益生菌和口服耐受性的制作方法

文档序号:449689阅读:391来源:国知局
专利名称:益生菌和口服耐受性的制作方法
背景技术
婴儿的牛奶变态反应或乳超敏反应十分常见,通常婴儿长到2或3岁时该反应就会消失,但偶尔也有终身均会过敏的。这是婴儿中的一种最常见的疾病,在足月婴儿中出现的频率为0.5-3%,在早产婴儿中的频率为3-5%。这种变态反应可导致皮疹、荨麻疹、嘴部红肿、流鼻涕、打喷嚏、腹痛、腹泻、呕吐、过敏或更常见地消化道问题,在某些情况下还可能与婴儿猝死有关。
乳超敏反应应与乳糖不耐性(先天缺乏乳糖酶导致对乳不耐受)相区分。大多数情况下,牛奶变态反应由α-乳球蛋白及β-乳球蛋白变应原造成。酪蛋白和/或白蛋白也是牛奶中潜在的致过敏乳蛋白,也可导致变态反应。当免疫系统针对上述蛋白产生超敏反应时,形成变态反应。此过程(致敏)的第一步,免疫系统首先把这些蛋白当作是一种进入身体的抗原,这将引起由特异抗体或特异致敏的T淋巴细胞组成的免疫应答。第二步,如果抗体是IgE抗体,其将通过产生炎症反应,即变态反应来应答变应原的存在。此种类型的变态反应的机制可解释如下IgE抗体出现于细胞(包括循环嗜碱性粒细胞)表面。当变应原和IgE发生相互作用时,呈递IgE/变应原对的细胞产生并释放包括组胺在内的化学介质。这种现象导致病理学效应,如局部或系统血管扩张。通常,当婴儿首次尝试食物的多样化而第一次饮用牛奶时,这种乳超敏反应就会出现。
Oy aboatech AB的WO01/97822公开了使用益生菌,如干酪乳杆菌鼠李糖亚种(Lactobacillus casei ssp.rhamnosus)来制备可以在高风险发生特应性疾病的婴儿中用于主要预防特应性疾病的组合物。这是为高风险过敏群体这一特殊群体进行过敏预防的一种尝试。
WO01/89541(Compagnie Gervais Danone)公开了在口服组合物中使用干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)可增加特异针对致病微生物的免疫性。其尤其旨在用于影响呼吸系统的病原体,同时该组合物可以是食品或是食品增补剂。
然而,仍然需要手段来预防特应性疾病,如牛奶变态反应和/或维持婴儿自身后天获得的或是在上述手段的帮助下获得的口服耐受性。
发明概述因此,本发明涉及至少包含可以维持口服耐受现象的物质的食品,以及包含可以促进和维持口服耐受现象的物质的食品。
本发明涉及不旨在用于变应性群体的食品。
附图简述

图1显示小鼠(常规的(CV),单相关的(monoassociated)和无菌的(GF))口服乳清蛋白后28天处死(A)或50天处死(B),小鼠血清中BLG-特异性抗体(IgE,IgG1和IgG2a)的效价降低。
图2显示体外脾细胞的IFN-γ、IL-10、IL-5和IL-4产生。给小鼠(常规的(CV),单相关的和无菌的(GF))喂食乳清蛋白(黑色柱)或盐水(无色柱),之后皮下注射于Al(OH)3中的100μg BLG及100μg OVA,管饲后28天处死(A)或50天处死(B)。在第50天处死的小鼠在第21天和第35天额外地又接受两次注射。
发明详述在本发明上下文中,“食品”这一术语旨在包括任何可食用的物质。因此,它可以是一种可供人食用的产品,但是,该术语同样也包括可被动物食用的产品,所述动物如宠物,如狗、猫、兔、豚鼠、小鼠、大鼠、鸟(如鹦鹉)、爬行动物和鱼(如,金鱼)等。此外,该术语也包括可由其它驯养的动物,如家畜,如牛、马、猪、绵羊、山羊、水牛、骆驼等等食用的产品。该术语也旨在包括任何婴儿配方食品、幼儿配方食品、较大婴儿和幼儿配方食品(infant and baby follow-up formula)等等。
当谈到牛奶变态反应或牛奶超敏反应时,应当理解我们意在指任何食物变态反应或超敏反应、以及更一般地任何特应性疾病。我们的讨论主要围绕此变态反应展开,是因为大多数情况下婴儿接触到的第一种食品是牛奶;然而,我们并不旨在将本专利申请的范围限于此疾病。
令人吃惊的是,我们已发现加入到食品中的益生菌能够用作佐剂来促进和维持口服耐受性(oral tolerance)。
在本发明的第一方面,本发明提供至少包含可以促进对牛奶蛋白的口服耐受现象的物质的食品。令人吃惊的是,我们发现乳杆菌属(lactobacillus)的乳酸细菌株,特别是副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)菌株可促进口服耐受的诱导,且特别适用于促进对牛奶蛋白的口服耐受性。
