用于生产葡糖胺和n-乙酰氨基葡糖的方法和物质的制作方法

专利名称：用于生产葡糖胺和n-乙酰氨基葡糖的方法和物质的制作方法
专利说明用于生产葡糖胺和N-乙酰氨基葡糖的方法和物质 发明领域 本发明涉及通过发酵生产葡糖胺和N-乙酰氨基葡糖的方法。本发明还涉及用于生产葡糖胺和N-乙酰氨基葡糖的微生物基因修饰的菌株。本发明还收集从发酵过程中回收N-乙酰氨基葡糖或葡糖胺的方法，本发明还收集由N-乙酰氨基葡糖源生产葡糖胺的方法。

背景技术：
发现氨基糖类通常作为复杂寡糖类和多糖类中的单体残基。葡糖胺是单糖葡萄糖的氨基衍生物。N-乙酰氨基葡糖是葡糖胺的乙酰化衍生物。葡糖胺、N-乙酰氨基葡糖和其它氨基糖类是许多天然多糖的重要组成部分。例如，含有氨基糖类的多糖可以形成与结构蛋白类似的细胞结构物质。
将葡糖胺制成营养药品用于治疗动物和人的骨关节病等疾病。葡糖胺的市场正在经历巨大的增长。此外，没有预计到对葡糖胺的世界市场价格有非常明显的侵蚀(erosion)。N-乙酰氨基葡糖也是治疗多种疾病的有价值的药物活性剂。N-乙酰氨基葡糖没有任何已经确定的副作用。由于N-乙酰氨基葡糖是动物体内蛋白合成的有价值和重要的成分，所以它对组织再生具有积极的影响，N-乙酰氨基葡糖在预防和/或治疗各种疾病方面具有治疗潜能，所述疾病诸如胃炎、食物过敏、炎症性肠病(IBD)、憩室炎、急性和慢性形式的类风湿性关节炎和骨关节炎，以及因骨关节组织代谢疾病导致的病理情况。
目前通过对壳多糖这种来源于N-乙酰基-D-葡糖胺的复杂碳水化合物进行酸水解得到葡糖胺。另一方面，还可以通过对各种乙酰化了的脱乙酰壳多糖进行酸水解生产葡糖胺。壳多糖这种N-乙酰氨基葡糖和葡糖胺的共聚物是在节肢动物和真菌中发现的常见天然物质。它可以获自价格低廉的来源，如节肢动物废物(refuse)，例如有壳的水生动物(龙虾(lobster)、小河虾(shrimp)、磷虾(krill)、蟹(crab)和对虾(prawn)的外骨骼)；用于生物降解猪废弃物的昆虫，如蝇幼体(fly larvae)；且近期来自用于柠檬酸生产中的废真菌生物质。终产物葡糖胺盐相对昂贵，因为在废物源中相对较低的壳多糖含量要求加工处理大量废物以获得相对少量的产物，并且因为加工本身产率和能量相对较低且是化学上密集的。
常用的工业化实践是如下述纯化壳多糖通过用酸与碱的组合处理壳多糖以除去无机物、蛋白质和废料起始物质附带的其它杂质，然后在单步骤中通过使用浓盐酸在高温使壳多糖解聚并脱乙酰化成葡糖胺，该步骤耗时长且产率低。葡糖胺作为游离碱极不稳定并发生降解。所以产生了诸如盐酸盐这类稳定的盐。还提供盐的其它混合物，其通常使用盐酸盐作为碱，以模拟已经测试过其在临床环境下的功效的形式，如Viartril和DONAX200-S。这些组合物采用混合盐形式，其分子式为(葡糖胺)2硫酸盐-(NaCl)2和(葡糖胺)2硫酸盐-(KCl)2。近来，研究将结构(葡糖胺)2硫酸氢钠-(HCl)2(葡糖胺)2硫酸氢钾-(HCl)2的盐作为在低剂量的钠和钾条件下提供葡糖胺的稳定盐的工具。
N-乙酰氨基葡糖不能在市场上广泛获得。目前通过使用有机乙酰化试剂诸如乙酐对葡糖胺进行乙酰化来生产N-乙酰氨基葡糖，这是一种昂贵和困难的步骤。这些方法存在产率极低的问题(从底物到葡糖胺的转化率约为50％)。
来源于有壳的水生动物的葡糖胺的常用形式带有标记，警告消费者对有壳的水生动物过敏的人可能出现过敏反应。越来越多的消费者寻找不含所有动物副产物的物质。此外，原料(即壳多糖源，诸如蟹壳)的利用率变得更加受限。因此，工业中需要生产用于商业销售和应用的高产率葡糖胺和N-乙酰氨基葡糖的成本-有效(cost-effective)的方法。
PCT公开WO 02/66667中公开了葡糖胺和从微生物生物质生产葡糖胺的方法。该生产方法克服了与有壳水生动物过敏相关的问题，但存在产率低的主要问题。更具体的说，由于该方法依赖于用于生产诸如柠檬酸的其它产品的发酵中产生的生物质废物，所以它不能产生足够量的葡糖胺以满足该产品逐渐增加的市场需求。美国专利US6,372,457中公开了通过微生物发酵生产葡糖胺的方法和物质，该文献的全部内容引入本文作为参考。然而，美国专利US 6,372,457中没有公开任何用于生产N-乙酰氨基葡糖的方法。
发明概述 本发明的一个实施方案涉及通过发酵生产葡糖胺或N-乙酰氨基葡糖的方法。该方法包括下列步骤(a)在发酵培养基中培养包括至少一种增加葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶活性的遗传修饰的微生物；和b)收集从培养步骤中产生的产物，所述产物选自葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸或N-乙酰氨基葡糖。
在一个方面中，增加葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶的遗传修饰提供了选自下组的结果葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶的酶活性增加；所述微生物超表达葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶；葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶的N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸产物抑制减少；和葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶对葡糖胺-6-磷酸的亲合力增加。在另一个方面中，用至少一种包括编码葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶的核酸序列的重组核酸分子转化所述的微生物。在一个方面中，编码葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶的核酸序列含有至少一种增加葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶的酶活性的遗传修饰。在另一个方面中，所述的葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶与选自SEQ ID NO30、SEQ ID NO32或SEQ ID NO34的氨基酸序列至少约35％相同，或至少约50％相同，或至少约70％相同的氨基酸序列，其中所述的葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶具有酶活性。在另一个方面中，所述的葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶具有选自SEQ ID NO30、SEQ ID NO32或SEQ IDNO34的氨基酸序列。
在本发明的另一个方面中，所述的微生物进一步包括至少一种降低葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性的遗传修饰。降低葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性的遗传修饰可以包括、但不限于编码微生物中葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的内源性基因的部分或完全缺失或失活。
在本发明该实施方案的另一个方面中，所述的微生物进一步包括至少一种增加葡糖胺-6-磷酸合酶的遗传修饰。在一个方面中，用至少一种包括编码葡糖胺-6-磷酸合酶的核酸序列的重组核酸分子转化所述的微生物。这类葡糖胺-6-磷酸合酶可以包括含有一种氨基酸序列的葡糖胺-6-磷酸合酶，所述的氨基酸序列与选自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ IDNO16、SEQ ID NO18或SEQ ID NO20的氨基酸序列至少约35％相同，或至少约50％相同，或至少约70％相同，其中所述的葡糖胺-6-磷酸合酶具有酶活性。在一个方面中，所述的葡糖胺-6-磷酸合酶包括选自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ IDNO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18或SEQ ID NO20的氨基酸序列。在一个方面中，所述的葡糖胺-6-磷酸合酶与野生型葡糖胺-6-磷酸合酶相比具有减少葡糖胺-6-磷酸合酶的产物抑制的修饰。这类葡糖胺-6-磷酸合酶可以包括、但不限于含有选自SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12或SEQ ID NO14的氨基酸序列的蛋白质。在另一个方面中，这种微生物进一步包括至少一种降低葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性的遗传修饰。降低葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性的遗传修饰包括、但不限于微生物中编码葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的内源性基因的部分或完全缺失或失活。
本发明的另一个实施方案涉及通过发酵生产葡糖胺或N-乙酰氨基葡糖的方法，包括(a)在发酵培养基中培养包括至少一种增加葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性的遗传修饰的微生物；(b)收集从培养步骤中产生的产物，其选自葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸或N-乙酰氨基葡糖。在该方面中，所述的遗传修饰优选提供了下组的结果所述微生物超表达葡糖胺-6-磷酸脱氨酶；葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的酶活性增加；葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的逆向反应增加以形成增加的葡糖胺-6-磷酸；葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的正向反应减少以形成还原的果糖-6-磷酸；葡糖胺-6-磷酸脱氨酶对果糖-6-磷酸的亲合力增加；葡糖胺-6-磷酸脱氨酶对葡糖胺-6-磷酸的亲合力降低；和葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的葡糖胺-6-磷酸产物抑制减少。一个方面中，用包括编码葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的核酸序列的重组核酸分子转化所述的微生物。在一个方面中，编码葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的核酸序列含有至少一种增加葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的酶活性的遗传修饰。在一个方面中，所述的葡糖胺-6-磷酸脱氨酶具有与SEQ ID NO42的氨基酸序列至少约35％相同，或至少约50％相同，或至少约70％相同的氨基酸序列，其中所述的葡糖胺-6-磷酸脱氨酶具有酶活性。在一个方面中，所述的葡糖胺-6-磷酸脱氨酶具有SEQ ID NO42的氨基酸序列。
在该实施方案的一个方面中，所述的微生物进一步包括降低葡糖胺-6-磷酸合酶活性的遗传修饰。例如，降低葡糖胺-6-磷酸合酶活性的遗传修饰可以包括、但不限于微生物中编码葡糖胺-6-磷酸合酶的内源性基因的部分或完全缺失或失活。
在该实施方案的另一个方面中，所述的微生物进一步包括增加葡糖胺-6-磷酸N-乙酰转移酶活性的遗传修饰。所述的遗传修饰可以提供选自下列结果的结果葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶的酶活性增加；所述微生物超表达葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶；葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶的N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸产物抑制减少；和葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶对葡糖胺-6-磷酸的亲合力增加。在一个方面中，如本文前一实施方案所述，用包括编码葡糖胺-6-磷酸N-乙酰转移酶的核酸序列的重组核酸分子转化所述的微生物。在上述实施方案中已经描述了葡糖胺-6-磷酸N-乙酰转移酶的各个方面且它们包括在本文中。在一个方面中，所述的微生物进一步包括降低葡糖胺-6-磷酸合酶活性的遗传修饰。这类修饰可以包括、但不限于微生物中编码葡糖胺-6-磷酸合酶的内源性基因的部分或完全缺失或失活。
在该实施方案的另一个方面中，所述的微生物进一步包括增加葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶活性的遗传修饰。所述的遗传修饰可以提供选自下组的结果葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶的酶活性增加；N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的酶活性降低；所述微生物超表达具有葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶活性的酶；葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶对葡糖胺-1-磷酸的亲合力增加；葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶对N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸的亲合力降低；和葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶的N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸产物抑制减少。在一个方面中，所述的微生物包括双功能的葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶，其中所述的葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶活性得到增加。在另一个方面中，所述的微生物用重组核酸分子转化，所述重组核酸分子包括编码葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的核酸序列或编码葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶的核酸序列。在一个方面中，编码葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶或葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶的核酸序列含有至少一种遗传修饰，所述遗传修饰分别增加葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶或葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶的活性。在另一个方面中，所述的葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶含有与SEQ IDNO56的氨基酸序列至少约35％相同的氨基酸序列，其中所述的葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶具有葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶的酶活性。在另一个方面中，所述的葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶含有SEQ ID NO56的氨基酸序列。在另一个方面中，具有葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶活性和降低或无N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶活性的截短的葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶包括、但不限于截短的葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶，所述酶具有与SEQ ID NO58的氨基酸序列至少约35％相同的氨基酸序列。在一个方面中，截短的葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶有SEQ ID NO58的氨基酸序列。在该方面中，所述的微生物可以进一步包括降低葡糖胺-6-磷酸合酶活性的遗传修饰，诸如上文所述。
本发明的另一个实施方案涉及通过发酵生产葡糖胺或N-乙酰氨基葡糖的方法，包括a)在发酵培养基中培养微生物，其包括至少一种降低葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性的遗传修饰和至少一种增加葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶活性的遗传修饰；和b)收集从培养步骤中产生的产物，其选自葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸或N-乙酰氨基葡糖。在一个方面中，降低葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性的遗传修饰包括微生物中编码葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的内源性基因的部分或完全缺失或失活。在另一个方面中，增加葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶活性的遗传修饰提供了选自下组的结果葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶的酶活性增加；N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的酶活性降低；所述微生物超表达具有葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶活性的酶；葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶对葡糖胺-1-磷酸的亲合力增加；葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶对N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸的亲合力降低；或葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶的N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸产物抑制减少。已经在上述实施方案中描述了这类双功能葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的各个方面且它们也包括在本文中。
在该实施方案的一个方面中，所述的微生物进一步包括至少一种增加葡糖胺-6-磷酸合酶活性的遗传修饰。已经在上述实施方案中描述了这类修饰的各个方面且它们包括在本文中。
本发明的另一个实施方案涉及通过发酵生产葡糖胺或N-乙酰氨基葡糖的方法，包括a)在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包括内源性葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶和至少一种增加葡糖胺-6-磷酸合酶活性的遗传修饰；和b)收集从培养步骤中产生的产物，其选自葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸或N-乙酰氨基葡糖。在一个方面中，用至少一种包括编码葡糖胺-6-磷酸合酶的核酸序列的重组核酸分子转化所述的微生物。上文已经描述了这种修饰的各个方面且它们包括在本文中。在一个方面中，所述的微生物进一步包括至少一种降低葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性的遗传修饰，正如本文上面所述。在一个方面中，该方法为通过发酵生产N-乙酰氨基葡糖的方法且其中所述的收集步骤包括收集从培养步骤中产生的产物，其选自N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸或N-乙酰氨基葡糖。
在上述任意实施方案的一个方面中，上述任意重组核酸分子的表达是可诱导型的，诸如被、但不限于乳糖诱导。在一个方面中，所述的微生物进一步包括减少对乳糖的转录诱导作用的抑制的遗传修饰。这类遗传修饰可以包括、但不限于编码Lac I阻抑蛋白的基因的部分或完全缺失或失活。
本发明在上述任意确定的实施方案中涉及通过发酵生产葡糖胺或N-乙酰氨基葡糖的方法，可以用于下面的讨论。在一个方面中，所述的培养步骤包括将发酵培养基中碳源的浓度维持在约0.5％-约5％的步骤。在另一个方面中，所述培养步骤在包括酵母提取物的发酵培养基中进行。在另一个方面中，所述培养步骤在包括碳源的发酵培养基中进行，所述的碳源选自葡萄糖、果糖、戊糖、乳糖或葡糖酸。戊糖可以包括、但不限于核糖、木糖和阿拉伯糖。在另一个方面中，在包括葡萄糖和核糖的发酵培养基中进行所述培养步骤，而在另一个方面中，在包括葡萄糖和葡糖酸的发酵培养基进行所述培养步骤。在一个方面中，在约25℃-约45℃的温度进行所述培养步骤，而在另一个方面中，在约37℃进行所述培养步骤。在一个方面中，在约pH 4-约pH 7.5的pH进行所述培养步骤，而在另一个方面中，在约pH 6.7-约pH 7.5的pH进行所述培养步骤，且在另一个方面中，在约pH 4.5-约pH 5进行所述培养步骤。
在通过发酵法生产葡糖胺或N-乙酰氨基葡糖的任意上述实施方案中，所述的微生物可以包括下列修饰中的任意一种或多种。在一个方面中，所述的微生物进一步包括增加微生物中葡糖磷酸异构酶活性的遗传修饰。例如，可以用包括编码葡糖磷酸异构酶的核酸序列的重组核酸分子转化所述的微生物，所述的葡糖磷酸异构酶可以包括含有SEQ ID NO105的氨基酸序列的葡糖磷酸异构酶。在另一个方面中，所述的微生物进一步包括该微生物中果糖磷酸激酶的部分或完全缺失或失活。在另一个方面中，所述的微生物进一步包括增加谷氨酰胺合成酶活性的遗传修饰。例如，可以用包括编码谷氨酰胺合成酶的核酸序列的重组核酸分子转化所述的微生物，所述的谷氨酰胺合成酶可以包括含有SEQ ID NO89的氨基酸序列的谷氨酰胺合成酶。在另一个方面中，所述的微生物进一步包括增加葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的遗传修饰。例如，可以用包括编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的核酸序列的重组核酸分子转化所述的微生物，所述的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶可以包括含有SEQ ID NO95的氨基酸序列的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。在另一个方面中，所述的微生物进一步包括编码负责微生物中糖原合成的酶的基因的部分或完全缺失或失活，所述酶包括、但不限于ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、糖原合酶和分支酶。优选上述修饰中无一种抑制微生物代谢半乳糖的能力。
在通过发酵生产葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖的方法的任意上述实施方案中，所述的收集步骤可以包括从微生物回收选自胞内葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖或葡糖胺的胞内产物，或从发酵培养基中回收选自葡糖胺或N-乙酰氨基葡糖组成的胞外产物。在一个方面中，该步骤包括选自如下的步骤(a)从所述发酵培养基中纯化选自葡糖胺或N-乙酰氨基葡糖的产物；(b)从微生物纯化选自葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸或N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸的产物；(c)使选自葡糖胺-6-磷酸或葡糖胺-1-磷酸组成的产物去磷酸化而产生葡糖胺；和(d)使选自N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸或N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸的产物去磷酸化而产生N-乙酰氨基葡糖；(e)处理选自N-乙酰氨基葡糖、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸或N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸的产物而产生选自葡糖胺、葡糖胺-6-磷酸或葡糖胺-1-磷酸组成的葡糖胺产物。在一个方面中，步骤(e)包括在酸性和加热条件下或通过酶促脱乙酰化水解选自N-乙酰氨基葡糖、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸或N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸的产物。在一个方面中，通过该发酵方法生产的N-乙酰氨基葡糖通过从发酵肉汤中沉淀含有N-乙酰氨基葡糖的固体来回收。在另一个方面中，通过该发酵方法生产的N-乙酰氨基葡糖通过使含有N-乙酰氨基葡糖的固体从发酵肉汤中结晶来回收。
本发明的另一个实施方案涉及任意上述基因修饰微生物。
上述任意实施方案中的基因修饰微生物包括、但不限于细菌和真菌。在一个方面中，所述的微生物选自细菌或酵母。合适的细菌包括、但不限于选自埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)或链霉菌属(Streptomyces)的细菌。合适的细菌进一步包括、但不限于选自大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)的种的细菌。合适的酵母包括、但不限于选自酵母属(Saccharomyces)、念珠菌属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluveromyces)和Phaffia的属的酵母。合适的酵母进一步包括、但不限于选自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、白色念珠菌(Candida albicans)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)、P.canadensis、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)或Phaffia rhodozyma的酵母。合适的真菌包括、但不限于选自曲霉属(Aspergillus)、犁头霉属(Absidia)、根霉属(Rhizopus)、金孢子菌属(Chrysosporium)、脉孢霉属(Neurospora)或木霉属(Trichoderma)的真菌。合适的真菌进一步包括、但不限于选自黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉(A.nidulans)、蓝色犁头霉(Absidia coerulea)、米根霉(Rhizopus oryzae)、Chrysosporium lucknowense、粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)、间型脉孢霉(N.intermedia)或Trichoderm reesei的真菌。
本发明的另一个实施方案涉及生产N-乙酰氨基葡糖的方法，包括(a)获得含有发酵过程产物即溶解的N-乙酰氨基葡糖的发酵肉汤；和(b)从该发酵肉汤中回收含有N-乙酰氨基葡糖的固体。在一个方面中，该方法进一步包括从发酵肉汤中除去细胞物质。在一个方面中，该方法进一步包括给发酵肉汤脱色的步骤。这类脱色步骤可以包括、但不限于多次N-乙酰氨基葡糖结晶、活性炭处理和色谱脱色。在一个方面中，该方法进一步包括使所述发酵肉汤与离子交换树脂接触的步骤。例如，使发酵肉汤与离子交换树脂接触的步骤可以包括、但不限于使发酵肉汤接触阴离子交换树脂和阳离子交换树脂。使发酵肉汤接触阴离子交换树脂和阳离子交换树脂的步骤可以包括使发酵肉汤接触阴离子和阳离子交换树脂的混合床。
在该实施方案的一个方面中，所述回收步骤包括从发酵肉汤中沉淀含有N-乙酰氨基葡糖的固体。
在该实施方案的一个方面中，所述回收步骤包括使含有N-乙酰氨基葡糖的固体从发酵肉汤中结晶。
在该实施方案的一个方面中，所述回收步骤包括浓缩含有溶解的N-乙酰氨基葡糖的发酵肉汤。在一个方面中，浓缩步骤在低于大气压下进行。在另一个方面中，通过膜分离进行浓缩步骤。在另一个方面中，浓缩步骤在约40℃-约75℃的温度进行。在另一个方面中，浓缩步骤在约45℃-约55℃的温度进行。在另一个方面中，进行浓缩步骤以使得发酵肉汤中固体的含量为至少约30％固体。在另一个方面中，进行浓缩步骤以使得发酵肉汤中固体的含量为至少约40％固体。在另一个方面中，进行浓缩步骤以使得发酵肉汤中固体的含量为至少约45％固体。在另一个方面中，该方法进一步包括在浓缩步骤后冷却发酵肉汤的步骤。例如，可以将发酵肉汤冷却至约-5℃-约45℃，或在另一个方面中，可以将发酵肉汤冷却至约-5℃到约室温，或在另一个方面中，可以将发酵肉汤冷却至约室温。
浓缩步骤的另一个方面进一步包括在冷却步骤后用N-乙酰氨基葡糖晶体接种发酵肉汤。在一个方面中，N-乙酰氨基葡糖的晶种选自通过发酵肉汤中成核形成的N-乙酰氨基葡糖晶体或外部提供的N-乙酰氨基葡糖晶体。
在该实施方案的任意各个方面中，回收步骤可以包括使N-乙酰氨基葡糖与水混溶性溶剂接触的步骤。水混溶性溶剂可以包括、但不限于异丙醇(IPA)、乙醇、甲醇、丙酮、四氢呋喃、二甲亚砜、二甲基甲酰胺、二噁烷和乙腈。
在该实施方案的任意各个方面中，该方法可以进一步包括干燥回收的含有N-乙酰氨基葡糖的固体的步骤。该步骤可以包括用水混溶性溶剂洗涤干燥的含有N-乙酰氨基葡糖的固体。
在该实施方案的任意各个方面中，该方法可以包括溶解回收的含有N-乙酰氨基葡糖的固体以形成N-乙酰氨基葡糖溶液和从该溶液中回收含有N-乙酰氨基葡糖的固体。
在该实施方案的任意各个方面中，该方法可以进一步包括过滤发酵肉汤以除去细菌内毒素。
本发明的另一个实施方案涉及由N-乙酰氨基葡糖源生产葡糖胺的方法，包括(a)从下组物质获得N-乙酰氨基葡糖源N-乙酰氨基葡糖、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸或N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸；和(b)处理(a)的N-乙酰氨基葡糖源从而由N-乙酰氨基葡糖源生产选自葡糖胺、葡糖胺-6-磷酸或葡糖胺-1-磷酸的葡糖胺产物。在一个方面中，N-乙酰氨基葡糖源中干固体的百分含量为至少约40％的N-乙酰氨基葡糖。在另一个方面中，N-乙酰氨基葡糖源为通过发酵法生产的N-乙酰氨基葡糖。在另一个方面中，N-乙酰氨基葡糖为通过发酵法生产的含有N-乙酰氨基葡糖的发酵肉汤，其中发酵肉汤已经过处理而基本上除去了细胞物质。在另一个方面中，将N-乙酰氨基葡糖作为固体或在溶液中提供。在另一个方面中，将N-乙酰氨基葡糖源悬浮于含水的低沸点伯醇或仲醇中。
在该实施方案的一个方面中，处理步骤(b)包括在酸性和加热条件下水解N-乙酰氨基葡糖源。在一个方面中，水解步骤在约60℃-约100℃的温度进行。在另一个方面中，水解步骤在约70℃-约90℃的温度进行。在另一个方面中，使用浓度为约10％-约40％重量/重量的盐酸溶液进行水解步骤。在另一个方面中，盐酸溶液与N-乙酰氨基葡糖源的纯干重的重量比约为1:1-约5:1。在另一个方面中，使水解步骤进行约10分钟-约24小时。
在一个方面中，水解步骤包括(a)通过将N-乙酰氨基葡糖源与盐酸溶液或再循环的母液在加热条件下合并以水解N-乙酰氨基葡糖源，从而产生含有葡糖胺盐酸盐的溶液；(b)冷却(a)的溶液以沉淀葡糖胺盐酸盐；和(c)从(b)中回收沉淀的含葡糖胺盐酸盐的固体。在一个方面中，通过连续掺合N-乙酰氨基葡糖源与盐酸溶液或再循环的水解母液来进行水解步骤(a)，以维持N-乙酰氨基葡糖源作为溶解的溶液，随后在加热条件下向(a)的溶液中添加无水盐酸以启动水解，并将N-乙酰氨基葡糖转化成葡糖胺盐酸盐。在另一个方面中，水解母液为回收步骤(c)中沉淀的葡糖胺盐酸盐后剩余的水解溶液，其中在进行水解前、过程中或之后向所述水解溶液中加入伯醇或仲醇。这类伯醇或仲醇可以包括、但不限于甲醇、异丙醇、乙醇、正丙醇、正丁醇和仲丁醇。在一个方面中，进行冷却步骤至溶液的温度约为-5℃-约40℃。
在另一个方面中，回收步骤包括(i)收集沉淀的含有葡糖胺盐酸盐的固体；(ii)用水混溶性溶剂洗涤该含有葡糖胺盐酸盐的固体；和(iii)干燥含有葡糖胺盐酸盐的固体。
在另一个方面中，回收步骤包括(i)收集沉淀的含有葡糖胺盐酸盐的固体；(ii)将来自(i)的固体溶于水而形成溶液；(iii)将(ii)的溶液的pH调节至约2.5-4；(iv)使(iii)的溶液接触活性炭以便使含有葡糖胺盐酸盐的固体脱色；(v)从(iv)的溶液中除去活性炭；(vi)使葡糖胺盐酸盐从(v)的溶液中结晶。在该方面中，结晶步骤包括在低于约70℃的温度浓缩所述葡糖胺盐酸盐。在一个方面中，结晶步骤包括在低于约50℃的温度浓缩所述葡糖胺盐酸盐。在一个方面中，结晶步骤包括在低于大气压浓缩所述葡糖胺盐酸盐。在另一个方面中，该方法进一步包括将结晶步骤(vi)后剩余的溶液再循环至随后的回收工艺的步骤(i)。在另一个方面中，该方法进一步包括将结晶步骤(vi)后剩余的溶液再循环至随后的结晶步骤。在该方面中，该方法可以包括用水混溶性溶剂洗涤来自步骤(vi)的结晶葡糖胺盐酸盐，所述的水混溶性溶剂包括、但不限于甲醇、异丙醇、乙醇、乙腈、丙酮、四氢呋喃、二甲亚砜、二甲基甲酰胺和二噁烷。在一个方面中，该方法进一步包括洗涤后，将结晶葡糖胺盐酸盐在低于约70℃的温度干燥约6小时以下。干燥步骤可以在低于大气压下进行。在一个方面中，使用通风(air sweep)进行干燥步骤。
在该实施方案的另一个方面中，将N-乙酰氨基葡糖源悬浮于含水的低沸点伯醇或仲醇中且其中该方法在步骤(a)-(b)之间还包括附加的步骤，即在除去水解后或再循环水解溶液前与醇形成的乙酸酯以便重新使用。在一个方面中，通过选自蒸馏、急骤蒸发或在低于大气压浓缩的方法除去乙酸酯。在另一个方面中，在约60℃-约100℃的温度进行水解步骤。在另一个方面中，在1个大气压和溶液的沸点进行水解步骤。在另一个方面中，水解步骤在下列条件下进行盐酸溶液与N-乙酰氨基葡糖源的干重之重量比约为31-约51，且温度低于约80℃。在一个方面中，该方法进一步包括如上所述用水混溶性溶剂洗涤步骤(c)中回收的葡糖胺盐酸盐和/或干燥结晶的葡糖胺盐酸盐的步骤。
在本发明该实施方案的另一个方面中，处理步骤(b)包括使N-乙酰氨基葡糖源接触去乙酰化酶以产生葡糖胺产物。这类去乙酰化酶可以包括、但不限于N-乙酰氨基葡糖-6-P脱乙酰酶、N-乙酰氨基葡糖脱乙酰酶和/或壳多糖脱乙酰酶，已经对这些酶进行了修饰或选择使其具有使N-乙酰氨基葡糖胺单体脱乙酰化以产生葡糖胺的能力。在一个方面中，通过结晶得到葡糖胺产物。在一个方面中，该方法包括通过沉淀回收所述葡糖胺产物。在一个方面中，将所述的去乙酰化酶固定在底物上。在一个方面中，接触步骤包括在有氯化钠或氯化钙水溶液存在的情况下使N-乙酰氨基葡糖源与去乙酰化酶接触的步骤。在该方面中，该方法可以进一步包括通过结晶或沉淀回收葡糖胺产物的步骤。在一个方面中，所述接触步骤包括在有醇存在的情况下使N-乙酰氨基葡糖源与去乙酰化酶接触以酯化醇。在另一个方面中，该方法进一步包括将盐与葡糖胺产物混合并使该混合物与离子交换介质接触，所述的盐包括、但不限于氯化物盐、磷酸盐、硫酸盐、碘化物和硫酸氢盐。
本发明的另一个实施方案涉及通过发酵生产葡糖胺的方法，包括(a)在发酵培养基中培养用包括编码葡糖胺-6-磷酸合酶的核酸序列的重组核酸分子转化的微生物，其中所述重组核酸分子的表达通过乳糖诱导来控制，且其中所述的培养步骤包括(i)使所述微生物在发酵培养基中生长，该发酵培养基包括葡萄糖作为碳源、pH为约pH 4.5-约pH 7且温度为约25℃-约37℃；(ii)在不向该培养基中添加另外的葡萄糖的情况下，通过向发酵培养基中添加乳糖诱导核酸序列的转录；(iii)步骤(ii)后，在有葡萄糖存在、pH为约4.5-约6.7且温度为约25℃-约37℃的条件下发酵所述微生物；和(b)收集从培养步骤中产生的、选自葡糖胺-6-磷酸和葡糖胺的产物。在一个方面中，向发酵步骤(iii)中加入微量元素源，包括、但不限于铁。在一个方面中，步骤(ii)包括使所述微生物在包括葡萄糖作为碳源、pH约为pH 6.9的发酵培养基中生长。在一个方面中，步骤(iii)包括在步骤(ii)后，在有葡萄糖存在、pH为约4.5-约5的条件下发酵所述微生物。在一个方面中，步骤(iii)包括步骤(ii)后，在有葡萄糖存在、pH为约6.7的条件下发酵所述微生物。
附图简述

图1是重组大肠杆菌中葡糖胺的生物合成和代谢途经的示意图。
图2是对重组大肠杆菌中葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖超量生产途经的新修饰的示意图。
图3是由葡萄糖到葡糖胺的途经和其它竞争途经的略图(PGI＝葡糖磷酸异构酶；PGM＝葡糖磷酸变构酶；PFK＝果糖磷酸激酶；zwf＝葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；GlmS＝葡糖胺-6-P合酶；磷酸酶＝葡糖胺-6-磷酸水解中涉及的磷酸酶活性)。
图4是表示葡糖胺-6-磷酸对重组枯草芽孢杆菌GlmS酶活性的影响的线性图。
图5是表示在低葡糖胺-6-磷酸水平下不同GlmS蛋白质的葡糖胺合酶活性的示意图。
图6是表示摇瓶培养中一定时间内酶活性改变的示意图。
图7是表示在摇瓶中不同条件下乳糖诱导的葡糖胺产生水平的柱形图(乳糖诱导型菌株为7107-16且对照菌株为2123-54)。
图8是线性图，表示微量元素对起始生长期后用乳糖诱导的细胞培养物中葡糖胺产量的影响。
图9是线性图，表示发酵罐中的磷酸浓度和铁供给量对葡糖胺产量的影响。
图10是线性图，表示存在20gl-1葡糖胺时7107-18在不同pH条件下的生长曲线。
图11是线性图，表示不同环境条件下，菌株2123-54在1-升发酵罐中的葡糖胺产量。
图12是线性图，说明在不同pH条件下葡糖胺的降解(在M9A-葡萄糖培养基中60gl-1)。
图13是线性图，说明N-乙酰氨基葡糖在M9A培养基(不含葡萄糖)中的稳定性，其中在两种N-乙酰氨基葡糖浓度(40和80gl-1)和两种pH(5.5和7.0)条件下检测稳定性。
图14是N-乙酰氨基葡糖生产的可选途经的略图。
图15是表示磷酸化的氨基糖类对葡糖磷酸异构酶活性(Pgi)的影响的线性图。
