)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、节杆菌属(Arthrobacter)、金杆菌属(Aurebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、棍状杆菌属(Clavibacter)、棒杆菌属(Corynebacterium)、短小杆菌属(Curtobacterium)、微杆菌属(Microbacterium)、脂肪杆菌属(Pimerobacter)、糖酵母属(Saccharomyces)、裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)、克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)、丝孢酵母属(Trichosporon)、许旺氏酵母属(Schwanniomyces)、毕赤氏酵母属(Pichia)以及假丝酵母属(Candida)组成的组的1个或2个以上属的微生物。
4.根据权利要求2的制备法，其中所述细胞选自属于由埃希氏杆菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、棒杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)以及糖酵母属(Saccharomyces)组成的组的1个或2个以上属的微生物。
5.根据权利要求2的制备法，其中所述细胞是属于棒杆菌属(Corynebacterium)的微生物以及埃希氏杆菌属(Escherichia)的微生物。
6.根据权利要求3～5中任一项的制备法，其中所述棒杆菌属的微生物是产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)。
7.根据权利要求3～5中任一项的制备法，其中所述埃希氏杆菌属的微生物是大肠杆菌(Escherichia coli)。
8.根据权利要求2的制备法，其特征在于所述细胞是转导了编码具有从尿苷5′-三磷酸生成胞苷5′-三磷酸活性的胞苷5′-三磷酸合成酶的DNA、编码具有通过胆碱生成磷酸胆碱的活性的胆碱激酶的DNA、或者编码具有通过胞苷5′-三磷酸和磷酸胆碱生成CDP-胆碱活性的胆碱磷酸胞苷转移酶的DNA而得到的转化体。
全文摘要
本发明涉及CDP－胆碱的制备法，其特征在于，将具有通过胆碱、磷酸胆碱或它们的盐以及尿嘧啶生成CDP－胆碱活性的生物催化剂在水溶性介质中与胆碱、磷酸胆碱或它们的盐以及尿嘧啶接触，在所述水溶性介质中生成蓄积CDP－胆碱，并从所述水溶性介质中回收CDP－胆碱。
文档编号C12P19/30GK1653188SQ0381043
公开日2005年8月10日 申请日期2003年5月8日 优先权日2002年5月8日
发明者桥本信一, 小田秀树 申请人:协和发酵工业株式会社