在优选实施方式中,所用的乳杆菌是副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)CNCM I-2116。已经证实这些微生物具有例如以下特性革兰氏阳性,过氧化氢酶阴性,来自精氨酸的NH3阴性,CO2产生阴性。它们产生L(+)乳酸,并且能在浓度高达0.4%的胆汁盐中生长。
根据本发明,为了促进对抗原的口服耐受,可以将所用乳酸细菌尤其添加入从出生至向营养中引入抗原(如牛奶抗原)时使用的婴儿配方食品中,当作一种佐剂或是增补剂。由于这种乳酸细菌不是婴儿肠道中的优势菌群,因此应当将大量的此种微生物加入到这种配方食品中,如105-108cfu/mL复水配方食品(reconstituted formulae)或cfu/g食品,更优选105-107,在一个优选实施方案中106cfu/ml复水配方食品。因此,可以每天摄入几次该乳酸细菌,从而导致这种微生物在肠道微生物菌群中的量持续地足够有效实现本发明的目的。
上述属于乳杆菌属的乳酸细菌,尤其是副干酪乳杆菌,在一个优选实施方案中为副干酪乳杆菌CNCM I-2116,也可添加到宠物食品中以促进口服耐受性。其优选添加到块状或油炸食品中,并且也可以添加到湿食品,如罐头食品中。还可以添加到宠物用的液体配方食品中,如小猫或小狗用的牛奶等等,此外,还能添加到宠物食用的咀嚼型食品中。对于非湿食品而言,宠物食品中此微生物的补充量可在104-108cfu/g之间,对于湿食品在105-108cfu/g之间,对于液体食品在105-108cfu/g之间,这些量并非是限制性的。
我们进一步研究了副干酪乳杆菌CNCM I-2116的蛋白水解活性及其在降解牛奶中最重要的变应原β-乳球蛋白时的潜在作用。
基于功能,可将乳酸细菌的蛋白水解系统分为3组i)蛋白酶将全蛋白分解为肽;ii)肽酶降解肽;和iii)转运系统运输降解产物穿过细胞膜。
蛋白酶位于细菌细胞外,而多数的肽酶位于细胞质中。在本研究中,来自胞质提取物的肽酶被用于降解天然的β-乳球蛋白(BLG)及其胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶解(tryptic-chymotriptic)(TC)肽。与副干酪乳杆菌相关的酶主要水解酸性TC肽、轻微水解碱性肽且根本不水解BLG。由于BLG的TC水解产物被证实主要由酸性肽组成(62%),因此,副干酪乳杆菌酶对它们的降解是十分有意义的。然而,这种蛋白水解活力无疑限于氨肽酶或二肽酶,因为通过大小排阻层析发现,由副干酪乳杆菌的降解作用释放的肽,分子量主要小于500Da。
氨肽酶和二肽酶活性也降解碱性级分,并且我们还观察到在副干酪乳杆菌降解后的此级分中存在分子量大于2000Da的肽。虽然我们并不想被理论所局限,但肽之间的强疏水相互作用能够解释这种观测现象,因为碱性TC肽已通过C18层析被证实具有高疏水性。
副干酪乳杆菌提取物对酸性TC肽的降解导致具有免疫抑制性的肽,该作用对于口服耐受性的诱导是必需的。
已经充分表征的耐受性诱导机制包括克隆缺失,克隆无反应性和通过诱导调节性T细胞而致的主动抑制。由于1-型调节性T细胞(Tr-1)能够产生高水平的免疫抑制性细胞因子如IL-10等,因此,其具有低增殖能力并能抑制幼稚和记忆T辅助细胞1-型和2-型应答。已发现IL-10可以下调CD54、CD80和CD86的表达,而这些分子是T细胞活化时的重要共刺激分子。有趣的是,已发现IL-10会响应副干酪乳杆菌降解的酸性肽而出现上调,表明这些肽可以通过主动抑制机制诱导针对BLG的口服耐受。
副干酪乳杆菌降解的酸性肽对口服耐受的这种潜在有益作用(在未接触过BLG的小鼠中得以强调)被BLG致敏小鼠(BLG耐受性小鼠)中获得结果所加强。使用来自BLG致敏小鼠的脾细胞也观察到对淋巴细胞增殖的抑制作用,表明降解的肽确实具有诱导、维持和强化T细胞的低应答性的能力。
副干酪乳杆菌CNCM I-2116通过其蛋白水解活性和释放生物活性肽来刺激调节性T细胞。我们还证实了副干酪乳杆菌的细胞质内容物具有免疫抑制性作用。这些发现强烈的提示诸如副干酪乳杆菌CNCM I-2116的细菌,可直接通过细胞与细胞间的相互作用或是通过降解抗原及死后释放细胞质内容物,诱导免疫抑制性活力。