图16是表示磷酸化的氨基糖类对葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶的影响的线性图。
图17是表示N-乙酰氨基葡糖发酵过程中酶的活性水平的线性图。
图18是线性图，显示摇瓶实验中戊糖和葡糖酸对N-乙酰氨基葡糖产量的影响(将每种糖以10gl-1加入到摇瓶中的培养基中)。
图19是线性图，表示在发酵罐中用IPTG在早期和晚期进行诱导的条件下，7107-87#25的N-乙酰氨基葡糖产量。
图20是线性图，表示锌和铁浓度对N-乙酰氨基葡糖产量的影响，且特别显示除去锌的有益作用。
图21是线性图，表示N-乙酰氨基葡糖(在M9A培养基中10g/l)的酸/热水解。
图22是线性图，表示在酸/热水解条件下葡糖胺(在M9A培养基中10g/l)的稳定性。
图23是线性图，表示在不同温度使用0.1N盐酸对N-乙酰氨基葡糖(在M9A培养基中20g/l)的酸水解。
图24是表示在90℃ N-乙酰氨基葡糖/葡糖胺水解的线性图。
图25是表示在90℃由N-乙酰氨基葡糖/葡糖胺水解形成氨的线性图。
发明详述 本发明涉及用于生产葡糖胺和N-乙酰氨基葡糖的生物合成方法。这类方法包括发酵基因修饰微生物以生产葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖。本发明还涉及用于生产葡糖胺和N-乙酰氨基葡糖的基因修饰微生物。此外，本发明涉及回收通过发酵法生产的N-乙酰氨基葡糖的方法，包括产生高纯度N-乙酰氨基葡糖的方法。本发明还涉及由N-乙酰氨基葡糖生产葡糖胺的方法。在本发明前，通过对葡糖胺乙酰化生产N-乙酰氨基葡糖且由此不认为已经描述了由N-乙酰氨基葡糖生产商业有用的葡糖胺，或乃至在商业上可行的的方法。本发明首次证实了可通过完全天然的生物方法直接生产N-乙酰氨基葡糖。
更具体地说，本发明总体涉及通过发酵微生物生产葡糖胺和N-乙酰氨基葡糖的方法。该方法包括在发酵培养基中培养微生物的第一个步骤，所述微生物的氨基糖代谢途经中具有遗传修饰，所述的氨基糖代谢途经包括将葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸或N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸转化成其它化合物的途经；合成葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸或N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸的途经；将葡糖胺、葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸或N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸转运出该微生物的途经；将葡糖胺或N-乙酰氨基葡糖转运入该微生物的途经；和竞争葡糖胺-6-磷酸生产中涉及的底物的途经，从而从该微生物产生可以包括胞内的葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖和/或葡糖胺，和/或胞外的葡糖胺或N-乙酰氨基葡糖的产物。该方法还包括收集所述产物的第二个步骤，通过下列方式进行自微生物回收胞内葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖和/或葡糖胺，和/或从发酵培养基中收集和/或回收胞外葡糖胺或N-乙酰氨基葡糖，该步骤可以包括回收和纯化步骤(在下面具体定义和讨论)。可以使用本文所述的方法使从本发明发酵法回收的N-乙酰氨基葡糖、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸和N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸脱乙酰化而产生葡糖胺、葡糖胺-6-磷酸和葡糖胺-1-磷酸。
本发明通过发酵生产葡糖胺和N-乙酰氨基葡糖的新方法是低廉的，且其葡糖胺和N-乙酰氨基葡糖产率可以超过通过目前方法生产的葡糖胺和N-乙酰氨基葡糖的产率。此外，通过使用本文所述的基因修饰微生物，本发明的方法易于修饰以适合于特定的难题或有关生产葡糖胺和N-乙酰氨基葡糖的变化的要求。此外，本领域技术人员可以使用和/或改变本发明公开的方法和物质以产生其它氨基糖类，诸如聚-N-乙酰氨基葡糖、聚-葡糖胺、半乳糖胺、甘露糖胺、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰甘露糖胺和及其衍生物。
氨基糖类N-乙酰氨基葡糖(GlcNAc)和葡糖胺(GlcN)是微生物中根本上重要的分子，因为它们是用于主要大分子且具体是糖缀合物(即含有共价结合的寡糖链的大分子)的生物合成的前体。例如，在大肠杆菌中，N-乙酰氨基葡糖和葡糖胺是细胞包膜中两种大分子肽聚糖和脂多糖的前体。阻断肽聚糖或脂多糖的生物合成的突变是致命的，导致细胞包膜的完整性丧失且最终导致细胞裂解。
本文所用的术语葡糖胺、D-葡糖胺和N-葡糖胺可以互换使用。类似地，术语葡糖胺-6-磷酸和N-葡糖胺-6-磷酸可以互换使用且术语葡糖胺-1-磷酸和N-葡糖胺-1-磷酸可以互换使用。葡糖胺、葡糖胺-6-磷酸和葡糖胺-1-磷酸可以分别缩写为GlcN、GlcN-6-P和GlcN-1-P。N-乙酰氨基葡糖还可以称作2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖。N-乙酰氨基葡糖还可以称为N-乙酰葡糖胺。与葡糖胺和衍生物类似，术语N-乙酰氨基葡糖、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸和N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸可以分别缩写为GlcNAc(或D-GlcNAc)、GlcNAc-6-P和GlcNAc-1-P。N-乙酰氨基葡糖也缩写为NAG。
本文涉及与上述鉴定的葡糖胺和N-乙酰氨基葡糖产物的生产相关的氨基糖代谢途经中的酶。氨基糖是糖的氨基衍生物(例如含有取代了羟基的氨基的糖)。本发明的氨基糖代谢途经为参与或影响氨基糖的生物合成、合成代谢或分解代谢的任何生化途经。本文的氨基糖代谢途经包括将氨基糖类及其前体转运入和转运出细胞的途经，且还可以包括竞争参与氨基糖生物合成或分解代谢的底物的生化途经。例如，最早期形成的氨基糖之一的直接前体为果糖-6-磷酸(F-6-P)，它在生化反应(通过葡糖胺合酶催化)或与铵的生化反应(通过葡糖胺脱氨酶催化)中形成葡糖胺-6-磷酸。果糖-6-磷酸也是糖酵解途径中的中间体。因此，糖酵解途经通过竞争底物果糖-6-磷酸与葡糖胺-6-磷酸生物合成途经竞争。此外，还可以将葡糖胺-6-磷酸转化成其它氨基糖类，并通过一系列生化反应形成各种大分子中的组成部分。照此，果糖-6-磷酸/葡糖胺-6-磷酸途经，糖酵解途经(达到影响葡糖胺-6-磷酸生物合成的程度)和葡糖胺-6-磷酸/大分子生物合成途经均视为本发明中的氨基糖代谢途经。
谷氨酰胺合成和代谢途经决定谷氨酰胺的有效性(葡糖胺-6-磷酸合成的氨基供体)且由此影响葡糖胺-6-磷酸的生物合成。因此，将所有这些途经均视为本发明中的氨基糖代谢途经。由葡糖胺-6-磷酸合成N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸和由葡糖胺-1-磷酸合成N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸要求提供乙酰辅酶A，它也是用于Krebs循环的底物。因此，Krebs循环与N-乙酰氨基葡糖合成途经竞争底物乙酰辅酶A。照此，乙酰辅酶A合成和代谢途经影响N-乙酰氨基葡糖的生物合成，且由此将它们均视为本发明中的氨基糖代谢途经。
就各种微生物而言，已经阐明了许多氨基糖代谢途经。具体阐明了在大肠杆菌中葡糖胺和N-乙酰氨基葡糖及其磷酸化衍生物的生物合成和分解代谢途经。这些途经包括利用这些氨基糖类作为碳源的多个转运系统。编码与氨基糖类在大肠杆菌中的转运、分解代谢和生物合成直接相关的酶和蛋白质的基因已经被克隆和测序。此外，已经分离了基本上在氨基糖代谢中每一步中都被阻断的大肠杆菌突变株。
图1中解释了大肠杆菌的氨基糖代谢的已知途经。美国专利US 6,372,457中首次描述了生产葡糖胺的微生物，它具有的葡糖胺生产能力远超过任意已知野生型或突变体微生物的葡糖胺生产能力。正如美国专利US 6,372,457中所公开的，分解代谢中的一些步骤被基因失活(用×表示)阻断，而催化GlcN 6-P合成的GlcN-6-P合酶在重组宿主细胞中超表达(用粗线表示)。本发明提供了美国专利US 6,372,457中未描述的用于生产葡糖胺的新发酵方法，包括美国专利US 6,372,457中未描述的用于生产葡糖胺的生产微生物的遗传修饰以及遗传修饰组合。还认为本发明首次描述了用于生产N-乙酰氨基葡糖的微生物的遗传修饰和发酵方法。
正如下文具体所述，尽管已经阐明了氨基糖代谢途经中涉及的许多途经和基因，但是截至到本发明为止，尚不了解在许多可能的遗传修饰中哪一种是产生可以商业化生产大量N-乙酰氨基葡糖的微生物所必不可少的。此外，此前尚未认识到本文所述用于生产葡糖胺的新的遗传修饰及其组合。实际上，本文所述用于生产葡糖胺的一些遗传修饰与现有技术中公开的用于葡糖胺生产的发酵方法中描述的相反，所述的现有技术为上文所述的美国专利US 6,372,457。
将微生物大肠杆菌的氨基糖代谢途经称为本发明具体的实施方案。图2中解释了本发明公开的用于超量生产葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖的氨基糖代谢途经中遗传修饰的主要方面。就图2而言，粗体箭头表示本发明涉及的通过遗传改造产生和/或增加代谢流量。公开了数种用于合成N-乙酰氨基葡糖的不同方法，包括、但不限于对GNA 1和/或NagB的修饰且进一步包括对GlmS和GNA 1、GlmS和GlmU、NagB和GNA1以及NagB和GimU的修饰的组合，可以单独使用或进一步与其它遗传修饰联用。例如，本发明涉及其它基因的超表达或缺失以使葡糖胺/N-乙酰氨基葡糖生产最优化。参考图3和下表，该附图解释了葡萄糖代谢和N-葡糖胺形成中各种其它酶的参与，且该表显示了可以另外对本发明微生物宿主进行的各种修饰以使葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖生产最优化。下文中详细描述了所有这些实施方案。可以理解的是其它微生物具有类似的糖代谢途经，且在这类途经中基因和蛋白质具有类似的结构和功能。照此，下面讨论的有关大肠杆菌的原理适用于其它微生物且显然包括在本发明中。

本领域中已知具有相同生物活性的酶可以具有不同的名称，这取决于该酶来源于什么样的微生物。下面是本文涉及的许多酶的可选名称总列表和来自一些生物体的编码这类酶的具体基因名称。这些酶的名称可以互换使用或如果合适用于给定的序列或生物体，但本发明意图包括来自任意生物体的指定功能的酶。
例如，本文一般称作“葡糖胺-6-磷酸合酶”的酶催化由果糖-6-磷酸和谷氨酰胺形成葡糖胺-6-磷酸和谷氨酸。该酶也称作葡糖胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶(异构化)；磷酸己糖氨基转移酶；D-果糖-6-磷酸转酰胺酶；葡糖胺-6-磷酸异构酶(形成谷氨酰胺)；L-谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转酰胺酶；和GlcN6P合酶。来自大肠杆菌和其它细菌的葡糖胺-6-磷酸合酶一般称作GlmS。来自酵母和其它来源的葡糖胺-6-磷酸合酶一般称作GFA或GFAT。
来自各种生物体的葡糖胺-6-磷酸合酶是本领域中公知的，且可用于本发明遗传改造策略中。例如，本文描述了来自大肠杆菌的葡糖胺-6-磷酸合酶。来自大肠杆菌的葡糖胺-6-磷酸合酶具有本文由SEQ ID NO2表示的、由本文SEQ ID NO1表示的核酸序列编码的氨基酸序列。本文还描述了来自枯草芽孢杆菌的葡糖胺-6-磷酸合酶，它具有本文SEQ ID NO16表示的、由本文SEQ ID NO15表示的核酸序列编码的氨基酸序列。本文还描述了来自酿酒酵母的葡糖胺-6-磷酸合酶，已知在该生物体中它作为葡糖胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶(GFA1)且具有本文由SEQ ID NO18表示的由本文SEQID NO17表示的核酸序列编码的氨基酸序列。本文还描述了来自白色念珠菌的葡糖胺-6-磷酸合酶，已知它在该生物体中也作为葡糖-果糖-6-磷酸氨基转移酶(GFA1)且具有本文SEQ ID NO20表示的由本文SEQ ID NO19表示的核酸序列编码的氨基酸序列。本发明还包括具有一种或多种遗传修饰的葡糖胺-6-磷酸合酶，所述的遗传修饰产生选自如下的结果葡糖胺-6-磷酸合酶的酶活性增加；葡糖胺-6-磷酸合酶的产物抑制减少；和葡糖胺-6-磷酸合酶对其底物的亲合力增加。一般来说，本发明突变的或修饰的酶的指定特征增加或减少是以在相同或等同条件下测定或确定的来自相同生物体的野生型(即正常的、未修饰的)酶的相同特征为对照(更具体的内容在下文中讨论)。
本文还描述了数种具有使酶活性的产物抑制减少的遗传修饰的葡糖胺-6-磷酸合酶。这类对葡糖胺-6-磷酸合酶的修饰还描述在美国专利US 6,372,457中，不过，本文描述了具有减少的产物抑制的至少另一种不同的GlmS突变体(SEQ ID NO14)。来自大肠杆菌的具有减少的产物抑制的葡糖胺-6-磷酸合酶具有包括、但不限于如下序列表示的氨基酸序列SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12和SEQ IDNO14(分别由SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11和SEQ ID NO13编码)。此外，将描述SEQ ID NO14中相对于野生型序列(SEQ ID NO2)的氨基酸位置的表作为表7提供，所述氨基酸位置导致酶对产物的抑制减少。SEQ ID NO4相对SEQ ID NO2而言具有以下突变4位上的Ile变成Thr、272位上的Ile变成Thr，且450位上的Ser变成Pro。SEQ ID NO6相对SEQ ID NO2而言具有以下突变39位上的Ala变成Thr、250位上的Arg变成Cys且472位上的Gly变成Ser。SEQ ID NO8相对SEQ ID NO2而言具有以下突变469位上的Leu变成Pro。SEQ ID NO10和12相对于SEQ ID NO2各自具有至少下述突变472位上的Gly变成Ser。本发明涉及这样一种葡糖胺-6-磷酸合酶，其具有表7中所列任意一个或多个位置的突变，包括其中所示的突变的任意组合；或这样一种葡糖胺-6-磷酸合酶，其具有SEQ ID NO4、6、8、10、12或14中任意一种表示的任意其它突变，包括其任意组合。此外，可以在来自其它微生物的葡糖胺-6-磷酸合酶中进行同源修饰。最后，一些天然存在的葡糖胺-6-磷酸合酶与来自其它微生物的葡糖胺-6-磷酸合酶相似，具有较低的产物抑制。例如，本发明者已经证实来自枯草芽孢杆菌的野生型葡糖胺-6-磷酸合酶表现出与大肠杆菌突变体GlmS酶非常类似的产物抗性(参见实施例部分)。
本文一般称作葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶的酶将葡糖胺-6-磷酸和乙酰辅酶A转化成N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸，从而释放CoA。该酶也称作葡糖胺-磷酸N-乙酰转移酶、磷酸葡糖胺转乙酰酶和磷酸葡糖胺乙酰化酶。酵母酶一般称作GNA1。来自各种生物体的葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶是本领域中公知的，且可用于本发明遗传改造策略中。例如，本文描述了来自酿酒酵母的葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶。来自酿酒酵母的葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶具有本文SEQ ID NO30表示的、由本文SEQ ID NO29所示的核酸序列编码的氨基酸序列。本文还描述了来自白色念珠菌的葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶，它具有本文SEQ ID NO32表示的、由本文SEQ ID NO31所示的核酸序列编码的氨基酸序列。本文还描述了来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶，它具有本文SEQ ID NO34表示的、由本文SEQ IDNO33所示的核酸序列编码的氨基酸序列。本发明还包括具有遗传修饰的葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶，所述遗传修饰产生选自如下的结果葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶的酶活性增加；所述微生物超表达葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶；葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶的N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸产物抑制减少；或葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶对葡糖胺-6-磷酸的亲合力增加。
本文一般称作葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的酶催化葡糖胺-6-磷酸和水形成果糖-6-磷酸和铵的可逆反应。该酶也称作葡糖胺-6-磷酸异构酶；GlcN6P脱氨酶；磷酸葡糖胺异构酶；磷酸葡糖胺异构酶；葡糖胺磷酸酯脱氨酶；2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖-6-磷酸乙酮醇异构酶(脱氨)。在大肠杆菌和其它细菌中，该酶一般称作NagB。来自各种生物体的葡糖胺-6-磷酸脱氨酶是本领域中公知的，且可用于本发明的遗传改造策略。例如，本文描述了来自大肠杆菌的葡糖胺-6-磷酸脱氨酶。来自大肠杆菌的葡糖胺-6-磷酸脱氨酶具有本文SEQ ID NO42表示的、由本文SEQ ID NO41所示的核酸序列编码的氨基酸序列。本发明还包括具有产生选自如下的结果的遗传修饰的葡糖胺-6-磷酸脱氨酶葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的酶活性增加；葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的逆向反应增加以形成增加的(更多)葡糖胺-6-磷酸；葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的正向反应减少以形成减少的(较少)果糖-6-磷酸的；葡糖胺-6-磷酸脱氨酶对果糖-6-磷酸的亲合力增加；葡糖胺-6-磷酸脱氨酶对葡糖胺-6-磷酸的亲合力降低；或葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的葡糖胺-6-磷酸产物抑制减少。
本文一般称作葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶的酶将葡糖胺-1-磷酸和乙酰辅酶A转化成N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸，并释放CoA。该酶在大肠杆菌和其它细菌中称作GlmU。细菌GlmU酶是双功能酶(即它具有两种酶功能-它还具有N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的功能，也称作UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶、UDP-N-乙酰氨基葡糖二磷酸化酶)。来自各种生物体的葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶是本领域中公知的，且可用于本发明的遗传改造策略中。例如，本文描述了来自大肠杆菌的葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶，实际上为双功能葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶。来自大肠杆菌的葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶具有本文SEQ ID NO56表示的、由本文SEQ ID NO55表示的核酸序列编码的氨基酸序列。本文还描述了大肠杆菌葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的截短突变体，其中编码N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的部分已经缺失，从而有效地使该酶仅保留了葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶活性。这种截短的葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶具有本文SEQ ID NO58表示的、由本文SEQ ID NO57所示的核酸序列编码的氨基酸序列。本发明还包括具有遗传修饰的葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶，所述遗传修饰产生选自如下的结果葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶的酶活性增加；N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的酶活性降低(条件是该酶为双功能酶)；葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶对葡糖胺-1-磷酸的亲合力增加；葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶对N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸的亲合力降低(条件是该酶为双功能酶)；或葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶的N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸产物抑制减少。
本文一般称作N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸脱乙酰酶的酶将N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸水解成葡糖胺-6-磷酸和乙酸酯。该酶在大肠杆菌和其它细菌中称作NagA。来自各种生物体的N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸脱乙酰酶是本领域中公知的且可用于本发明的遗传改造策略中。例如，本文描述了来自大肠杆菌的N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸脱乙酰酶。来自大肠杆菌的N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸脱乙酰酶具有本文SEQ ID NO84表示的、由本文SEQ ID NO85表示的核酸序列编码的氨基酸序列。本发明还包括具有遗传修饰的N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸脱乙酰酶，所述遗传修饰产生选自如下的结果葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶的活性增加；葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶的逆向反应增加以形成增加的N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸；葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶的正向反应减少以形成减少的葡糖胺-6-磷酸；葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶对葡糖胺-6-磷酸的亲合力增加；葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶对N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸的亲合力降低；葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶的N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸产物抑制减少。
本文一般称作磷酸葡糖胺变位酶催化葡糖胺-6-磷酸与葡糖胺-1-磷酸之间的转化。该酶在大肠杆菌和其它细菌中一般称作GlmM。来自各种生物体的磷酸葡糖胺变位酶是本领域中公知的且可用于本发明的遗传改造策略中。例如，本文描述了来自大肠杆菌的磷酸葡糖胺变位酶。来自大肠杆菌的磷酸葡糖胺变位酶具有本文SEQ ID NO54表示的由本文SEQ ID NO53表示的核酸序列编码的氨基酸序列。本发明还包括具有产生选自如下的结果的遗传修饰的磷酸葡糖胺变位酶磷酸葡糖胺变位酶的活性增加；形成增加的葡糖胺-1-磷酸的磷酸葡糖胺变位酶正向反应增加；形成减少的葡糖胺-6-磷酸的磷酸葡糖胺变位酶的逆向反应减少；磷酸葡糖胺变位酶对葡糖胺-6-磷酸的亲合力增加；磷酸葡糖胺变位酶对葡糖胺-1-磷酸的亲合力降低；和磷酸葡糖胺变位酶的葡糖胺-1-磷酸产物抑制减少。
本文一般称作葡糖磷酸异构酶的酶催化葡萄糖-6-磷酸转化成果糖-6-磷酸。该酶在大肠杆菌和其它细菌中一般称作葡糖磷酸异构酶或Pgi。来自各种生物体的葡糖磷酸异构酶是本领域中公知的且可用于本发明的遗传改造策略中。例如，本文描述了来自大肠杆菌的葡糖磷酸异构酶。来自大肠杆菌的葡糖磷酸异构酶具有本文SEQ ID NO105表示的、由本文SEQ IDNO104所示的核酸序列编码的氨基酸序列。
本文一般称作果糖磷酸激酶的酶催化由果糖6-磷酸(F-6-P)形成果糖-1，6，-二磷酸。大肠杆菌中由pfkA编码的主要果糖磷酸激酶提供了90％的果糖磷酸激酶活性。剩余的10％活性由pfkB编码的次要果糖磷酸激酶提供。果糖磷酸激酶在大肠杆菌和其它细菌中一般称作果糖磷酸激酶或Pfk。来自各种生物体的果糖磷酸激酶是本领域中公知的且可用于本发明的遗传改造策略中。例如，本文描述了来自大肠杆菌的PfkA。
本文一般称作谷氨酰胺合成酶的酶在需要NH3和ATP的反应中催化L-谷氨酸转化成L-谷氨酰胺。该酶在大肠杆菌和其它细菌中一般称作谷氨酰胺合成酶或GlnA。来自各种生物体的谷氨酰胺合成酶是本领域中公知的且可用于本发明的遗传改造策略中。例如，本文描述了来自大肠杆菌的谷氨酰胺合成酶。来自大肠杆菌的谷氨酰胺合成酶具有本文SEQ ID NO89表示的、由本文SEQ ID NO88表示的核酸序列编码的氨基酸序列。
本文一般称作葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶催化戊糖磷酸途经中的第一个步骤，从而将葡萄糖-6-磷酸转化成葡糖酸-1，5-内酯。该酶在大肠杆菌和其它细菌中一般称作葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，由zwf编码。来自各种生物体的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶是本领域中公知的且可用于本发明的遗传改造策略中。例如，本文描述了来自大肠杆菌的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。来自大肠杆菌的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶具有本文SEQ ID NO95表示的、由本文SEQ IDNO94表示的核酸序列编码的氨基酸序列。
许多酶可以导致微生物中的糖原合成。这类酶包括、但不限于ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、糖原合酶和分支酶。
本文涉及的其它基因包括、但不限于N-乙酰氨基葡糖转运蛋白(IINag)、甘露糖转运蛋白(EIIM，P/IIIman)、葡萄糖转运蛋白(IIHlc)和/或磷酸酶。大肠杆菌中的基因分别对应nagC、nagD、nagE(N-乙酰氨基葡糖转运蛋白(IINag))；manXYZ(甘露糖转运蛋白(EIIM，P/IIIman))；ptsG(葡萄糖转运蛋白(IIHlc))或磷酸酶基因。nagC基因编码起nag调节子阻抑物以及glmU操纵子的激活物和阻抑物作用的调节蛋白。nagD基因的功能未知，但认为由于它居留在nag调节子中而与氨基糖代谢相关。葡糖胺和N-乙酰-葡糖胺降解中涉及的nag基因(nagS、nagB、nagC、nagD、nagE)作为位于大肠杆菌染色体上15分钟处的调节子存在(即nag调节子)。甘露糖转运蛋白(EIIM，P/IIIman)(manXYZ)负责将葡糖胺转运入细胞。葡萄糖转运蛋白(IIHlc)(ptsG)使葡萄糖转运入细胞，而可以用作葡糖胺的第二转运蛋白。磷酸酶可催化糖磷酸酯和蛋白质的去磷酸化在本领域中是众所周知的。
本发明的一个实施方案涉及通过发酵生产葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖的方法。这类方法一般包括下列步骤(a)在发酵培养基中培养包括至少一种特异性遗传修饰的微生物，本文公开的特异性遗传修饰可用于增加微生物中葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖的产量；和(b)收集从所述培养步骤中产生的产物，其选自葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸或N-乙酰氨基葡糖。更具体的说，这些产物可以包括从微生物中收集的胞内葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖和/或葡糖胺，和/或从发酵培养基中收集的胞外葡糖胺或N-乙酰氨基葡糖。在一个方面中，在酸性/加热条件下水解N-乙酰氨基葡糖，N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸和N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸，其中水解产物(葡糖胺、葡糖胺-6-磷酸和葡糖胺-1-磷酸)是稳定的。在另一个方面中，通过使用去乙酰化酶使N-乙酰氨基葡糖、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸和N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸脱乙酰化。回收和纯化方法在下文中具体讨论。
一般来说，用于本发明方法的基因修饰微生物一般含有至少一种参与至少一种氨基糖代谢途经的修饰的基因，所述修饰导致(a)葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺-1-磷酸，N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸和/或N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸转化成其它化合物的能力降低(即抑制葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸和/或N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸分解代谢或合成代谢途经)；(b)产生(即合成)葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸和/或N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸的能力增强；(c)将葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖转运入细胞的能力降低；(d)将葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸、葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖转运出细胞的的能力增强；和/或(e)利用参与葡糖胺-6-P生产的底物来和生化反应竞争的能力降低；和/或(f)使用乙酰辅酶A(涉及N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸和N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸产生)来和生化反应竞争的能力降低。
一般来说，具有遗传修饰的氨基糖代谢途经的微生物含有至少一种如下具体所述的遗传修饰，它使如上所述的一种或多种氨基糖代谢途经与相同条件下培养的野生型微生物相比发生改变。这类氨基糖代谢途经中的修饰改变了微生物产生氨基糖的能力。如下具体所述，本发明的基因修饰微生物优选与在相同或等同条件下培养的相同种类(且优选相同菌株)的野生型微生物相比，其具有增强的产生葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖的能力。等同条件是这样的的培养条件，其相似、但不必相同(例如在培养基组成、温度、pH和其它条件上存在一些改变是可以接受的)，且基本上不改变对微生物生长或微生物产生葡糖胺或N-乙酰氨基葡糖的影响。
一般可以将影响葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖产生的氨基糖代谢途经分入下列途经种类中的至少一种(a)将葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸和N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸转化成其它化合物的途经；(b)合成葡糖胺-6-磷酸的途经；(c)将葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖转运入细胞的途经；(d)将葡糖胺、葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸和/或N-乙酰氨基葡糖转运出细胞的途经；和(e)竞争参与葡糖胺-6-磷酸产生的底物的途经。
可以用传统的菌株发育和分子遗传技术开发通过遗传修饰具有增强的生产糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖的能力的微生物。一般来说，产生具有增强的葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖生产能力的微生物的策略是(1)失活或缺失至少一种且优选一种以上氨基糖代谢途经，所述途径中葡糖胺-6-磷酸产生被负面影响(例如抑制)；和(2)扩增至少一种且优选一种以上氨基糖代谢途经，所述途径中葡糖胺-6-磷酸产量增加。
在本发明的一个实施方案中，可以通过扩增葡糖胺-6-磷酸合酶基因(glmS)的表达(例如超表达)，和/或通过扩增葡糖胺-6-磷酸脱氨酶基因(在大肠杆菌中为nagB基因，其产物为葡糖胺-6-磷酸脱氨酶)的表达来增强微生物合成葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸和/或N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸的能力。葡糖胺-6-磷酸脱氨酶催化正向反应，其中葡糖胺-6-磷酸脱氨基生成果糖-6-磷酸和铵。葡糖胺-6-磷酸脱氨酶还催化逆向反应，其中果糖-6-磷酸和铵形成葡糖胺-6-磷酸。葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的逆向反应不同于葡糖胺-6-磷酸合酶的作用，因为在合酶反应中，果糖-6-磷酸和谷氨酰胺形成葡糖胺-6-磷酸和谷氨酸。足够的胞内谷氨酰胺供应是葡糖胺-6-磷酸合酶反应的关键。对葡糖胺-6-磷酸合成和降解途经的检查显示可能存在无用的循环，由此果糖-6-磷酸和葡糖胺-6-磷酸的连续互变导致谷氨酰胺不经济地耗尽。因此，葡糖胺-6-磷酸脱氨酶逆向反应的应用优于葡糖胺-6-磷酸合酶，这是因为脱氨酶将铵而非氨基酸(谷氨酰胺)作为氨基供体。葡糖胺-6-磷酸脱氨酶催化可逆反应，该反应的动态平衡而有利于葡糖胺-6-磷酸降解成果糖-6-磷酸和铵。因此，作为本发明的另一个实施方案，使用逆向反应活性增加而正向反应活性降低的葡糖胺-6-磷酸脱氨酶诱变形式或超表达的葡糖胺-6-磷酸脱氨酶来生产葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖。本发明的另一个实施方案在于提供含有葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的微生物，其中所述的葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的Vmax增加、比活性增加、稳定性增加、对底物果糖-6-磷酸和铵的亲合力增加，且葡糖胺-6-磷酸的产物抑制减少。可以从自然界分类具有这类改善的葡糖胺-6-磷酸脱氨酶或可以通过任意合适的遗传修饰或蛋白质改造方法生产。例如，基于计算机的蛋白质改造可以用于该目的。参见例如，Maulik等1997，《分子生物技术治疗应用和策略》(Molecular BiotechnologyTherapeutic Applications and Strategies)Wiley-Liss，Inc.，将该文献的全部内容引入本文作为参考。例如，可以通过导入编码nagA基因的重组核酸分子在大肠杆菌中实现葡糖胺-6-磷酸脱氨酶表达的扩增。因为宿主菌株中的葡糖胺-6-磷酸合酶可以催化葡糖胺-6-磷酸的合成，所以应分析含有失活的glmS基因的大肠杆菌突变株中葡糖胺-6-磷酸脱氨酶表达的扩增。当不需要消除该生物体中葡糖胺-6-磷酸合酶的活性时，它是本发明的一个实施方案。
作为本文所述的其它酶和其它蛋白质的实例，修饰的葡糖胺-6-磷酸脱氨酶可以是例如突变的(即遗传修饰的)葡糖胺-6-磷酸脱氨酶基因，且可以通过任意合适的遗传修饰方法生产。例如，可以通过任意插入、缺失和/或取代核苷酸的方法(诸如通过易错PCR修饰(erro-prone PCR))来编码葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的重组核酸分子。在该方法中，在导致高频率错掺合(misincorporation)错误的条件下通过用于扩增的DNA聚合酶扩增所述基因。作为结果，在PCR产物中获得高频突变。然后可以通过测试与携带非突变重组葡糖胺-6-磷酸脱氨酶核酸分子的微生物相比突变体基因赋予测试微生物葡糖胺产量增加的能力来筛选所得葡糖胺-6-磷酸脱氨酶基因突变体。因此，本发明的一个实施方案在于提供用遗传修饰的重组核酸分子转化的微生物，所述核酸分子包括编码突变或同源葡糖胺-6-磷酸脱氨酶蛋白的核酸序列。这类葡糖胺-6-磷酸脱氨酶蛋白在本文中可以称作葡糖胺-6-磷酸脱氨酶同源物(下文具体描述)。
下本发明的一个方面中，glmS或nagB的超表达对葡糖胺-6-磷酸的胞内累积和最终产生葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖而言是重要的，这是因为细胞中葡糖胺-6-磷酸合酶/或葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的水平会控制碳脱离糖酵解并重新定向进入葡糖胺-6-磷酸合成。
为了生产N-乙酰氨基葡糖，必须将葡糖胺-6-磷酸转化成N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸或N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸，然后使其去磷酸化和/或分泌入培养肉汤。在本发明的一个实施方案中，通过扩增葡萄糖-6-磷酸乙酰转移酶基因的表达来增强微生物合成N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸和N-乙酰氨基葡糖的能力，仅作为实例，其中所述的葡萄糖-6-磷酸乙酰转移酶基因在酿酒酵母中为GNA1基因，其产物为葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶。在本发明的另一个实施方案中，通过扩增N-乙酰基葡糖-6-磷酸脱乙酰酶基因的表达来增强微生物合成N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸和N-乙酰氨基葡糖的能力，所述的N-乙酰基葡糖-6-磷酸脱乙酰酶基因在大肠杆菌中为nagA基因，其产物为N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸脱乙酰酶。脱乙酰酶催化正向反应中N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸转化成葡糖胺-6-磷酸。它还催化将葡糖胺-6-磷酸转化成N-乙酰氨基葡糖的逆向反应。N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸脱乙酰酶催化具有动态平衡的可逆反应，所述动态平衡利于N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸的脱乙酰化成葡糖胺-6-磷酸。因此，作为本发明的另一个实施方案，将其逆向作用活性增加且正向反应活性降低的N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸脱乙酰酶的诱变形式用于生产葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖。
由于葡糖胺-6-磷酸合酶(GlmS)受到产物葡糖胺-6-磷酸的强烈抑制，所以扩增葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶基因(GNA1)和/或N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸脱乙酰酶基因(nagA)的表达可以降低胞内葡糖胺-6-磷酸水平、减少GlmS酶的产物抑制且由此增加葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖的产量。
在本发明的另一个实施方案中，通过扩增磷酸葡糖胺变位酶基因的表达来增强微生物合成葡糖胺和N-乙酰氨基葡糖的能力，其中所述的磷酸葡糖胺变位酶基因在大肠杆菌中为glmM基因，其产物为磷酸葡糖胺变位酶。磷酸葡糖胺变位酶催化葡糖胺-6-磷酸转化成葡糖胺-1-磷酸。由于葡糖胺-6-磷酸合酶(GlmS)受到产物葡糖胺-6-磷酸的强烈抑制，所以扩增磷酸葡糖胺变位酶基因的表达可以降低胞内葡糖胺-6-磷酸水平、减少GlmS酶的产物抑制且由此增加葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖产量。
在本发明的另一个实施方案中，通过扩增双功能葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因的表达来增强微生物合成葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖的能力，其中所述的双功能葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因在大肠杆菌中为glmU基因，其产物为葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶。本发明还包括具有葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶活性的蛋白质的表达的扩增或活性增加。所述的双功能酶催化葡糖胺-1-磷酸转化成N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸(作为葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶)并将该产物进一步转化成UDP-N-乙酰氨基葡糖(作为N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶)。因此，作为本发明的另一个实施方案，将其乙酰转移酶作用的活性增加和尿苷酰转移酶作用的活性降低的葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的诱变形式用于生产葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖。glmU基因是大肠杆菌生长的必需基因，因为葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶在氨基糖代谢途经中起作用，所述途径中葡糖胺-6-磷酸通过一系列生化反应掺入大分子。需要将其乙酰转移酶作用的活性增加且尿苷酰转移酶作用的活性降低的GlmU酶的诱变形式用于含有野生型GlmU基因的宿主菌株，使得可以合成来源于葡糖胺的大分子以支持细胞生长。
葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖合成与附图3中概括的葡萄糖代谢的许多不同途经紧密相关。葡萄糖被细胞摄入且同时转化成葡萄糖-6-P。葡萄糖可通过包括附图中所示途径在内的多种途经代谢。在葡糖胺合成途经中，葡萄糖-6-P异构化成果糖-6-磷酸，随后是GlmS介导的果糖-6-磷酸转化成葡糖胺-6-磷酸。最终使葡糖胺-6-磷酸被去磷酸化并分泌。葡萄糖-6-磷酸的主要竞争性可选途经是其通过果糖磷酸激酶进入糖酵解。葡萄糖-6-磷酸的另一个重要可选途经是其氧化成葡糖酸内酯-6-磷酸(进入戊糖磷酸途经)。另外，可以将葡萄糖-6-磷酸转化成葡萄糖-1-磷酸，由后者形成糖原并储存在细胞中。如下具体所述用于调节其它竞争性途经以使葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖产量达到最大值在本发明的范围内。
细菌细胞累积糖原作为碳储备的主要形式。糖原合成包括三种酶ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(也称作葡萄糖-1-磷酸腺苷酰转移酶)；糖原合酶；和分支酶。这些酶分别催化由葡萄糖-1-磷酸合成单糖供体(ADP-葡萄糖)、这些单糖单位聚合成葡萄糖的(1，4)聚合物和该聚合物的重排从而在链中产生(1-6)分支。ADP-葡萄糖焦磷酸化酶是糖原合成中的关键酶且强烈受到异构效应物的调节。例如，3-磷酸甘油酸刺激酶活性，而正磷酸抑制该活性。这些效应物可以在体内糖原合成控制中起关键作用。根据生长条件，细胞中糖原的量占其干重的10-60％。一般来说，糖原在碳和能量供应充足且氮为限制性的营养物的条件下累积。磷酸在生长培养基中耗尽也导致糖原在细胞中量较高。ADP-葡萄糖在细菌中的唯一功能在于用作糖原合成的前体。在具有糖原合成阻断的大肠杆菌突变体中，细胞生长没有受到有害影响。阻断糖原合成可以利用更多的碳源用于葡糖胺/N-乙酰氨基葡糖的生产。
为了使葡糖胺/N-乙酰氨基葡糖产量最大，可以操纵葡糖磷酸异构酶(由pgi基因编码)。超表达pgi基因可以增加萄糖-6-P转化成用于合成葡糖胺-6-P的直接底物即果糖-6-P。
需要葡萄糖支持细胞生长和葡糖胺合成。果糖磷酸激酶(PfkA和PfkB，前者是主要的同工酶)催化果糖6-P转化成果糖-1，6-二磷酸。该反应与葡糖胺-6-P合成竞争。在控制碳流的过程中，需要调节PfkA和/或PfkB的表达以将更多的萄糖-6-P定向于葡糖胺途经葡。为了最大限度地合成葡糖胺，葡萄糖的供应不应受到限制，但过量的葡萄糖通常导致乙酸酯形成。由于乙酸酯累积抑制细胞生长并产生信号使总体细胞代谢下调，所以应避免它。控制碳供应的一种手段在于使碳流从细胞生长和乙酸酯形成中解偶联而用于葡糖胺合成。这可以通过缺失pfkA基因并给细胞提供果糖用于生长来实现。在pfkA剔除突变体中，进入糖酵解的果糖-6-磷酸流量极大受限。因此，实际上所有的葡萄糖可以用于葡糖胺合成，而细胞生长和能量产生可通过果糖进料来提供，其中果糖被转运入细胞并磷酸化成果糖-1-磷酸。后者被进一步磷酸化成果糖-1，6-二磷酸。
文献提示磷酸化氨基糖类可抑制戊糖磷酸途经中的酶。实际上，N-乙酰氨基葡糖产生导致细胞生长抑制，而这种抑制可以通过加入该途经中诸如葡糖酸和核糖这类中间体而缓解。还发现补充葡糖酸和戊糖化合物可以增加N-乙酰氨基葡糖产量。为了克服氨基糖类的抑制作用，可以超表达戊糖磷酸途经中的酶，诸如葡萄糖-6-P脱氢酶(由zwf基因编码)。
葡糖胺/N-乙酰氨基葡糖合成消耗氨基供体谷氨酰胺。谷氨酰胺的合成包括由glnA基因编码的谷氨酰胺合酶。glnA基因超表达可以增加谷氨酰胺收集量且由此增加葡糖胺/N-乙酰氨基葡糖。
因此，总体描述了本发明的一些优选修饰后，在一个实施方案中，所述的微生物包括至少一种增加微生物中葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶活性的遗传修饰。优选增加葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶活性的遗传修饰提供了选自如下的结果葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶的酶活性增加；所述微生物超表达葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶；乙酰氨基葡糖-6-磷酸乙酰转移酶的N-葡糖胺-6-磷酸产物抑制减少；和/或葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶对葡糖胺-6-磷酸的亲合力增加。在一个方面中，用至少一种包括编码葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶的核酸序列的重组核酸分子转化所述的微生物。这类核酸分子可以包括编码葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶的核酸序列，所述序列含有至少一种增加葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶活性或产生任意上述结果的遗传修饰。上文已经描述了葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶的功能和有代表性的序列。
在另一个实施方案中，所述的微生物包括至少一种增加葡糖胺-6-磷酸合酶活性的遗传修饰。优选增加葡糖胺-6-磷酸合酶活性的遗传修饰产生选自如下的结果葡糖胺-6-磷酸合酶的酶活性增加；葡糖胺-6-磷酸合酶超表达；葡糖胺-6-磷酸合酶的产物抑制减少；和葡糖胺-6-磷酸合酶对其底物的亲合力增加。在一个方面中，用至少一种包括编码葡糖胺-6-磷酸合酶的核酸序列的重组核酸分子转化所述的微生物。这类核酸分子可以包括编码葡糖胺-6-磷酸合酶的核酸序列，所述序列含有至少一种增加葡糖胺-6-磷酸合酶的酶活性、减少葡糖胺-6-磷酸合酶的产物抑制或产生任意上述结果的遗传修饰。上文已经描述了葡糖胺-6-磷酸合酶的功能和有代表性的序列。
在另一个实施方案中，所述的微生物包括至少一种降低葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性的遗传修饰。在一个方面中，降低葡糖胺-6-磷酸合酶活性的遗传修饰为微生物中编码葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的内源性基因部分或完全缺失或失活。
在另一个实施方案中，所述的微生物包括至少一种降低葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性的遗传修饰。优选增加葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性的遗传修饰产生选自如下的结果所述微生物超表达葡糖胺-6-磷酸脱氨酶；葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的酶活性增加；葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的逆向反应增加从而形成增加的(更多)葡糖胺-6-磷酸；葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的正向反应减少从而形成减少的(较少)果糖-6-磷酸；葡糖胺-6-磷酸脱氨酶对果糖-6-磷酸的亲合力增加；葡糖胺-6-磷酸脱氨酶对葡糖胺-6-磷酸的亲合力降低；和葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的葡糖胺-6-磷酸产物抑制减少。在一个方面中，用至少一种包括编码葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的核酸序列的重组核酸分子转化所述的微生物。这类核酸分子可以包括编码葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的核酸序列，所述序列含有至少一种增加葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的酶活性或产生任意上述结果的遗传修饰。上文已经描述了葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的功能和有代表性的序列。
在另一个实施方案中，所述的微生物包括至少一种降低葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性的遗传修饰。在一个方面中，降低葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性的遗传修饰为微生物中编码葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的内源性基因的部分或完全缺失或失活。
在另一个实施方案中，所述的微生物包括至少一种增加葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶活性的遗传修饰。优选所述的遗传修饰提供选自如下的结果葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶的酶活性增加；N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的酶活性降低；所述微生物超表达具有葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶活性的酶；葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶对葡糖胺-1-磷酸的亲合力增加；葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶对N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸的亲合力降低；和/或葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶的N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸产物抑制减少。在一个方面中，用至少一种包括编码葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶或有葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶活性的酶的核酸序列的重组核酸分子转化所述的微生物。这类核酸分子可以包括编码葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶的核酸序列，所述序列含有至少一种增加葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶的酶活性或产生任意上述结果的遗传修饰。上文已经描述了葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶的功能和有代表性的序列。
在另一个实施方案中，所述的基因修饰微生物包括至少一种增加N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸脱乙酰酶活性的遗传修饰。优选增加N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸脱乙酰酶活性的遗传修饰产生选自如下的结果N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸脱乙酰酶的活性增加；N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸脱乙酰酶超表达；形成N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸的N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸脱乙酰酶的逆向反应增加；形成葡糖胺-6-磷酸的N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸脱乙酰酶的正向作用减少或更优选消除。在一个方面中，用包括编码N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸脱乙酰酶的核酸序列的重组核酸分子转化所述的微生物。这类核酸分子可以包括编码N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸脱乙酰酶的核酸序列，所述序列含有至少一种增加N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸脱乙酰酶的酶活性或产生任意上述结果的遗传修饰。上文已经描述了N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸脱乙酰酶的功能和有代表性的序列。
在另一个实施方案中，所述的基因修饰微生物包括至少一种增加磷酸葡糖胺变位酶活性的遗传修饰。优选增加磷酸葡糖胺变位酶活性的遗传修饰产生选自如下的结果磷酸葡糖胺变位酶的活性增加；磷酸葡糖胺变位酶超表达；形成葡糖胺-1-磷酸的磷酸葡糖胺变位酶的作用增加；和/或形成葡糖胺-6-磷酸的磷酸葡糖胺变位酶的作用减少或更优选消除。在一个方面中，用至少一种包括编码磷酸葡糖胺变位酶的核酸序列的重组核酸分子转化所述的微生物。这类核酸分子可以包括编码磷酸葡糖胺变位酶的核酸序列，所述序列含有至少一种增加磷酸葡糖胺变位酶的酶活性或产生任意上述结果的遗传修饰。上文已经描述了磷酸葡糖胺变位酶的功能和有代表性的序列。
在本文所述的任意实施方案中，所述的基因修饰微生物可以含有至少一种增加微生物中葡糖磷酸异构酶活性的其它遗传修饰。优选所述的基因修饰微生物可以含有的至少一种增加葡糖磷酸异构酶活性的其它遗传修饰产生选自如下的结果葡糖磷酸异构酶的活性增加；葡糖磷酸异构酶超表达；葡糖磷酸异构酶对其底物的亲合力增加。在一个方面中，用至少一种包括编码葡糖磷酸异构酶的核酸序列的重组核酸分子转化所述的微生物。这类核酸分子可以包括编码葡糖磷酸异构酶的核酸序列，所述序列含有至少一种增加葡糖磷酸异构酶的酶活性或产生任意上述结果的遗传修饰。上文已经描述了葡糖磷酸异构酶的功能和有代表性的序列。
在本文所述的任意实施方案中，所述的基因修饰微生物可以含有至少一种降低微生物中果糖磷酸激酶活性的其它遗传修饰。在一个方面中，降低微生物中果糖磷酸激酶活性的遗传修饰为微生物中编码果糖磷酸激酶的内源性基因部分或完全缺失或失活。上文已经描述了果糖磷酸激酶的功能和有代表性的序列。
在本文所述的任意实施方案中，所述的基因修饰微生物可以含有至少一种增加微生物中谷氨酰胺合成酶活性的其它遗传修饰。优选所述的基因修饰微生物可以含有的至少一种增加谷氨酰胺合成酶活性的其它遗传修饰产生选自如下的结果谷氨酰胺合成酶的活性增加；谷氨酰胺合成酶超表达；谷氨酰胺合成酶对其底物的亲合力增加。在一个方面中，用至少一种包括编码谷氨酰胺合成酶的核酸序列的重组核酸分子转化所述的微生物。这类核酸分子可以包括编码谷氨酰胺合成酶的核酸序列，所述序列含有至少一种增加谷氨酰胺合成酶的酶活性或产生任意上述结果的遗传修饰。上文已经描述了谷氨酰胺合成酶的功能和有代表性的序列。
在本文所述的任意实施方案中，所述的基因修饰微生物可以含有至少一种增加微生物中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的其它遗传修饰。优选所述的基因修饰微生物可以含有的至少一种增加葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的其它遗传修饰产生选自如下的结果葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活性增加；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶超表达；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶对其底物的亲合力增加。在一个方面中，用至少一种包括编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的核酸序列的重组核酸分子转化所述的微生物。这类核酸分子可以包括编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的核酸序列，所述序列含有至少一种增加葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活性或产生任意上述结果的遗传修饰。上文已经描述了葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的功能和有代表性的序列。
在本文所述的任意实施方案中，所述的基因修饰微生物可以含有至少一种降低负责微生物中糖原合成的一种或多种酶的活性的其它遗传修饰。这类酶包括、但不限于糖原合成包括的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、糖原合酶和分支酶。在一个方面中，降低负责糖原合成的酶活性的遗传修饰为一种或多种内源性基因的部分或完全缺失或失活，所述的基因编码负责微生物中糖原合成的酶。
在本文所述的任意实施方案中，所述的基因修饰微生物可以含有至少一种增加磷酸酶活性的其它遗传修饰。本文所述的基因修饰微生物中起始的胞内产物为葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖和/或葡糖胺。在包括大肠杆菌在内的许多微生物中，足够的胞内铵供应对葡糖胺-6-磷酸脱氨酶反应是重要的。一般使葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸和N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸去磷酸化成为葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖，此后转运出细胞。不过，本发明的另一个实施方案提供了经过遗传修饰的微生物，其具有适宜的磷酸酶活性，所述磷酸酶活性用于葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸和/或N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸的去磷酸化。这类磷酸酶可以包括、但不限于例如碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、磷酸-糖磷酸酶和磷酸-氨基糖磷酸酶。在一个优选的实施方案中，这类大肠杆菌具有增强的(即增加的)磷酸酶活性(即磷酸酶作用)水平。
在上述任意实施方案中，所述的微生物可以含有至少一种增加或降低酶活性的其它遗传修饰，所述的酶选自N-乙酰氨基葡糖脱乙酰酶、葡糖胺-6-磷酸脱氨酶、N-乙酰氨基葡糖转运蛋白(IINag)、葡糖胺合酶、磷酸葡糖胺变位酶、葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶、甘露糖转运蛋白(EIIM，P/IIIman)，果糖磷酸激酶、葡萄糖转运蛋白(IIGlc)、葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶或磷酸酶。大肠杆菌中的基因分别对应NagA、nagB、nagC、nagD、nagE、glmS、glmM、glmU、marzXYZ、pfkA、pflrB、ptsG、GNA1或磷酸酶基因。
可以将上述确定的各种遗传修饰合并而产生含有一种以上所需修饰的微生物，以增假该微生物的葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖产生。例如，在一个实施方案中，所述的微生物含有下列遗传修饰(1)增加葡糖胺-磷酸N-乙酰转移酶活性的遗传修饰；和(2)增加葡糖胺-6-磷酸合酶活性的遗传修饰。在一个更优选的实施方案中，所述的微生物还含有降低葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性的遗传修饰。
在另一个实施方案中，所述的微生物含有下列遗传修饰(1)增加葡糖胺-磷酸N-乙酰转移酶活性的遗传修饰；和(2)增加葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性的遗传修饰。在一个更优选的实施方案中，所述的微生物还含有降低葡糖胺-6-磷酸合酶活性的遗传修饰。
在另一个实施方案中，所述的微生物含有下列遗传修饰(1)增加葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性的遗传修饰；和(2)增加葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶活性，且优选增加葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶活性和/或降低N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶活性的遗传修饰。在一个更优选的实施方案中，所述的微生物还含有降低葡糖胺-6-磷酸合酶活性的遗传修饰。
在另一个实施方案中，所述的微生物含有下列遗传修饰(1)增加葡糖胺-6-磷酸合酶活性的遗传修饰；和(2)增加葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶活性，且优选增加葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶活性和/或降低N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶活性的遗传修饰。在一个更优选的实施方案中，所述的微生物还含有降低葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性的遗传修饰。
在另一个实施方案中，用于本发明发酵方法中的基因修饰微生物含有内源性葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶(例如酵母含有内源性葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶)，且还含有至少一种增加葡糖胺-6-磷酸合酶活性的遗传修饰。在一个更优选的实施方案中，所述的微生物还含有降低葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性的遗传修饰。
在另一个实施方案中，用可操作地连接于转录控制序列的重组核酸分子转化用于本发明发酵方法中的基因修饰微生物，所述的重组核酸分子编码葡糖胺-6-磷酸合酶、葡糖胺-6-磷酸脱氨酶、葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸脱乙酰酶、磷酸葡糖胺变位酶或葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶。该重组核酸分子可以含有影响所述酶作用的遗传修饰。与不存在该重组核酸分子时蛋白质的表达或生物活性水平相比，所述重组核酸分子的表达增加所述微生物对葡糖胺-6-磷酸合酶、葡糖胺-6-磷酸脱氨酶、葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸脱乙酰酶、磷酸葡糖胺变位酶或葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的表达和/或生物活性。在一个优选的实施方案中，将所述的重组核酸分子整合入微生物。在另一个实施方案中，所述的微生物在编码以下蛋白的基因中含有至少一种其它遗传修饰葡糖胺-6-磷酸合酶、葡糖胺-6-磷酸脱氨酶、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸脱乙酰酶、N-乙酰-葡糖胺-特异性酶IINag、磷酸葡糖胺变位酶、葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶、果糖磷酸激酶、PEP葡萄糖PTS的酶IIGlc、PEP甘露糖PTS的EIIM，P/IIIman、葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶和/或磷酸酶。所述的遗传修饰增加或降低蛋白质的作用，但除磷酸酶外，其中磷酸酶的作用优选得到增加。在另一个优选的实施方案中，所述的微生物在编码以下酶的基因中含有遗传修饰N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸脱乙酰酶、葡糖胺-6-磷酸脱氨酶和N-乙酰-葡糖胺-特异性酶IINag，其中所述的遗传修饰降低或增加所述蛋白质的作用。在一个实施方案中，所述的遗传修饰为至少部分基因被缺失。
在另一个实施方案中，本发明的基因修饰微生物含有可操作地连接于转录控制序列的重组核酸分子和至少一种位于基因中的遗传修饰，所述的重组核酸分子编码葡糖胺-6-磷酸合酶、葡糖胺-6-磷酸脱氨酶、葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸脱乙酰酶、磷酸葡糖胺变位酶或葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶，而所述的基因编码选自下组的蛋白质N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸脱乙酰酶、葡糖胺-6-磷酸脱氨酶、N-乙酰-葡糖胺-特异性酶IINag、磷酸葡糖胺变位酶、葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶-N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶、果糖磷酸激酶、葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶、PEP葡萄糖PTS的酶IIGlc和/或PEP甘露糖PTS的EIIM，P/IIIman。所述的遗传修饰增加或降低蛋白质的作用，且重组核酸分子的表达增加所述微生物对所述酶的表达。在另一个实施方案中，所述的微生物含有至少一种位于磷酸酶基因中的遗传修饰，使得由这类基因编码的磷酸酶具有增加的作用。在一个优选的实施方案中，将所述的重组核酸分子整合入微生物的基因组。
本文所述突变的各种其它组合包括在本发明中且许多描述在实施例部分中。
此外，本领域技术员可以使用和/或改进本发明公开的方法和物质以产生其它氨基糖类，诸如聚-N-乙酰氨基葡糖、聚-葡糖胺、半乳糖胺、甘露糖胺、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰甘露糖胺及其衍生物。
如上所述，为了通过本发明的发酵方法生产显著高产率的葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖，对微生物进行遗传修饰以促进葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖的生产，本文所用的基因修饰微生物含有从其正常(即野生型或天然存在)形式修饰(即突变或改变的)而得到的基因组。在一个方面中，这类生物体可以内源含有和表达编码有意义蛋白质的基因，且所述的遗传修饰可以是该基因的遗传修饰，由此这种修饰对基因的表达和/或活性具有一定影响(例如增加、降低、缺失)。在另一个方面中，这类生物体可以内源含有和表达编码有意义蛋白质的基因，且所述的遗传修饰可以为导入至少一种外源性核酸序列(例如重组核酸分子)，其中所述的外源性核酸序列编码蛋白质，所述蛋白质为目的蛋白质和/或影响该蛋白质或编码该蛋白质的基因的活性。与野生型或正常蛋白质细胞，导入微生物的外源性核酸序列可以编码野生型蛋白质或它可以含有一种或多种影响编码蛋白质的表达和/或活性。在另一个方面中，所述生物体不必内源(天然)含有编码有意义蛋白质的基因，而得到遗传修饰以导入至少一种重组核酸分子，该重组核酸分子编码具有有意义蛋白质的生物活性的蛋白质。此外，重组核酸分子可以编码野生型蛋白质，或与野生型蛋白质相比重组核酸序列可以得到修饰以影响所编码的蛋白质的表达和/或活性。在其它实施方案中，可以将各种表达控制序列(例如启动子)导入微生物以影响微生物中内源性基因的表达。在下文中更具体地讨论各自与这些各个方面相关的不同实施方案。
本文所用的基因修饰微生物可以包括任意基因修饰微生物，包括细菌、原生生物、显微藻类、真菌或其它微生物。这类基因修饰微生物含有基因组，所述基因组可从其正常(即野生型或天然存在)形式修饰(即突变或改变的)而来和/或得到修饰以表达染色体外遗传物质(例如重组核酸分子)，从而获得所需结果(例如作为的修饰结果，酶的表达和/或活性增加、降低乃至改变和/或葡糖胺或N-乙酰氨基葡糖的产量改变)。更具体地说，通过修饰微生物基因组(例如内源性基因)和/或通过将遗传物质(例如重组核酸分子)导入微生物来修饰微生物，所述遗传物质可以保留在染色体外或可以被整合入宿主微生物基因组。照此，这种遗传修饰可以包括导入或修饰调节序列，该调节序列调节微生物中内源性或重组导入的核酸序列的表达；导入野生型或修饰的重组核酸分子(例如编码野生型或修饰的蛋白质)；修饰微生物中的内源性基因；或使微生物在表达和/或生物活性方面具有特异性特征的任意其它修饰。可以使用传统的菌株发育和/或分子遗传技术对微生物进行遗传修饰。这类技术是本领域中公知的且对微生物而言一般是公开的，例如在Sambrook等的1989，《分子克隆实验室指南》(Molecular CloningALaboratory Manual)，Cold Spring Harbor Labs Press中。将该参考文献(Sambrook等，文献同上)的全部内容引入本文作为参考。基因修饰微生物可以包括其中的核酸分子已经被插入、缺失和/或修饰(即突变，例如通过核苷酸的插入、缺失、取代和/或翻转)的微生物，使得这类修饰在微生物中提供所需的作用。本发明的基因修饰微生物包括使用重组技术修饰的微生物。
在本发明的一个实施方案中，微生物的遗传修饰增加或降低本发明氨基糖代谢途经中涉及的蛋白质的活性。这类遗传修饰包括任意类型的修饰，且特别包括通过重组技术和/或通过传统诱变进行的修饰。本文所用的导致基因表达、基因功能或基因产物(即基因编码的蛋白质)功能降低的遗传修饰可以称作基因的失活(完全或部分)、缺失、中断、封闭(blockage)、沉默或下调。例如，使这类基因编码的蛋白质功能降低的基因中的遗传修饰可以为如下结果该基因完全缺失(即该基因不存在且由此所述蛋白质不存在)、导致蛋白质的不完全或不翻译(例如不表达蛋白质)的基因突变，或降低或消除蛋白质天然功能(例如表达具有降低或无酶活性或作用的蛋白质)的基因突变。更具体地说，本文涉及的酶的作用或活性减少一般指的是所述微生物中导致酶表达和/或功能性(比活性)降低的任意遗传修饰，并包括酶的活性(例如比活性)降低、酶的抑制或降解作用增加和酶的表达减少或消除。例如，可以通过阻断或减少酶的产生、降低酶的活性或抑制酶的活性来降低本发明酶的作用或活性。还能够将这些修饰中的一些进行组合。阻断或减少酶的产生可以包括使编码该酶的基因处于要求在培养基中存在诱导化合物的启动子控制下。通过建立使诱导物从培养基中耗尽的条件，可以关闭编码该酶的基因表达(和由此的酶合成)。阻断或降低酶的活性还可以包括使用与美国专利4,743,546中所述类似的切除技术方法，将该文献引入本文作为参考。为了应用这种方法，将编码目的酶的基因克隆在特定遗传序列之间，所述的特定遗传序列允许该基因从基因组的特异性受控切除。例如，可以通过如美国专利4,743,546中所述使培养物的培养温度变化或通过一些其它物理或营养信号促进切除。
使基因表达或功能增加的遗传修饰可以称作基因的扩增、超表达、活化、增强、添加或增量调节。更具体地说，本文所述增加酶或其它蛋白质的作用(或活性)一般指的是所述微生物中导致酶或蛋白质的表达和/或功能性(生物活性)增加的任意遗传修饰且包括较高的酶活性(例如比活性或体内酶活性)、酶的抑制或降解作用减少和酶的超表达。例如，可以增加基因拷贝数，可以通过使用使表达水平高于天然启动子的启动子来增加表达水平或可以通过遗传改造或传统诱变改变基因以增加酶的生物活性。还能够对这些修饰中的一些进行组合。
一般来说，本发明突变或修饰酶的指定特征(例如酶活性)的增加或降低参照来源于相同生物体(来自相同来源或亲代序列)的野生型(即正常未修饰的)酶的相同特征，所述的相同特征是在相同或等同条件下测定或建立的。类似地，基因修饰微生物的特征的增加或减少(例如蛋白质或蛋白质产物的表达和/或生物活性)在相同或等同条件下参照相同种类的野生型微生物的相同特征，且优选参照相同菌株的相同特征。这类条件包括试验或培养条件(例如培养基成分、温度、pH等)，在此条件下测定微生物的蛋白质活性(例如表达或生物活性)或其它特征；和所用试验的类型；评价的宿主微生物等。如上所述，等同条件是相似、但不必相同(例如可以接受条件中的一些保守改变)，且与在相同条件下进行的比较相比基本上不改变对微生物生长或酶的表达或生物活性的影响的条件(例如培养条件)。