在本发明的第二方面,本发明提供至少包含可以维持口服耐受性现象(如对于牛奶蛋白的口服耐受)的物质的食品。实际上,我们已发现双岐杆菌属(Bifidobacterium)菌株对口服耐受性的维持具有特殊效用。因此,本发明的一个目的是把双岐杆菌当作一种佐剂或增补剂添加到食物中,特别是对于那些已经被诱导了口服耐受性的群体。特别地,这些群体可以是乳汁哺乳的婴儿事实上,母亲食用的部分变应原可通过母乳传递给婴儿;在这样的群体中,口服耐受性已经通过母乳哺乳得到了促进,并且这种耐受性可以通过给予婴儿有效量的具有上述性质的双岐杆菌来维持。
众所周知,一些婴儿在首次使用牛奶时不会出现牛奶超敏反应,然而,当他们在例如8个月大取食其它食品成分时,会出现一些食品超敏反应。虽然我们不想局限于理论,但我们认为在这些婴儿中诱导的口服耐受性并未得到维持或是适当的维持。所以,本发明的一个目的是通过添加具有维持以前已经诱导的口服耐受性的能力的双岐杆菌至食物中,维持已经诱导的口服耐受性。
在此过程开始时给予婴儿或儿童这种双岐杆菌可能是有用的。
在优选实施方案中,双岐杆菌是乳酸双岐杆菌(Bifidobacteriumlactis),在最佳实施方式中可以是熟知的Bb12菌株ATCC 27536,它能够从Hansen(Chr.Hansen A/S,10-12 Boege Alle,P.O.Box 407,DK-2970Hoersholm,Danemark)得到。由于命名术语被修改过多次,Bb12在文献和商品中也被当作两岐双岐杆菌(B.bifidum)和B.animalis。
已证实此微生物具有例如如下特性革兰氏阳性,不运动、非产孢子的杆菌、抗胃肠道酸性和胆汁盐。它们为过氧化氢酶阴性,仅产生L(+)乳酸而非其D(-)异构体。它们能够利用如下的碳水化合物核糖、蔗糖、D-葡萄糖、D-棉子糖、麦芽糖、蜜二糖、苦杏仁苷、和β-龙胆二糖。
这些微生物可以添加到任何类型的婴儿、幼儿或儿童食品中,如麦乳精、婴儿配方食品、较大婴儿配方食品、幼儿谷类食品等等。有时,早至4月龄即可使婴儿的营养多样化,并且,双岐杆菌可添加到4个月及更大些儿童的婴儿食品中。由于乳超敏反应主要在2-3岁时消失,因此,这种为了维持口服耐受性而添加双岐杆菌到婴儿和幼儿食品中的操作,可以在4个月的婴儿到3岁幼儿的每一食品中进行。但是,这种补充也可在并非专门用于婴儿或幼儿营养而是作为他们营养的一部分的食品中进行,如牛奶、酸乳酪、凝乳、奶酪、发酵乳、基于乳的发酵品、冰淇淋、基于发酵的谷物的食品、或奶制品等。
添加到婴儿食品、幼儿食品或食品中的微生物的量一般应为105-108cfu每mL复水配方食品或cfu每克食品,优选105-107,最优选106。然而,这些量不应理解为是限制性的,而应该根据目标群体进行适应性调节,如根据婴儿或幼儿的体重和年龄,或是根据特定群体,诸如患有特定疾病的群体(如患有肠道疾病、急性腹泻或炎性综合症等的婴儿、幼儿或儿童)进行调节。
上述的双岐杆菌,尤其是乳酸双岐杆菌,优选乳酸双岐杆菌Bb12ATCC 27536,也能添加到宠物食品中维持口服耐受性。优选添加到块状或油炸食品中,并且也能添加到湿食品中,如罐头食品。其还能够添加到宠物食用的液体配方食品中,如给小猫或小狗等等的奶。此外,还能添加到宠物的咀嚼型食品中。对于非湿食品而言,给宠物食品补充的这种微生物的量可在104-108cfu/g之间,对于湿食品而言,可在105-108cfu/g之间,对于液体食品在105-108cfu/g之间,这些量均并非限制性的。
我们已证实乳酸双岐杆菌Bb12的无细胞提取物水解BLG的胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶解肽,并由此减少IgE对它们的识别和增强它们在体外对Th1细胞的刺激。酸性TC肽比碱性肽是更好的脾细胞增殖诱导剂。然而,当用乳酸双岐杆菌无细胞提取物进一步水解后,酸性和碱性肽表现出相似的刺激效应。这种刺激效应在未接触过BLG的小鼠中比在BLG耐受性小鼠中更为明显。
蛋白质,如BLG对蛋白酶的相对抗性,使得部分蛋白可以在消化后保持完整,从而使得它们具有潜在的高变应原性。普遍接受的是蛋白质的胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶水解可以降低蛋白的变应原性。与此发现相符,我们发现IgE对BLG的胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶解肽的结合能力比对天然BLG的结合能力差。
虽然我们不想局限于理论中,但我们认为这些具有潜在抗过敏作用的菌株的干预作用似乎在于,通过增强IFN-γ(一种与Th1细胞相关的细胞因子)的形成来调节促Th1/抗Th2应答。IFN-γ是一种有效的免疫调节和炎性细胞因子,其在新生儿中以低水平存在,在对食品过敏的患者中缺乏。IFN-γ在食物过敏预防中起到至关重要的作用,其抑制Th2分化、降低IL-4水平,并由此抑制IgE的产生。我们发现单独来自乳酸双岐杆菌Bb12的无细胞提取物可以诱导脾细胞产生IFN-γ。这些发现强烈地提示,诸如乳酸双岐杆菌Bb12的细菌可以在细胞裂解并释放细胞质内含物到肠道内后通过降解潜在的变应原性蛋白或直接地增强Th1应答。
除了上述提到的IFN-γ作用外,据报道,IFN-γ可增加跨肠道粘膜对完整抗原的吸收,提示乳酸双岐杆菌Bb12对具有降低的针对奶蛋白的应答性的个体有潜在的不利影响。然而,IFN-γ同样也增强跨淋巴集结的抗原运输。由于淋巴集结是口服抗原暴露后分泌型IgA的形成位点,乳酸双岐杆菌Bb12对IFN-γ产生的局部刺激可以通过免疫排斥机制,抑制潜在有害性食物抗原的渗透。与这种发现相符,当婴儿食用含有乳酸双岐杆菌Bb12的较大婴儿配方食品后,观测到粪便中IgA的水平增加。
我们的结果表明,乳酸双岐杆菌Bb12通过免疫偏离机制(可以增强促Th1/抗Th2细胞应答),并通过水解和免疫排斥潜在有害食物性抗原的机制,而表现出抗过敏的特性。我们研究了Bb12是否能够在以前从未接触过BLG的年幼小鼠(“幼稚” 小鼠)中诱导IFN-γ的形成。未接触过BLG的小鼠的脾细胞,与通过喂食富含BLG的饲料而获得耐受的小鼠的脾细胞相比,应答乳酸双岐杆菌降解的级分时,IFN-γ的产生更显著,表明乳酸双岐杆菌Bb12能维持在用奶瓶喂养的婴儿和较大幼儿中的Th1应答,从而平衡新生儿中被极化的Th2免疫。
第三方面,本发明提供包含可以促进和维持口服耐受现象(如对牛奶蛋白)的物质的食品。相应地,食品可以包含乳杆菌和双岐杆菌的联合以同时促进和维持口服耐受,特别是对牛奶的口服耐受。在优选实施方案中,为了达到此期望的目的,该食品包含副干酪乳杆菌和乳酸双岐杆菌。例如这种联合可以包括副干酪乳杆菌CNCM I-2116和乳酸双岐杆菌ATCC27536。这种促进和维持口服耐受性的方式可以是一种或几种乳杆菌与一种或几种双岐杆菌的联合。如可以是副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei),鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)和乳酸双岐杆菌(Bifidobacterium lactis)的联合,随摄入补充了这些微生物的食品的群体不同,乳杆菌和双岐杆菌的比例是可变的。如对于从未接触过牛奶的婴儿群体,乳杆茵∶双岐杆菌的比例可在10∶1和1∶1之间。对于以前已经食用过牛奶(或任何其它变应原或抗原)的婴儿、幼儿或儿童的群体,乳杆菌∶双岐杆菌的比例可在1∶10和1∶1之间。
当1种以上的双岐杆菌被添加到食品中时,1种双岐杆菌与另一种的比例可从0.01到99.9%,并且这同样适用于制品中有1种以上乳杆菌的情况。
本发明的微生物联合可添加到本发明第一、二方面列举的任何食品中,同样也可添加到任何其它的食品中,如巧克力、巧克力粉、涂抹食品、糕点、果冻、果酱、饼干、零食、果汁、奶制品、谷类早餐食品以及更一般地婴儿、幼儿或儿童所食用的任何食品,以及任何宠物食品。
根据本发明,食品中微生物的量,对于添加到湿的或液体的食品中而言,优选为104-108cfu/g食品或cfu/ml复水产品,对于添加到非湿的或较不湿的食品中而言,在104-109cfu/g食品之间。乳杆菌∶双岐杆菌比例不妨碍食品中添加的微生物量。
特别的是,单独或联合使用本发明微生物,均有助于预防和维持对摄入的抗原的耐受性。这特别适用于食物变态反应,如对包括虾、小龙虾、龙虾、螃蟹在内的甲壳类动物,以及对花生、蛋、木本坚果(如胡桃或腰果)、大豆、小麦、鱼的变态反应和任何其它已知的食品变态反应。它同样也适用于其它变态反应,如对螨、花粉或灰尘等等的变态反应。