优选含有使指定蛋白质(例如酶)活性增加或降低的遗传修饰的基因修饰微生物与野生型微生物中野生型蛋白质活性相比，前者的蛋白质活性(例如表达、产生和/或生物活性)分别增加或降低至少约5％，且更优选至少约10％，且更优选至少约15％，且更优选至少约20％，且更优选至少约25％，且更优选至少约30％，且更优选至少约35％，且更优选至少约40％，且更优选至少约45％，且更优选至少约50％，且更优选至少约55％，且更优选至少约60％，且更优选至少约65％，且更优选至少约70％，且更优选至少约75％，且更优选至少约80％，且更优选至少约85％，且更优选至少约90％，且更优选至少约95％或5％-100％之间的任意整数百分比(例如6％、7％、8％等)。当将分离的修饰核酸分子或蛋白质直接与分离的野生型核酸分子或蛋白质相比时，优选差异相同(例如，当将在体外进行的比较与在体内进行的比较相比时)。
在本发明的另一个方面中，含有使指定蛋白质(例如酶)活性增加或降低的遗传修饰的基因修饰微生物与野生型微生物中野生型蛋白质活性相比，前者的蛋白质活性(例如表达、产生和/或生物活性)分别增加或降低至少约2-倍，且更优选至少约5-倍，且更优选至少约10-倍，且更优选至少约20-倍，且更优选至少约30-倍，且更优选至少约40-倍，且更优选至少约50-倍，且更优选至少约75-倍，且更优选至少约100-倍，且更优选至少约125-倍，且更优选至少约150-倍或从至少约2-倍开始增加的任意整数倍(例如3-倍、4-倍、5-倍、6-倍等)。
提供增加或降低活性(包括表达、比活性、体内活性等)的微生物的遗传修饰优选影响微生物中葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖生物合成途经或氨基糖代谢途经的活性，而无论该途经是内源性和遗传修饰的、内源性并将一种或多种重组核酸分子导入生物体的，还是完全通过重组技术提供的。本发明＂影响葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖生物合成途经的活性＂包括与不存在遗传修饰的生物体相比，在由生物体表达的葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖生物合成途经中产生任意可检测到或可测定的改变或修饰的任何遗传修饰。葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖生物合成途经中的可检测改变或修饰可以包括、但不限于所述微生物在葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖生物合成途经中至少一种产物产量的可检测改变和/或其在胞内和/或胞外葡糖胺或N-乙酰氨基葡糖生产中的可检测改变。
在本发明的一个实施方案中，遗传修饰包括如本文所述修饰编码具体酶或其它蛋白质的核酸序列的修饰。这类修饰可以针对内源性酶或蛋白质，由此例如通过传统诱变和选择技术和/或分子遗传技术、包括遗传工程技术对天然含有这类蛋白质的微生物进行遗传修饰。遗传工程技术可以包括，例如使用靶向重组载体使内源性基因部分缺失或用异源序列取代部分内源性基因，所述的异源序列诸如编码改进的酶或其它蛋白质的序列或增加内源性酶或其它蛋白质表达的不同启动子。遗传工程技术还可以包括使用重组技术使基因超表达。
例如，可以在编码本文所述的氨基糖代谢途经中目的酶或其它蛋白质的至少一种基因的上游导入非天然的启动子。优选用组成型启动子、诱导型启动子或在所用生长条件下具有最佳表达的启动子取代内源性基因的5′上游序列。这种方法在内源性基因在所用生长条件下没有活性或活性不足时特别有用。
在本发明该实施方案的另一个方面中，所述的遗传修饰可以包括将可编码目的酶或蛋白质的重组核酸分子导入宿主。所述宿主可以包括(1)不表达具体酶或蛋白质的宿主细胞；或(2)表达具体酶或蛋白质的宿主细胞，其中导入的重组核酸分子改变或增强了微生物中所述酶或其它蛋白质的活性。本发明的目的是包括任意基因修饰微生物，其中所述的微生物包括至少一种适合于本发明生产葡糖胺或N-乙酰氨基葡糖的发酵方法的修饰。
可以通过重组技术，诸如通过将分离所核酸分子导入微生物来修饰基因修饰微生物。例如，可以用编码目的蛋白质如需要增加其表达的蛋白质的重组核酸分子转染基因修饰微生物。转染后的核酸分子可以以其表达能力得到保留的方式保留在染色体外或可以整合入转染(即重组)后的宿主细胞染色体内的一个或多个位点。优选一旦本发明的宿主细胞被核酸分子转染，则所述核酸分子被整合入该宿主细胞基因组。整合的显著优点在于将核酸分子稳定地维持在细胞中。在优选的实施方案中，整合的核酸分子与可以被诱导以控制该核酸分子表达的转录控制序列(下述)可操作地连接。
可以通过随机或靶向整合将核酸分子整合入宿主细胞基因组。这类整合方法在本领域中是公知的。例如大肠杆菌菌株ATCC 47002含有突变，所述突变使其不能维持含有ColE 1复制起点的质粒。当将这类质粒转入该菌株时，对质粒上含有的遗传标记的选择使该质粒被整合入染色体。所述菌株可，例如，用含有目的基因和位于大肠杆菌lacZ基因5′-和3′-末端侧翼的选择标记的质粒转化。LacZ序列使将要进入的DNA靶向至染色体中含有的lacZ基因。在lacZ基因座的整合取代了编码β-半乳糖苷酶的完整lacZ基因，其中部分lacZ基因被目的基因中断。可以筛选β-半乳糖苷酶为阴性的成功整合体。基因修饰微生物还可以通过用诸如使用转导型噬菌体的方法将核酸分子导入受体细胞来产生。重组技术和转导噬菌体技术在生产本发明数种不同基因修饰微生物中的应用是本领域中公知的且具体描述在实施例部分中。
Hamilton等(1989，《细菌学杂志》(J.Bacteriol.)1714617-4622)描述了通过变温(temperature shift)在大肠杆菌染色体中进行被靶向基因的缺失和基因整合的载体和方法。该方法可用于研发不同的产葡糖胺大肠杆菌菌株。基因整合方案包括下列主要步骤。第一步是克隆靶位点的序列并进行内部缺失和/或将待整合的异源基因插入缺失位点。第二步是将含有这些序列的片段亚克隆入含有温敏复制起点和抗生素选择标记的温敏(temperaturesensitive)整合载体。第三步是将所述的整合载体转入大肠杆菌宿主菌株并在非容许温度(42℃)通过单交换重组过程选择含有整合入染色体的完整质粒的克隆。第四步是使所选克隆的细胞在容许温度(30℃)在液体培养物中生长。含有整合的质粒的细胞具有失去该质粒的倾向。复制起点和抗生素抗性基因或整个质粒被丢失的细胞在培养物中过度生长。一般来说，通过用来自2-10个克隆的收集物的细胞接种50-ml LB培养基，并使该培养物生长24小时来完成该步骤。使该培养物以1,000-倍稀释度传代至新鲜培养基并再生长24小时。第五步，将细胞铺板并选择已经失去抗生素抗性的克隆。根据整合的基因或缺失的基因的性质，可以使用基因特异性选择步骤。一般通过使用引物组进行PCR进行克隆的筛选，所述的引物组可以通过PCR产物的大小将染色体中具有目的改变的克隆与其天然形式区别开来。通过Southern印迹分析、使用对整合或缺失的DNA序列具有特异性的探针验证克隆。
应理解本发明公开了包括在发酵方法中使用具有生产商业有用量的葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖的能力的微生物的方法(即与在相同条件下培养的野生型微生物相比，优选其生产葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖的能力增强)。本文所用的发酵方法是在容器、生物反应器、发酵罐或其它合适的培养室内培养诸如微生物的细胞，以便由细胞产生产物(即所述细胞在培养过程中产生产物)的方法。产物一般用于实验或商业化目的。通过对一种或多种基因进行遗传修饰来进行本发明的发酵方法，所述的基因编码氨基糖代谢途经中涉及的蛋白质，所述的遗传修饰可以导致与相应野生型蛋白质相比具有改变(例如增加或减少)的功能的蛋白质产生(表达)。这类改变的功能提高了遗传改造的微生物生产葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖的能力。尽管由于不同遗传修饰的多样性，但是本领域技术人员可以理解诸如通过实施例中所述具体选择技术生产基因修饰微生物可以产生许多满足指定功能需求的生物体，所述微生物具有本文另外部分所述具体改变的功能(例如生产葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸和/或N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸的能力增强)的。例如，指定核酸序列中不同的随机核苷酸缺失和/或取代均可以产生相同的表型结果(例如由该序列编码的蛋白质的作用减少)。本发明涉及导致具有本文所述特征的微生物产生的任意这类遗传修饰。
按照本发明的一个实施方案，基因修饰微生物包括具有增强的合成葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸和/或N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸的能力的微生物。本发明的＂增强的合成能力＂指的是在与产物合成相关的氨基糖代谢途经中的任意增强或上调，使得与在相同条件下培养的野生型微生物相比所述微生物产生的产物量增加。
在本发明的一个方面中，当在任意合适的培养条件且特别是在本文所述的任意培养条件下培养时，用于发酵方法的基因修饰微生物产生至少约1g/L，且优选至少约5g/L，且更优选至少约10g/L，且甚至更优选至少约20g/L，且甚至更优选至少约30g/L，且甚至更优选至少约40g/L，且甚至更优选至少约50g/L，且甚至更优选至少约60g/L，且甚至更优选至少约70g/L，且甚至更优选至少约80g/L，且甚至更优选至少约90g/L，且甚至更优选至少约100g/L，且甚至更优选至少约110g/L，且甚至更优选至少约120g/L，且甚至更优选至少约150g/L，且甚至更优选至少约180g/L，或任意更高量，或至少约1g/L-至少约500g/L之间的任意整数量(例如2g/L、3g/L等)的葡糖胺、葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸和/或N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸。在另一个方面中，用于本发明发酵方法的基因修饰微生物产生的葡糖胺、葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸和/或N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸比在与基因修饰微生物相同条件或等同条件下培养的相同种类(并优选菌株)的野生型(即未修饰的天然存在的)微生物产生的葡糖胺、葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸和/或N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸高至少约2-倍以上，且优选至少约5-倍，且更优选至少约10-倍，且更优选至少约25-倍，且更优选至少约50-倍，且甚至更优选至少约100-倍，且甚至更优选至少约200-倍以上，包括至少2-倍-至少200-倍之间的任意增加的整倍数(即至少3-倍、至少4-倍等)。在实施例部分中鉴定了大量具有这类特征的具体微生物。
在另一个方面中，当在下列条件培养时，用于本发明发酵方法的基因修饰微生物产生至少约1g/L的葡糖胺在pH7.0的发酵培养基中、37℃培养约24小时至细胞密度为至少约细胞干重8g/L，所述培养基包括14g/LK2HPO4、16g/LKH2PO4、1g/L Na3柠檬酸·2H2O(Na3Citrate·2H2O)、5g/L(NH4)2SO4、20g/L葡萄糖、10mM MgSO4、1mM CaCl2和1mM IPTG。在另一个方面中，当在下列条件培养时，用于本发明发酵方法的基因修饰微生物产生至少约1g/L的葡糖胺在pH 7.0的发酵培养基中、约28℃-约37℃、约10-约24小时至细胞密度为至少约细胞干重8g/L，该培养基包括14g/LK2HPO4、16g/LKH2PO4、1g/L Na3柠檬酸·2H2O、5g/L(NH4)2SO4、20g/L葡萄糖、10mM MgSO4、1mM CaCl2和约0.2mM-约1mM的IPTG。在一个优选的实施方案中，IPTG的量约为0.2mM。
用于本发明发酵方法的微生物(例如宿主细胞或生产生物体)是任意的微生物(例如细菌、原生生物、藻类、真菌或其它微生物)且最优选细菌、酵母或真菌。合适的细菌属包括、但不限于埃希氏菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌属、假单胞菌属和链霉菌属。合适的细菌种类包括、但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短乳杆菌、铜绿假单胞菌和浅青紫链霉菌。合适的酵母属包括、但不限于糖酵母属(Saccharomyces)、裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)、念珠菌属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和Phaffia。合适的酵母种类包括、但不限于酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、白色念珠菌、多形汉逊酵母、巴氏毕赤酵母、P.canadensis、马克斯克鲁维酵母和Phaffia rhodozyma。合适的真菌属包括、但不限于曲霉属、犁头霉属、根霉属、金孢子菌属、脉孢霉属和木霉属。合适的真菌种类包括、但不限于黑曲霉、构巢曲霉、蓝色犁头霉、米根霉、Chrysosporium luckrtowense、粗糙脉孢霉、N.intermedia和Trichoderm reesei。特别优选的大肠杆菌菌株包括K-12、B和W且最优选K-12。尽管大肠杆菌是一种优选的细菌且用作本发明各种实施方案的实例，但是应理解在本发明方法中可以使用产生葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖且可以通过遗传修饰以提高葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖产量的任意微生物。用于本发明发酵方法的微生物也可以称作生产生物体。
在一个优选的实施方案中，所述的基因修饰微生物为细菌或酵母且更优选埃希氏菌属的细菌，且甚至更优选大肠杆菌。遗传修饰的大肠杆菌优选在基因中含有修饰，所述的基因包括、但不限于nagA、nagB、nagC、nagD、nagE、manXYZ、glmM、pfkB、pfkA、glmU、glmS、GNA1、ptsG或磷酸酶基因。在另一个实施方案中，这类遗传修饰的大肠杆菌有nag调节子基因的缺失，而在另一个实施方案中，所述大肠杆菌有nag调节子基因的缺失和manXYZ基因中的遗传修饰，使得由manXYZ基因编码的蛋白质具有降低的作用。
按照本发明，本文的具体酶或其它蛋白质指的是具有野生型参比蛋白的至少一种生物活性的任意蛋白质，包括全长蛋白、融合蛋白或天然存在的蛋白质的任意同源物(包括天然等位基因变体、片段、来自不同生物体的相关蛋白以及合成或人工衍生的变体(同源物))。参比蛋白的同源物(突变体、变体、修饰形式)包括与天然存在的参比蛋白的至少一或数个、但不限于一或数个氨基酸不同的蛋白质，所述氨基酸已经被缺失(例如蛋白质的截短形式，诸如肽或片段)、插入、翻转、取代和/或衍生(例如通过糖基化、磷酸化、乙酰化、豆蔻酰化、异戊二烯化、棕榈酸化、氨基化和/或糖基磷脂酰肌醇的加成)。一种优选的同源物为天然存在的蛋白质的生物活性片段。用于本发明的天然存在的蛋白质的其它优选同源物如下文具体所述。因此，本发明分离的核酸分子可以编码任意具体蛋白可读框、结构域、其生物活性片段的翻译产物，或具有生物活性的天然存在蛋白质或结构域的任意同源物。
本发明的分离蛋白质为从其天然环境中取出的蛋白质(即已经接受过人工操作)，且可以包括例如纯化的蛋白质、部分纯化的蛋白质、重组产生的蛋白质和合成产生的蛋白质。数种重组产生的蛋白质描述在实施例部分中。照此，＂分离的＂并不反映出蛋白质的纯化程度。此外和作为实例，通过参比称作＂蛋白质X＂的假想蛋白(即本发明中所用的任意酶或蛋白质可以取代该术语)，＂大肠杆菌蛋白质X＂指的是来自大肠杆菌的蛋白质X(包括天然存在的蛋白质X的同源物)或根据对来自大肠杆菌的天然存在蛋白质X的结构(例如序列)可能还加上对其功能的了解而产生的蛋白质X。换句话说，大肠杆菌蛋白质X如本文具体所述与具有来自大肠杆菌的天然存在蛋白质X具有基本上类似的结构和功能或为来自大肠杆菌的天然存在蛋白质X的生物活性(即具有生物活性)同源物的任意蛋白质X。照此，大肠杆菌蛋白质X可以包括纯化、部分纯化、重组、突变/修饰和合成的蛋白质。该讨论可类似地应用于本文公开的其它微生物的蛋白质X。
同源物可以为天然等位变异或天然突变的结果。编码蛋白质的核酸的天然存在的等位基因变体为出现在基因组中的基本上与编码这种蛋白的基因相同的基因座上的基因，但所述基因由于例如突变或重组产生的天然变异而有相似、但不相同的序列。等位基因变体通常编码的蛋白质具有的活性和与该基因进行比较的基因所编码的蛋白质相似。一类等位基因变体可以编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而具有不同的核酸序列。等位基因变体还可以包括该基因5′或3′未翻译区中的改变(例如在调节控制区中)。等位基因变体是本领域技术人员众所周知的。
可以使用本领域用于生产蛋白质的公知技术制备同源物，所述技术包括、但不限于对分离的天然存在的蛋白质进行直接修饰、直接蛋白质合成，或使用例如传统或重组DNA技术修饰编码蛋白质的核酸序列以进行随机或靶向诱变。
与野生型蛋白质相比，同源物修饰可以激动、拮抗或基本上不改变与天然存在蛋白质相比的同源物的基本生物活性。一般来说，蛋白质的生物活性或生物作用指的是该蛋白质表现出或具有的、在体内(即蛋白质的天然生理环境)或体外(即在实验室条件下)测定或观察到的该蛋白质天然存在形式的任意功能。上文已经具体描述了本文所用的酶和蛋白质的生物活性。例如，本文一般称作＂葡糖胺-6-磷酸合酶＂的酶催化由果糖-6-磷酸和谷氨酰胺形成葡糖胺-6-磷酸和谷氨酸。对蛋白质、诸如在同源物中进行修饰可以使蛋白质具有谷天然存在的蛋白质相同水平的生物活性，或使蛋白质具有比天然存在蛋白质降低或增加的生物活性。使表达减少或蛋白质活性降低的修饰可以称作失活(完全或部分)、下调或蛋白质作用降低。类似地，使表达增加或蛋白质活性增加的修饰可以称作扩增、超量生产、活化、增强、上调或蛋白质作用增加。指定蛋白质的功能亚单位、同源物或片段优选能够执行与天然蛋白质基本上相同(例如至少定性地相同)的生物功能(即具有生物活性)。注意不必要求蛋白质的功能亚单位、片段或其它同源物具有与参比或野生型蛋白质相同水平的生物活性以便认为具有参比或野生型蛋白质的生物活性(即定性相似性是足够的)。在一个实施方案中，与野生型蛋白质相比，优选同源物的修饰基本上不会使该蛋白质与天然存在蛋白质相比前者的基本生物活性降低。增加的生物活性(例如增加的酶活性)在同源物中是所需的。同源物与天然存在形式相比还可以在除蛋白质功能或酶活性以外的方面具有不同特征，诸如与天然存在蛋白质相比对一些化合物的抑制作用的敏感性降低。
本发明的分离蛋白、包括其生物活性同源物或片段具有至少一种野生型或天然存在蛋白质的生物活性特征。检测和测定蛋白质表达和生物活性的方法包括、但不限于蛋白质转录的测定、蛋白质翻译的测定、蛋白质的细胞定位的测定、蛋白质与另一种蛋白质结合(binding)或连接(association)的测定、编码蛋白质调节序列的基因与蛋白质或其它核酸的结合或连接的测定、表达蛋白质的细胞中该蛋白质的生物活性增加、降低或诱导的测定。
测定本发明蛋白质的蛋白质表达水平的方法包括、但不限于Western印迹法、免疫细胞化学法、流式细胞术或其它基于免疫的试验、基于蛋白质特性的试验，所述特性包括、但不限于配体结合、酶活性或与其它蛋白质配偶体的相互作用。结合试验也是本领域中众所周知的。例如，BIAcore机可以用于测定两种蛋白质之间的复合物的结合常数。可以通过监测当缓冲液通过芯片时折射率随时间的变化测定复合物的解离常数(O′Shannessy等《生物化学年鉴》(Anal.Biochem.)212457-468(1993)；Schuster等《自然》(Nature)365343-347(1993))。测定蛋白质彼此结合的其它合适的试验包括例如免疫测定法，诸如酶联免疫吸附测定法(ELISA)和放射性免疫测定法(RIA)或通过经荧光、UV吸收、圆二色性(circular dichrosim)或核磁共振(NMR)监测蛋白质的光谱或光学特性改变来测定结合。用于测定本发明中所用蛋白质的酶活性的试验在本领域中众所周知且许多描述在实施例部分中。
上文中已经就有代表性的野生型或突变蛋白质的功能和氨基酸序列(和编码它们的核酸序列)而言描述了氨基糖代谢途经中涉及的、且代表本文所述发酵方法中的修饰和应用的理想靶的许多酶和蛋白质。在本发明的一个实施方案中，指定蛋白质的同源物(可以包括来自其它生物体的相关蛋白质或指定蛋白质的修饰形式)被包括以便用于本发明的遗传修饰生物体。本发明包括的蛋白质同源物可以包括一种氨基酸序列，该氨基酸序列与本文公开的、并代表可以按照本发明修饰或超表达的酶或蛋白质的氨基酸序列的氨基酸序列至少约35％相同，且更优选至少约40％相同，且更优选至少约45％相同，且更优选至少约50％相同，且更优选至少约55％相同，且更优选至少约60％相同，且更优选至少约65％相同，且更优选至少约70％相同，且更优选至少约75％相同，且更优选至少约80％相同，且更优选至少约85％相同，且更优选至少约90％相同，且更优选至少约95％相同，且更优选至少约96％相同，且更优选至少约97％相同，且更优选至少约98％相同，且更优选至少约99％相同，或35％-99％之间的任意整数百分比(即36％、37％等)相同。优选同源物的氨基酸序列具有野生型或参比蛋白的生物活性。
除非另有说明，本文涉及的百分比(％)同一性指的是使用以下方法进行的同源性评价(1)使用标准默认参数，使用氨基酸检索所用的blastp和核酸检索所用的blastn进行BLAST 2.0 Basic BLAST同源性检索，其中通过默认(default)过滤查询序列的低复杂区(描述在下列文献中Altschul，S.F.，Madden，T.L.，Schaffer，A.A.，Zhang，J.，Zhang，Z.，Miller，W.& Lipman，D.J.(1997)“缺口BLAST和PSI-BLAST新一代”蛋白质数据库检索程序(＂GappedBLAST和PSI-BLASTa new Generation of protein database search programs.＂)-《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)253389-3402，将该文献的全部内容引入本文作为参考)；(2)BLAST2序列比对(使用下述参数)；(3)和/或使用标准默认参数的PSI-BLAST(Position-Specific Iterated BLAST)。注意由于在BLAST 2.0 Basic BLAST与BLAST 2之间的标准参数存在一定的差异，所以使用BLAST 2程序可能将两种具体序列视为具有显著同源性，而使用上述序列之一作为查询序列的BLAST 2.0 Basic BLAST中进行的检索可能不会将另一序列鉴定为最高匹配。此外，PSI-BLAST提供了自动易用的＂轮廓(profile)＂检索版本，它是查询序列同源物的灵敏方式。该程序首先进行有缺口的(gapped)BLAST数据库检索。PSI-BLAST程序应用来自返回的任意重要比对的信息以构建位置特异性得分矩阵，用它取代用于下一个循环的数据库检索的查询序列。因此，应理解可以通过使用这些程序中的任意一种测定百分比同一性。
使用如Tatusova和Madden，(1999)在“Blast 2序列-比较蛋白质和核苷酸序列的新工具”(＂Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein和nucleotide sequences＂)-FEMS Microbiol Lett.174247-250中所述的BLAST2序列可以对两种具体序列进行序列比对，将该文献的全部内容引入本文作为参考。使用BLAST 2.0算法在blastp或blastn中进行BLAST 2序列比对，以便在两种序列之间进行缺口BLAST检索(BLAST 2.0)，从而允许在所得比对中导入缺口(缺失和插入)。本文为清楚起见，如下使用标准默认参数进行BLAST 2序列对比。
就blastn而言，使用0 BLOSUM62矩阵 匹配得分＝1 错配罚分＝-2 开放缺口5)和延长缺口(2)罚分 缺口x_递减(drop offf)(50)期望值(expect)(10)字符大小(11)过滤(启动) 就blastp而言，使用0 BLOSUM62矩阵 开放缺口(11)和延长缺口(1)罚分 缺口x递减(50)期望值(10)字符大小(3)过滤(启动)。
本发明中参比和/或使用的蛋白质还可以包括含有这样的氨基酸序列的蛋白质，所述的氨基酸序列包括参比蛋白氨基酸序列的至少30个连续氨基酸残基(即与上述序列之一的30个连续氨基酸具有100％同一性的30个连续氨基酸残基)。在一个优选的实施方案中，本发明中参比和/或使用的蛋白质可以包括含有这样的氨基酸序列的蛋白质，所述的氨基酸序列包括参比蛋白氨基酸序列的至少50个，且更优选至少75个，且更优选至少100个，且更优选至少115个，且更优选至少130个，且更优选至少150个，且更优选至少200个，且更优选至少250个，且更优选至少300个，且更优选至少350个参比蛋白的连续氨基酸残基。在一个实施方案中，这类蛋白质具有参比蛋白的生物活性。
本发明术语＂连续＂或＂相邻＂有关本文所述核酸或氨基酸序列的指的是连接在不间断的序列中。例如，对含有第二种序列的30个连续(或相邻)氨基酸的第一种序列而言，指的是第一种序列包括30个氨基酸残基的不间断序列，该序列与第二种序列中的30个氨基酸残基的不间断序列100％相同。类似地，第一种序列与第二种序列具有＂100％同一性＂，指的是第一种序列完全与第一种序列匹配，其中在核苷酸或氨基酸之间无缺口。
在另一个实施方案中，本发明中参比或使用的蛋白质、包括同源物包括含有这样的氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列与天然存在蛋白质的氨基酸序列足够相似，从而编码同源物的核酸序列能够在中等、高或极高严格条件(下述)下和(即与)编码天然存在蛋白质的核酸分子杂交(即与编码天然存在蛋白质的核酸链的补体杂交)。优选指定的同源物由在中等、高或极高严格条件(下述)下与编码野生型或参比蛋白的核酸序列的补体杂交的核酸序列编码。
参比核酸序列的核酸序列补体指的是与编码蛋白质的链互补的核酸链的核酸序列。可以理解编码指定氨基酸序列的双链DNA包括单链DNA及其含有为该单链DNA补体的序列的互补链。照此，本发明的核酸分子可以为双链或单链且包括那些在严格杂交条件下与编码蛋白质的氨基酸序列的核酸序列和/或与编码这类蛋白质的核酸序列的补体形成稳定杂合体的核酸分子。推定互补序列的方法是本领域技术人员公知的。应注意由于氨基酸测序和核酸测序技术并非完全没有误差，所以本文提供的序列至多代表本发明参比蛋白的表观序列。
作为本文所用的杂交条件指的是标准杂交条件，在此条件下核酸分子用于鉴定相似的核酸分子。这类标准条件例如公开在Sambrook等的《分子克隆实验室指南》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，Cold SpringHarbor Labs Press，1989中。将Sambrook等的上述文献的全部内容引入本文作为参考(特别是参见9.31-9.62页)。此外，例如，在Meinkoth等1984《生物化学年鉴》(Anal.Biochem.)138，267-284中公开了计算适宜杂交和洗涤条件的公式以获得许可各种程度核苷酸错配的杂交；将Meinkoth等的上述文献的全部内容引入本文作为参考。
更具体地说，本文涉及的中等的严格杂交和洗涤条件指的是允许分离与杂交反应中用作探针的核酸分子具有至少约70％核酸序列同一性的核酸分子的条件(即允许约30％以下核苷酸错配的条件)。本文涉及的高严格杂交和洗涤条件指的是允许分离与杂交反应中的探针核酸分子具有至少约80％核酸序列同一性的核酸分子的条件(即允许约20％以下核苷酸错配的条件)。本文涉及的极高严格杂交和洗涤条件指的是允许分离与杂交反应中的探针核酸分子具有至少约90％核酸序列同一性的核酸分子的条件(即允许约10％以下核苷酸错配的条件)。如上所述，本领域技术人员可以使用Meinkoth等的上述文献中的公式计算适宜的杂交和洗涤条件以获得这些具体的核苷酸错配水平。这类条件是可变的，这取决于是形成DNARNA还是DNADNA杂合体。对DNA:DNA杂合体计算出的解链温度低于比对DNARNA杂合体计算的解链温度低10℃。在特定的实施方案中，DNA:DNA杂合体的严格杂交条件包括在6X SSC(0.9M Na+)离子强度和约20℃-约35℃(低严格)、更优选约28℃-约40℃(更严格)且甚至更优选约35℃-约45℃(甚至更严格)的温度及适宜洗涤条件下杂交。在具体的实施方案中，DNA:RNA杂合体的严格杂交条件包括在6X SSC(0.9M Na+)离子强度和约30℃-约45℃、更优选约38℃-约50℃且甚至更优选约45℃-约55℃的温度与类似的严格洗涤条件下杂交。这些值基于对大于约100个核苷酸的分子、0％甲酰胺和约40％的G+C含量计算的解链温度。另一方面，可以如Sambrook等(文献同上)9.31-9.62页中所述根据经验计算Tm。一般来说，洗涤条件应尽可能严格且应适合于所选杂交条件。例如，杂交条件可以包括盐与比具体杂合体的计算Tm低约20-25℃的温度条件的组合，且洗涤条件一般包括盐与约比具体杂合体的计算Tm低约12-20℃的温度条件的组合。适用于DNADNA杂合体的杂交条件的一个实例包括在42℃、6X SSC(50％甲酰胺)中杂交2-24小时、随后是包括在室温和约2X SSC中洗涤一次或多次、随后在高温和低离子强度下进行额外的洗涤(例如在约37℃和约0.1X-0.5XSSC中至少洗涤一次、随后在约68℃、约0.1X-0.5X SSC中至少洗涤一次)。
在一个实施方案中，同源物可以为天然等位变异或天然突变。指定蛋白质的同源物还可以为来自不同生物体的基本上相同功能的天然存在的蛋白质，其相互之间在如本文所述核酸或氨基酸水平上有至少一定程度的结构相似性(例如至少约35％同一性)的。还可以使用本领域中公知的技术生产本发明的同源物，包括、但不限于直接修饰蛋白质或使用例如传统或重组DNA技术修饰编码蛋白质的基因以实现随机或靶向诱变。编码指定蛋白质的核酸的天然存在的等位基因变体为存在于基因组中基本上编码给定蛋白质的基因相同的基因座上的基因，但因例如突变或重组导致天然变异而具有相似而不相同的序列。天然等位基因变体一般编码与和它们进行比较的基因编码的蛋白质具有相似活性的蛋白质。一类等位基因变体可以编码相同的蛋白质，但因遗传密码的简并性而有不同的核酸序列。等位基因变体还可以包括位于该基因5′或3′未翻译区的变异(例如在调节控制区中)。等位基因变体是本领域技术人员众所周知的。
在一个方面中，本发明蛋白质和/或同源物的最小大小为足以具有蛋白质所需生物活性的大小。在另一个实施方案中，本发明的蛋白质长度至少约为30个氨基酸且更优选至少约50个氨基酸，且更优选至少约75个氨基酸，且更优选至少约100个氨基酸，且更优选至少约115个氨基酸，且更优选至少约130个氨基酸，且更优选至少约150个氨基酸，且更优选至少约200个氨基酸，且更优选至少约250个氨基酸，且更优选至少约300个氨基酸，且更优选至少约350个氨基酸。除非操作限制，对这类蛋白质最大大小没有限制，这是因为该蛋白质可以包括指定蛋白质或全长蛋白质的一部分，以及所需的其它序列(例如融合蛋白序列)。用于本发明的合适的融合片段包括、但不限于具有以下性质的片段可以提高蛋白质稳定性、提供其它所需生物活性(例如第二种酶功能)和/或有助于纯化蛋白质(例如通过亲合层析法)。
在本发明的一个实施方案中，本文所述的任意氨基酸序列可以使用分别位于具体氨基酸序列C-和/或N-末端侧翼的至少1到约20个其它异源氨基酸生产。所得蛋白质或多肽可以称作＂主要由＂具体氨基酸序列组成。本发明的异源氨基酸为如下氨基酸序列天然发现的所述序列不与所述具体氨基酸序列侧接(即在自然和体内没有发现)，或与具体氨基酸序列功能不相关，或当其在基因中存在时不由与编码该具体氨基酸序列的天然存在核酸序列侧接的核苷酸编码，条件是使用用于指定氨基酸序列所来源的生物体的标准密码子翻译天然存在序列中的这类核苷酸。类似地，当用于本文涉及的核酸序列时，术语＂主要由...组成′指的是编码特定氨基酸序列的核酸序列，所述核酸序列可在其5′和/或3′端分别侧接至少1到约60个其它异源核苷酸。天然发现的所述异源核苷酸出现在天然基因中时不与编码具体氨基酸序列的核酸序列侧接(即在自然和体内没有发现)，或不编码可将任意其它功能赋予具有所述具体氨基酸序列的蛋白质或改变所述蛋白质功能的蛋白质。
本发明的实施方案包括编码本文所述氨基糖代谢途经中的酶或其它蛋白质的核酸分子的应用和/或操作。本发明的核酸分子包括编码本文所述的任意酶或其它蛋白质的核酸序列、主要由它们组成或由它们组成。
本发明分离的核酸分子为已经从其天然环境中取出(即已经接受人工操作)的核酸分子，其天然环境为所述核酸分子天然存在其中的基因组或染色体。照此，＂分离的＂不一定反映出核酸分子已经纯化的程度，而表示该分子不包括该核酸分子天然存在其中的完整基因组或完整染色体。分离的核酸分子可以包括基因，诸如本文所述的葡糖胺-6-磷酸合酶基因。包括基因的分离的核酸分子并非是包括这类基因的染色体的片段，其包括与所述基因相关的编码区和调节区，但不包括在相同染色体上天然发现的其它基因。分离的核酸分子还可以包括于于其它核酸侧接(即序列的5′和/或3′端)的具体核酸序列，所述的其它核酸在自然界一般不位于该具体核酸序列的侧翼(即为异源序列)。分离的核酸分子可以包括DNA、RNA(例如mRNA)或DNA或RNA的衍生物(例如cDNA)。尽管术语＂核酸分子＂主要指物理的核酸分子且术语＂核酸序列＂主要指核酸分子上的核苷酸序列，但是两种术语可以互换使用，尤其是对于能够编码蛋白质的核酸分子或核酸序列而言可以互换使用。
优选使用重组DNA技术(例如聚合酶链反应(PCR)扩增、克隆)或化学合成生产本发明分离的核酸分子。分离的核酸分子包括天然核酸分子及其同源物，包括、但不限于天然等位基因变体和其中的核苷酸已经被插入、缺失、取代和/或翻转的修饰核酸分子，所述方式的修饰为蛋白质的生物活性提供所需的影响。上文已经具体描述了等位基因变体和蛋白质同源物(例如由核酸同源物编码的蛋白质)。
可以使用本领域技术人员公知的许多方法生产核酸分子的同源物(例如，参见Sambrook等，文献同上)。例如，可以使用各种技术修饰核酸分子，所述技术包括、但不限于传统诱变技术和重组DNA技术，诸如定点诱变、对核酸分子进行化学处理以诱导突变、对核酸片段进行限制酶切割、核酸片段的连接、PCR扩增和/或核酸序列选择区的诱变、寡核苷酸混合物的合成和将混合物组连接以＂构建＂核酸分子的混合物及其组合。核酸分子同源物可以通过筛选由所述核酸编码的蛋白质的功能和/或通过与野生型基因杂交从修饰核酸的混合物中选出。
本发明核酸分子的最小大小为足以编码具有所需生物活性的蛋白质或足以形成探针或寡核苷酸引物的大小，所述的探针或寡核苷酸引物能够与编码天然蛋白质的核酸分子的互补序列形成稳定的杂合体(例如在中等、高或极高严格条件下，且优选在极高严格条件下)。照此，本发明核酸分子的大小可以取决于核酸的组成和核酸分子与互补序列之间的百分比同源性或同一性以及杂交条件本身(例如温度、盐浓度和甲酰胺浓度)。用作寡核苷酸引物或探针的核酸分子的最小大小一般为如果该核酸分子富含GC，至少约为12-约15个核苷酸长度；和如果该核酸分子富含AT则至少约为15-约18个碱基长度。对本发明核酸分子的最大大小没有限制(除非实际限制)因为该核酸分子可以包括蛋白质编码序列、即编码全长蛋白质的核酸序列(包括完整基因)的一部分。
由于已知本发明的一些核酸分子且特别是本文具体描述的任意核酸分子的核酸序列，所以允许本领域技术人员例如(a)制备那些核酸分子的拷贝和/或(b)获得包括至少这类核酸分子的一部分的核酸分子(例如包括全长基因、全长编码区、调节控制序列、截短的编码区的核酸分子)。可以按照各种方式获得这类核酸分子，包括使用寡核苷酸探针筛选适宜文库或DNA的传统克隆技术和使用寡核苷酸引物对适宜的文库或DNA的PCR扩增。用于筛选或扩增核酸分子的优选文库包括细菌和酵母基因组DNA文库，且特别是大肠杆菌基因组DNA文库。克隆和扩增基因的技术公开在例如Sambrook等的上述文献中。
本发明的另一个实施方案包括重组核酸分子，它包括重组载体和含有编码一种氨基酸序列的核酸序列的核酸分子，所述的氨基酸序列具有如本文所述的氨基糖代谢途经中的任意酶或其它蛋白质的生物活性。本发明的重组载体为改造(即人工生产的)的核酸分子，它用作操作被选择的核酸序列并将这类核酸序列导入宿主细胞的工具。该重组载体由此适用于克隆、测序和/或操作所选择的核酸序列，诸如通过表达所选择的核酸序列和/或将其递送入宿主细胞以形成重组细胞来进行。这类载体一般含有异源核酸序列，所述异源核酸序列是并非天然发现与克隆或转运的核酸序列相邻的核酸序列，不过，所述载体还可以含有天然发现与本发明核酸分子相邻或用于表达本发明核酸分子的调节核酸序列(例如启动子、未翻译区)(下文详细讨论)。该载体可以为原核生物或真核生物RNA或DNA，且一般为质粒。可以将该载体保持为染色体外元件(例如质粒)或可以将其整合入重组生物体(例如微生物或植物)的染色体。这种完整的载体可以适当保留在宿主细胞中，或在一些条件下，所述质粒DNA可以缺失，从而遗留下本发明的核酸分子。整合的核酸分子可以受染色体启动子控制、天然或质粒启动子控制或数种启动子组合的控制。可以将核酸分子的单或多个拷贝整合入染色体。本发明的重组载体可以含有至少一种选择标记。
在一个实施方案中，用于本发明重组核酸分子的重组载体为表达载体。本文所用的术语＂表达载体＂用以指适合于产生编码的产物(例如目的蛋白质)的载体。在该实施方案中，将编码待产生产物的核酸序列插入所述载体中，使得重组载体以产生重组核酸分子。将编码产生的蛋白质的核酸序列插入所述载体，使得该核酸序列与载体的调节序列可操作地连接，所述调节序列使得所述核酸序列能够在重组宿主细胞中转录和翻译。
在另一个实施方案中，用于本发明重组核酸分子的重组载体为靶向载体。本文所用的术语＂靶向载体＂用以指用于将具体核酸分子递送入重组宿主细胞的载体，其中所述核酸分子用于使宿主细胞或微生物中的内源性基因缺失或失活(即用于被靶向的基因破坏或剔除技术)。这类载体在本领域中也称作＂剔除＂载体。在该实施方案的一个方面中，载体的部分、而更一般的情况是插入载体的核酸分子(即插入片段)具有与宿主细胞中靶基因的核酸序列同源的核酸序列(即被靶向以便被缺失或失活的基因)。载体插入片段的核酸序列被设计成用于结合靶基因，使得靶基因和插入片段进行同源重组，由此使内源性基因缺失、失活或减弱(即至少部分内源性靶基因被突变或缺失)。
一般来说，重组核酸分子包括可操作地与一种或多种表达控制序列连接的本发明的至少一种核酸分子，所述的表达控制序列包括转录控制序列和翻译控制序列。本文所用的术语＂重组分子＂或＂重组核酸分子＂主要指的是与表达控制序列可操作地连接的核酸分子或核酸序列，而当这类核酸分子为如本文所述的重组分子时，可以与术语＂核酸分子＂互换使用。本发明的术语＂可操作地连接＂指的是将核酸分子与表达控制序列(例如转录控制序列和/或翻译控制序列)按照使得该分子能够在转染(即转化、转导、转染、偶联(conjugated)或导入(conduced))到宿主细胞时被表达的方式进行连接。转录控制序列使控制转录起始、延伸或终止的序列。特别重要的转录控制序列为那些控制转录起始的序列，诸如启动子、增强子、操纵物和阻抑物序列。合适的转录控制序列包括可以在导入所述重组核酸分子的宿主细胞或生物体中起作用的任意转录控制序列。
本发明的重组核酸分子还可以含有其它调节序列，诸如翻译调节序列、复制起点和其它与重组细胞相容的调节序列。在一个实施方案中，本发明的重组分子(包括整合入宿主细胞染色体的那些重组分子)还含有分泌信号(即信号片段核酸序列)以使表达的蛋白质能够从产生该蛋白质的细胞中分泌。合适的信号片段包括与待表达的蛋白质天然相关联的信号片段或能够指导本发明蛋白质分泌的任意异源信号片段。在另一个实施方案中，本发明的重组分子包括能够将表达的蛋白质递送并插入至宿主细胞膜中的前导序列。合适的前导序列包括与蛋白质天然相关的前导序列，或能够直到所述蛋白递送并插入细胞膜的任意异源前导序列。
本发明的术语＂转染＂用于指可以将外源性核酸分子(即重组核酸分子)插入细胞的任意方法。当用以指将核酸分子导入诸如藻类、细菌和酵母这类微生物细胞或导入植物细胞时，术语＂转化＂可以与术语＂转染＂互换使用。在微生物系统和植物系统中，术语＂转化＂用于描述因微生物或植物获得外源性核酸而导致的遗传改变，且基本上与术语＂转染＂同义。因此，转染技术包括、但不限于转化、对细胞进行化学处理、粒子轰击、电穿孔、微注射、脂转染、吸附、感染和原生质体融合。
优选通过用一种或多种重组分子转化细菌或酵母细胞(即宿主细胞)产生重组细胞，每种重组分子包括一种或多种核酸分子，这些核酸分子与含有一种或多种转录控制序列的表达载体可操作地连接。术语可操作地连接指的是将该核酸分子插入表达载体，使得该分子能够在转入宿主细胞时被表达。本文所用的表达载体为能够转化宿主细胞表达具体的核酸分子的DNA或RNA载体。优选所述的表达载体还能够在宿主细胞中复制。在本发明中，表达载体一般为质粒。本发明的表达载体包括在酵母宿主细胞或细菌宿主细胞、优选大肠杆菌宿主细胞中起作用(即指导基因表达)的任意载体。本发明优选的重组细胞描述在实施例部分中。
本发明的核酸分子可以与含有调节序列的表达载体可操作地连接，所述的调节序列诸如转录控制序列、翻译控制序列、复制起点和与重组细胞相容且控制本发明核酸分子表达的其它调节序列。本发明的重组分子特别包括转录控制序列。转录控制序列为控制转录起始、延伸和终止的的序列。特别重要的转录控制序列为那些控制转录起始的序列，诸如启动子、增强子、操纵物和阻抑物序列。合适的转录控制序列包括能够在酵母或细菌细胞且优选大肠杆菌中起作用的任意转录控制序列。各种这类转录控制序列是本领域技术人员公知的。
优选在人工启动子控制下克隆包括编码各种本文所述酶和蛋白质(包括其同源物)的核酸序列的重组核酸分子。该启动子可以是提供维持生产生物体中编码蛋白质的足够水平所需的基因表达水平的任意合适的启动子。合适的启动子可以为可通过不同化学物质(诸如乳糖、半乳糖。麦芽糖和盐)或生长条件的改变(诸如温度)诱导的启动子。诱导型启动子的应用可以使基因表达和发酵法的性能达到最佳。优选的启动子还可以为组成型启动子，这是因为可避免添加昂贵的诱导物。这类启动子包括已经通过遗传修饰(诸如通过使用较弱的突变体阻抑基因)形成功能上组成型的或＂遗漏(leaky)＂的正常诱导型启动子系统。所用的特别优选的启动子为lac、PL和T7。基因的剂量(拷贝数)可以根据最大程度地形成产物的要求而改变。在一个实施方案中，将重组基因整合入宿主基因组。
本领域技术人员可以理解重组DNA技术的应用可以通过操纵例如宿主细胞内核酸分子的拷贝数、那些核酸分子的转录效率、所得转录物的翻译效率和翻译后修饰的效率来改善被转化的核酸分子的表达。用于增加本发明核酸分子表达的重组技术包括、但不限于使核酸分子与高拷贝数质粒可操作地连接、将核酸分子整合入宿主细胞染色体、给质粒添加载体稳定性序列、取代或修饰转录控制信号(例如启动子、操纵基因、增强子)、取代或修饰翻译控制信号、修饰本发明的核酸分子以对应宿主细胞的密码子利用、缺失使转录物不稳定的序列，以及应用在发酵过程中使重组细胞生长和重组酶产生暂时分离的控制信号。本发明表达的重组蛋白的活性可以通过对编码这类蛋白的核酸分子进行片段化、修饰或衍生而得到改善。这类修饰具体描述在实施例部分中。
本发明的一种或多种重组分子可以用于生产本发明的编码产物。在一个实施方案中，通过在有效产生蛋白质的条件下表达本文所述的核酸分子来生产编码的产物。生产编码蛋白的优选方法是通过用一种或多种重组分子转染宿主细胞以形成重组细胞。合适的细胞为任意的微生物(例如宿主细胞或生产生物体)，所述的微生物为任意的微生物(例如细菌、原生生物、藻类、真菌或其它微生物)，且最优选细菌、酵母或真菌。合适的细菌属包括、但不限于埃希氏菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌属、假单胞菌属和链霉菌属。合适的细菌种类包括、但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短乳杆菌、铜绿假单胞菌和浅青紫链霉菌。合适的酵母包括、但不限于糖酵母属、念珠菌属、汉逊酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属和Phaffia。合适的酵母种类包括、但不限于酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、白色念珠菌、多形汉逊酵母、巴氏毕赤酵母、P.canadensis、马克斯克鲁维酵母和Phaffiarhodozyma。合适的真菌属包括、但不限于曲霉属、犁头霉属、根霉属、金孢子菌属、脉孢霉属和木霉属。合适的真菌种类包括、但不限于黑曲霉、构巢曲霉、蓝色犁头霉、米根霉、Chrysosporium lucknowense、粗糙脉孢霉、间型脉孢霉和Trichoderm reesei。宿主细胞可以为未转染的细胞或已经用至少一种其它重组核酸分子转染的细胞。
本发明的其它实施方案包括本文所述的任意遗传修饰的微生物和具有实施例中具体鉴定的微生物的鉴定特征的微生物。这类鉴定特征可以包括实施例中微生物的任意或所有基因型和/或表型特征，包括其产生葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖的能力。
如上所述，在生产本发明葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖的方法中，在发酵培养基中培养具有遗传修饰的氨基糖代谢途经的微生物以生产葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖。合适或有效的发酵培养基指的是本发明的遗传修饰微生物在其中培养时能够产生葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖的任意培养基。这类培养基一般为包括可同化碳、氮和磷酸盐源的含水培养基。这类培养基还可以包括合适的盐、无机物和其它营养物。本文所述的对微生物的遗传修饰的一个优点在于尽管这类遗传修饰显著改变了氨基糖类的代谢，但是它们不会产生对生产生物体的任何营养需求。因此，优选将含有葡萄糖、果糖、乳糖、甘油或两种或多种不同化合物的混合物作为唯一碳源的极限盐培养基(minimal-salts medium)用作发酵培养基。应用的极限盐-葡萄糖培养基是用于葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖发酵的最优选培养基，且它还有利于回收和纯化产物。在一个方面中，酵母提取物为培养基的成分。
可以在常规发酵生物反应器中培养本发明的微生物。可以通过任意发酵法培养所述微生物，包括、但不限于分批发酵、补料分批发酵(feed-batch)、细胞再循环和连续发酵。优选通过分批发酵或补料分批发酵法使本发明的微生物生长。
在本发明的一个实施方案中，在接种前，使发酵培养基达到所需温度，一般约为20℃-约45℃，优选约25℃-约45℃或25℃-约40℃，其中更为优选的温度约为25℃-约37℃，且在一些实施方案中更优选约为30℃或约37℃。发酵条件可以包括在约20℃-约40℃之间按照整数增加的任意温度(即21℃、22℃等)培养本发明的微生物。注意本发明微生物生长和葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖产生的最佳温度可以根据不同因素改变。例如，对用于微生物中重组核酸分子表达的具体启动子的选择可以影响最佳培养温度。本领域技术人员使用标准技术、诸如在实施例部分所述用于本明一种微生物的那些技术可轻易测定用于本发明任意微生物的生长和葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖产生的最佳温度。
给培养基接种足量的基因修饰微生物的活跃生长培养物以便在合理生长期限后产生高细胞密度。使细胞生长至细胞密度至少约为10g/l，优选约10g/l-约40g/l，且更优选至少约40g/l。该方法一般需要约10-60小时。
在发酵过程中必须向培养基中添加足量的氧以维持起始细胞生长过程中的细胞生长并维持代谢和葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖产生。通过搅拌和通气易于提供氧。可以将诸如搅拌或振摇这类常规方法用于搅拌培养基并给其通气。优选培养基中氧的浓度大于约饱和值(即在大气压和约30-40℃下氧在培养基中的溶解度)的15％，且更优选大于约饱和值的20％，但只要发酵不受到不良影响可以存在低浓度的偏移。进一步理解在发酵过程中使氧的水平可以达到极低水平并持续任意适宜的时间，条件是它促进该生产方法过程中葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖的稳定性和形成。可以通过常规方法监测培养基中氧的浓度，诸如使用氧电极。可以使用其它氧的来源，诸如未稀释的氧气和用非氮的惰性气体稀释的氧。
由于通过发酵生产葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖优选基于使用葡萄糖作为唯一的碳源，在优选的实施方案中，在大肠杆菌中诱导PEP葡萄糖PTS。因此，甚至在没有PEP甘露糖PTS的功能性EIIM，P/IIIMan的情况下(例如在具有manXYZ突变的大肠杆菌中)，产物葡糖胺通过诱导的葡萄糖转运系统被细胞吸收。然而，在有过量葡萄糖存在的情况下，葡糖胺的吸收被严重抑制。因此，本发明的一个实施方案是通过维持发酵生物反应器中过量的葡萄糖防止葡糖胺产物的吸收。本文所用的＂过量＂的葡萄糖指的是葡萄糖的量高于正常条件(诸如上述培养条件下)维持微生物生长所需的量。
优选将葡萄糖浓度维持在约0.05％-约15％重量/发酵培养基体积。在另一个实施方案中，将葡萄糖的浓度维持在约0.5-约150g/L发酵培养基，且甚至更优选约5-约100g/L发酵培养基，且甚至更优选约5-约20g/L发酵培养基。在一个实施方案中，通过任意合适的方法(例如通过使用葡萄糖试纸)监测发酵培养基中的葡萄糖浓度，且当葡萄糖浓度处于或接近耗尽时，再向培养基中加入葡萄糖。在另一个实施方案中，通过发酵培养基的半连续或连续补料维持葡萄糖浓度。可以将本文公开的用于葡萄糖的参数用于本发明发酵培养基中所用的任意碳源。进一步理解可以在发酵过程中使碳源达到不可检测到的水平并持续任意合适的时间，条件是它促进葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖产生过程。可以用于本发明发酵方法的其它碳源包括、但不限于果糖、戊糖、乳糖和葡糖酸。戊糖包括、但不限于核糖、木糖和阿拉伯糖。在一个方面中，培养步骤在包括葡萄糖和核糖的发酵培养基中进行。
本发明的另一个实施方案在于补充和/或控制发酵培养基中必要的其它成分和参数来维持和/或促进葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖的产量和稳定性。例如，在一个实施方案中，所述发酵培养基包括硫酸铵且通过添加过量硫酸铵补充培养基中的硫酸铵浓度。优选将发酵培养基中硫酸铵的量维持在约0.1％-约1％(重量/体积)的水平，且优选约0.5％。在另一个实施方案中，监测发酵培养基中pH的波动。在本发明的发酵方法中，优选将pH维持在约pH 4.0-约pH 8.0的pH，在一个方面中，pH维持在约pH 4-约pH 7.5，且在另一个方面中，pH维持在约pH 6.7-约pH 7.5，且在另一个实施方案中，pH维持在约pH4.5-约pH 5。尽管上文描述了优选的实施方案，但是可以在pH 4-pH 8之间按照0.1增加的任意pH条件下进行发酵法(即pH4.1、pH 4.2、pH 4.3等)。在本发明的方法中，如果发酵培养基的起始pH为pH 7.0，作为实例，那么监测发酵培养基的pH对pH 7.0的显著偏移，且例如通过添加氢氧化钠进行相应调节。由于对葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖的稳定性和形成速率而言最佳的pH可以不同于细胞生长的最佳pH，所以可以使用两阶段(或两个以上阶段的方案)的方案。使用这类方案，细胞开始在最佳pH生长以使生物质快速产生，然后使用不同pH以便最大限度地合成葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖，同时将葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖的降解减少到最低限度。
本发明的另一个实施方案在于使碳流从产生乙酸酯重新定向于生成毒性较低的副产物。通过这类方法，与发酵培养基中过量葡萄糖修改的毒性问题可以得到避免。重新定向来自乙酸酯产生的碳流的方法是本领域中公知的。
在本发明的分批发酵、补料分批发酵和/或连续发酵法中，将发酵持续至形成葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖(正如通过胞外葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖的累积所验证的)基本上停止。总发酵时间一般约为40-约60小时且更优选约48小时。在连续发酵法中，当葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖累积在培养基中时，可以从生物反应器中将其取出。本发明的方法使得包括胞内葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖和/或葡糖胺或胞外葡糖胺或N-乙酰氨基葡糖在内的产物可以生成。
为了进行葡糖胺和N-乙酰氨基葡糖合成，使用大肠杆菌pET表达系统对不同基因进行超表达。基因表达通过IPTG和乳糖诱导。IPTG的成本使得葡糖胺的生产非常昂贵。因此，理想的情况是从发酵法中消除使用IPTG。乳糖相对低廉且可以用于大规模生产工艺。就乳糖诱导而言，乳糖首先需要被细胞中的β-半乳糖苷酶转化成真正的诱导物异乳糖。了葡糖胺生产菌株诸如2123-54不能将乳糖用作诱导物，因为该菌株对β-半乳糖苷酶呈阴性。这种情况是因通过在LacZ基因座上插入的T7-glmS*54表达盒使lacZ基因起始和破坏所致。
一般来说，可以将数种不同的方法用于消除对IPTG的依赖性。本发明中所示的一种手段在于复原lacZ基因。这可通过将T7-glmS*54表达盒整合在染色体中除lacZ以外的不同位点来达到上述目的。
在galK位点上整合可以保留lacZ基因的完整性。Lac+菌株能够通过乳糖诱导，其昂贵程度远低于PTG。选择galK位点是为了整合T7-glmS*54表达盒，因为所述整合体菌株(stains)也可以是Gal-。据报导在这类菌株中，半乳糖可以用作lac启动子的诱导物。因此，除异乳糖的诱导外，通过乳糖水解产生的半乳糖也可以进一步促进诱导。当将次最佳量的乳糖用于葡糖胺生产过程时，这种情况可能有利。还可以在任意其它位点上进行整合，其中插入不会导致对细胞生长和N-乙酰氨基葡糖或/葡糖胺生产产生任何负面影响。
乳糖诱导受到葡萄糖阻抑。当培养物中存在高水平的葡萄糖时，葡糖胺产生不会出现。然而，一旦葡萄糖被消耗，则乳糖被利用并诱导葡糖胺产生。葡萄糖与乳糖之比影响酶的表达和葡糖胺/N-乙酰氨基葡糖的产生。葡萄糖阻抑通过抑制天然lac操纵子而发生。在有葡萄糖存在的情况下，乳糖转运蛋白(LacY)和β-半乳糖苷酶(LacZ)的合成受到抑制，产生很少的用于诱导T7RNA聚合酶的诱导物分子(异乳糖和半乳糖)。葡萄糖阻抑的详细机理仍然是研究的对象。看起来葡萄糖阻抑在两种水平上起作用。一种阻抑水平是通过cAMP介导的对lac启动子序列的作用。另一种水平在于通过对葡萄糖转运蛋白、即酶IAGlc(由crr基因编码)和IICBGlc(由ptsG基因编码)导致的对乳糖吸收的抑制作用。lacUV5启动子对葡萄糖阻抑不敏感，而阻止乳糖(诱导物)进入细胞可以防止诱导。
可以通过使用最佳生长和诱导方案将葡萄糖阻抑减少到最低限度。还可以导入不同的遗传修饰以便将葡萄糖阻抑减少到最低限度。一种手段在于用认为不会受到葡萄糖抑制的lacUV5启动子取代lac操纵子中的天然lac启动子。还可以通过对crr基因进行遗传修饰将葡萄糖阻抑减少到最低限度。另一种手段在于使lacI阻抑基因之一缺失。在一些葡糖胺和N-乙酰氨基葡糖生产型大肠杆菌菌株中，存在lacI阻抑基因的两个拷贝，一个位于天然lac操纵子中，而另一个位于DE3元件中。lacI基因之一缺失增加了对葡萄糖阻抑的耐受性和葡糖胺/N-乙酰氨基葡糖的产生。由于通过lacY编码的乳糖通透酶将乳糖转运入细胞，所以乳糖诱导可以受到lacY超表达的影响。
不仅可通过合成率、而且可通过细胞代谢和降解率来测定葡糖胺和或N-乙酰氨基葡糖水平，条件是该产物在发酵条件下不稳定。正如本发明公开的，发现葡糖胺在用于大肠杆菌生长的一般pH范围内极不稳定。葡糖胺和或其降解产物还对菌株7107-18产生毒性作用。甚至当在进行细胞接种前将浓度低至20g l-1的葡糖胺在培养基(pH 7.0)中预保温3.5小时的时候也观察到毒性。毒性至少部分是由于起始pH为7.0的培养基中的GlcN降解产物所致。GlcN在较低pH条件下更为稳定，葡糖胺在pH 4.7以下不会降解。
为了研发经济的方法，必须最大限度地合成葡糖胺，同时将产物降解减少到最低限度。此外，在相对低pH在发酵罐内进行的GlcN生产方案不仅可以保存合成的GlcN，该方法还可以通过降低毒性分解产物的浓度而保护细胞。这些有益作用必须与降低的生长率和如此生长的细胞的代谢活性取得平衡。连续的GlcN合成需要细胞中的能量恒定产生，而在这些较低pH条件下缓慢生长的细胞不能够产生所需的足够能量。
一般来说，大肠杆菌在低于6-7的pH条件下生长极慢。这对于分离在低pH条件下表现出改善的生长特征的大肠杆菌突变体是有用的。另一方面，可以在通常在低pH条件下生长的其它细菌和酵母种类中改造增强的葡糖胺合成途经。例如，酿酒酵母在pH 4-pH 5生长最佳。
研发新策略以克服产物降解的问题。通过超表达导致N-乙酰氨基葡糖-6-P合成的葡糖胺-6-PN-乙酰转移酶(GNA1)扩展大肠杆菌中的葡糖胺合成途经。使用这种菌株可以证实N-乙酰氨基葡糖-6-P的产生并且作为N-乙酰氨基葡糖有效分泌至培养基。N-乙酰氨基葡糖在宽pH和温度范围内极为稳定。使用弱酸性条件易于将产物转化回葡糖胺。通过使用这种策略，使N-乙酰氨基葡糖的滴度升高至高于葡糖胺生产菌株中的数倍。也将N-乙酰氨基葡糖作为终产物回收。
数种因素可以导致简单矿质培养基中的高滴度N-乙酰氨基葡糖产量。第一种因素是N-乙酰氨基葡糖的稳定性。它不仅可以保护产物，而且可以避免葡糖胺降解产物的毒性作用。其次，N-乙酰化步骤作为强的力量可以使途经流向这一目的。有趣的是是应注意当NagB酶在没有GlmS和GNA1酶存在的情况下超表达时，它仅起作用至足以提供细胞存活和生长所需的氨基糖的程度。当GNA1酶与NagB共表达时，它导致数克(multi-gram)水平的N-乙酰氨基葡糖产生，从而证实了乙酰化反应在该途经中的驱动力。第三，N-乙酰氨基葡糖合成利用了乙酰辅酶A作为乙酰基供体。尽管可以将其看作细胞的一类代谢负荷，但是它实际上ke避免乙酸酯形成，且由此防止因乙酸酯累积在细胞培养物中而产生的副作用。还可以通过对乙酸酯合成中涉及的酶进行遗传修饰将乙酸酯的形成减少到最低限度。
NagB和GNA1的组合提供了从果糖-6-P到N-乙酰氨基葡糖-6-P的目的途经。不同于使用谷氨酰胺和果糖-6-P作为底物的GlmS，NagB酶催化将铵直接合成N-乙酰氨基葡糖-6-P。此外，NagB蛋白约为30kDa，远小于GlmS蛋白(约70kDa)。发现与GlmS蛋白相比，当在大肠杆菌中超表达时，NagB蛋白的较大部分位于可溶性蛋白部分中。
GlmS酶一般受到强产物抑制。产物抗性GlmS酶的应用在升高葡糖胺滴度且还可能在升高N-乙酰氨基葡糖滴度方面起重要作用。通过体外诱变产生产物抗性GlmS突变体。还可以从天然中分离这类突变体。通过证实天然枯草芽孢杆菌GlmS的产物抗性来解释上述情况。
下面是葡糖胺和N-乙酰氨基葡糖最佳生产的示例方案。它们仅是本发明一些可操作的和优选实施方案的实施例，且不解释为本发明唯一的实施方案。实施例部分中详细描述了烧瓶培养合发酵罐培养的数种优选发酵方案和发酵法参数。
下面是对本发明乳糖诱导的葡糖胺发酵法的常见方案的描述 菌株重组大肠杆菌 诱导细胞密度达到10g/l后加入30g/l乳糖(作为35％的进料在10小时内缓慢加入)。在该过程暂停葡萄糖进料以防止葡萄糖的抑制作用。加入所有乳糖后，恢复葡萄糖进料。
进料50％葡萄糖与5μgFeSO4-7H2O/g葡萄糖和0.33μgMnSO4-H2O/g葡萄糖，以限定浓度加入葡萄糖。
发酵时间72小时 发酵方式补料分批，需要时添加50％的萄糖，维持限定的葡萄糖浓度接种物按体积计5％ pH 生长过程中为6.9，然后诱导后为6.7，用10N的NH4OH控制温度30℃，诱导后切换至25℃ 氧 20％以上溶解的O2，通过搅拌控制 通气0.5-1vvm 培养基

在上述培养基中，在灭菌前加入除葡萄糖(逐步添加)和Fe、Zn、Mn、Cu、B、Mo、Co微量元素(灭菌后添加)外的所有成分。
下面是对本发明N-乙酰氨基葡糖发酵法的常见方案的描述 菌株重组大肠杆菌诱导 细胞密度达到15-20g/l后在单点添加(single point addtion)中加入的5-10g/l乳糖(作为10小时期限内缓慢充入的35％进料)。在该过程中不暂停葡萄糖进料，但稳定在6.5g l-1小时-1下保持稳态(基于起始体积)。
进料65％葡萄糖，不进行任何改变，以限定浓度使葡萄糖进料。
发酵时间60-72小时 发酵方式补料分批，其中需要添加65％的葡萄糖，维持限定的葡萄糖浓度 接种物 按体积计2.5％-5％ pH 全程6.9，用12N的NH4OH控制 温度37℃，自始至终 氧 20％以上的溶解的O2，通过搅拌控制 通气0.5-1vvm 培养基

在上述培养基中，在灭菌前加入除葡萄糖(逐步添加)外的所有成分。在灭菌后起始pH接近3.0并在接种前用NH4OH调节至6.9。
本发明的方法进一步包括收集产物的步骤，该产物可以为胞内葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖和/或葡糖胺和/或胞外葡糖胺和/或胞外N-乙酰氨基葡糖。收集的一般步骤可以包括回收(下文定义)产物的步骤且还可以包括根据需要纯化产物的步骤。下文提供了对回收和纯化方法的详细讨论。为了＂收集(collect)＂，诸如葡糖胺或N-乙酰氨基葡糖这类产物可以单纯指从发酵生物反应器中收集产物，且不需要包含分离、回收或纯化的附加步骤。例如，收集步骤可以指从生物反应器中取出全部培养物(即微生物和发酵培养基)、从生物反应器中取出含有胞外葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖的发酵培养基，和/或从生物反应器中取出含有胞内葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖和/或葡糖胺的微生物。本文所用的术语＂回收(recover)＂指的是将葡糖胺或N-乙酰氨基葡糖溶液的溶解性条件降至葡糖胺或N-乙酰氨基葡糖分别成为不溶和从溶液或中沉淀或结晶。这些步骤后可以进一步进行纯化步骤。优选回收基本上纯形式的葡糖胺和N-乙酰氨基葡糖。本文所用的＂基本上纯＂指的是允许有效利用葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖作为商业销售的营养化合物的纯度。在一个实施方案中，葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖产物优选分离自生产生物体和其它发酵培养基组成成分。进行这类分离的方法如下所述。
优选通过本发明方法从微生物和/或发酵培养基中收集或回收至少约1g/L的产物(即葡糖胺、N-乙酰氨基葡糖、葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸和/或N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸)。更优选通过本发明方法回收至少约5g/L，且甚至更优选至少约10g/L，且甚至更优选至少约20g/L，且甚至更优选至少约50g/L，且甚至更优选至少约75g/L，且甚至更优选至少约100g/L，且甚至更优选至少约120g/L的产物和至少约1g/L-至少约120g/L之间的任意以整数增加的浓度的产物(即2g/L、3g/L等)。在一个实施方案中，回收约1g/L-至少约120g/L的产物。
一般来说，本发明方法生产的大部分葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖是胞外的。可以通过常规方法、诸如通过过滤或离心从发酵培养基中去除微生物。在一个实施方案中，收集或回收步骤包括从发酵培养基中纯化葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖。可以通过常规方法、诸如色谱法、提取、结晶(例如蒸发结晶)、膜分离、反渗透和蒸馏从不含细胞的发酵培养基中回收葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖。在一个优选的实施方案中，通过结晶从不含细胞的发酵培养基中回收葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖。在另一个实施方案中，回收产物的步骤包括浓缩胞外葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖的步骤。
在一个实施方案中，葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖和/或葡糖胺累积在胞内，回收产物的步骤包括从微生物中分离葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖和/或葡糖胺。例如，可以通过下列步骤收集产物用不降解产物(葡糖胺、N-乙酰氨基葡糖、葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸和/或N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸)的方法裂解微生物细胞，离心裂解物以除去不溶性细胞碎片且然后通过如上所述的常规方法回收产物葡糖胺、N-乙酰氨基葡糖、葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸和/或N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸。
本文所述的基因修饰微生物中的起始胞内产物为葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖和/或葡糖胺。一般认为在从微生物中输出的过程中磷酸化中间体去磷酸化，这很可能是由于在微生物的壁膜间隙内存在碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、糖磷酸酶或氨基糖磷酸酶。在本发明的一个实施方案中，在从细胞输出前或该过程中用天然存在的磷酸酶使葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸和/或N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸去磷酸化以有利于所需产物葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖的产生。在该实施方案中，在细胞中扩增重组提供的磷酸酶活性或用磷酸酶处理发酵培养基的需求得到避免。在另一个实施方案中，通过包括、但不限于内源性磷酸酶基因的遗传修饰或通过对微生物进行重组修饰以表达磷酸酶基因的方法来增加生产微生物中磷酸酶的水平。在另一个实施方案中，在使葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸和/或N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸释放入培养基中后，诸如当如上所述裂解细胞时，用磷酸酶处理收集的发酵培养基。
如上所述，本发明的方法生产了大量胞外葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖。特别是该方法生产了胞外葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖，使得大于约50％的总葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖是胞外的，更优选大于约75％的总葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖是胞外的，且最优选大于约90％的总葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖是胞外的。通过本发明的方法生产的胞外葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖浓度大于约1g/l、更优选大于约5g/l、甚至更优选大于约10g/l、且甚至更优选大于约20g/L、且甚至更优选大于约50g/l、且甚至更优选大于约75g/l、且甚至更优选大于约100g/l、且甚至更优选大于约120g/l。
本发明的另一个实施方案涉及生产N-乙酰氨基葡糖的新方法。该方法包括获得含有溶解的N-乙酰氨基葡糖(通过诸如如上所述的发酵法生产)的发酵肉汤，并从所述发酵肉汤中回收含有N-乙酰氨基葡糖的固体。本发明通过发酵法生产的N-乙酰氨基葡糖作为该发酵法产物的N-乙酰氨基葡糖。换句话说，培养细胞的发酵方法使得通过细胞产生N-乙酰氨基葡糖。术语回收指的是使N-乙酰氨基葡糖溶液的溶解条件降至N-乙酰氨基葡糖变得不溶并沉淀出溶液或结晶。首先可以通过除去细胞物质和细菌内毒素处理含有N-乙酰氨基葡糖、残余培养基和细胞物质的发酵罐肉汤。在除去细胞物质前，通过使用不同方法裂解发酵肉汤中的细胞，所述方法包括、但不限于超声处理、渗透性破坏、研磨(grinding)/成珠(beading)、弗氏压滤法(FrenchPress)、匀浆、爆发式减压(explosive decompression)、溶剂处理、临界点提取和冻融。可以通过微孔过滤或超滤或其组合除去细胞物质和内毒素。本领域中公知的其它技术包括离心和渗滤。在除去细胞物质后，可以测试溶液以验证充分除去了内毒素。
在从发酵肉汤中回收含有N-乙酰氨基葡糖的固体前，可以给发酵肉汤脱色和/或去灰。如果进行这些过程，那么首先进行其中之一。然而，通过首先进行去灰步骤使得对脱色的需求减少，这是因为通过诸如用使用离子交换树脂去灰过程去除了颜色而导致。脱色步骤可以通过多次N-乙酰氨基葡糖结晶、活性炭处理和层析脱色来进行。层析脱色的应用可以包括使用离子交换树脂(不用于离子交换，仅用于颜色吸收)、Dow Optipore SD-2树脂和基于传统硅石的层析介质。
可以通过使发酵肉汤接触离子交换树脂进行去灰步骤，可以包括使发酵肉汤接触阴离子交换树脂和/或阳离子交换树脂。在一个实施方案中，使用包含阴离子和阳离子交换树脂的混合床。可以用强酸或弱酸离子交换树脂除去阳离子，而弱碱树脂因其增强的除去发酵中产生的有机酸的能力而被优选。一般选择在除去阴离子前除去阳离子，因为来自阳离子交换器(cation exchanger)中的流出物可以降低的pH，而来自阴离子交换器(anionexchanger)的流出物具有升高的pH。已证实N-乙酰氨基葡糖在高pH具有差向异构化的趋势，从而产生可测定水平的N-乙酰甘露糖胺。用强或弱碱树脂除去阴离子。所得纯化的溶液几乎不携带离子物质，而主要由水、N-乙酰氨基葡糖和来自发酵过程中未消耗的发酵罐进料的碳水化合物组成。这种中间体产物的N-乙酰氨基葡糖纯度一般大于流出物总干固体含量的约90％。如果需要进一步磨光(polish)以完成去灰，那么可以应用混合床离子交换步骤。在这种情况中，阳离子和阴离子树脂在离子交换器中所占比例相同并使已大部分去灰的发酵罐肉汤通过该床。尽管混合床离子交换也可以取代单独的阳离子和阴离子交换器，且尽管这还有利于使将肉汤pH改变的量级减至最小，操作分离的床更为便利，这是因再生前需要分离离子交换树脂，该过程中树脂丢失造成污染的危险升高。
从发酵肉汤中回收含有N-乙酰氨基葡糖的固体的步骤可以包括从发酵肉汤中沉淀和/或结晶含有N-乙酰氨基葡糖的固体。一般来说，在回收步骤前，浓缩发酵肉汤以提供较高浓度的溶解以便使N-乙酰氨基葡糖沉淀或结晶。浓缩步骤可以在真空(即低于大气压)或通过膜分离进行。在优选的实施方案中，浓缩步骤在约40℃-约75℃的温度，且更优选在约45℃-约55℃的温度进行。进行浓缩步骤一般是为了使发酵肉汤中固体含量至少达到约30％固体、更优选至少约40％固体且更优选至少约45％固体。
浓缩后，一般冷却发酵肉汤。这类冷却可以是被动的，即简单地使肉汤达到室温；或其可以是主动的，诸如通过使用冷冻干燥机、喷雾冷凝器、造粒机(priller)、刨片机(flaker)和掺合机(blender)或安装了冷却套管的挤压机(extruder)。单独冷却浓缩肉汤的步骤足以回收含有N-乙酰氨基葡糖的固体。例如，可以将发酵肉汤冷却至约-5℃-约45℃、约-5℃-约室温或冷却至约室温。
从发酵肉汤中回收含有N-乙酰氨基葡糖的固体还可以包括给发酵肉汤接种N-乙酰氨基葡糖结晶以通过存在的结晶生长而促进回收。可以通过发酵肉汤中的成核作用提供结晶，或通过外部提供N-乙酰氨基葡糖晶体。在第一种情况中，将发酵肉汤浓缩和/或冷却至一些成核作用出现是通过使过饱和溶液达到不稳定状态，但然后较缓慢地冷却以避免另外的成核并促进存在的结晶生长来进行。另一方面，可以将通过任意方法产生的N-乙酰氨基葡糖晶体导入发酵肉汤作为晶种。
可以通过使肉汤中的N-乙酰氨基葡糖接触水混溶性溶剂促进从发酵肉汤中回收含有N-乙酰氨基葡糖的固体。已经发现N-乙酰氨基葡糖极不溶于水混溶性溶剂中溶解度很低，所述溶剂诸如异丙醇(IPA)、乙醇、甲醇、丙酮、四氢呋喃、二甲亚砜、二甲基甲酰胺、二噁烷和乙腈。因此，通过将这类水混溶性溶剂导入肉汤，N-乙酰氨基葡糖变得可溶性降低且可进一步回收。
本发明的回收方法可以作为发酵罐肉汤的分批或连续结晶进行。可以通过滤器或离心连续收集在浓缩过程中形成的晶体，而使母液再循环用于进一步浓缩，或所述晶体可以与母液一起保留至固体水平需要取出它们。
在回收含有N-乙酰氨基葡糖的固体后，可以通过诸如离心或过滤从发酵肉汤中分离该固体。可以通过本领域技术人员公知的各种技术、诸如真空干燥来干燥所得的固体饼，而这类步骤优选在低温进行以防止降解和形成颜色。最终干燥的产物一般至少约为50％干燥固体、更优选至少约70％干固体，且更优选至少约85％干燥固体。在干燥前，可以用诸如如上所述的水混溶性溶剂洗涤回收的固体。该洗涤步骤使产物稳定，例如用来防止形成颜色。
在另一个实施方案中，通过将所述固体溶解并在第二个回收步骤中回收该固体来进一步纯化回收的含有N-乙酰氨基葡糖的固体。第二次回收步骤可以包括任意上述的回收工艺步骤。对第二个回收循环的需求根据所需终产物纯度和起始纯度来决定。
可以使用上述各种回收方法生产高纯度的N-乙酰氨基葡糖。本发明的方法特别可以生产至少约70％纯、更优选至少约90％纯且更优选至少约99％纯的N-乙酰氨基葡糖。
优选各种回收方案。例如，可以将不含细胞的肉汤用于生产固体N-乙酰氨基葡糖而不需进一步除去离子，该方案通过下列步骤进行用活性炭脱色；在真空蒸发器中浓缩至干固体约45％以上，所述真空蒸发器可具有多级能量效率的(例如优选的条件为在约600mm Hg的真空下液体温度45℃-55℃)；给温热的浓缩物接种纯N-乙酰氨基葡糖；和在搅拌的同时使其冷却。过滤或离心冷却的肉汤并回收固体饼。可以将回收的固体进行真空干燥并用作生产纯N-乙酰氨基葡糖或葡糖胺盐的中间体；且如果N-乙酰氨基葡糖纯度为87％以上，那么可以由单结晶生产纯的N-乙酰氨基葡糖。作为接种、冷却和从母液中回收的另一种选择，通过冷却使过饱和液流固化。合适的冷却装置包括冷冻干燥机、喷雾冷凝器、造粒机、刨片机和掺合机或安装了冷却套管的挤压机。可以进一步干燥所得固体。
在另一个优选的回收实施方案中，可以将回收的N-乙酰氨基葡糖再溶于水而无需预先干燥，并对其进行第二次循环浓缩、接种、冷却和固体收集。用水混溶性溶剂洗涤收集的固体并在真空中干燥。对双结晶(doublecrystallization)的需求根据N-乙酰氨基葡糖的起始纯度来决定。当纯度即干固体百分比为87％以上时，需要单结晶(single crystallization)。当纯度为70％时，需要双结晶。
另一个优选的回收实施方案为通过单结晶产生纯N-乙酰氨基葡糖，它通过使用已经在达70℃的温度脱色并浓缩的物质，或通过在70℃将部分纯化的物质再溶解并将其冷却至室温来进行。用水混溶性溶剂洗涤回收的固体并干燥。
在另一个优选的回收实施方案中，通过用应用包括阳离子交换树脂在内的层析介质在模拟移动床层析系统(simulated moving bed chromatographicsystem)中分离来进一步纯化已经去灰的不含细胞的发酵罐肉汤。一旦获得约98％纯的液流，则真空浓缩生产了用于下述稳定化处理的物质。
在另一个优选的回收实施方案中，为了获得对具有高纯度且颜色稳定的N-乙酰氨基葡糖的高回收率，使用水混溶性溶剂，所述N-乙酰氨基葡糖在105℃干燥时由于分解而表现出低于1％的重量减轻。通过以相对高纯度(例如通过脱色和去灰获得93％的纯度)的N-乙酰氨基葡糖作为开始，能够通过真空浓缩除去水且然后通过加入水溶性溶剂沉淀其它的纯产物。用含水的混容型溶剂处理沉淀产物的过程有利于随后的干燥步骤，其中可以防止残余的水强化降解反应。
本发明的另一个实施方案涉及由N-乙酰氨基葡糖生产葡糖胺的方法。为了生产葡糖胺作为终产物，可以水解N-乙酰氨基葡糖以产生葡糖胺作为终产物。可以使用发酵中产生的N-乙酰氨基葡糖直接进行水解而不需首先将其从发酵中分离；或可选在从发酵中分离N-乙酰氨基葡糖，诸如使用如上所述的任意方法回收N-乙酰氨基葡糖后对其进行水解。此外，可以使用本发明该方法中任意其它可利用的N-乙酰氨基葡糖来源。在本发明前，通过使用有机乙酰化试剂使葡糖胺乙酰化来制备N-乙酰氨基葡糖，或通过直接对壳多糖进行酶水解来生产N-乙酰氨基葡糖，这些方法与传统上用于由壳多糖生产葡糖胺的酸水解法类似。因此，不需要从N-乙酰氨基葡糖生产终产物葡糖胺的逆向反应。
因此，本文所述的N-乙酰氨基葡糖来源不需要指N-乙酰氨基葡糖纯的来源，而是含有一定量用来转化成葡糖胺的N-乙酰氨基葡糖的任意来源(固体或溶液)。可以由通过如上所述发酵方法产生的N-乙酰氨基葡糖生产葡糖胺盐酸盐且然后如上文具体所述从发酵肉汤中回收或该方法可以使用通过发酵生产的N-乙酰氨基葡糖直接作为发酵罐浓缩物，该浓缩物已经除去了细胞物质，但没有除去残余的颜色或离子成分。另一方面，N-乙酰氨基葡糖的任意其它适宜来源可以用于本方法，所述来源包括通过其它方法诸如壳多糖的酶水解生产的N-乙酰氨基葡糖。在一个优选的实施方案中，由N-乙酰氨基葡糖源生产葡糖胺盐酸盐，所述的N-乙酰氨基葡糖源中的总固体中包括至少约30％的N-乙酰氨基葡糖，更优选该来源中的总固体中包括至少约35％，且更优选至少约40％，且更优选至少约45％，且更优选至少约50％，且更优选至少约55％，且更优选至少约60％，且更优选至少约65％，且更优选至少约70％，且更优选至少约75％，且更优选至少约80％，且更优选至少约85％，且更优选至少约90％，且更优选至少约95％的N-乙酰氨基葡糖源。一般来说，由包括至少约1％-100％之间任意整数百分比(即1％、2％、3％、...98％、99％、100％)的N-乙酰氨基葡糖的N-乙酰氨基葡糖源生产葡糖胺盐酸盐。将N-乙酰氨基葡糖作为固体或作为在水溶液或含水低沸点伯醇或仲醇中的溶液用于反应，所述醇包括、但不限于乙醇、甲醇、正-丙醇、异丙醇、正-丁醇或仲-丁醇。在一个优选的实施方案中，N-乙酰氨基葡糖源包括至少约40％N-乙酰氨基葡糖作为该来源中总干固体的百分比。