第四方面,本发明提供一种包含益生菌的可预防移植排斥危险的食品。该食品可以包含至少一个可以诱导口服耐受性的乳酸细菌家族成员,和/或至少一个可以维持以前诱导的口服耐受性的双岐杆菌属成员。优选乳杆菌属的乳酸细菌,特定是副干酪乳杆菌,并且更特别的是副干酪乳杆菌CNCM I-2116。所用双岐杆菌优选是乳酸双岐杆菌,特别是乳酸双岐杆菌Bb12株系ATCC27536。
实际上,虽然我们不想局限于理论中,但我们认为这两种细菌具有通过促进口服耐受性特异刺激免疫系统的能力。因此,由单独或联合的这两种细菌与免疫系统一起形成的去除变态反应的机制并不特异针对牛奶变态反应或超敏反应,而且这种机制还能够帮助需要移植的患者或已经接受移植的患者不排斥移植物。因此,本发明的一个方面在于通过在移植前和移植后帮助诱导和维持对移植物的口服耐受,从免疫学的观点来看,通过获得对将要移植的抗原的口服耐受性来帮助患者支持移植,从而预防移植物抗宿主疾病出现的风险。
本发明中添加到食品中的微生物优选是活体,但也可以是死的或可以通过,如冻干,灭活。事实上,死细菌的外膜似乎至少部分地与活细菌以相同方式激活免疫系统。因此,在本发明的任何实施方案中,细菌或细菌联合可使用死生物体来实现。在这种情况下,添加到食品中的微生物的量优选相对于上述给定量增加5%到250%。
实施例下述的实施例举例说明本发明范围内的一些产品及其制备方法。它们不应当被认为以任何方式限制本发明。对本发明而言,可以进行改变和修饰。即,本领域技术人员将意识到,为了针对各种应用合理地调节本发明化合物的天然水平,可以在这些实施例中实施许多变化以包括宽范围的配方食品、成分、加工工艺和混合物。
实施例1口服耐受性的诱导本实验使用3组各20只无菌3-5周龄C3H/HeJ雌性小鼠,和1组3周龄常规BALB/c雌性小鼠。两种益生菌株用于本研究一种来自the NestléCulture Collection(洛桑,瑞士),是从健康婴儿粪便中分离的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)NCC 2461(CNCM I-2116),一种是从ChrisHansen(法国)购买的人源乳酸双岐杆菌(Bifidobacterium lactis)Bb12 NCC362菌株使用胃管经口给无菌小鼠接种0.3ml包含大约5×108cfu/mL的副干酪乳杆菌或乳酸双岐杆菌菌株的24小时细菌培养物。在喂食细菌后两周实施口服诱导。在每一组中,根据每克体重3mg乳清蛋白,给10只小鼠口服乳清蛋白,以诱导口服耐受性。通过对酸性乳清超滤获得乳清蛋白,蛋白含量为80%,其中,大约62%为β-乳球蛋白。剩余的10只小鼠单次口服喂给盐水作为阴性对照(未引起耐受的小鼠)。
5天后,所有小鼠皮下用100μm 3次结晶的β-乳球蛋白(BLG)和100μg级别为V的卵清蛋白(OVA)进行免疫。管饲后28天或50天,处死小鼠,分别评价耐受性的诱导和维持。每次处死5只喂食乳清蛋白的小鼠和5只喂食盐水的小鼠。在21天和35天给第50天处死的小鼠额外增加2次皮下注射BLG和OVA。通过ELISA方法检测血清中BLG特异的IgE和BLG特异的IgG1及IgG2a的水平。
在口服乳清蛋白后28天处死且用BLG免疫的小鼠中评价常规、无菌和单相关小鼠中的口服耐受性诱导,见图1A。结果清晰地表明,在常规、无菌和与副干酪乳杆菌有关联的小鼠中,喂食乳清蛋白显著抑制(P<0.05)BLG特异的IgE、IgG1及IgG2a抗体应答,表明Th1和Th2型体液应答受到抑制。而与乳酸双岐杆菌有关联的小鼠中,仅有抗BLG特异性IgE应答受到显著抑制抗BLG IgG1应答受到抑制,但不显著(P<0.2)。因此,在这组小鼠中,只有Th2型体液应答对耐受性敏感。
就脾细胞增殖及细胞因子产生而言的耐受性诱导为了进一步验证通过益生菌可以调节耐受性的诱导,对脾细胞进行体外培养,检测细胞增殖(表1)和培养上清中的细胞因子谱(图2A)。
表1常规的(Conv)、单相关的和无菌的(GF)小鼠在口服饲喂乳清蛋白后28或50天处死,其脾细胞经BLG或PHA激活引起的增殖反应。