在一个实施方案中，可以使用在酸性和加热条件下进行水解来由N-乙酰氨基葡糖源生产葡糖胺盐酸盐。酸水解技术是本领域中公知的。本发明提供了将N-乙酰氨基葡糖转化成葡糖胺盐酸盐的该化学反应的具体应用。水解反应释放1摩尔的乙酸且对转化成葡糖胺盐酸盐的每摩尔N-乙酰氨基葡糖而言各消耗各1摩尔的盐酸和水。水、盐酸和N-乙酰氨基葡糖的许多组合成功地进行该反应，由此能够使用无水盐酸、干N-乙酰氨基葡糖和水作为反应剂，或将水引入N-乙酰氨基葡糖和/或盐酸。使用过量水和盐酸进行该反应。重要参数为反应时间和温度以及残余的盐酸浓度。在转化完全后冷却该反应体系，而且过量盐酸的残余浓度及最终温度确立了葡糖胺盐酸盐产物的溶解度。过度水平的溶解度导致葡糖胺盐酸盐的每次回收率(per-pass recovery)降低并降低产率。葡糖胺可以降解且导致这种情况的反应发生在溶液中。反应速率与温度、溶液中N-乙酰氨基葡糖和/或葡糖胺的浓度和溶液中盐酸的浓度相关。成功的条件包括60℃-100℃的温度，更优选70℃-90℃。盐酸溶液与N-乙酰氨基葡糖固体可接受的重量比在1:1-5:1的范围，优选3:1且更优选2.5:1。盐酸溶液的可接受浓度为10-40％w/w，且更优选约10％w/w-37％w/w。可以用无水盐酸取代含水盐酸，条件是对稀释液的加热进行控制且存在适当溶液以便完全溶解N-乙酰氨基葡糖。由于所有组合均成功，添加顺序和添加时的温度的重要程度较低。进行该反应的时间随反应温度和酸浓度改变，并且范围从高温浓酸条件时的10分钟到低温稀酸时的3小时以上(例如至多24小时)。将该溶液冷却至4℃以沉淀葡糖胺盐酸盐。高温和低温均是可接受的(例如约-5℃-约40℃之间的任意温度)，但将4℃选作在适宜商业化条件下使水解溶液中的残余葡糖胺盐酸盐最少的适宜温度。对更不纯的水解溶液、即葡糖胺盐酸盐的相对干燥固体组成较低的溶液而言，需要较缓慢的冷却速率和在结束温度的额外保留时间以使水解溶液重新变为饱和。溶解搅拌应缓和，但不克服杂质对结晶过程造成的阻碍。
由于使用过量盐酸进行水解反应，所以冷却并去除葡糖胺盐酸盐后的水解溶液具有再次用于水解的能力。由于每次水解循环中乙酸副产物浓度增加且反应剂氯化氢耗尽时，水解溶液的活性变得较低且需要较长时间才能完成反应。能够通过提供气态形式的氯化氢并溶解该反应剂来补充氯化氢，而从每次反应循环中增加的乙酸副产物造成单纯水解产物溶液再循环的阻碍增加。可以通过在水解步骤前、过程中或之后经添加伯醇或仲醇酯化乙酸来克服上述阻碍。乙酸与醇形成酯，然后可以通过在N-乙酰氨基葡糖水解前、过程中或之后对所述酯进行蒸馏、急骤蒸发或真空蒸发将其除去。
可以将N-乙酰氨基葡糖与再循环的水解母液连续掺和以确保其溶解或保持溶解。随后加入无水盐酸取代物，这使得该溶液的温度升高以启动水解反应并维持足够的残余酸浓度，从而将葡糖胺盐酸盐的溶解度减小到最低限度。将压力控制在高于大气压并选择升温以允许使用最少的反应器保留时间。在N-乙酰氨基葡糖完全转化成葡糖胺盐酸盐后，冷却该反应体系并通过过滤或离心回收葡糖胺盐酸盐。使滤液或浓缩液通过冷却器再循环至达到目标温度即约4℃并回收大部分葡糖胺盐酸盐。然后使浓缩液或滤液再循环以便重新使用。一同补充反应消耗的足量水和N-乙酰氨基葡糖。通过下列方式除去如乙酸这类反应副产物的累积连续净化母液；从净化液流中分离残余的盐酸并使其返回反应体系以便随后重新使用；或用伯醇或仲醇酯化如乙酸这类累积的反应副产物并将其作为酯类干燥。
有关本文所述的水解方法中回收葡糖胺的详细内容与上述的N-乙酰氨基葡糖回收相似，并将它们引入本文作为对回收葡糖胺的参考。下面和实施例部分中讨论了葡糖胺回收的一些优选方面。
过滤或离心可回收固体葡糖胺盐。以N-乙酰氨基葡糖为基准，回收的摩尔产率为50％-90％。醇洗涤和干燥后的葡糖胺纯度一般在96％-100％。从离心机或过滤仪中回收的湿饼(wet cake)用醇洗涤以便将产物在干燥过程中成块的倾向减小到最低限度。然后在真空干燥器或Wyssmont型干燥器中在真空条件下干燥产物至干燥损耗达产品要求。
能够以回收的N-乙酰氨基葡糖水解过滤-饼或离心-饼开始，可以对其进行洗涤或不洗涤。将所述饼在室温和搅拌下溶于水至浓度约为25％(w)。加入诸如氢氧化钠或氢氧化钾这类碱以使pH达到2.5-4。一旦pH得到调节，则用活性炭处理完全溶解的溶液。例如，在分批方式中，每克葡糖胺盐酸盐中加入0.02克Darco G-60或等量的活性炭并最少混合30分钟。过滤该混合物以除去活性炭。然后用约等于重结晶的葡糖胺盐酸盐的量的水冲洗活性炭以洗脱任何活性炭和过滤设备上所带的葡糖胺盐酸盐。另一方面，使该溶液通过活性炭的颗粒填充的床，随后通过洗脱步骤回收夹带的葡糖胺盐酸盐，此后使消耗的活性炭再生或将其弃去。
然后在真空和搅拌下将澄清溶液加热至50℃。使用50-60cm Hg真空。通过蒸发除去约一半体积并通过过滤、离心或其它回收重结晶的葡糖胺盐酸盐的适宜方式从剩余的溶液中回收固体。使剩余的溶液返回用于进一步回收。收集固体、用水混溶性溶剂冲洗并干燥，所述的水混溶性溶剂包括、但不限于甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、仲丁醇、丙酮、四氢呋喃、二甲亚砜、二甲基甲酰胺或二噁烷。
当从单次使用的水解产物中重结晶时，进一步蒸发液体至可见固体且估计体积为初始体积的约20-30％。将等体积的水混溶性溶剂作为液体沉淀剂添加，通过过滤、离心或其它回收重结晶的葡糖胺盐酸盐的适宜方法从所得溶液中回收固体。然后将剩余溶液冷却至例如4℃并过滤以回收剩余的葡糖胺盐酸盐。
当从多次使用的水解产物中重结晶时，将随后循环中活性炭处理过的水解产物加入到当前循环的回收溶液中以补充由于蒸发和固体回收除去的体积。然后通过蒸发除去约一半体积并重复该循环。
重结晶的葡糖胺盐酸盐纯度取决于因中和过量酸而产生的盐的量和从第一次水解产物结晶步骤中带来的其它杂质。当回收的葡糖胺盐酸盐不满足纯度要求时，通过用单次使用的水解重结晶步骤取代多次使用的水解重结晶步骤来控制上述情况。将混溶溶剂沉淀过程中回收的所得沉淀的葡糖胺盐酸盐再溶解并引入作为随后一系列重结晶的组成部分。
回收的葡糖胺盐酸盐湿饼应含有醇以便将产物成块和在干燥过程中颜色变深的倾向减少到最低限度。然后将其在真空干燥器或Wyssmont型干燥器中在真空条件下干燥至干燥损耗满足产品要求。
在一个实施方案中，水解步骤包括下列步骤(a)通过将N-乙酰氨基葡糖源与盐酸溶液或再循环的水解母液在加热条件下合并来水解N-乙酰氨基葡糖源以产生含有葡糖胺盐酸盐的溶液；(b)冷却(a)的溶液以沉淀葡糖胺盐酸盐；和(c)从(b)中回收沉淀的含有葡糖胺盐酸盐的固体。在一个方面中，水解步骤可以通过下列步骤进行连续将N-乙酰氨基葡糖源与盐酸溶液或再循环的水解母液掺合以维持N-乙酰氨基葡糖源作为溶解的溶液，随后在加热条件下向(a)的溶液中添加无水盐酸以启动水解并将N-乙酰氨基葡糖转化成葡糖胺盐酸盐。在另一个方面中，再循环的水解母液为回收步骤(c)中沉淀的葡糖胺盐酸盐后剩余的水解溶液，其中在进行水解步骤前、过程中或之后向水解溶液中添加伯醇或仲醇。在该方面中，可以将冷却步骤进行至溶液约为-5℃-约40℃。
回收步骤可以包括(i)收集沉淀的含有葡糖胺盐酸盐的固体；(ii)用水混溶性溶剂(包括、但不限于甲醇、异丙醇、乙醇、乙腈、丙酮、四氢呋喃、二甲亚砜、二甲基甲酰胺和二噁烷)洗涤含有葡糖胺盐酸盐的固体；和(iii)干燥含有葡糖胺盐酸盐的固体。
在另一个方面中，回收步骤可以包括(i)收集沉淀的含有葡糖胺盐酸盐的固体；(ii)将来自(i)的固体溶于水而形成溶液；(iii)将(ii)溶液的pH调节至约2.5和4(例如通过添加碱、通过洗涤以除去酸、通过离子交换介质或任意其它合适的方法)；(iv)使(iii)的溶液接触活性炭以便给含有葡糖胺盐酸盐的固体脱色；(v)从(iv)的溶液中除去活性炭；和(vi)使葡糖胺盐酸盐从(v)的溶液中结晶。在该方面中，结晶步骤包括在低于约70℃的温度且更优选低于约50℃的温度浓缩葡糖胺盐酸盐。在一个方面中，结晶步骤包括在低于大气压的条件下浓缩葡糖胺盐酸盐。在另一个方面中，该方法进一步包括使结晶步骤(vi)后剩余的溶液再循环到随后的回收过程的步骤(i)或到随后的结晶步骤(例如重结晶)。
在另一个方面中，当将N-乙酰氨基葡糖源悬浮于含水的低沸点伯醇或仲醇中时，该水解方法可以在冷却溶液前进一步包括另外的步骤，即在水解后或再循环水解溶液以便重新使用前去除与醇形成的乙酸酯。通过包括、但不限于在低于大气压下蒸馏、急骤蒸发和浓缩的方法除去乙酸酯。在该实施方案中，水解步骤在约60℃-约100℃的温度进行，且优选在一个大气压和溶液的沸点进行。
在另一个方面中，当在酸与N-乙酰氨基葡糖之比相对高(例如约3:1-约5:1)和温度相对低(例如低于约80℃)的条件下进行水解时，产生的葡糖胺晶体质量可以足够高以避免对重结晶葡糖胺的需求。在该实施方案中，单结晶步骤后，如上文所述用水混溶性溶剂洗涤，且然后是如上所述的干燥步骤。
实际上，本文所述的任意水解和回收方法可以进一步包括用如本文上述的水混溶性溶剂洗涤从步骤(vi)结晶的葡糖胺盐酸盐的步骤，随后是干燥步骤。在一个方面中，在低于约70℃的温度将结晶的葡糖胺盐酸盐干燥约6小时以下，而在另一个实施方案中，低于约50℃的温度将结晶的葡糖胺盐酸盐干燥约3小时以下。干燥步骤可以在有或没有真空和有或没有空气或惰性气体通风存在的情况下进行。
将N-乙酰氨基葡糖转化成葡糖胺的另一种方法在于使用酶水解步骤。N-乙酰氨基葡糖在发酵肉汤中或回收后的水解的酶促方法描述在实施例部分。三种类型的酶为候选物N-乙酰氨基葡糖-6-P脱乙酰酶(EC 3.5.1.25，NagA)、N-乙酰氨基葡糖脱乙酰酶(EC 3.5.1.33)和壳多糖脱乙酰酶。
将Fujishima等所述的脱乙酰酶鉴定为N-乙酰氨基葡糖-6-P脱乙酰酶(EC 3.5.1.25，NagA)。对N-乙酰氨基葡糖6-P的亲合力和效力远高于对N-乙酰氨基葡糖的亲合力和效力。然而，纯化自大肠杆菌的N-乙酰氨基葡糖-6-P脱乙酰酶对N-乙酰氨基葡糖无作用。
众所周知N-乙酰氨基葡糖-6-P脱乙酰酶(EC 3.5.1.25，NagA)的作用是将N-乙酰氨基葡糖-6-P转化成葡糖胺-6-P，这是N-乙酰氨基葡糖、N-乙酰甘露糖胺和神经氨酸的细胞代谢中必不可少的步骤。一般来说，这类酶如重组大肠杆菌NagA蛋白对非磷酸化的N-乙酰氨基葡糖没有活性。测定许多不同生物体中编码N-乙酰氨基葡糖6-P脱乙酰酶(nagA基因)的DNA序列。并不了解是否存在仅对N-乙酰氨基葡糖具有活性的脱乙酰酶(由此不同于NagA)。
壳多糖脱乙酰酶(EC 3.5.1.41)催化壳多糖中的N-乙酰氨基葡糖单位的脱乙酰化，从而产生脱乙酰壳多糖。通常通过使用在N-乙酰基中具有放射性标记的底物乙二醇壳多糖(部分O-羟乙基化的壳多糖)测定壳多糖脱乙酰酶活性。该酶还对mycrocrystalline壳多糖和羧甲基壳多糖(可溶性衍生物)起作用。然而，据报导来自鲁氏毛霉(Mucor rouxii)的壳多糖脱乙酰酶不会使N-乙酰氨基葡糖单体或2-3寡聚体脱乙酰化(Araki和Ito，1975.Eur.J.Biochem.5571-78，将该文献的全部内容引入本文作为参考)。尽管没有证明通常的壳多糖脱乙酰酶使葡糖胺单体脱乙酰化，但是可以从天然分离或在体外产生具有这类活性的壳多糖脱乙酰酶变体。
许多酰基转移酶可以从底物中除去乙酰基并将其转移到成另一种底物(Konecny等)。尽管没有证明这类酶可以使N-乙酰氨基葡糖脱乙酰化，但是可以从天然分离或在体外产生具有这类活性的酰基转移酶变体。
可以使用具有天然酰基转移酶的生物体或具有重组酰基转移酶的生物体所含的或由其分离的酰基转移酶对N-乙酰氨基葡糖进行脱乙酰化。可以通过随机诱变或定向诱变和/或通过蛋白质改造改进重组酰基转移酶。
在应用酰基转移酶或脱乙酰酶技术将N-乙酰氨基葡糖转化成葡糖胺的过程中，由于已知葡糖胺在溶液中不稳定，存在产物通过各种机制降解的可能性，尤其是当外部低pH环境可以另外使氮原子质子化时更是如此。
尽管单纯pH降低适合于酸水解，但是它成为酶催化中的问题。酶在暴露于未缓冲或非中性pH环境时更可能变性。此外，高盐负荷通常与酶变性相关。
因此，提出使用公知的酶固定技术(下述)来固定酶构象并减少暴露于高离子浓度和的影响和减少昂贵的酶消耗。此外，提出利用葡糖胺盐酸盐相对于诸如乙酸钠、乙酸钙、氯化钠和氯化钙这类其它盐而言较低的溶解度。
通过为氯化钠或氯化钙水溶液和N-乙酰氨基葡糖提供适宜的酶，平衡反应进行至形成高可溶性的乙酸钠或乙酸钙，将其用作酶的pH缓冲剂。该反应还产生相对不溶性、但稳定的葡糖胺盐酸盐，该盐可以通过蒸发浓缩或使用液体沉淀剂使其从溶液中结晶或沉淀。当葡糖胺从溶液中分离时，它将平衡反应拉向正向，从而又消耗了N-乙酰氨基葡糖。剩余的母液含有残余的溶解葡糖胺盐酸盐、乙酸钠或乙酸钙、氯化钠或氯化钙和少量未反应的N-乙酰氨基葡糖。用作为液体沉淀剂的醇处理该母液使可溶性乙酸钠或乙酸钙与可溶性较低的葡糖胺盐酸盐、氯化钠或氯化钙和N-乙酰氨基葡糖分离，所述母液可以再循环至酶转化过程开始。
将N-乙酰氨基葡糖通过酶的作用转化成葡糖胺盐酸盐的另一种手段在于使用催化性的酶通过将乙酰基从N-乙酰氨基葡糖转移到加入的醇上使醇酯化。除去水解过程中形成的酯驱动正向反应以消耗N-乙酰氨基葡糖，从而生成葡糖胺游离碱。
酶促水解中形成的葡糖胺游离碱的稳定可以通过使其与氯化物盐例如氯化钠溶液的混合，并将混合物通过氢形式的阳离子交换树脂，其中盐的阳离子与氢离子交换，且形成稳定的葡糖胺盐酸盐，而离子交换树脂保留了盐的阳离子。按照相同方式，可以所选择的任意各种盐与葡糖胺游离碱掺合，所述盐包括、但不限于磷酸盐。硫酸盐。碘化物和硫酸氢盐，在所述盐通过阳离子交换柱时被转化成已知的稳定酸式盐，包括(葡糖胺)2硫酸盐-(NaCl)2、(葡糖胺)2硫酸盐-(KCl)2、(葡糖胺)2硫酸盐、葡糖胺盐酸盐、葡糖胺氢碘酸盐、葡糖胺磷酸盐(葡糖胺)2硫酸氢钾-(HCl)2和(葡糖胺)2硫酸氢钠-(HCl)2。
因此，在一个方面中，上述重组去乙酰化酶与固相支持体结合，即固定化酶。本文所用的与固相支持体结合的酶(例如脱乙酰酶)包括固定化分离的酶；含有该酶的固定化细胞，诸如重组酶(包括固定化细菌、真菌(例如酵母)、显微藻类、昆虫、植物或哺乳动物细胞)；稳定的完整细胞；和稳定细胞/膜匀浆物。稳定的完整细胞和稳定细/膜匀浆物包括来自下述来源的细胞和匀浆物表达所述酶的天然存在微生物，或本文另外部分中公开的已经过遗传修饰(例如通过重组技术)以表达所述酶的遗传修饰微生物、昆虫细胞或哺乳动物细胞。因此，尽管下文讨论了固定酶的方法，但是应理解这类方法同样应用于固定细菌和其它细胞，而在这类实施方案中，细胞可以被裂解。
固定酶的各种方法公开在下列文献中Industrial Enzymology 2nd Ed.，Godfrey，T.和West，S.Eds.，Stockton Press，New York，N.Y.，1996，pp.267-272；Immobilized Enzymes，Chibata，I.Ed.，Halsted Press，New York，N.Y.，1978；Enzymes和Immobilized Cells in Biotechnology，Laskin，A.Ed.，Benjamin/Cummings Publishing Co.，Inc.，Menlo Park，California，1985；和Applied Biochemistry和Bioengineering，Vol.4，Chibata，I.和Wingard，Jr.，L.Eds，Academic Press，New York，N.Y.，1983，将这些文献的全部内容引入本文作为参考。
简单的说，固相支持体指的是可以与酶成键而对分离的酶活性没有显著影响的任意固相有机支持体、人工膜、生物聚合物支持体或无机支持体。典型的有机固相支持体包括聚合物，诸如聚苯乙烯、尼龙、苯酚-甲醛树脂、丙烯酸共聚物(例如聚丙烯酰胺)、稳定的完整细胞和稳定的粗完整细胞/膜匀浆物。示例性的生物聚合物支持体包括纤维素、聚葡聚糖(例如

)、琼脂糖、胶原蛋白和壳多糖。典型的无机支持体包括玻璃珠(多孔和无孔)、不锈钢、金属氧化物(例如多孔陶瓷，诸如ZrO2、TiO2、Al2O3和NiO)和砂土(sand)。优选的固相支持体选自稳定的完整细胞或粗细胞匀浆物。这类支持体的制备要求最少的操作和最低的成本。另外，这类支持体提供酶的极佳稳定性。
可以通过各种方法使酶与固相支持体结合，包括吸附、交联(包括共价结合)和截留。可以通过范德华力、氢键、离子键或疏水键吸附。用于吸附固定的示例固相支持体包括聚合物吸附剂和离子交换树脂。珠形式的固相支持体特别适合。可以选择吸附固相支持体的颗粒大小以使固定化酶被筛网过滤器(mesh filter)保留在反应器中，而使底物(例如油)以所需比例流过所述反应器。由于使用了多孔颗粒支持物，所以能够控制吸附过程以使酶或细菌细胞被包埋在颗粒腔内，由此提供保护而没有不可接受的活性丧失。
将本文引述或描述的各公开文献和参考文献的全部内容引入本文作为参考。
提供下列实验结果的目的在于解释本发明而非限定本发明的范围。
实施例 下面是本文涉及和/或所述的各种基因修饰微生物的目录。上述美国专利US6,372,457中描述一些菌株，并将它们用作进行本文具体描述的遗传修饰的亲代菌株。
大肠杆菌菌株
注意 1)表中所列的所有菌株均来源于相同的亲代菌株W3110。
2)表中所列的大部分菌株由菌株7107-18(TetR::nag manXYZDE3T7-glmS*54::gaIK)发育而来。为简化起见，将这些菌株的基因型列为7107-18+新改变。
3)用两个字母鉴定来自非大肠杆菌的其它来源的基因。Sc酿酒酵母，Ca白色念珠菌，At拟南芥，Bs枯草芽孢杆菌。
4)除非另有说明，为了进行基因整合，使插入的表达盒与靶位点的基因或操纵子的芳香相同。
实施例1 下面的实施例描述了较佳葡糖胺生产者的突变体筛选。
美国专利US 6,372,457中描述了产生高水平葡糖胺的重组大肠杆菌菌株，将该文献的全部内容引入本文作为参考。使用代谢改造手段构建这些菌株。该手段由三步组成。第一步是导入限制代谢和葡糖胺及其6-磷酸衍生物的输入的突变。第二步是超表达编码关键的生物合成酶葡糖胺合酶(GlmS)的大肠杆菌glmS基因。第三步是通过对该酶进行体外诱变将GlmS的产物抑制作用减小到最低限度。重组菌株2123-54含有处于T7启动子控制下的产物抗性重组大肠杆菌glmS突变基因，且在摇瓶培养物中的补充了葡萄糖的简单无机盐培养基中表现出最高产物滴度。该菌株用作评价用于进一步改善的新菌株的参比物。还将其用于改善细胞生长和IPTG诱导的葡糖胺产生的实验中。
IPTG-诱导型葡糖胺生产菌株2123-54的基因型 2123-54来源于命名为W3110的实验室大肠杆菌K-12菌株。表1中描述了相关的基因型。
表1.葡糖胺生产菌株2123-54的基因型

证实nag和manXYZ突变对葡糖胺产生具有正面影响且持续被携带入新的生产型菌株。通过使用T7表达系统，大肠杆菌野生型glmS基因得到超表达且使用IPTG诱导可以产生数倍高水平的葡糖胺产量。由于大肠杆菌野生型GlmS受到其产物葡糖胺-6-P的强烈抑制，所以大肠杆菌glmS突变体的收集物通过易错PCR产生，并通过平板摄取试验(plate feeding assay)筛选葡糖胺产量增加的突变体。将改良的葡糖胺生产者中表达glmS*突变体的表达构建体整合入染色体的lacZ位点以产生稳定生产菌株。许多突变株合成了具有产物抗性的葡糖胺合酶。在摇瓶实验中，这些突变株产生的葡糖胺水平比带有大肠杆菌野生型glmS表达构建体的菌株明显增加。菌株2123-54(带有T7-glmS*54表达构建体)产生的葡糖胺超过每升11g。
研发简化的摇瓶筛选法 正如美国专利US 6,372,457中所述，在摇瓶培养中不同的葡糖胺生产菌株生长在补充了葡萄糖的无机盐培养基中以进行葡糖胺产生。在上述实验中，在葡萄糖和硫酸铵逐渐耗尽时，给培养物补充上述物质，从而使葡糖胺连续产生。然而，这需要频繁监测和进料(每隔6-8小时)3天期限。因此，需要研发更简便而可靠的评价不同葡糖胺生产菌株的摇瓶培养方案。
葡糖胺生产中所用的简单无机盐培养基为M9A(表2)。研发三步方案以用于菌株评价。首先，用在LB平板上新鲜生长的细胞启动3-ml LB中的培养，使其在37℃生长约8小时。第二步，用1.5-ml培养物接种250-ml摇瓶内的50ml的M9A培养基，并将培养物在37℃保温并以225rpm振摇约16小时(过夜)。在600nm处测定培养物的细胞密度。包括该步骤是为了使细胞适应于基本培养基并产生可再现的葡糖胺生产结果。第三步，将细胞的等分部分加入到250-ml摇瓶中含有IPTG(0.2mM)的50ml M9A培养基中。起始细胞OD为0.3。将细胞在37℃保温和且以225rpm振摇72小时。在24、48和72小时时取样(1ml)以测定培养肉汤中葡糖胺的水平。在24和48小时的时间点处，通过添加少量NaOH将pH调节至7.0并加入20gl-1的葡萄糖。在这些实验条件下，对照菌株2123-54在72小时时产生了约6g l-1的葡糖胺。
表2.用于葡糖胺生产的M9A和M9B培养基*
*为了进行发酵，给培养基补充消泡剂(Mazu204和0.25ml l-1) 摇瓶实验中的突变体筛选 使用最优化方案重新评价带有整合的glmS突变构建体的约150个重组大肠杆菌菌株。使用Ehrlich′s试剂根据比色方法检测葡糖胺。菌株2123-72和2123-103产生的葡糖胺水平稍高于2123-54(表3)。
表3.摇瓶培养中IPTG诱导的葡糖胺产生
*括号内所示的百分比数字是与在不同时间点来自2123-54的值相比较而言。
1-升发酵罐中产生高葡糖胺的菌株2123-72和2123-103的评价 在1-升发酵罐中比较葡糖胺产量可能较好的菌株2123-72和2123-103与2123-54。将发酵罐设定起始体积为475ml补充了消泡剂(0.25ml l-1的Mazu 204)和微量元素(表4)的M9A培养基。使用75％NH4OH进行发酵以便将pH控制到6.9。在整个发酵过程中将温度维持在30℃。调节通气和搅拌以维持溶解氧浓度为饱和浓度即空气的20％。给培养物补充65％葡萄糖，进料速度由计算机程序控制，从而使接种时的生长速率为0.40小时-1，且到6小时的时候达最大速率5ml/小时。发酵要求精确控制pH、氧和葡萄糖浓度。在发酵罐中获得的葡糖胺浓度高于摇瓶中的葡糖胺浓度。
在两种不同条件下测试两组各种菌株。一组发酵罐以低葡萄糖浓度(10gl-1，葡萄糖限制)开始，而另一组以较高葡萄糖浓度(40g l-1，过量葡萄糖)开始。过量葡萄糖条件与摇瓶生长条件更接近相似。葡萄糖限制条件通常用于发酵实验且一般导致2123-54的葡糖胺产量较高。发酵开始时用IPTG诱导所有培养物。在葡萄糖限制或过量条件下，两种菌株2123-72和2123-103的性能均优于2123-54，它们在第50小时的产量达14g l-1葡糖胺，而2123-54在第50小时的产量达10g l-1的葡糖胺(数据未显示)。
表4.给用于一些实验的生长培养基补充的微量元素
实施例2 下面的实施例描述了超表达不同的glmS基因以用于葡糖胺生产。
在大肠杆菌中克隆并表达细菌葡糖胺合酶基因(glmS)和酵母同源物(GFA基因)以证实它们在葡糖胺代谢途经改造中的应用。通过PCR从枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和白色念珠菌中扩增不同的基因并使其处于表达载体pET24d(+)中的T7启动子控制下。将这些构建体转入大肠杆菌菌株7101-17(DE3)并保持为游离的复制质粒。另外，将由T7启动子驱动的白色念珠菌GFA1基因整合入7101-17(DE3)中染色体的lacZ位点上。使用IPTG诱导评价含有不同glmS和GFA基因的菌株的基因表达和葡糖胺产量。
枯草芽孢杆菌glmS基因的克隆 枯草芽孢杆菌glmS基因含有1803bp的可读框且编码约65kDa的蛋白质(599个残基，不包括通常在细胞中除去的起始物甲硫氨酸)。枯草芽孢杆菌glmS可读框的核苷酸序列如SEQ ID NO15所示。枯草芽孢杆菌GlmS蛋白的推定的氨基酸序列如SEQ ID NO16所示。通过PCR由菌株ATCC23856和ATCC23857扩增glmS基因。正向引物含有ATG起始密码子和Bsa I位点(SEQ ID NO21)5′-GAT CGG TCT CGC ATG TGT GGA ATC GTA GGTTATATC GGT C-3′。反向引物含有终止密码子和Xho I位点(SEQ ID NO22)5′-GAT CCT CGA GTT ACT CCA CAG TAA CAC TCT TCGCAA GGT TACG-3。
将预计大小的PCR产物连入pET24d(+)(Novagen Inc，Wisconsin)。用酶Nco I和Xho I预消化该载体。通过限制性分析证实重组质粒pSW07-15#83并将其转入7101-17(DE3)，产生大肠杆菌菌株7107-24(来自枯草芽孢杆菌ATCC23856的glmS基因)和7107-25(来自枯草芽孢杆菌ATCC23857的glmS基因)。作为对照，还将空载体pET24d(+)转入7101-17(DE3)，产生菌株7107-22。
酿酒酵母GFA1基因的克隆 酿酒酵母GFA1可读框含有2154bp且编码716个残基的肽(不包括起始物甲硫氨酸)。酿酒酵母GFA1可读框的核苷酸序列如SEQ ID NO17所示。酿酒酵母GFA1蛋白推定的氨基酸序列如SEQ ID NO18所示。根据该序列预测的蛋白质大小约为80kDa。在GFA1基因序列中不存在内含子，因此，从由菌株酿酒酵母S288C(ATCC204508)生产的基因组DNA扩增该基因。
包括ATG起始密码子和Bsa I位点的正向引物含有如下序列(SEQ IDNO23)5′-GAT CGG TCT CGC ATG TGT GGT ATC TTT GGT TAC-3′。包括终止密码子和EcoR I位点的反向引物含有如下序列(SEQ ID NO24)5′-GAT CGA ATT CTT ATT CGA CGG TAA CAG ATT TAG-3′。
将约2.2kb的PCR产物克隆入pPCR-Script Amp SK(+)。通过限制酶消化证实重组质粒。酿酒酵母GFA1片段通过用EcoR I和Bsa I消化来分离，并被连入pET24d(+)的EcoR I和Nco I位点。通过限制分析证实该重组质粒并将其转入7101-17(DE3)，，产生大肠杆菌菌株7107-101。
白色念珠菌GFA1的克隆 白色念珠菌GFA1基因不含内含子且其2142-bp可读框编码约80kDa的肽(712个残基，不包括起始物甲硫氨酸)。白色念珠菌GFA1可读框的核苷酸序列如SEQ ID NO19所示。白色念珠菌GFA1蛋白推定的氨基酸序列如SEQ ID NO20所示。通过使用正向引物和反向引物的PCR由菌株ATCC10261扩增GFA1编码序列。正向引物含有ATG起始密码子和Bsa I位点5′-GAT CGG TCT CGC ATG TGT GGT ATT TTT GGT TAC GTC-3′(SEQ IDNO25).反向引物含有终止密码子和Xho I位点5′-GAT CCT CGA GTTACT CAA CAG TAA CTG ATT TAG CC-3′(SEQ ID NO26)。
将PCR产物克隆入载体pMOSBlue(Amersham Pharmacia Biotech，NewJersey)并通过限制性酶消化证实重组质粒。分离Bsa I-Xho I片段并连入通过用Nco I和XhoI消化生产的pET24d(+)。将所得质粒转入宿主7101-17(DE3)，产生大肠杆菌菌株7107-23。
还将白色念珠菌GFA1基因克隆入表达载体pET23b(+)(Novagen Inc)。不同于pET24d(+)，这种载体不含T7启动子下游的lac操纵子序列。不存在lac操纵子可以导致重组蛋白表达水平较高。通过PCR由酵母基因组DNA扩增白色念珠菌GFA1编码序列。正向引物含有ATG起始密码子和Nde I位点5′-GCG GGT ACC CAT ATG TGT GGT ATT TTT GGT TAC GT-3′(SEQID NO27)。反向引物含有BamH I位点5′-GCG GGA TCC TTA CTC AACAGT AAC TGA TTT AGC CA-3′(SEQ ID NO28)。将正确大小的PCR产物连入pET23b的Nde I和BamH I位点。通过限制性分析证实重组质粒并转入表达宿主7101-17(DE3)，产生大肠杆菌菌株7107-58和7107-59。作为对照，还将空载体pET23b转入7101-17(DE3)，产生菌株7107-57。
公开文献中描述了使用大肠杆菌pET表达系统超表达白色念珠菌GFA1蛋白(P.Sachadyn等，Protein Expression and Purification19，343-3492000)。然而，完全没有证实或讨论葡糖胺的产生。此外，从不同的白色念珠菌菌株(ATCC13153)中克隆报导的GFA1基因。尽管两种GFA1蛋白具有相同的氨基酸序列，但是来自ATCC 13153的GFA1基因含有分别由CTA和GCC编码、而不是由ATCC 10261中的TTA和GCT编码的残基Leu29和Ala 655。尝试测试在残基Leu 29和Ala655使用不同的密码子是否对大肠杆菌中的GFA1基因表达产生影响。进行使用基于StratageneQuikChangeTM定点诱变试剂盒(Stratagene，CA)的策略的定点诱变以便将质粒pET23b(+)/白色念珠菌GFA1中的Leu29密码子转化成CTA并将Ala655密码子转化成GCC，从而产生质粒pET23b(+)/白色念珠菌GFA1-M。通过测序证实新质粒中不存在两种突变且将该质粒转入7101-17(DE3)，产生大肠杆菌菌株7107-60和7107-61。
GlmS和GFA蛋白的超表达 用含有不同glmS和GFA1基因的pET载体转化的菌株生长在LB培养基中以证实GlmS和GFA1蛋白表达。首先在37℃使细胞在测试管内的LB培养基中生长过夜。给该培养基补充卡那霉素(25mgl-1)以维持质粒。然后将50-μl过夜培养物接种用于启动250-ml带挡流板(baffled)的烧瓶中的50-ml培养物。将培养物在37℃保温并以225rpm振摇3小时。此时加入IPTG至终浓度为1mM。在诱导3小时后，收集培养物用于SDS-PAGE分析。作为阴性对照，还使含有空pET24d(+)载体的细胞生长并对其进行分析。为了进行比较，还使含有由T7启动子驱动并整合入染色体中的lacZ位点上的野生型大肠杆菌glmS基因和突变glmS*54基因的大肠杆菌细胞如上所述生长，但不进行抗生素筛选。
通过下列标准方法进行SDS-PAGE。当T7-大肠杆菌glmS表达盒被携在pET质粒中携带或整合入染色体时，GlmS蛋白以极高水平的表达(数据未显示)。充当质粒pET24d(+)/T7-枯草芽孢杆菌glmS宿主的细胞超表达约65kDa蛋白质，其为GlmS蛋白的预计大小(数据未显示)。来自整合的盒的表达水平与表达pET质粒中含有的大肠杆菌glmS基因的细胞相似。
酿酒酵母GFA1基因的宿主细胞显示出清楚的超表达的蛋白质带，所述蛋白是酵母蛋白的预计大小(80kDa，数据未显示)。在含有T7-白色念珠菌GFA1表达盒(数据未显示)的菌株7107-23中，当与含有空载体的菌株相比时，80-kDa蛋白质带的合成不明显(数据未显示)。然而，GFA1带在菌株7107-58和7107-59中得到超表达，这两种菌株含有基于pET23b(+)-的载体携带的白色念珠菌GFA1基因(数据未显示)。表达水平显然高于含有基于pET24d(+)的载体的菌株7107-23中的表达水平。Leu 29和Ala 655可选密码子的中的应用不会影响大肠杆菌中白色念珠菌GFA1蛋白质的表达。
总之，大肠杆菌中酵母GFA1基因的表达水平比细菌glmS基因低。当尝试在大肠杆菌宿主中表达真核基因时通常会观察到这种情况。
葡糖胺-6-磷酸合酶活性试验 为了测定酶的活性和葡糖胺的产量，使不同菌株生长在M9A培养基中。将三步方案用于生产培养。首先，将新鲜生长在LB平板上的细胞用于启动3-ml LB中的培养物，使所述细胞在37℃生长约6小时。第二步，将1.5-ml培养物用于接种250-ml带挡流板的摇瓶(baffled flask)内的50ml的M9A，并将培养物在37℃保温且以225rpm振摇约16小时(过夜)。包括该步骤是为了使细胞适应于基本培养基和可再现的葡糖胺生产结果。第三步，将细胞的等分样品加入到250-ml摇瓶中含有IPTG(1mM)的50ml M9A培养基中。将起始细胞密度调节至0.3 OD600。将细胞在37℃保温和且以225rpm振摇24小时。在离心后，将培养肉汤用于葡糖胺检测并将细胞沉淀用于测定葡糖胺合酶活性。来自有代表性实验的数据如表5中所示。
易于在表达枯草芽孢杆菌glmS基因(编码SEQ ID NO16)的大肠杆菌细胞中检测到酶活性。活性水平与具有含有大肠杆菌glmS(编码SEQ ID NO2)和大肠杆菌glmS*54突变体(编码SEQ ID NO6)基因的构建体的细胞相差无几。然而，在酵母GFA1基因(编码SEQ ID NO18和SEQ ID NO20)的宿主细胞中仅可以检测到微量的酶活性。来自M9A培养基中培养物的活性数据一般与在LB培养基中生长的细胞的SDS-凝胶分析结果一致。看起来低蛋白质表达水平是造成充当酵母GFA1基因的宿主细胞中酶活性极低的主要原因之一。
通过表达不同的glmS和GFA1基因的葡糖胺产量 仅有极低水平的葡糖胺产生且分泌入用空载体pET24d(+)转化的7101-17(DE3)细胞培养基(表5)。细菌glmS基因(大肠杆菌glmS或枯草芽孢杆菌glmS)的表达使葡糖胺产量增加50-倍。在表达酵母GFA1基因的培养物中也观察到了数倍增加的葡糖胺水平。与pET24d(+)相比，pET23b(+)的应用产生较高水平的白色念珠菌GFA1蛋白和较高水平的葡糖胺产量。改变白色念珠菌GFA1基因中的Leu 29和Ala 655密码子不会影响葡糖胺的产量水平。这些观察结果一般与SDS-PAGE分析结果一致。正如在酶活性试验中观察到的，在染色体中整合T7-大肠杆菌glmS表达盒看起来是有利的，此时在菌株2123-12中产生的葡糖胺水平高于在7107-214中产生的葡糖胺水平。显然带有在染色体中整合的大肠杆菌glmS*54的大肠杆菌菌株在葡糖胺产量方面优于其它测试菌株。
表5.表达不同glmS和GFA1同源物的大肠杆菌菌株中的葡糖胺合酶活性和葡糖胺产量
注意 1)宿主细胞大肠杆菌7101-17(DE3)。基因型nagΔ，manXYZ DE3。
2)细胞培养物在30℃的摇瓶中26小时，所述的摇瓶中含有补充了7.5g(NH4)2SO4每升和40g葡萄糖每升的M9A培养基。
3)白色念珠菌GFA1(M)Leu29和Ala 655密码子分别由TTA和GCT改变成CTA和GCC。
实施例3 下面的实施例表示不同产物抗性GlmS酶的特征大肠杆菌GlmS突变体和野生型枯草芽孢杆菌GlmS。
在体外研究不同的葡糖胺合成酶，包括天然枯草芽孢杆菌GlmS、天然大肠杆菌GlmS和突变体大肠杆菌GlmS。使各种的大肠杆菌菌株细胞生长在M9A培养基中、收集并冷冻。生产细胞提取物并表征和比较葡糖胺合成酶且进行比较。测定两种其它的大肠杆菌glmS突变体的DNA序列，这两种大肠杆菌glmS突变体表现出强产物抗性并使重组大肠杆菌中的葡糖胺产量较高。
对葡糖胺-6-P抑制的敏感性 检验酶对反应产物葡糖胺-6-P的敏感性。在饱和葡糖胺和果糖-6-磷酸水平和0-30mM葡糖胺-6-P范围内检测起始速度。示例结果如附图4和5中所示。来自菌株2123-12的大肠杆菌天然GlmS酶在1mM葡糖胺-6-P浓度下失去了约50％的活性。活性随葡糖胺-6-P浓度的增加而持续降低。在菌株2123-54中，1mM葡糖胺-6-P基本上对酶活性没有影响。高于该浓度，抑制作用基本上呈线性，在10mM葡糖胺-6-P时活性保留了约50％。来自诸如2123-4、2123-59、2123-64、2123-72、2123-103和2123-124这类其它菌株的突变体GlmS酶也表现出对GlcN-6-P抑制的敏感性降低。图5表示在相对“低”[葡糖胺-6-P]条件下的活性。该图突出了野生型GlmS与这些突变体Glms菌株之间的显著差异。甚至相当低浓度的葡糖胺-6-P也会显著抑制天然GlmS酶。
当在大肠杆菌中超表达野生型芽孢杆菌属glmS基因时，它使得葡糖胺的产量高于野生型大肠杆菌glmS基因的超表达。感兴趣的是天然芽孢杆菌属的酶表现出与大肠杆菌突变体GlmS酶几乎相差无几的产物抗性(图4)。在0、2和4mM葡糖胺-6-P下测定枯草芽孢杆菌酶的活性。该酶具有的Km(果糖-6-磷酸)为0.62mM且Ki(葡糖胺-6-P)为1.25mM(数据未显示)。
对菌株2123-12而言，Vmax对[抑制剂]的非线性回归值的二级图产生的抑制常数(Ki)为0.56mM。突变体2123-54和枯草芽孢杆菌酶具有较高的Ki值(表6)。对这些突变体中的数种测定的Ki常数为对菌株2123-12中的天然酶的值的4-8倍。从摇瓶研究中显然发现对葡糖胺-6-P的敏感性降低使得较高水平的葡糖胺累积。这一结果强烈提示胞内[葡糖胺-6-P]在重组大肠杆菌菌株中相当高(多毫摩尔)，从而导致葡糖胺合成酶的活性降低。对葡糖胺-6-P抑制的敏感性显著降低为在超表达突变体大肠杆菌GlmS和野生型芽孢杆菌GlmS酶的菌株中葡糖胺合成的增加提供了最简单的解释。
对底物果糖-6-P和谷氨酰胺的亲合力 使用粗提取物测定谷氨酰胺和果糖-6-磷酸的米-曼(Michaelis-Menten)常数(表6)。使用野生型大肠杆菌GlmS酶(菌株2123-12)从非线性回归中得到的值为0.20mM(果糖-6-磷酸)和0.17mM(谷氨酰胺)。使用突变体GlmS*54(菌株2123-54)进行的类似实验得到的值为0.64mM(果糖-6-磷酸)和0.73mM(谷氨酰胺)。这些值稍高于使用天然酶获得的值。在大肠杆菌(菌株7107-24)中表达的枯草芽孢杆菌GlmS酶表现出的Km(果糖-6-P)值与突变体大肠杆菌酶GlmS*54极为相似。
表6.不同GlmS酶的特征
*ND未测定 热稳定性 将在50℃变性用于测定不同GlmS酶的热稳定性的可能差异。在50℃保温粗提取物并在90分钟期限内取样。在25℃使用饱和浓度的所有底物检测样品的葡糖胺合成酶活性。
看起来在50℃的热稳定性与葡糖胺产量之间没有任何显著相关性(数据未显示)。菌株2123-124具有最低的稳定性，但已经证实它是最佳葡糖胺生产菌株之一。菌株12、54与59之间几乎没有显著的热稳定性差异，而本发明者从其它实验中得知菌株54在葡糖胺生产方面是更好的菌株。
实施例4 下面的实施例描述了GlmS序列分析。
通过分别使用质粒pKlN23-72和pKLN23-103进行转化和整合实验从宿主菌株7101-17(DE3)衍生菌株2123-72和2123-103。对这些质粒中的glmS区(glmS*72和glmS*103)进行测序。大肠杆菌glmS*72突变体编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO13中所示。大肠杆菌GlmS*72蛋白推定的氨基酸序列如SEQ ID NO14中所示。
感兴趣的是，证实两种突变体带有相同的导致在15、387、450和525位上的氨基酸取代的突变(表7)。列出大肠杆菌野生型GlmS(SEQ ID NO2)、突变体GlmS*49(SEQ ID NO4)、GlmS*54(SEQ ID NO6)和GlmS*124(SEQ ID NO8)中相关位置上的残基用于比较。GlmS*72相对于其它产物抗性GlImS突变体而言没有通常的突变，但不包括另外在GlmS*49和GlmS*72中发现的450位丝氨酸改变成脯氨酸。感兴趣的是三种GlmS突变体酶(GlmS*49、72和124)具有使450-469区中的一个残基改变成脯氨酸的突变。GlmS*54还带有472位上的残基改变甘氨酸被丝氨酸取代。这些数据提示在蛋白质该区中的改变可以在酶的产物抗性方面起重要作用。
表7.编码产物抗性葡糖胺合酶的大肠杆菌突变体glmS基因中的碱基改变
*为简便起见，按照推定的氨基酸序列的编号给出位置。
使用Megalign程序、J.Hein法、Lasergene软件(DNA Star，Inc，Madison，WI)以标准设定分析不同细菌glmS编码序列的核苷酸序列。还使用Megalign程序、Lipman-Pearson蛋白质序列对比、Lasergene软件(DNA Star)以标准设定比较从所述核苷酸序列中推定的氨基酸序列；结果如表8中所示。
表8.来自不同微生物的葡糖胺合酶的肽大小和同源性
*氨基酸残基数不包括起始物甲硫氨酸，它在翻译后通过酶的作用除去。
**核苷酸水平的同源性表示在括号内。
枯草芽孢杆菌glmS基因编码599个氨基酸残基的葡糖胺合酶(不包括起始密码子甲硫氨酸，它在翻译后被酶除去)，其比大肠杆菌同源物短9个残基的(SEQ ID NO16)。将对应在不同产物抗性大肠杆菌GlmS突变体中发现突变的位置的芽孢杆菌GlmS蛋白的氨基酸残基列在表9中用于比较。感兴趣的是，芽孢杆菌的酶在10个位置中有6个具有与大肠杆菌野生型GlmS不同的残基，不过，无一改变与大肠杆菌突变体酶中的相同。
表9.产物抗性大肠杆菌GlmS和野生型枯草芽孢杆菌GlmS*中的氨基酸残基改变

*仅显示不同于大肠杆菌野生型GlmS蛋白中的残基。
**由于比对中的小缺口，芽孢杆菌GlmS序列的位置基于与大肠杆菌野生型GlmS序列的对比。
实施例5 下面的实施例证实了摇瓶培养中葡糖胺产生过程中的酶活性。
在摇瓶和发酵罐中检验与葡糖胺生产相关的各种酶活性。将葡萄糖代谢和N-葡糖胺形成中涉及的这些酶概括在图3中。葡萄糖被细胞吸收且同时转化成葡萄糖-6-P。通过许多途经代谢葡萄糖，包括图中所示的那些途经。在葡糖胺合成途经中，葡萄糖-6-P异构化成果糖-6-磷酸，随后GlmS介导果糖-6-磷酸转化成葡糖胺-6-磷酸。最终使葡糖胺-6-磷酸去磷酸化并分泌。葡萄糖-6-磷酸的主要竞争可选途经是其通过果糖磷酸激酶进入糖酵解。葡萄糖-6-磷酸的另一种重要的可选途经是其氧化成葡糖酸内酯-6-磷酸(进入戊糖磷酸途经)。另外，可以将葡萄糖-6-磷酸转化成葡萄糖-1-磷酸，由它生产糖原并储存在细胞中。
使用菌株2123-54进行的摇瓶实验中的酶分析结果如图6中所示。使细胞生长在M9A培养基中并在培养开始时用0.2mM IPTG诱导。在整个实验过程中葡糖胺合酶(GlmS)的活性均较高。在12小时时存在高水平的GlmS活性且到24小时时进一步增加。然后GlmS活性下降。然而，这种降低并不显著。72小时时的活性仍然较高且基本上与在12小时时观察到的活性相同。因此，看起来在本实验过程中GlmS活性并没有显著降低。
葡糖磷酸异构酶(Pgi)活性在12小时时较高且到24小时时显著增加。此后恢复到12小时时观察到的水平并在本实验剩余的时间内保持该水平。在这组实验条件下由葡萄糖形成果糖-6-磷酸显然不应受到这些细胞中低Pgi活性的限制。
果糖-6-磷酸的其它主要途经为糖酵解。本文第一个进行步骤由果糖磷酸激酶(Pfk)介导。在12小时时观察到了最高的Pfk活性，且尽管它在接下来的48小时内下降，但是仍然可检测到活性。这种活性模式对Pfk而言是常见的。在指数生长过程中活性最高，然后在细胞进入稳定期时下降。
在提取物中检测到了葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Glu6P DH)。这种酶使来自葡萄糖的碳进入戊糖磷酸途经以再生NADPH。这种酶的活性与所测定的其它酶的活性相比较低，相当稳定，且在本实验的前24小时后稍降。发现葡糖磷酸变构酶(Pgm)的活性在本实验条件下极低。
实施例6 下面的实施例描述了研发重组大肠杆菌菌株用于乳糖诱导的葡糖胺生产。
为了研发商业上可行的葡糖胺生产方法，两种因素必不可少。第一个是增加葡糖胺滴度。第二个是在发酵过程中消除使用IPTG，因为IPTG的成本导致葡糖胺的生产非常昂贵。在研究过程的早期阶段研发的用于葡糖胺生产的菌株需要培养基中的IPTG以诱导葡糖胺合酶的表达。
从发酵过程中消除IPTG的策略 发酵过程中对IPTG的需求是因编码GlcN6P合酶的glmS基因在诸如2123-54这类生产菌株中的超表达模式所致。glmS基因分离自大肠杆菌染色体DNA并将其克隆入表达载体中来自噬菌体T7的启动子之后。这种启动子极为有效力且极具特异性。它不由大肠杆菌RNA聚合酶识别，而由T7RNA聚合酶识别。在命名为DE3的遗传元件中提供T7 RNA聚合酶，该DE3含有由大肠杆菌lac启动子和lac操纵子驱动的T7 RNA聚合酶的基因。就是这些启动子和操纵子的应用要求用IPTG诱导。Lac启动子受lacI基因编码的lac阻抑蛋白的负控制。在没有诱导物存在的情况下，lac阻抑蛋白与lac操纵子结合并阻止来自操纵子下游的基因(在这种情况中为和T7RNA聚合酶基因)的表达。在没有T7RNA聚合酶存在的情况下，不会表达重组glmS基因。在有IPTG存在的情况下，lac阻抑蛋白不结合操纵子，结果是T7RNA聚合酶基因得到表达，从而使glmS超表达。
Lac启动子的另一种诱导物为异乳糖。它是β-半乳糖苷酶对乳糖起作用的副产物。诸如2123-54这类葡糖胺生产菌株对β-半乳糖苷酶是阴性的，这是由于lacZ基因被缺失和破坏。然而，在有功能性lacZ基因存在的情况下，乳糖可以被转化成异乳糖，从而启动了上述可以使glmS表达的反应串联。
按照上述内容，存在数种用于消除对IPTG依赖性的方法。本实施例中解释的一种手段是复原lacZ基因。可以通过在染色体中的不同位点上整合T7-glmS*54表达盒来进行。在galK位点上整合可以保持lacZ基因的完整性。Lac+菌株能够通过昂贵程度远低于IPTG的乳糖来诱导。选择galK位点是因为整合体菌株还可以为Gal-。据报导在这类菌株中，半乳糖可以用作lac启动子的诱导物。此外，通过乳糖水解产生的半乳糖可以增强乳糖诱导。当将次最优量的乳糖用于葡糖胺生产过程中时，它可以增强诱导。理论上，当将T7-glmS*54表达盒插在菌株7101-17(DE3)中的galK位点中时，产生的菌株可以与菌株2123-54类似，但可以用乳糖、半乳糖或IPTG诱导葡糖胺产生。
通过温度选择在染色体上被靶向的位点中进行基因整合或缺失的一般方案 Hamilton等(1989，J.Bacteriol.1714617-4622)描述了通过变温在大肠杆菌染色体中进行靶向的基因缺失和基因整合的载体和方法。该方法适用于研发不同的葡糖胺生产型大肠杆菌菌株。用于基因整合的方案包括下列主要步骤。第一步是克隆靶位点的序列并进行内部缺失和/或插入缺失位点上整合的外源基因。第二步是将含有这些序列的片段亚克隆入含有温敏复制起点和抗生素选择标记的温敏整合型载体。第三步是将所述的整合载体转入大肠杆菌宿主菌株并在非容许温度(42℃)通过单交换重组过程选择含有整合入染色体的完整质粒的克隆。第四步是使所选克隆的细胞在非容许温度(30℃)在液体培养物中生长。整合的质粒的细胞具有失去该质粒的倾向。含有已经失去部分复制起点和抗生素抗性基因或整个质粒的细胞在培养物生长最快。一般来说，通过在50-ml LB培养基中接种来自2-10个克隆的收集物的细胞并使该培养物生长24小时来完成该步骤。使该培养物以1,000-倍稀释度转至新鲜培养基并再生长24小时。第五步，将细胞铺板并选择已经失去抗生素抗性的克隆。可以使用基因特异性选择步骤，这取决于整合基因或缺失基因的性质。为筛选克隆，使用引物组进行PCR，所述的引物组可以将具有目的染色体改变的克隆与其天然形式通过PCR产物的大小区别开来。通过Southern印迹分析、使用对整合或缺失DNA序列具有特异性的探针验证克隆。
通过温度选择研发用于T7glmS*54在galK位点上整合的载体 研发含有部分大肠杆菌gal操纵子序列、来自质粒pUC4K(AmershamPharmacia Biotech，Piscataway，NJ)的卡那霉素抗性选择标记和来自pMAK705(Hamilton等，1989，J.Bacteriol.1714617-4622)的温敏pSC101复制起点的载体，以便使用温度选择方案在galK位点进行基因整合。通过PCR从大肠杆菌菌株W3110扩增部分大肠杆菌gal操纵子序列(3.3kb)。PCR产物含有序列galTKM(从galT编码序列的ATG起始密码子上游的14bp处开始且终止于galM编码序列的终止密码子后68bp处)并将其克隆入载体pCRScript Amp SK(+)，产生重组质粒pKLN23-157。使galK序列(限制位点Sfo I与Mlu I之间)缺失0.7-kb，且在缺失位点上添加唯一的限制位点(Sal I、Bgl和McsI)，产生质粒pKLN07-1。通过Pst I消化从pUC4K(AmershamPharmacia Biotech，Piscataway，NJ)中将卡那霉素抗性盒作为Pst I片段分离，并用T4 DNA聚合酶处理以产生平端。将该片段连入质粒pKLN07-1(方向未确定)的Not I位点(用T4DNA聚合酶平端化)。从质粒中取出作为BamHI/Sac II(末端用T4 DNA平端化)片段的kan::galTKM片段并连入含有pMAK705(Hamilton等，1989，J.Bacteriol.1714617-4622)的温敏复制子的Pvu II/Sma片段，产生质粒pSW07-4。将表达盒T7-glmS*54作为Not I片段从质粒pKLN23-54(公开在美国专利US 6,372,457中)消化并用T4DNA聚合酶使末端平端化。将该片段克隆入pSW07-4的Msc I位点，产生质粒pSW07-9。
乳糖诱导型菌株的筛选 在用pSW07-9转化大肠杆菌菌株7101-17(DE3)后，将根据Hamilton等(1989)改进的方案用于对整合突变体进行温敏筛选。对含有来自pMAK705的温敏复制子的质粒而言，质粒复制可以在30℃进行，而在抗生素选择条件下、在非容许温度(42℃)促使质粒整合。在42℃保温转化的细胞，并由此选择了已经整合了质粒的菌株。通过将细胞铺于在含有卡那霉素的平板上、在42℃保温该平板并选择菌落来进行上述过程。通常通过同源重组将完整的质粒整合入染色体。单交换事件可以在galT或galM区中进行。
由于复制起点，含有整合质粒的细胞具有使质粒从染色体中环切出的倾向。尽管含有整合的完整质粒的细胞在30℃生长得极少，但是已经失去质粒或复制起点部分的细胞显示出正常生长。因此，当使在42℃选择的细胞在30℃生长时，已经失去质粒的细胞比保留该质粒的细胞生长得快。原则上，存在两种使细胞通过同源重组失去质粒的不同方式。它们可以失去完整的质粒，产生含有天然gal操纵子的回复体菌株；或仅失去含有复制起点和选择标记的质粒部分，产生含有在galK位点上整合的T7-glmS*54序列的菌株。将来自通过在42℃选择来分离的菌落的细胞在30℃的液体培养物中保温，所述培养物铺在不含抗生素的平板上。由于所述整合导致galK基因失活，所以整合体菌株不能利用半乳糖作为唯一的碳源。将半乳糖平板用于筛选这种整合体菌株，然后通过Southern印迹杂交、使用galK序列作为探针验证所述菌株。将这些乳糖诱导型葡糖胺生产菌株命名为7107-16和7107-18。
实施例7 本实施例描述了乳糖诱导型葡糖胺产生。
含有在galK位点整合的T7-glmS*54表达盒的菌株(7107-16和7107-18)在用IPTG或乳糖诱导后产生了高浓度的葡糖胺。在IPTG诱导下对照菌株(2123-54)产生了4.2g/l。乳糖诱导菌株中的葡糖胺产率与IPTG-诱导的2123-54的产率相差无几。2123-54和乳糖诱导菌株中的葡糖胺浓度如图7中所示。
在乳糖诱导的培养物样品中检测葡糖胺合酶活性。使细胞生长在含有不同量葡萄糖和/或乳糖(数字代表克/升表示)的M9A培养基中。生长24小时后检测酶活性和葡糖胺。正如表10中所示，乳糖诱导GlmS活性和葡糖胺合成。乳糖的诱导受到培养基中葡萄糖的量的影响。高浓度的葡萄糖表现出对乳糖诱导的强抑制。选择菌株7107-18进一步研发乳糖诱导方案。在评价摇瓶和1升发酵罐中利用各种乳糖诱导方案评价所述菌株。
表10.乳糖诱导的菌株7107-16中的葡糖胺合酶活性和葡糖胺产量水平
注意1)使细胞生长在含有不同量葡萄糖和/或乳糖(数字代表克/升)的M9A培养基中。
2)生长24小时后检测酶活性和葡糖胺。
乳糖诱导和葡萄糖抑制 在发酵实验中，尝试不同的乳糖浓度并在乳糖诱导后补充乳糖或葡萄糖。监测72小时内的葡糖胺浓度。第一个乳糖诱导方案与IPTG诱导类似的方面在于在接种前加入乳糖(没有葡萄糖，因为葡萄糖抑制lac操纵子)，随后补充葡萄糖以便提供碳用于生长、形成GlcN和维持生物质。当细胞在存在40gl-1乳糖的条件下生长并连续补充乳糖时，细胞持续消耗乳糖。这导致大量半乳糖累积达40g l-1。葡糖胺的产生水平与IPTG诱导下的2123-54类似(约10g l-1)。
使细胞在存在40gl-1乳糖的条件下生长24小时且然后改为补充葡萄糖。在这些条件下，细胞停止利用乳糖且半乳糖在整个试验的剩余部分均保持10g l-1的恒定值。葡糖胺产量以良好速率持续，从而达到与菌株2123-54相差无几的水平。这一结果表明葡糖胺产量可以在停止乳糖利用后由葡萄糖严格支持。这一结果还暗示诱导仅需要少量乳糖，导致仅有低浓度的半乳糖累积。对乳糖的需求减少和半乳糖的累积减少对降低成本和产物回收而言均是理想的。
使用50和60g/l的增加的乳糖、随后补充葡萄糖的诱导方案在添加葡萄糖后表现出连续利用乳糖一定时间。这表明葡萄糖的抑制作用在高浓度乳糖条件下不完全，或诱导的酶持续以适当的水平起作用以便在添加葡萄糖后保持葡糖胺生产。
由此需要应用较低浓度的乳糖，且本实验显示在最低乳糖测试水平、甚至在较低乳糖测试水平，可以将葡萄糖的抑制作用减小到最低限度。进一步的研发工作集中在建立诱导所需的最低乳糖水平、诱导的最佳时机和持续时间以及乳糖诱导前在起始生长期使用葡萄糖的优点。当在受控发酵中需要较高细胞密度时，后者可能尤其重要。
尝试使细胞在葡萄糖中生长至细胞耗尽葡萄糖时，随后用乳糖诱导。在葡萄糖上生长使得细胞密度约为17g l-1且然后开始缓慢补充乳糖。在这些条件下，GLcN产量达到10g l-1。将这种策略在后期实验中用于GlcN生产。
乙酸酯的影响 乙酸酯是大肠杆菌发酵中的常见副产物。在下述情况下乙酸酯甚至在有氧条件下形成葡萄糖过量时，生长率超过临界水平时或形成的代谢物的糖酵解和氧化率因呼吸容量饱和而不平衡时。向培养物中添加乙酸酯显示出对生长和葡糖胺累积的明显负面影响。还显示乙酸酯在葡糖胺产生过程中累积。微量元素的水平影响乙酸酯形成的水平(参见下文)。
通过方法研发减少乙酸酯累积的策略包括通过减补充葡萄糖使生长受限，使得葡萄糖不会变饱和。在整个过程中使用这种策略。一些条件可能会产生显著水平的乙酸酯，诸如高微量元素或钾限制。低pH增加乙酸酯的抑制作用。
温度的影响 正如美国专利US 6,372,457中公开的，生长和葡糖胺生产的优选温度为30℃。较高的生长温度(37℃)使生长率较高、葡萄糖吸收增加且最终抑制乙酸酯水平。较高的温度还可以导致形成含有不溶性/失活的重组GlmS蛋白的包含体。烧瓶中的研究显示诱导后当温度从30℃变至25℃时乙酸酯水平显著降低而GLcN水平相差无几。因此，在酵罐中评价通过低温(25℃)来减少乙酸酯累积。结果显示甚至在葡萄糖累积的条件下，较低的温度也会减少乙酸酯累积。
微量元素的影响 为了使生物质生长至较高密度，需要一定的微量元素，尤其是铁、锌和锰。整个微量元素包装的起始滴度显示当微量元素浓度过低时，生物质的产量受到限制。然后确定铁是主要的限制性生长因子，而如果它过量，那么它可以使GLcN滴度较低而乙酸酯浓度较高。锰对烧瓶培养中的细胞密度和GLcN水平具有相似但较弱的影响。看起来锰的作用是对铁作用的附加。在发酵罐中证实了锰的负面作用(图8)。发现足量的铁供应是使细胞足以受到乳糖诱导的所必不可少的。因此，必须建立临界浓度范围以平衡生长需要、诱导需要和对乙酸酯及GLcN产生的影响。限制铁、锰和锌以限制来自糖酵解的碳流在柠檬酸发酵的方法改进中具有优势。
在数次实验后，确立了最终方案培养基中的硫酸铁为3mg l-1并以5μgl-1葡萄糖的比例将硫酸铁加入到葡萄糖进料中。在培养基中3mg硫酸铁的初始水平下，需要向葡萄糖进料溶液中加入铁以维持较低水平的生物质生长并继续GLcN生产。
磷酸盐浓度的作用 磷是必需的细胞常量营养物，主要用于合成核酸、磷脂和辅酶。磷酸化代谢中间体也是细胞代谢必不可少的。M9A培养基中的高磷酸盐浓度还可缓冲在烧瓶条件下不易于控制的培养物的pH。然而，将这种培养基按比例放大至发酵规模指的是磷酸盐的量可以远超过正常生物质的需求。高盐浓度对产物回收造成了难题。因此，需要降低磷酸盐浓度。数种降低磷酸盐浓度的试验证实生长较好，而GLcN产量极低。例如，当磷酸钾浓度从30g l-1降至6g l-1时，生长得到改善，而GLcN产量限制降低(图9)。
实施例8 本实施例描述了pH对乳糖诱导型葡糖胺生产菌株7107-18生长的作用。
正如实施例11中所示，葡糖胺在用于大肠杆菌生长的规定pH范围不稳定。葡糖胺还对菌株7107-18产生毒性作用。甚至当在细胞接种前将浓度低至20g l-1的葡糖胺在培养基(pH7)中预保温3.5小时时，也观察到了毒性。这种毒性至少部分是因起始pH 7.0的培养基中GlcN降解产物所致。GlcN在较低pH条件下更为稳定，葡糖胺在pH 4.7以下不会降解。然而，已知低pH水平限制细胞生长。因此，进行实验，其中7107-18在pH 7.0、6.0、5.5、5.0和4.7的条件下生长。主要目的在于研究在这些较低pH条件下的细胞生长(有GlcN)，以及上述观察到的GlcN降解导致的细胞死亡是否可以在较低pH条件下减少。
将含有40g l-1葡萄糖和20g l-1Glu的M9A培养基分批调节至5种不同的pH。立即在一组烧瓶中接种7107-18细胞。在接种前，将不含细胞、含相同培养基的重复烧瓶保温10小时。在48小时内从烧瓶中取样7次以测定pH、OD600和GlcN浓度。在每一样品点，将培养物的pH重新调节回起始的设定。
如果不与葡糖胺一起预保温，pH 7.0条件下的细胞培养物甚至在培养基中存在20g l-1葡糖胺时也显示出良好生长(图10)。在pH 7.0-4.7之间，生长率随pH的降低而下降。然而，细胞在pH 4.7持续显示出显著生长。
与上述观察结果类似，将培养基与葡糖胺一起预保温后，细胞不能在pH 7.0良好地生长。在接种入预保温的培养基后，观察细胞生长。在所有检测的pH水平下生长都很差。看起来这种情况是较低pH和葡糖胺降解的组合对细胞培养物的影响结果。
基于这些实验，可在低于7.0的pH水平下使7107-18细胞生长以便将葡萄糖分解导致的产物损失和毒性作用减少到最低限度。然而，必须谨慎调节最佳pH和培养条件较低pH水平可以使葡糖胺稳定，但它们也对细胞代谢和细胞生长产生负面影响。在相对低pH水平下在发酵罐中进行的GlcN生产方案当然有助于保护产生的任何GlcN，从而通过降低分解产物的浓度来保护该方法中的细胞。这些有益作用必须与以该方式生长的细胞的代谢活性降低相平衡。持续的GlcN合成要求在细胞中恒定产生能量，但在这些较低pH水平下缓慢生长的细胞看起来不能产生足够的所需能量。
实施例9 本实施例描述了在较低pH条件下发酵以稳定葡糖胺。
大肠杆菌的一般最佳生长pH接近中性(pH 7.0)，且GLcN发酵开始使用6.7-6.9的pH。然而，发现GLcN在溶液中发生降解，尤其是在中性-碱性pH条件下。该生物体对pH敏感且在pH降低时生长不佳。因此，进行试验以测定低pH对生长期后葡糖胺合成和累积的作用。由于认为葡糖胺降解是氧化性的，所以还测试了溶解氧水平的影响+。使细胞生长在pH6.7下以达到高细胞密度。在诱导培养物后，使pH从6.7降至5.5且溶解氧的水平也从20％降至5％饱和。在本实施例中，在低pH条件下葡糖胺累积最佳，且较低氧浓度看起来也是有益的(图11)。至少部分改善是由于降解减少，如pH和氧条件持续变化显示，在低而持续补充葡萄糖的条件下葡糖胺停止累积后，在培养基中在低pH条件下降解大为减少。
实施例10 本实施例总结了用于乳糖-诱导的葡糖胺发酵法的条件。
使用用于乳糖诱导的葡糖胺生产的重组大肠杆菌菌株7107-18研发发酵方法。产物滴度在72小时时为约20g l-1葡糖胺。对本领域技术人员而言，该方法可以基于本发明中公开的观察结果进一步被优化。还可以将为其它发酵过程研发的方法应用于葡糖胺发酵过程以增强性能。将本发明中公开方法的主要因素和成分概括如下。
菌株 重组大肠杆菌 诱导 细胞密度达到10g/l后加入30g/l 乳糖(作为35％的进料在10小时 内缓慢加入)。在该过程中使葡萄 糖补料暂停以防止葡萄糖的抑制 作用。加入所有乳糖后，恢复葡 萄糖进料。
进料 50％葡萄糖与5ug FeSO4-7H2O/g 葡萄糖和0.33ug MnSO4-H2O/g 葡萄糖，以限定浓度进行葡萄糖 补料。
发酵时间 72小时 发酵方式 分批补料，按需要添加50％葡萄 糖，维持限定的葡萄糖浓度 接种物按体积计5％ pH生长过程6.9，然后诱导后为6.7， 用10N NH4OH控制 温度 30℃，诱导后切换至25℃ 氧20％或20％以上溶解的O2，通过 搅拌控制 通气 0.5-1vvm 培养基
在灭菌前加入除葡萄糖(逐步添加)和Fe、Zn、Mn、Cu、B、Mo、Co微量元素(灭菌后添加)外的所有成分。
实施例11 本实施例描述了葡糖胺和N-乙酰氨基葡糖的稳定性及其对大肠杆菌的影响。
葡糖胺的稳定性 在补充了40g l-1葡萄糖的不含细胞的M9A培养基(14g l-1KH2PO4、16g1-1K2HPO4、1g l-1Na3柠檬酸盐2H2O、5g l-1(NH4)2SO4、10mM MgSO4、1mMCaCl2，pH7.0)中测试葡糖胺的稳定性。将葡糖胺制成30％葡糖胺-HCl浓溶液并加入至终浓度为0、4、13、26和42g l-1(在250-ml烧瓶中总计50ml)。将培养基的pH调节至pH 6.9。将烧瓶置于震摇器上并以约225rpm搅拌。在30℃监测葡糖胺水平和pH约24小时。发现葡糖胺不稳定且降解是浓度依赖性的，其中在较高葡糖胺浓度下降解率也较高。在含有42g l-1葡糖胺的培养基中1天以内有过半葡糖胺降解。当起始葡糖胺浓度为4g l-1时，降解仅约为25％。葡糖胺降解伴随培养基中pH下降。与培养基中不含葡糖胺的pH改变仅约0.15个单位相比，24小时后在42g l-1葡糖胺样品中培养基中的pH下降0.7个单位(从6.9到6.2)。
在30℃、不含细胞的M9A-葡萄糖(40g l-1)对在4种起始pH水平下的葡糖胺(60g l-1)分解监测52小时。在每个取样时间，将溶液重新调节至其原始pH。每种条件设立三个重复。正如图12中所示，降解是强pH-依赖性的，在较高pH条件下发生得较快。与pH5.5时葡萄糖损耗18％相比，在pH 7.0时葡糖胺的损耗为68％。相对pH外推降解率提示在低于约4.7的pH条件下可以不发生分解。
当葡糖胺降解时，溶液变黄-琥珀色。可以通过在360-400nm处的吸收估计颜色形成的程度。除降解率较快的早期取样期外，葡糖胺的降解量与培养基中琥珀色的密度之间存在强的相关性。在两种最低pH水平下，葡糖胺消失与颜色出现之间存在显著的延迟，表明带颜色的化合物并非葡糖胺的直接降解产物。降解率在所有测试pH水平下减慢以后，降解的葡糖胺与黄色之比是恒定的。
几乎不了解有关葡糖胺降解和颜色形成中涉及的分子事件。有关于葡糖胺在水和干燥条件下热降解的报导(Shu，1998，Journal of Agricultural和Food Chemistry，vol.46，pp.1129-1131；Chen和Ho，1998，Journal ofAgricultural和Food Chemistry，vol.46，pp.1971-1974，将这两篇文献的全部内容引入本文作为参考)。然而，并不了解相同类型的化学时间在本研究所用的温和条件下是否发生。尽管工作人员已经观察到由葡糖胺形成棕色产物并研究了这些棕色产物的抗氧化活性(Oyaizu和Mankoto，1988，NipponShokuhin Kogyo Gakkaishi，vol.35，pp.771-775，将该文献的全部内容引入本文作为参考)，但是在其研究中并未对棕色产物进行化学鉴定。考虑到葡糖胺的分子结构，醛和氨基可以参与降解和/或聚合。颜色出现表明形成了共轭双键和复杂结构。
为了检测醛基的参与，在含有30g l-1葡糖胺以及含和不含40g l-1葡萄糖的M9A培养基中监测降解。如果醛基参与，那么存在的葡萄糖可以影响葡糖胺降解/聚合的比例。没有观察到葡糖胺分解的显著差异。这一观察结果提示氨基在葡糖胺降解中的影响。
葡糖胺对大肠杆菌7107-18的影响 葡糖胺是大肠杆菌生长必需的，因为它是合成重要细胞壁成分的前体。大肠杆菌还能够利用葡糖胺和N-乙酰氨基葡糖作为唯一的碳源。氨基糖类的分解代谢需要在菌株7107-18缺失的nagB基因编码的功能性葡糖胺脱氨酶。正如所预计的，7107-18不能在含有葡糖胺作为唯一碳源的平板上生长。进行实验以便研究葡糖胺是否影响大肠杆菌7107-18的细胞在含有40g l-1葡萄糖的培养基中的生长和存活。新鲜接种的培养物的生长受到每升10和20g葡糖胺的轻度抑制。正如通过细胞平板实验所示，每升40g葡糖胺可以防止细胞生长并在接种约16小时后开始杀死细胞。52小时后，存活计数稳定在约原始数量五分之一下。
进行更多的实验以便研究葡糖胺对大肠杆菌7107-18的毒性作用。立即将细胞接种入含有35g l-1的M9A-葡萄糖(40g l-1)。葡糖胺较好生长，而当细胞被接种入预保温短至3.5小时的相同培养基中时，所述细胞快速死亡。这表明杀伤作用主要是由接种前培养基中形成的葡糖胺降解产物所致。尚不了解为何如果细胞在培养基制成后立即接种则存活和生长。一种解释可能为葡糖胺依次降解成产物A、B、C和D。细胞可能具有耐受或同化相对低水平的早期产物的能力，而晚期产物和/或较高浓度的早期产物可能更具毒性。这种假设与较高葡糖胺浓度和较长预保温次数使存活计数水平较低的观察一致。使用了35g l-1葡糖胺时，存活计数稳定在低于接种浓度的105倍。甚至在不进行培养基预保温的情况下，细胞在含有50g l-1葡糖胺的培养基中死亡。
N-乙酰氨基葡糖的稳定性 看起来氨基在降解中起重要作用，正如pH的影响所提示的。如果这一情况确实，那么N-乙酰氨基葡糖应更为稳定。此外，pH的影响可能哺乳它们与葡糖胺一起时的影响显著。在与葡糖胺降解研究相似的实验中测试N-乙酰氨基葡糖的稳定性。在2天内，监测不含葡萄糖的M9A培养基中80和40g l-1N-乙酰氨基葡糖在pH 5.5和7.0时的稳定性。没有出现显著降解(图13)。这一结果与含有葡糖胺时观察到的降解明显相反。当葡糖胺分解时，培养基中出现琥珀色。在48小时内，在含有N-乙酰氨基葡糖的M9A培养基中没有观察到这种颜色形成。另外，在保温过程中没有pH的显著下降。结果证实游离氨基是葡糖胺分解和/或聚合中涉及的关键功能基团。
N-乙酰氨基葡糖对大肠杆菌7107-18的影响 将细胞接种入含有62g/L N-乙酰氨基葡糖的M9A-葡萄糖(40g/L)。生长在将培养基预保温8小时以上时也没有观察到显著的生长抑制。
概括地说，N-乙酰氨基葡糖对大肠杆菌菌株7107-18没有负面影响且它远比葡糖胺稳定。因此，生产N-乙酰氨基葡糖而不是葡糖胺有潜在的优势。已知葡糖胺通过其亚单位由manXYZ基因编码的甘露糖转运蛋白以及通过由ptsG基因编码的葡萄糖转运蛋白被转运入细胞并磷酸化。尽管manXYZ基因在菌株7107-18中缺失，但是葡糖胺吸收仍然可以通过葡萄糖转运蛋白进行。由于培养基中的高浓度，大量葡糖胺可进入细胞。由于7107-18中编码甘露糖转运蛋白的基因(manXYZ)和编码N-乙酰氨基葡糖转运蛋白的基因(nagE)缺失，所以N-乙酰氨基葡糖可以在培养基内累积至高浓度而不被转运回细胞。这代表了生产N-乙酰氨基葡糖优于生产葡糖胺的另一种可能的优势。
实施例12 本实施例描述了葡糖胺测定的HPLC法。
需要研发对葡糖胺进行层析法定量的简单HPLC法。所需方法的特征包括最少的样品准备和适度精确地测定葡糖胺。本文提供的方法基于Way等所述(J.Liq.Chromatography & Related Technol.232861.2000)。改进Way等所述步骤中的流动相允许分辨摇瓶细胞培养样品中观察到的其它峰和葡糖胺峰。
方法描述 柱　　　　　　　　　　　　 Phenomenex Prodigy　ODS (3)C18-5u，150 x 4.6mm (Phenomenex，Torrance，CA) 流动相 MeOH含水缓冲液(1:4v/v)。含 水缓冲液由10mM乙酸钠和10 mM辛磺酸钠组成，pH 5.1。完整 的流动相如下生产。向1升去离 子水中加入0.8g乙酸钠和2.16g 辛磺酸钠(Sigma-超纯(ultrapure))。 在将盐溶解后，使用冰醋酸将pH 调节至5.1+/-0.1。向这1升溶液 中加入250ml甲醇并给该溶液脱 气。将储器和柱保持在室温。
流速 0.7ml/分钟 检测器 30℃的折射率检测器 样品 在M9A培养基中10μl 注射无菌M9A生长培养基导致在色谱图上产生两个主要的峰。另外，如果分析不含葡萄糖、钙和镁盐的M9A，那么色谱图基本上没有改变。将葡糖胺注射到M9A中又产生了又一不同的单峰。在这些条件下，葡糖胺在约13分钟时洗脱其后有一极大的负峰。此外，通过改变pH、离子强度、甲醇(MeOH)浓度或辛磺酸盐的浓度增加分辨率并不成功。这种负向偏转始终跟随在葡糖胺峰之后。除去这类负向偏转的常用方式是用流动相稀释样品。然而，即使将样品稀释20倍也不会完全除去负向偏转且这类高稀释度对来自摇瓶或发酵罐的样品而言不实用。
发现使用峰高而不是峰面积积分允许500-10,000份/百万(ppm)的近似范围内的相当精确的葡糖胺定量。为了测定该范围，必须在M9A中而不是在水或流动相中制备标准品。因此，在M9A生长培养基中制备所有样品并也使用M9A生产任意稀释液。对每份样品的操作时间均为20分钟。
方法验证 首先，在M9A中制备数种葡糖胺的标准品。重复注射得到相当精确的(+/-5％)结果。
第二步，通过比色测定和HPLC分析摇瓶样品。获得的值一般在比色测定的10％内。因比色测定固有的标准偏差而不必期待HPLC与比色法之间非常接近的一致性。例如，通过比色法检测的两份样品(均为10,000ppm)得到的值为8.9和9.3g l-1。
第三步，向摇瓶样品中掺加已知量的葡糖胺并检测。未稀释的摇瓶样品产生1479ppm的值。在用等体积的5000-ppm葡糖胺标准品稀释后，稀释的摇瓶样品产生3440的值(预计为3240)。与预计值之间存在部分偏差很可能因M9A所致。实际上，单独的M9A产生100PPM左右的假葡糖胺＂值＂。
通过HPLC法和比色法检测摇瓶培养样品。结果如表11中所示。通过离心和过滤以除去颗粒而获得培养物上清液，并将所述培养上清储存在-20℃至分析为止。使用在M9A培养基中制备的单点2500ppm标准溶液校准HPLC。融化后，立即通过HPLC分析样品。所述样品在自动取样器中保存过夜后，再次被分析。两种方法之间的一致性极佳。将样品储存在-20℃时数周都没有显示出葡糖胺浓度下降。将过滤样品保持在室温过夜不会使葡糖胺浓度有任何下降。
表11.HPLC法与比色法用于葡糖胺定量时的比较*
*对培养样品进行离心并过滤以除去颗粒并储存在-20℃至实验时。使用融化的样品(0小时)进行HPLC分析，并在将样品在室温在自动取样器中保存过夜(24小时)后重复进行分析。葡糖胺浓度以PPM表示。
实施例13 本实施例描述了为进行N-乙酰氨基葡糖生产的葡糖胺-6-磷酸N-乙酰转移酶1基因(GNA1)的超表达。
下面的实施例描述了在重组大肠杆菌中不同的葡糖胺-6-磷酸N-乙酰转移酶1基因(GNA1)的克隆和超表达，以增加N-乙酰氨基葡糖的合成。使用含有来自酵母酿酒酵母(ScGNA1)、酵母白色念珠菌(CaGNA1)和高级植物拟南芥(AtGNA1)的GNA1基因的基于pET的表达载体证实了这种策略的可行性。
通过克隆pET载体中T7 lac启动子后面的GNA基因的编码序列并将重组pET质粒转入乳糖诱导的葡糖胺生产菌株大肠杆菌7107-18进行GNA1克隆和表达。通过SDS-PAGE和酶活性分析测定基因的功能性表达。在摇瓶实验中监测N-乙酰氨基葡糖的合成。
克隆酿酒酵母GNA1基因用于在大肠杆菌中超表达 为了克隆和表达酿酒酵母GNA1基因(ScGNA1)，基于GNA1基因的的公布序列(Murakami等，1995，Nat.Genet.10，pp.261-268，将该文献从全部内容引入本文作为参考)合成引物。使用聚合酶链反应(PCR)利用引物对来自酿酒酵母菌株S288C的基因组DNA的GNA1编码序列进行扩增。用于扩增的引物为正向引物07-83和反向引物07-84，且具有如下序列07-835′-GATCGGTCTCGCATGAGCTTACCCGATGGATTTTATATAAGGC-3′(SEQID NO35)；07-845′-GATCCTCGAGCTATTTTCTAATTTGCATTTCCACGCCTGC-3′(SEQIDNO36)。引物07-83含有Bsa I限制性内切核酸酶位点(GGTCTC，以SEQ ID NO35的5-10位核苷酸表示)，其后面是从ATG起始密码子开始的GNA1编码序列的31个核苷酸(以SEQ ID NO36的13-43位核苷酸表示)。引物07-84含有Xho I限制性内切核酸酶位点(CTCGAG，以SEQ ID NO36的5-10位核苷酸表示)，其后面是从翻译终止密码子开始的GNA1编码序列的30个核苷酸(以SEQ ID NO36的11-40位核苷酸表示)。使用标准方案进行PCR扩增以产生含有位于Bsa I和Xho I位点侧翼的完整ScGNA1编码序列的DNA片段。
将含有GNA1序列的PCR产物克隆入载体pCR-Script AmpSK(+)(Stratagene，LaJolla，CA)，产生质粒pSW07-60。通过Bsa I和Xho I消化从质粒PSW07-60中分离ScGNA1片段并克隆在表达载体pET24d(+)(Novagen，Inc.，Madison，WI)的Nco I和Xho I位点上，产生质粒SW07-60。按照这种方式克隆使ScGNA1序列位于pET24d(+)的T7-lac启动子之后，产生表达盒T7-lac-ScGNA1。
克隆白色念珠菌GNA1基因用于大肠杆菌超表达 为了克隆和表达白色念珠菌GNA1(CaGNA1)，基于GNA1的公布序列(Mio等，1999，J.Biol.Chem.274，pp.424-429，将该文献从全部内容引入本文作为参考)合成引物。利用PCR使用引物07-92和07-93从白色念珠菌ATCC10261基因组DNA扩增GNA1编码序列。正向引物07-92和反向引物07-93具有如下序列07-925′-GATCGGTCTCGCATGATGTTACCACAAGGTTATAC-3′(SEQ IDNO37)和07-935′-GATCCTCGAGCTAGAATCTACATACCATTTCAAC-3′(SEQ ID NO38)。引物07-92含有Bsa I限制性内切核酸酶位点(GGTCTC，以SEQ ID NO37的5-10位核苷酸表示)，后面是从ATG起始密码子开始的GNA1编码序列的23个核苷酸(以SEQ ID NO37的13-35位核苷酸表示)。引物07-93含有Xho I限制性内切核酸酶位点(CTCGAG，以SEQ ID NO38的5-10位核苷酸表示)，后面是从翻译终止密码子开始的GNA1编码序列的24个核苷酸(以SEQ ID NO38的11-34位核苷酸表示)。在标准条件下进行PCR扩增以产生含有位于Bsa I和Xho I位点侧翼的完整CaGNA1编码序列的DNA片段。
将含有CaGNA1序列的PCR产物连入载体pCR-Script Amp SK(+)(Stratagene，LaJolla，CA)的SrfI位点，产生质粒pKLN07-33。使用限制酶BsaI和XhoI从质粒pKLN07-33中分离CaGNA1片段，并将该片段克隆在表达载体pET24d(+)(Novagen，Inc.，Madison，WI)的Neo I和Xho I位点，产生质粒pKLN07-34和pKLN07-35。按照这种方式克隆将CaGNA1序列置于pET24d(+)的T7-lac启动子之后，产生表达盒T7lac-CaGNA1。
克隆拟南芥属(Arabidopsis)GNA1基因用于大肠杆菌中超表达 为了克隆和表达拟南芥GNA1(AtGNA1)，基于GNA1的公布序列(GenebankAL391144)合成引物07-94和07-95。使用PCR利用引物从BAC克隆F14F8(Arabidopsis Biological Resource Center DNA Stock Center，Columbus，OH)扩增GNA1编码序列。正向引物07-94和反向引物07-95具有如下序列07-945′-GATGGTCTCGCATGGCTGAGACATTCAAGATC-3′(SEQ ID NO.39)，和07-955′-GATCCTCGAGTTAATCGAAGTACTTAGACATTTGAATC-3′(SEQ ID NO40)。引物07-94含有Bsa I限制性内切核酸酶位点(GGTCTC，以SEQ ID NO39的4-9位核苷酸表示)，后面是从ATG起始密码子开始的GNA1编码序列的21个核苷酸(以SEQ ID NO39的12-32位核苷酸表示)。引物07-95含有Xho I限制性内切核酸酶位点(CTCGAG，以SEQ ID NO40的5-10位核苷酸表示)，后面是从翻译终止密码子开始的GNA1编码序列的24个核苷酸(以SEQ ID NO40的11-38位核苷酸表示)。使用标准方案进行PCR扩增以产生含有位于Bsa I和Xho I位点侧翼的完整CaGNA1编码序列的DNA片段。用限制性内切核酸酶Bsa I和Xho I消化PCR片段并克隆在表达载体pET24d(+)(Novagen，Inc.，Madison，WI)的Nco I和Xho I位点上，产生质粒pSW07-70。按照这种方式克隆将AtGNA1序列置于pET24d(+)的T7-lac启动子之后，产生表达盒T7lac-AtGNA1。
大肠杆菌中不同重组GNA1基因的功能性表达和N-乙酰氨基葡糖生产 将重组质粒pSW07-62(含有酿酒酵母GNA1基因)、pKLN07-34(含有白色念珠菌GNA1基因)和pSW07-70(含有拟南芥GNA1基因)转入大肠杆菌菌株7107-18，分别产生菌株7107-87、7107-117和7107-93。通过将空载体转入相同宿主生产对照菌株7107-88。按照标准方案，使转化体的细胞培养物生长在LB培养基中并用1mM IPTG诱导。从诱导过的培养物中取样进行SDS-PAGE分析以证实GNA1蛋白超表达。预计AtGNA1、CaGNA1和ScGNA1的蛋白质大小分别为17kDa、16.9kDa和18.1kDa。在来自表达不同GNA1基因的诱导培养物的样品中观察到了预计大小的超表达蛋白质。在所有情况中，超表达的蛋白质显示非常易溶。正如预计的，在对照菌株7107-88中没有观察到接近GNA1基因的预计大小的超表达蛋白质。
进行不同大肠杆菌菌株的筛选以证实重组GNA1基因的功能性表达。酿酒酵母、白色念珠菌和拟南芥GNA1表达载体的宿主菌株生长在补充了40g l-1葡萄糖，10g l-1核糖、5g l-1酵母提取物、0.6g l-1MgSO4-7H2O、0.05gl-1CaCl2-2H2O、25mg l-1卡那霉素和0.2mM IPTG的M9B生产培养基[6gl-1KH2PO4、24g l-1K2HPO4、1g l-1Na3柠檬酸盐-2H2O、10g l-1(NH4)2SO4(磷酸盐调节至pH7.4)+痕量金属(trace metal)(0.2mgl-1FeSO4-7H2O、0.015mgl-1ZnSO4-7H2O、0.015mg l-1MnSO4-H2O、0.001mg l-1CuSO4-5H2O、0.001mg1-1NaMoO4-2H2O、0.001mg l-1H3BO3和0.001mg l-1CoCl2-6H2O)]中。在24小时，基于HPLC结果加入总计30g l-1(NH4)2SO4/天的葡萄糖，并向水平已经下降至1g l-1以下的烧瓶中加入5g l-1(NH4)2SO4。一式两份的烧瓶中含有每种菌株，使得可以在24小时收集一个烧瓶，而在48小时收集另一个烧瓶用于酶分析和N-乙酰氨基葡糖及乙酸酯水平的测定。
检测葡糖胺合酶(GlmS)活性，且所有菌株均表现出良好的活性水平。还按照Mio等所述的方法检测了样品的葡糖胺-6-PN-乙酰转移酶(GNA1)的酶活性(Journal of Biological Chemistry，1999，274，pp.424-429(表12)。正如预计的，对照菌株没有表现出显著的GNA1活性水平。酵母和高等植物GNA1基因的表达产生高乙酰转移酶活性。这些GNA1转化体还合成了极高水平的N-乙酰氨基葡糖(表12和13)。表达来自酿酒酵母(7107-87)和白色念珠菌(7107-117)的GNA1基因的菌株中的乙酰转移酶活性相差无几。然而，在表达酿酒酵母基因的菌株中N-乙酰氨基葡糖产量高4倍。尽管含有拟南芥基因的菌株中的GNA1酶活性低于含有白色念珠菌基因的菌株中的GNA1酶活性，但是N-乙酰氨基葡糖产量是前者高于后者。显然GNA1活性水平与N-乙酰氨基葡糖产量之间不存在简单的相关性；来自不同来源的GNA1酶在酶的特征方面可能存在差异。所述数据证实不同GNA1基因在代谢改造中产生N-乙酰氨基葡糖的用途。在三种测试的GNA1基因中，酿酒酵母GNA1在N-乙酰氨基葡糖产生方面远优于其它。因此，选择酿酒酵母GAN1基因用于本发明公开的后面的研究工作。