实施例2 副干酪乳杆菌NCC 2461的免疫抑制作用对β-乳球蛋白口服耐受性诱导的影响天然BLG及其TC级分在用副干酪乳杆菌提取物降解前后的分子量大小为了评价是否副干酪乳杆菌提取物水解BLG及其TC级分,比较用副干酪乳杆菌提取物降解前后肽的分子大小。副干酪乳杆菌提取物根本不降解天然BLG,但降解酸性和碱性TC级分。强烈降解具有高分子量(1000-5000Da)的酸性肽,释放出分子量低于1000Da的小肽。小肽在降解的级分中占75%以上(在降解前为36%),42%的释放的肽分子量小于500Da。碱性级分降解的程度较小。此级分中500-1000Da的肽减少,形成分子量小于500Da的肽,这种小于500Da的肽在降解后占级分的43%,而降解前占37%,令人吃惊的是,降解后的此级分中分子量高于2000Da的肽增加。
被副干酪乳杆菌提取物降解的或未降解的BLG和其TC级分对淋巴细胞增殖的影响无论浓度如何,甚至在用副干酪乳杆菌提取物进行水解后,天然BLG和碱性TC级分对淋巴细胞增殖也无影响。相反,酸性TC级分当以大于1,000μg/ml的浓度使用时,正如刺激指数大于1.8并在2,000μg/ml时达到2.5所证实的那样,可以刺激淋巴细胞增殖。用副干酪乳杆菌提取物降解后,这种刺激效应显著受到抑制(p<0.05),在2,000μg/ml时观察到最强的抑制作用。另外,发现在使用以前从未接触过BLG的小鼠的脾细胞时,经副干酪乳杆菌降解后的酸性级分的免疫抑制效应比用接触过BLG的小鼠时更为明显,刺激指数降低分别为0.7和0.4。
用副干酪乳杆菌提取物降解的或来降解的BLG及其TC级分对细胞因子产生的影响应答用副干酪乳杆菌提取物降解的或未降解的天然BLG及碱性TC级分,脾细胞产生低水平的IFN-γ和IL-10。酸性TC级分则被发现可以诱导高水平IFN-γ和低水平IL-10,而当用副干酪乳杆菌提取物降解后酸性TC级分诱导相反的应答。无论哪种级分,均发现IL-4以低水平产生。但是,BLG和酸性级分的降解降低了该因子的分泌,水平接近本实验的检测限度。
副干酪乳杆菌提取物对淋巴细胞增殖和细胞因子产生的影响为了更好的理解副干酪乳杆菌通过何种机制诱导小鼠对BLG的口服耐受性,研究了单独细胞质提取物对淋巴细胞增殖和细胞因子产生的影响。副干酪乳杆菌提取物以剂量依赖方式抑制有丝分裂原诱导的淋巴细胞增殖,最大抑制作用出现在低稀释倍数(1/10),而在高稀释倍数(1/1000)时无作用。但是,即使是在高剂量(1/10稀释),副干酪乳杆菌提取物也不影响缺乏PHA时所观测到的细胞增殖,提示所使用的浓度对细胞是无毒的。此外,当细胞增殖被强烈抑制时,产生高数量的IL-10,而IFN-γ的产生不受影响仍然保持非常低水平。
实施例3 口服耐受性的维持本实验为实施例1的继续。
在喂食已经形成耐受性的小鼠乳清蛋白后,持继7周监测小鼠体内特异抗体反应抑制作用的维持(图1)。常规小鼠中BLG特异的IgE、IgG1和IgG2a反应被维持在受到抑制的状态(p<0.01)。在无菌小鼠和副干酪乳杆菌关联小鼠中对抗BLG IgG2a效价的抑制作用未得到维持,而特异性IgE和IgG1水平却相反。在乳酸双岐杆菌定居的小鼠中,发现BLG特异性IgE应答持续受到抑制且抗BLG IgG1效价显著降低。结果,在常规小鼠中Th1和Th2型体液免疫应答持继受到抑制,而在无菌的、乳酸双岐杆菌相关的和副干酪乳杆菌相关的小鼠中仅维持了对Th1型抗体效价的消除作用。
在诱导口服耐受后50天处死的小鼠中脾细胞的IFN-γ产生与28天后获得的相似,除了无菌小鼠与乳酸双岐杆菌相关小鼠中这种降低分别为不显著的和显著的降低(图2B)。Th1细胞活力在所有小鼠组中也仍保持受到抑制(图2B)。相反,IL-10仅在喂食乳清蛋白的常规小鼠中维持高产量(图2B)。然而,如有BLG存在时分别达到131、61和38的高刺激指数所清楚显示的,已发现无菌小鼠和乳酸双岐杆菌相关小鼠的脾细胞对长期持续耐受表现敏感(表1)。BLG存在时在常规小鼠和副干酪乳杆菌定居的小鼠中获得较低刺激指数。但是来自所有实验组小鼠的细胞均对PHA产生良好应答(表1)。
实施例4 乳酸双岐杆菌Bb12对β-乳球蛋白的抗过敏特性。
对BLG的TC级分的表征-乳酸双岐杆菌驱动的水解对BLG及其TC肽的分子大小的影响乳酸双岐杆菌提取物降解酸性和碱性级分,而不降解天然的BLG。在乳酸双岐杆菌降解之前,酸性级分含有36%的分子量在2000到5000Da的肽。乳酸双岐杆菌降解后,这些肽的百分数降到21%,同时低分子量肽(<500Da)从19%增加到46%。水解碱性级分后同样也释放小肽。分子量在500到2000Da之间的碱性肽被分解,产生具有滞后的停留时间的小肽。
BLG及其TC级分的IgE结合能力。
BLG及其碱性TC级分的结合能力不随乳酸双岐杆菌提取物的降解而明显降低。相反,酸性TC肽与血清IgE的结合由于乳酸双岐杆菌驱动的水解而轻微下降。
乳酸双岐杆菌提取物降解的BLG及其TC级分对淋巴细胞增殖的影响在乳酸双岐杆菌降解之前,当酸性级分浓度为1,000μg ml-1或更高时,显著刺激淋巴细胞增殖;但存在BLG和碱性级分时,无论浓度多少均不显著刺激增殖。相反,经乳酸双岐杆菌提取物降解后,BLG和其TC级分均以剂量依赖方式刺激淋巴细胞增殖。当浓度为1,000μg ml-1或更高时,BLG和碱性级分诱导显著的细胞增殖;而酸性级分在浓度为2,000μg ml-1时诱导显著的细胞增殖。再者,对于BLG、酸性级分和碱性级分,在2,000μg ml-1时达到相似的刺激指数。虽然酸性和碱性TC肽有不同的刺激作用,但用乳酸双岐杆菌提取物降解后在高剂量时产生会聚效果。
由于经乳酸双岐杆菌提取物水解的BLG,不像酸性和碱性级分,随后不进行过滤以除去酶,所以,作为对照评估单独提取物对淋巴细胞增殖的影响。稀释到1/100倍时(关于BLG水解,含有2000μg ml-1的BLG及含有40μg ml-1细胞提取物蛋白的孔),提取物强烈地刺激淋巴细胞增殖,表明BLG的刺激效应可能主要由浓度在40μg ml-1的无细胞提取物引起。相反地,正如C18层析后所证实的一样,超滤乳酸双岐杆菌提取物本身产生基本无蛋白的透过物,表明过滤后在酸性和碱性级分中仅保留了痕量的提取物。在低浓度时(1/1000或4μg ml-1细胞提取物蛋白),提取物不可能刺激淋巴细胞增殖,说明其对观察到的酸性和碱性级分的作用无贡献。
幼稚小鼠和具耐受性的小鼠的淋巴细胞增殖本段涉及乳酸双岐杆菌提取物对用于体外刺激淋巴细胞增殖的因子的效应,其中所用淋巴细胞来自幼稚的年幼小鼠和每天取食富含BLG饲料的小鼠。经乳酸双岐杆菌提取物降解之前,酸性级分对来自幼稚小鼠的淋巴细胞比对那些来自耐受性对应小鼠的淋巴细胞有更大刺激作用,而BLG和碱性肽则不如此。经乳酸双岐杆菌提取物降解之后,BLG及其TC级分均刺激来自幼稚小鼠的淋巴细胞比那些来自耐受性小鼠的淋巴细胞获得显著更强的增殖,这可以由指数相较于3达到4而得以说明。然而,已经证实,单独乳酸双岐杆菌提取物(稀释到1/100)可以在幼稚小鼠中如前述针对耐受性小鼠一样刺激淋巴细胞增殖,表明乳酸双岐杆菌提取物降解的天然BLG对于细胞增殖并无真实的刺激作用。
细胞因子的产生本段涉及在BLG及其TC级分(被乳酸双岐杆菌提取物水解或未被水解时)存在下,来自幼稚小鼠和耐受性小鼠的脾细胞的细胞因子产生情况。在幼稚小鼠和耐受性小鼠的脾细胞培养物中,存在未经处理的BLG、酸性和碱性TC级分时,IFN-γ以低水平表达,应答酸性级分得到最高产量400pg ml-1。当经乳酸双岐杆菌提取物水解后,BLG及各级分强烈诱导幼稚小鼠和耐受性小鼠的脾细胞分泌IFN-γ,其中幼稚小鼠具有更高产量。观测到IL-10的分泌具有相同的应答情况,但生产水平比IFN-γ低10倍。无论是BLG样品或小鼠,在细胞培养上清中均未检测到IL-4或IL-5,表明无强Th2型细胞因子诱导。正如在淋巴细胞增殖方面观察到的,应答乳酸双岐杆菌提取物降解的BLG所引起的IFN-γ产生主要是由保留于样本中的提取物所致。
实施例5 促进和诱导口服耐受性的婴儿配方食品我们将如下成分根据所示比例进行混合制备婴儿配方食品。最终产品100g包含519卡,均为粉剂。
脂肪27.7g来自乳的脂肪0.7g脂肪混合物(150) 26.8g卵磷脂 0.2g亚油酸 4.1gα-亚麻酸 525mg蛋白质 9.5g游离糖 57.9g乳糖57.9g矿物质(灰分)1.9g钠 120mg钾 460mgChlorure330mg钙 320mg磷 160mg镁 36mg锰 40μg
硒 10.4μg总固体 97.0g水分含量3.0g按照每100g 106副干酪乳杆菌和102乳酸双岐杆菌,向以上制备的配方产品添加副干酪乳杆菌和乳酸双岐杆菌。
实施例6 促进和诱导口服耐受的猫粮该饲料混合物由约58%重量玉米、约6%重量玉米麸质、和约23%重量的鸡肉粉、盐、维生素和矿物质(构成剩余部分)组成。
将饲料混合物加入预处理器(preconditioner)中并润湿。润湿的饲料然后加入挤压-蒸煮器中并糊化。迫使正在离开挤压机的糊化基质通过模具并挤出,将这种挤压物切成适合喂食猫的块,在约110℃干燥约20分钟,冷却形成颗粒饲料。在此,将以下的一种或多种菌株的冻干粉末加入颗粒饲料副干酪乳杆菌和乳酸双岐杆菌。因此,提供足够量的粉末以便猫的相应膳食摄入量大约为每天107-109cfu。将一些粉末混合在第一份颗粒饲料中并进行包装。第二份量的粉末称量后与脂质载体混合,然后喷雾到第二份颗粒饲料上。在50-60℃充分干燥包衣数分钟后包装这些饲料。
权利要求
1.至少包含可以维持口服耐受性的物质的食品,所述物质由双岐杆菌属菌株组成。
2.根据权利要求1的食品,其中双岐杆菌是乳酸双岐杆菌。
3.根据权利要求1或2的食品,其中双岐杆菌是乳酸双岐杆菌ATCC27536。
4.根据权利要求1-3之任一项的食品,其中添加的细菌是已灭活的或死的细菌。
5.根据权利要求1-4之任一项的食品,其中该食品不旨在用于过敏群体。
6.根据权利要求1-5之任一项的食品,其中该食品是婴儿配方食品。
7.根据权利要求1-6之任一项的食品,其中细菌在食品中以每ml复水产品或每g食品105-108cfu,优选105-107cfu,最优选106cfu的量存在。
8.根据权利要求1-5之任一项的食品,其中该食品是宠物食品。
9.根据权利要求8的食品,其中细菌以104-108cfu/g非湿食品,105-108cfu/g湿食品,以及105-108cfu/g液体食品的量存在。
10.至少包含可以促进口服耐受性的物质和可以维持口服耐受性的物质的食品,其中所述可以促进口服耐受性的物质由乳杆菌属的乳酸细菌组成,而所述可以维持口服耐受性的物质由双岐杆菌属的乳酸细菌组成。
11.根据权利要求10的食品,其中乳杆菌是副干酪乳杆菌,而双岐杆菌是乳酸双岐杆菌。
12.根据权利要求11的食品,其中副干酪乳杆菌是副干酪乳杆菌CNCM I-2116,而乳酸双岐杆菌是乳酸双岐杆菌ATCC 27536。
13.根据权利要求10-12之任一项的食品,其中该食品不旨在用于过敏群体。
14.根据权利要求10-13之任一项的食品,其中该食品是婴儿配方食品。
15.根据权利要求14的食品,其中对于从未接触过各种新食品抗原的婴儿群体,乳杆菌与双岐杆菌的比例是10∶1-1∶1。
16.根据权利要求14的食品,其中对于已经接触过食品抗原的婴儿、幼儿、儿童群体,乳杆菌与双岐杆菌的比例是1∶10-1∶1。
17.根据权利要求10-13之任一项的食品,其中该食品是宠物食品。
18.根据权利要求10-17之任一项的食品,其中微生物在本发明食品中的量,当微生物掺入湿产品或液体产品中时,优选为104-108cfu/g食品或cfu/ml复水产品,而当微生物掺入到非湿产品或较不湿的产品中时,为104-109cfu/g食品。
19.包含可以预防变态反应和/或降低移植物排斥危险的益生菌的食品。
20.根据权利要求19的食品,其包含至少一个可以诱导口服耐受性的乳酸细菌家族成员,和/或至少一个可以维持以前已诱导的口服耐受性的乳酸细菌家族成员。
21.根据权利要求20的食品,其中诱导口服耐受性的乳酸细菌属于乳杆菌属,优选为副干酪乳杆菌,在优选实施方案中为副干酪乳杆菌CNCM I-2116。
22.根据权利要求21的食品,其中维持口服耐受性的乳酸细菌属于双岐杆菌属,优选是乳酸双岐杆菌,在优选实施方案中是Bb 12菌株ATCC27536。
23.根据权利要求19-22之任一项的食品,其中所述变态反应是食物变态反应。
全文摘要
本发明涉及至少包含可以促进口服耐受性的物质(副干酪乳杆菌)的食品、至少包含可以维持口服耐受性的物质(乳酸双岐杆菌)的食品、以及包含可以促进和维持口服耐受性物质的(乳杆菌和双岐杆菌的联合)的食品。该食品旨在用于婴儿、幼儿、儿童以及宠物。本发明涉及不旨在用于过敏群体的食品。
文档编号A23C9/127GK1662154SQ03814536
公开日2005年8月31日 申请日期2003年5月22日 优先权日2002年5月24日
发明者G·普里乌特, S·佩凯 申请人:雀巢技术公司
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