表12.表达三种不同GNA1基因的菌株中葡糖胺合酶和乙酰转移酶的活性
1)以μmol分钟-1mg l-1蛋白表示的酶活性。
2)测定23小时时间点取的样品中的N-乙酰氨基葡糖浓度。
3)括号内的数字表示不同的姊妹体(sibling)。
菌株7107-18产生可以通过HPLC检测的高浓度葡糖胺。然而，在超表达乙酰转移酶基因的菌株中检测到极少或没有检测到游离的葡糖胺(低于0.5g l-1)。这清楚地表明在GNA1转化体中中间体葡糖胺-6-P没有显著增加，从而证实酶GNA1是高水平N-乙酰氨基葡糖产量的主要驱动力。
乙酸酯的累积是在大肠杆菌中获得高水平重组蛋白和其它发酵产物的公知障碍。在培养基中存在过量的葡萄糖时，大肠杆菌细胞倾向于合成高浓度的乙酸酯和其它有机酸，通常导致生长抑制。乙酸酯的产生已经成为葡糖胺生产型大肠杆菌菌株中的难题。然而，在对照菌株累积多-克水平的乙酸酯的条件下，N-乙酰氨基葡糖生产菌株在23小时的时间点累积很少或没有累积乙酸酯。N-乙酰氨基葡糖的合成消耗了乙酸酯形成的前体乙酰辅酶A。尽管乙酰辅酶A的利用是影响细胞的代谢负荷，但是使乙酰辅酶重新定向于N-乙酰氨基葡糖生产显然通过避免乙酸酯累积而显示出显著的有益性。重要的是注意产生N-乙酰氨基葡糖的菌株与对照菌株相比表现出较高的细胞密度(表13)。
表13.用不同GNA1表达构建体转化的大肠杆菌菌株中的细胞生长和N-乙酰氨基葡糖生产
不同GNA1酶的序列分析 在超表达各种GNA1基因的大肠杆菌菌株中观察到了在比活性和NAG产量方面的显著差异。然而，由于所有酶均催化相同的反应，所以可以预计各种GNA1在核苷酸与蛋白质水平上存在同源性。SEQ ID NO29含有酿酒酵母GNA1基因的编码序列。SEQ ID NO29编码由本文SEQ ID NO30表示的酿酒酵母GNA1氨基酸序列。SEQ ID NO33含有拟南芥GNA1基因的编码序列。SEQID NO33编码由本文SEQ ID NO34表示的拟南芥GNA1氨基酸序列。SEQ ID NO31含有白色念珠菌GNA1基因的编码序列。SEQID NO31编码由本文SEQ ID NO32表示的白色念珠菌GNA1氨基酸序列。当通过J.Hein DNA序列对比法(DNA Alignment method)(DNAStar参比)进行序列对比时，核苷酸序列表现出显著的同源性。ScGNA1和At-GNA1编码序列共有49.7％的同一性，而ScGNA1和CaGNA1编码序列共有53.1％的同一性。CaGNA1和AtGNA1编码序列共有47.2％的同一性。
通过Lipman-Pearson蛋白质序列蛋白法(DNAStar，Inc.，Madison，WI)进行序列对比时，将所述编码序列翻译成氨基酸序列揭示出各种GNA1蛋白中的显著同一性。正如在表14中观察到的，ScGNA1序列(SEQ ID NO30)与CaGNA1序列(SEQID NO32)共有44％的同一性，且与AtGNA1(SEQ IDNO34)序列共有38.9％的同一性。看起来一些区更为高度保守；例如，在所有序列中氨基酸GHIED均是保守的(与ScGNA1序列(SEQ ID N030)的96-100位氨基酸进行序列对比)。此外，相当于SEQ ID NO30的ScGNA1129-148位残基的20个残基的区是高度保守的。该区与CaGNA1序列中的相应区具有75％的同一性且与AtGNA1序列中的相应区具有70％的同一性。
表14.ScGNA1、AtGNA1和CaGNA1的肽大小和同源性
*括号内表示的是在核苷酸水平上的同源性。
实施例14 本实施例描述通过超表达大肠杆菌nagB和酿酒酵母GNA1构建生产N-乙酰氨基葡糖的菌株。
作为nag调节子的一部分的nagB基因编码葡糖胺-6-磷酸脱氨酶(NagB)、作为部分nag调节子参与N-乙酰氨基葡糖(GlcNAc)的分解代谢途经。Nag调节子由操纵子nagBACD和背驰转录的nagE组成(Plumbridge，JA.，1991，Mol.Microbiol.82053-2062)。外源性GlcNAc在被转入细胞时磷酸化，形成GlcNAc-6-P。编码N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸脱乙酰酶的nagA基因的产物将GlcNAc-6-P转化成GlcN-6-P。NagB随后催化GlcN-6-P转化成果糖-6-磷酸(F-6-P)。
大肠杆菌中的glmS基因产物催化脂多糖和肽聚糖形成途经中的必需中间体GlcN-6-P的合成。因此，具有缺陷型glmS的突变体依赖于外源性GlcN或GlcNAc。然而，已经证实NagB催化通常由GlmS进行的反应，使F-6-P转化成GlcN-6-P。实际上，具有表达葡糖胺-6-磷酸脱氨酶(nagB)的高拷贝质粒的glmS突变体的转化显示抑制了glmS突变(J Bac 1989 Dec；171(12)6589-6592)。由于NagB可以催化F-6-P转化成GlcN-6-P，所以可能nagB取代我们的生产菌株中的glmS*54而超表达可以使葡糖胺累积。如果T7lac-ScGNA1盒也存在于该菌株中，那么可以使GlcN-6-P转化成GlcNAc-6-P并在培养基中作为NAG累积。
为了检测通过超表达nagB基因生产葡糖胺或N-乙酰氨基葡糖的效率，将用于GNA1克隆和整合的方法和方案用于在大肠杆菌7101-19(DE3)的pfkB位点克隆和整合T7lac-nagB表达盒。内源性glmS基因也需要在该菌株中失活。glmS序列位于glmU序列的下游并在glmS启动子序列上游没有明显的启动子。看起来glmU和glmS形成操纵子glmUS。通过PCR从大肠杆菌基因组DNA扩增glmS序列和一些侧翼序列，并将其克隆入质粒载体。利用适宜的限制酶切消化除去来自glmS序列的内部片段。将含有内部缺失的glmS序列连入温敏复制起点和卡那霉素选择标记以产生整合载体。将温度选择方案用于选择具有glmS缺失的突变体。由于葡糖胺是细胞壁合成必需的，所以需要在培养基中提供葡糖胺以便于突变体生长。
克隆nagB基因用于在大肠杆菌中超表达 使用基于大肠杆菌nagB基因的公布序列的信息(Peri等，1990，Biochem.Cell Biol.68，pp.123-137，将该文献的全部内容引入本文作为参考)，设计用于扩增nagB编码序列的引物。使用正向引物07-141和反向引物07-142、通过PCR从大肠杆菌W3110基因组DNA扩增nagB编码序列，所述的正向引物07-141和反向引物07-142具有如下序列07-1415′-GATGGTCTCGCATGAGACTGATCCCCCTGAC-3′(SEQ ID NO43)和07-1425′-GATCCTCGAGTTACAGACCTTTGATATTTTCTGCTTCTAATTC-3′(SEQID NO44)。
引物07-141含有Bsa I限制性内切核酸酶位点(GGTCTC，以SEQ IDNO43的4-9位核苷酸表示)，所述位点后面是从ATG起始密码子开始的nagB编码序列的20个核苷酸(以SEQ ID NO43的12-31位核苷酸表示)。引物07-142含有Xho I限制性内切核酸酶位点(CTCGAG，以SEQ ID NO45的5-10位核苷酸表示)，所述位点后面是从翻译终止密码子开始的nagB编码序列的33个核苷酸(以SEQ ID NO44的11-43位核苷酸表示)。大肠杆菌nagB编码序列和NagB氨基酸序列分别由SEQ ID NO41和SEQ ID NO42表示。
用限制性内切核酸酶Bsa I和Xho I消化含有nagA编码序列的PCR片段并连入质粒pET24d(+)(Novagen，Inc.，Madison，WI)的Nco I和Xho I位点，生产质粒pSW07-93。按照这种方式克隆使nagB序列位于pET24d(+)的T7-lac启动子之后，形成表达盒T7-lac-nagB。
nagB基因的超表达 将质粒pSW07-93#3、#8和#16转入菌株7101-17(DE3)，分别产生菌株7107-636、7107-637和7107-638。还将pET24d(+)质粒转入菌株7101-17(DE3)以产生阴性对照菌株7107-639。进行标准诱导实验，其中使转化体的细胞培养物生长在LB培养基中并用1mM IPTG诱导。在不同时间点从诱导的培养物中取样以通过SDS-PAGE证实NagB蛋白的超表达。超量生产的NagB蛋白的预计大小为29.8kDa。在菌株7107-636和7107-637中超量产生了相当于预计大小NagB的蛋白质。在对照菌株7107-639中显然没有超量产生这种大小的蛋白质。诱导后2小时的蛋白质样品显示出超量产生的NagB蛋白大部分存在可溶性级分中。然而，在诱导后4小时，仅有约25％的蛋白质出现在可溶性部分中。
染色体中pfkB基因座上的T7lac-nagB盒的整合 已经证实了NagB的成功表达，下一步是将T7lac-nagB表达盒整合入大肠杆菌7101-17(DE3)的染色体。决定对大肠杆菌染色体的pfkB基因进行靶向整合。pfkB基因编码提供存在于大肠杆菌中的总果糖磷酸激酶活性的10％的稀有果糖磷酸激酶。因此，对该位点进行靶向整合不应影响生长或N-乙酰氨基葡糖的产生。
需要数个克隆步骤来研发载体以指导T7lac-nagA盒在菌株7101-17(DE3)的染色体中的pfkB处的整合。第一步是克隆含有pfkB编码序列及其侧翼区的大肠杆菌基因组的区。基于的公布序列设计引物(Blattner等，1997，Science227(5331)1453-1474)以便从大肠杆菌W3110基因组DNA扩增pfkB与侧翼基因组区。用于通过PCR扩增pfkB区的引物07-16和07-17具有如下序列07-165′-GATCGCCGGCTTACATGCTGTAGCCCAGC-3′(SEQ ID NO45)和07-175′-GATCCTGCAGTCATGCTGCTAATAATCTATCC-3′(SEQ ID NO46)。
引物07-16含有Nae I位点(GCCGGC，以SEQ ID NO45的5-10位核苷酸表示)，并从pfkB编码序列起始密码子上游的1045个核苷酸处扩增(以SEQ ID NO45的11-29位核苷酸表示)。引物07-17加入了Pst I位点(CTGCA G，以SEQ ID NO46的5-10位核苷酸表示)，并从pfkB终止密码子下游的1357个碱基对处扩增(以SEQ ID NO46的11-32位核苷酸表示)。将含有pfkB与侧翼区的3332个碱基对的PCR产物连入pPCR-Script AmpSK(+)(Stratagene，LaJolla，CA)的SrfI位点产生质粒pKLN07-14。
在标准PCR条件下使用正向引物07-145和反向引物07-146由质粒pSW07-93#3(参见上文)扩增T7-lac-nagB盒。所述引物具有如下序列07-1455′-GATCTACGTAAGCAACCGCACCTGTGGC-3′(SEQ ID NO47)和07-1465′-GATCCAATTGATCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAGC-3′(SEQ ID NO48)。
引物07-145含有SnaB I位点(TACGTA，以SEQ ID NO47的5-10位核苷酸表示)并由T7启动子上游的76个核苷酸处扩增(以SEQ ID NO47的11-28位核苷酸表示)。引物07-146含有Mfe I位点(CAATTG，以SEQ IDNO48的5-10位核苷酸表示)并由T7终止子下游的25个碱基对处扩增(以SEQ ID NO48的11-36位核苷酸)。
下一个克隆步骤是将T7lac-nagB盒连入质粒pKLN07-14。用限制性内切核酸酶Snab I和Mfe I消化质粒pKLN07-14以除去pfkB编码序列的523-bp部分。用限制性内切核酸酶Snab I和Mfe I消化含有T7lac-nagB盒的PCR片段并连接在pKLN07-14的SnaB I和Mfe I位点，产生质粒pSW07-97。质粒pSW07-97由此含有pfkB与侧翼基因组区，该侧翼基因组区中pfkB编码序列的523个核苷酸的区被T7lac-nagB盒取代。
用限制性内切核酸酶Not I和Sal I由质粒pSW07-97消化含有ORFb1722-DpfkB::T7-lac-nagB-ORFb1725与部分pPCR-Script MCS的片段。用限制性内切核酸酶Not I和Sal I从质粒pKLN07-21(上述)切下含有温敏复制子与卡那霉素抗性盒的片段。将两种片段彼此连接，产生质粒pSW07-98。
将质粒pSW07-98用于产生在染色体的DpfkB上含有T7/ac-nagB的大肠杆菌菌株。在用pSW07-98转化大肠杆菌7101-17(DE3)后，将温度选择方案用于选择含有整合在pfkB位点的T7-lac-nagB的菌株。将所得菌株命名为7107-645并通过标准高度严格Southern印迹杂交、使用nagB编码序列作为探针验证菌株。
含有整合的T7lac-nagB盒的大肠杆菌菌株中glmS基因的缺失 为了缺失glmS基因，研发glmS序列取代载体大肠杆菌菌株7107-645。需要数个步骤构建该载体。第一步是扩增含有glmS基因与侧翼序列的基因组区。接下来将该片段与来自pKLN07-21(上述)的含有温敏复制子和卡那霉素抗性盒的片段连接。最终可以从所得质粒中切下glmS编码序列的部分，产生使glmS缺失靶向至大肠杆菌基因组的整合型载体。
为了进行第一步，基于glmS基因与侧翼区(参比)的公布序列合成引物。这些引物用于从大肠杆菌W3110基因组DNA扩增含有glmU、glmS和pstS基因的片段。将用于扩增的引物命名为07-139和07-140，且它们具有如下序列07-139，5′-GATGCGGCCGCATGTTGAATAATGCTATGAGCGTAGTGATC-3′(SEQ IDNO49)和07-140，5′-GATCGTCGACTTAGTACAGCGGCTTACCGCTACTGTC-3′(SEQ IDNO.50)。
正向引物07-139含有从其ATG起始密码子开始的glmU编码序列的前30个核苷酸(以SEQ ID NO49的12-41位核苷酸表示)，其前面是Not I限制性内切核酸酶位点(GCGGCCGC，以SEQ ID NO49的4-11位核苷酸表示)。反向引物07-140含有从其翻译终止密码子开始的pstS编码序列的最后27个核苷酸(以SEQ ID NO50的11-37位核苷酸表示)，前面是Sal I限制性内切核酸酶位点(GTCGAC，以SEQ ID NO50的5-10位核苷酸表示)。在标准条件下进行PCR以产生含有位于Not I和Sal I限制性内切核酸酶位点侧翼的glmU-glmS-pstS编码序列的片段。
用限制性内切核酸酶Not I和Sal I消化PCR片段。用限制性内切核酸酶Not I和Sal I从质粒pKLN07-21(上述)中切下温敏复制子与卡那霉素抗性盒片段。将两种片段彼此连接，产生质粒pSW07-94#43. 用限制性内切核酸酶Sac II消化质粒pSW07-94#43以除去glmS编码序列的980个核苷酸。将该质粒的剩余部分与其自身连接，产生整合载体pSW07-95。
在尝试改善重组频率以便在大肠杆菌染色体上产生glmS突变的过程中，还通过向质粒pSW07-95中添加glmU上游区域的772个核苷酸构建质粒pSW07-99。基于glmU基因与侧翼区(参比)的公布的序列合成引物。这些引物用于从大肠杆菌W3110基因组DNA扩增含有glmU起始密码子上游的772个核苷酸和glmU编码序列的前246个核苷酸的片段。将用于扩增的引物命名为07-147和07-148且它们具有如下序列07-147，5′-GATGCGGCCGCATGGCAATGACTTACCACCTGGAC-3′(SEQ ID NO51)和07-148，5′-CGTACCCAGCTGCTCTGCCTGAAGCACCC-3′(SEQ ID NO52)。
正向引物07-147含有atpC编码序列的前24个核苷酸(以SEQ ID NO51的12-35位核苷酸表示)，其前面是Not I限制性内切核酸酶位点(GCGGCCGC，以SEQ ID NO51的4-11位核苷酸表示)。反向引物07-148含有从ATG起始密码子下游的246个碱基对处开始的glmU编码序列的29个核苷酸(以SEQ ID NO52的1-29位核苷酸表示)。在标准条件下进行PCR以产生含有从atpC起始密码子到glmU编码序列的246位核苷酸的基因组DNA区的片段。用限制性内切核酸酶Not I和SexA I消化PCR产物并连入质粒pSW07-95#6的Not I和SexA位点，产生质粒pSW07-99。
将质粒pSW07-95和pSW07-99用于产生在染色体上具有glmS缺失的大肠杆菌菌株。在用质粒pSW07-95或pSW07-99转化大肠杆菌菌株7107-645(20)、7107-645(30)和7107-645(43)后，将温度选择方案用于选择含有glmS缺失的菌株。将葡糖胺(2g l-1)加入到所有烧瓶中进行传代并在传代后加入所有平板。使用标准PCR方案选择并筛选glms缺失的卡那霉素敏感性菌株。将通过PCR鉴定的可能存在glmS缺失的菌株铺至不添加葡糖胺的LB平板，以便发现生长的减慢。一些菌株在LB平板上有限地生长，而其它菌株没有表现出生长。通过在高严格条件下使用2.0-kb含有glmS编码序列的片段进行Southern杂交证实这些菌株含有glmS缺失，将所得菌株命名为7107-646。
nagB的功能性表达和对葡糖胺产生的影响 进行摇瓶筛选61(Shake Flask Screen 61)以检测菌株7107-646的葡糖胺产量和酶活性。在含有补充了10g l-1葡萄糖、0.6g l-1MgSO4-7H2O、0.05gl-1CaCl2-2 H2O和0.2mM IPTG的M9B生长培养基[6g l-1KH2PO4、24gl-1K2HPO4、1g l-1Na3柠檬酸盐-2H2O、10g l-1(NH4)2SO4(磷酸盐调节至pH 7.4)+痕量金属(0.2mg l-1FeSO4-7H2O、0.015mg l-1 ZnSO4-7H2O、0.015mgl-1MnSO4-H2O、0.001mg l-1CuSO4-5H2O、0.001mg l-1NaMoO4-2H2O，0.001mgl-1H3BO3和0.001mg l-1CoCl2-6H2O)的烧瓶中检测菌株。使培养物在30℃生长24小时且然后置于25℃。在24和48小时时将各培养物的pH调节至7.2。在24和48小时时，将葡萄糖加入到烧瓶中至每天总计约30g l-1，并向水平下降至1g l-1以下的烧瓶中加入5g l-1(NH4)2SO4。在24和48小时时取样并使用如美国专利US6,372,457中所述改进的Elson-Morgan试验测定培养物上清液中的葡糖胺浓度。在任意样品中均未检测到葡糖胺。在48小时的时候，检测来自菌株7107-646#7和7107-646#20的样品的NagB活性。与对照菌株7101-17(DE3)中没有检测到活性相比，这些菌株具有58和53mmol分钟-1mg-1的酶活性，表明成功地超表达了nagB。在本实验中7107-646菌株的生长盒对照菌株7101-17(DE3)一样好或优于所述对照菌株这一事实表明超表达的nagB能够抑制glmS突变。然而，nagB的超表达不会使葡糖胺累积增加。
T7lac-ScGNA1盒的整合 nagB在glmS缺失菌株中超表达没有导致葡糖胺累积，可能是由于NagB通常催化GlcN-6-P的脱氨基作用这一事实。由NagB酶产生的少量GlcN-6-P可以迅速被转化回果糖-6-P，从而防止了任何GlcN-6-P的累积，然而，如果导入GNA1酶，那么GNA1可以将GlcN-6-P转化成GlcNAc-6-P并连续驱动由果糖-6-磷酸形成葡糖胺-6-磷酸。为了检测这种可能性，将T7lac-ScGNA1盒整合在菌株7107-646(3)和7107-646(7)的manXYZ处。使用如实施例16中详述的质粒pSW07-68#25进行GNA1整合。通过标准PCR方案筛选manXYZ缺失位点处存在T7lac-ScGNA1的卡那霉素敏感性菌株。通过标准高度严格Southern杂交、使用含有ScGNA1编码序列的片段作为探针验证PCR阳性的菌株。检测分别来源于菌株7107-646(3)和7107-646(7)的所得菌株7107-660和7107-661的NAG累积。
nagB的功能性表达和大肠杆菌中N-乙酰氨基葡糖生产 进行摇瓶筛选67以检测含有glmS缺失、位于pfkB的T7lac-nagB盒和位于manXYZ的T7lac-ScGNA1盒的菌株的葡糖胺产量。使菌株7107-660(1)、7107-660(4)、7107-661(1)、7107-661(2)和7107-661(3)以及对照菌株7101-17和7107-607(2)生长在含有补充了g l-1葡萄糖、10g l-1乳糖、0.6g l-1MgSO4-7H2O和0.05g l-1CaCl2-2 H2O的M9B生长培养基(上述)的烧瓶中。使培养物在37℃生长8小时且然后置于30℃。接种后8小时，加入葡萄糖至25g l-1并将pH调节至7.2。在24、31、48和56小时时，基于HPLC结果加入葡萄糖至每天总计30-40g l-1，在水平低于1g l-1的烧瓶中加入(NH4)2SO4至5g l-1，并将pH调节至7.2。在27小时时，加入乳糖至5g l-1。在24、48和72小时使取样以便对NAG浓度进行HPLC分析。在72小时时收集细胞培养物以检测葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶(GNA1)、葡糖胺合酶(GlmS)和葡糖胺-6-磷酸脱氨酶(NagB)活性。
酶分析证实7107-660和7107-661菌株缺乏功能性GlmS蛋白。正如预计的，在这些菌株中NagB活性升高。葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶活性与对照菌株7107-607(2)中观察到的相似，表明了在这些菌株中GNA1蛋白的功能性表达。
超表达nagB和GNA1的glmS缺失菌株能够产生N-乙酰氨基葡糖(表15)。菌株7107-661性能最佳，产生了使用生产型菌株7107-607#2获得的NAG浓度的75％。感兴趣的是，菌株7107-660(1)表现出的NagB活性低于其它姊妹体20倍且结果产生浓度低得多的GlcNAc。看起来葡糖胺-6-P乙酰转移酶在指导葡糖胺-6-磷酸形成的过程中有助于驱动NagB催化的反应。数据证实了N-乙酰氨基葡糖合成的新生物途经的功能性。此外，nagB与GNA1的联合超表达是在大肠杆菌中生产N-乙酰氨基葡糖的有效方法。
表15.超表达nagB的glmS突变菌株中的酶活性和GlcNAc生产
1)测定在72小时的时间点所取样品的酶活性和N-乙酰氨基葡糖浓度。2)以μmol分钟-1mg-1蛋白表示的酶活性。
3)括号内的数字表示不同的姊妹体。
实施例15 本实施例描述用于菌株7107-18中生产N-乙酰氨基葡糖的glmM和glmU基因的克隆和超表达。
在大肠杆菌中，glmN和glmU基因编码催化GlcN-6-P转化成UDP-GlcNAc这前三步的酶。需要UDP-GlcNAc合成必需的细胞包膜成分。GlmM通过两步乒乓反应(ping-pong reaction)机制催化GlcN-6-P与GlcN-1-P的互变，其中GlcN-1，6-二磷酸用作第一产物和第二底物。已知GlmM仅在磷酸化形式时具有活性，不过尚不了解体内酶的活化。在以高水平过量生产GlmM的菌株中，磷酸化的酶的总量没有增加，表明GlmM磷酸化的水平可以受到严格调节(Mengin-Lecreulx和van Heifenoort，J.Biol.Chem.199627132-39)。GimU是含有单独的尿苷酰转移酶(N-末端)和乙酰转移酶(C-末端)结构域的双功能酶。乙酰转移酶结构域负责催化将GlcN-1-P转化成GIcNAc-1-P；然后尿苷酰转移酶结构域将GlcNAc-1-P转化成UDP-GlcNAc。在近期的公开文献中，表达的GlmU的截短形式具有N-末端His6 tags并检测其乙酰转移酶和尿苷酰转移酶活性(Pompeo等，J.Biol.Chem.2001 2763833-3839)。通过使蛋白质缺失前78个N-末端氨基酸残基获得GlmU截短形式，其具有的尿苷酰转移酶活性相对于全长GlmU减少1320倍。这种截短的GlmU蛋白保留了在全长GlmU中观察到的乙酰转移酶活性的66％。
图14表示细菌途经，通过该途经GlcN-6-P经GlmM和GlmU酶的作用被转化成UDP-GlcNAc。glmM、glmU、截短的glmU或glmM与glmU的组合的超表达可以使N-乙酰氨基葡糖累积于培养基中。因此，构建用于超表达这些基因的菌株。
用于在大肠杆菌中超表达的glmM基因的克隆 为了克隆和表达大肠杆菌glmM基因，基于公布的glmM基因的公开序列(Mengin-Lecreulx，and van Heij enoort，J.Biol.Chem.，1996，27132-39)合成引物。在标准条件下通过PCR、使用正向引物07-163和反向引物07-164由大肠杆菌W3110基因组DNA扩增glmM编码序列。所述引物具有如下序列07-1635′GATCGGTCTCGCATGAGTAATCGTAAATATTTC3′(SEQ IDNO59)和07-1645′GATCCTCGAGTTAAACGGCTTTTACTGCATC3′(SEQID NO60)。
引物07-163含有Bsa I限制性内切核酸酶位点(GGTCTC，以SEQ IDNO59的5-10位核苷酸表示)，其后面是从ATG起始密码子开始的glmM编码序列的21个核苷酸(以SEQ ID NO59的13-33位核苷酸表示)。引物07-164含有Xho I限制性内切核酸酶位点(CTCGAG，以SEQ ID NO60的5-10位核苷酸表示)，其后面是从翻译终止密码子开始的glmM编码序列的21个核苷酸(以SEQ ID NO60的11-31位核苷酸表示)。大肠杆菌glmM编码序列和GlmM氨基酸序列分别用SEQ ID NO53和SEQ ID NO54表示。在标准条件下进行PCR扩增以产生含有位于Bsa I和Xho I限制性内切核酸酶位点侧翼的完整glmM编码序列的DNA片段。PCR产物用限制酶Bsa I和Xho I消化并连接在质粒pET24d(+)(Novagen，Inc.，Madison，WI)的Nco I和Xho I位点上，产生质粒pSW07-109。按照这种方式克隆使glmM序列置于pET24d(+)的T7lac启动子之后，产生T7lac-glmM表达盒。
克隆glmU基因用于在大肠杆菌中超表达 为了克隆和表达大肠杆菌glmU基因，基于公布的glmU基因序列(Mengin-Lecreulx，和van Heijenoort，，J.Bac.，1993，1756150-6157)合成引物。在标准条件下通过PCR、使用正向引物07-161和反向引物07-162由大肠杆菌W3110基因组DNA扩增glmU编码序列。所述引物具有如下序列07-1615′GATCGGTCTCGCATGTTGAATAA TGCTATGAGC3′(SEQ ID NO61)和07-1625′GATCCTCGAGTCACTTTTT CTTTACCGGACGAC3′(SEQID NO62)。
引物07-161含有Bsa I限制性内切核酸酶位点(GGTCTC，以SEQ IDNO61的5-10位核苷酸表示)，其后面是从ATG起始密码子开始的glmU编码序列的21个核苷酸(以SEQ ID NO61的13-33位核苷酸表示)。引物07-162含有Xho I位点(CTCGA G，以SEQ ID NO62的5-10位核苷酸表示)，其后面是从翻译终止密码子开始的glmU编码序列的23个核苷酸(以SEQ IDNO62的11-33位核苷酸表示)。分别将大肠杆菌glmU编码序列和GlmU氨基酸序列表示为SEQ ID NO55和SEQ ID NO56。在标准条件下进行PCR扩增以产生含有位于Bsa I和Xho I限制性内切核酸酶位点侧翼的完整glmU编码序列的DNA片段。PCR产物用限制酶Bsa I和Xho I消化并连接在质粒pET24d(+)(Novagen，Inc.，Madison，WI)的Nco I和Xho I位点，产生质粒pSW07-108。按照这种方式克隆使glmM序列置于pET24d(+)的T7lac启动子之后，产生T7lac-glmU表达盒。
N-末端截短的GlmU酶(GlmUt)的克隆和表达 在标准条件下通过PCR、使用正向引物07-165和反向引物07-162由大肠杆菌W3110基因组DNA扩增截短的glmU编码序列。引物07-165具有如下序列07-1655′GATGGTCTCGCATGGAGCAGCTGGGTACGGGTC3′(SEQ ID NO63)。
引物07-165含有Bsa I限制性内切核酸酶位点(GGTCTC，以SEQ IDNO63的4-9位核苷酸表示)和从ATG起始密码子下游232bp处开始的glmU CDS序列(以SEQ ID NO63的15-33位核苷酸表示)。这一结果导致glmU蛋白的前77个氨基酸缺失。还将起始密码子掺入引物07-165。使用引物07-165和07-162产生的PCR产物含有前77个氨基酸残基缺失的glmU编码序列。分别将大肠杆菌N-末端截短的glmU编码序列和N-末端截短的GlmU氨基酸序列表示为SEQ ID NO57和SEQ ID NO58。PCR产物用Bsa I和Xho I消化并连接在质粒pET24d(+)(Novagen，Inc.，Madison，WI)的Nco I和Xho I位点上，产生质粒pSW07-110。按照这种方式克隆使截短的glmM(glmUt)序列置于pET24d(+)的T7lac启动子之后，产生T7lac-glmUt表达盒。
大肠杆菌中GlmM、GlmU和GlmUt蛋白的超表达 将含有glmU、glmM或glmUt的质粒pSW07-108、pSW07-109和pSW07-110转入菌株7101-17(DE3)，产生表16中所列的菌株。将空载体pET24d(+)转入菌株7101-17(DE3)，产生对照菌株7107-22。进行标准诱导实验，其中使转化体的细胞培养物生长在LB培养基中并用1mM IPTG诱导。从在不同时间点处经过诱导的培养物中取样进行SDS-PAGE以验证蛋白质的超表达。GlmU、GlmM和GlmUt蛋白的预计大小分别为51kDa、50kDa和42kDa。在来自超表达glmU、glmM或glmUt的菌株的样品中观察到了SDS-PAGE上预计大小的蛋白质带。在对照菌株中没有观察到接近GlmU、GlmM和GlmUt预计大小的超表达蛋白质。通过SDS-PAGE测定来自诱导过的培养物的全部和可溶性部分。正如通过目测估计判定的，约20％的GlmU蛋白在可溶性部分中。然而，使用截短形式的GlmU蛋白几乎没有观察到可溶性蛋白。类似地，几乎没有可溶性形式的GlmM蛋白。
表16.含有用于产生GlmU、N-末端截短的GlmU和GlmM蛋白的不同质粒的菌株

T7lac-glmU和T7lac-glmUt在nag缺失位点的整合 SDS-PAGE凝胶表明GlmU和GlmUt蛋白在大肠杆菌中成功超表达。因此，研发将表达盒整合入生产型菌株7107-18的染色体的策略。为整合选择的靶为菌株7107-18染色体上nag缺失的位点。在构建葡糖胺生产菌株的早期阶段中，nag操纵子缺失，并且在用由菌株IBP590生产的噬菌体进行P1转导后将四环素抗性盒插入染色体中的缺失位点(Plumbridge，1989，Mol.Microbiol.3506-515；Plumbridge，1991，Mol.Microbiol.52053-2062；Plumbridge，1992，J.Gen.Microbiol.1381011-1017)。因此，对染色体的该区进行靶向整合不应影响菌株的生长或葡糖胺产生。
作为研发T7lac-glmU盒在染色体nag缺失位点的靶向整合的载体的策略的组成部分，通过PCR由质粒pSW07-108#1扩增T7lac-glmU片段。在标准条件下使用引物GNT7nagA1-5和07-120进行PCR。所述引物具有如下序列GNT7nagA1-55′GCGACGCTCTCCCGGGTGCGACTCCTGCATTA3′(SEQ ID NO64)和07-1205′GATCTGTACAATCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAGCAAAAAACCCC3′(SEQ ID NO65)。
正向引物GNT7nagA1-5引入了Xma I限制性内切核酸酶位点(CCCGGG，以SEQ ID NO64的11-16位核苷酸表示)并从T7启动子上游的296个碱基对处扩增。引物07-120含有BsrG I限制性内切核酸酶位点(TGTACA，以SEQ ID NO65的5-10位核苷酸表示)并由T7终止子下游的25个碱基对处扩增。
质粒pCALG43(实施例29中所述)含有位于生产菌株的nag缺失的侧翼序列、来自pMAK705(Hamilton等，1989，J.Bac.171(9)4617-4622，将该文献的全部内容引入本文作为参考)的温敏复制子和质粒pUC4K(AmershamPharmacia Biotech，Piscataway，NJ)的卡那霉素抗性盒。含有T7lac-glmU盒的PCR产物用限制酶Xma I和BsrG I消化并连接在pCALG43的Age I和BsrGI位点上。可以用所得质粒pSW07-112指导将T7lac-glmU盒直接整合到我们的生产菌株的染色体的nag缺失位点。
为了产生用于将T7lac-glmU(截短的)盒整合在Dnag的质粒，使用相同的策略和PCR引物，但将质粒pSW07-110#53用作PCR模板。将所得质粒命名为pSW07-113。
质粒pSW07-112和pSW07-113用于产生含有整合在染色体上nag缺失位点上的T7lac-glmU盒或T7lac-glmUt盒的大肠杆菌菌株。在用所述质粒转化大肠杆菌7107-18后，将实施例13中所述的温度选择方案用于选择含有所述插入片段的菌株。通过PCR筛选在nag缺失位点存在glmU表达盒的卡那霉素敏感菌落。通过在高严格条件下使用截短的glmU PCR产物作为探针进行Southern杂交验证PCR阳性的菌株。证实菌株7107-678和7107-679含有在nag缺失位点整合的T7lac-glmU。证实菌株7107-680和7107-681含有在nag缺失位点整合的T7lac-glmUt。
T7lac-glmM在glg缺失位点的的整合 SDS-PAGE凝胶证实GlmM蛋白在大肠杆菌中成功超表达。因此，研发将T7lac-glmM盒整合入生长菌株7107-18的染色体的策略。为整合选择的靶为glg操纵子。glg区被预先靶向缺失以通过阻断糖原合成途经而增加通过葡糖胺和N-乙酰氨基葡糖生产途经的碳流。这种突变对生长或NAG产生没有有害影响。因此，在该染色体位点上整合T7lac-glmM盒应不会对生产菌株产生负面影响。
作为研发在染色体glg位点的靶向整合的载体的策略的组成部分，通过PCR由质粒pSW07-109#29扩增T7lac-glmM片段。在标准条件下使用引物GNT7nagA1-5和GNT7nagA2-3进行PCR。所述引物具有如下序列GNT7nagA1-55′GCGACGCTCTCCC GGGTGCGACTCCTGCATTA3′(SEQID NO66)和GNT7nagA2-35′GCGCTAATCAAGTTTTCCCGGGTCGAGGTGCCGTAA3′(SEQ ID NO67)。
正向引物GNT7nagA1-5引入了Xma I位点(CCCGG G，以SEQ ID NO66的11-16位核苷酸表示)，并从T7启动子上游的296个碱基对处扩增。引物GNT7nagA2-3也引入了Xma I位点(CCCGGG，以SEQ ID NO67的17-22位核苷酸表示)并从T7终止子下游的25个碱基对扩增。所得PCR产物用限制性内切核酸酶Xma I消化并连入质粒pCALG28-2(实施例29中所述)的Age I位点。该过程产生其中的T7lac-glmM盒与glg操纵子以同向连接的质粒pSW07-111#3和其中的T7lac-glmM盒与glg操纵子以反向连接的pSW07-111#4。这些质粒可以用于指导将T7lac-glmM整合在生长菌株的glg区。
在用质粒pSW07-111#3或pSW07-111#4转化大肠杆菌7107-18后，将温度选择方案用于选择含有位于glg位点上的T7-lac-glmM的菌株。在高严格条件下使用glmM编码序列作为探针进行Southern杂交。证实菌株7107-682含有整合在染色体中glg位点的T7-lac-glmM(与中断的glg基因同向的glmM CDS)。证实菌株7107-683含有整合在染色体中的glg位点的T7-lac-glmM(与中断的glg基因反向的glmM CDS)。
GlmM/GlmU试验 检测含有超表达的GlmM(变位酶)、GlmU(乙酰转移酶/尿苷酰转移酶)和N-末端截短的GlmU的各种菌株。在从这种筛选中选出的菌株中检测这些酶的活性。使用葡糖胺-1-磷酸到葡糖胺-6-P方向中的偶联的反应检测磷酸葡糖胺变位酶(GlmM)。使用葡糖胺-6-P脱氨酶(NagB)、葡糖磷酸异构酶和葡萄糖-6-P脱氢酶将形成的葡糖胺-6-P定量转化成6-磷酸葡糖酸。形成NADH允许在340nm的条件下监测反应。使用葡糖胺-1-磷酸和乙酰辅酶A检测葡糖胺-1-磷酸乙酰转移酶(GlmU)。使用试剂二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在终点试验中测定形成的游离辅酶A。在410nm处监测游离辅酶A的形成。
将酶的活性水平以及葡糖胺和N-乙酰氨基葡糖的水平概括在表17中。在含有天然形式或N-末端截短形式的超表达GlmU的菌株中产生了大量N-乙酰氨基葡糖。所述酶的活性一般比仅表现出低水平活性的对照菌株7017-18高30-50倍。在这些菌株中还形成了大量游离的葡糖胺。GlmM蛋白的超表达不会产生较高的活性。在本实验条件下，单独超表达GlmM不会形成大量N-乙酰氨基葡糖。此外GlmM和GlmU的超表达不导致相对GlmU菌株而言的增加的N-乙酰氨基葡糖水平。正如文献中报导的，GlmM酶受磷酸化调节，这在本文并未叙述。预计不受磷酸化调节或具有其它改善的动力学特征的GlmM突变酶的产生和应用可以增加通过GlmS-GlmM-GlmU或NagB-GlmM-GlmU途经合成N-乙酰氨基葡糖的效率。
表17.分析超表达GlmM、GlmU和GlmUt(N-末端截短的GlmU)的菌株
*所有所列的重组基因在T7启动子控制下超表达。
glmps＝葡糖胺合成酶 glmM＝磷酸葡糖胺变位酶 glmU＝葡糖胺-1-磷酸乙酰转移酶 glmUt＝N-末端截短形式的GlmU。
实施例16 本实施例描述将T7lac-ScGNA1盒的一个或多个拷贝整合入葡糖胺或N-乙酰氨基葡糖生产菌株的染色体。
使用载体pET24d(+)超表达ScGNA1导致在72小时的培养后产生的N-乙酰氨基葡糖为24g l-1(表1)。为了避免在培养物中使用抗生素和使N-乙酰氨基葡糖产量最大化，决定将T7lac-ScGNA1表达盒整合入染色体。由于并不了解多少个拷贝的T7lac-ScGNA1表达盒使NAG产量最优化，所以决定将该盒的多个拷贝整合入染色体。基于被靶向的基因对细胞生长或N-乙酰氨基葡糖产生而言并非必需的推定来选择整合的插入位点。选择4个靶位点manXYZ、fcuIk、treB和melAB。
13中所述的一般温度选择策略和方案适用于染色体中GNA 1的整合。研发了不同温敏整合型载体，它们各自含有温敏复制起点、抗生素选择标记和T7lac-ScGNA1表达盒。就每种载体而言，从重组质粒pSW07-62#25中分离T7lac-ScGNA1表达盒并插入克隆自目的整合位点的大肠杆菌DNA序列的片段。将整合载体转入大肠杆菌宿主菌株并使用变温步骤选择含有整合的ScGNA的克隆。
可以将相同方法和方案用于整合来自不同来源的其它GNA1同源物。预计本领域技术人员可进行修改和改变以使这些方法和方案适用于各具体基因。这类修改和改变包括、但不限于将不同限制位点用于克隆和整合在染色体中的不同位置。
manXYD位点上GNA1的整合(GNA1的一个拷贝) 亚克隆T7lac-ScGNA1表达盒以便在7107-18中的染色体manXYZ位点上进行整合。大肠杆菌manXYD是编码甘露糖吸收和磷酸化过程中涉及的三种蛋白质复合物的操纵子。该操纵子可以缺失而不会影响大肠杆菌在含有葡萄糖作为碳源的培养基中生长。为了在manXYZ位点上整合GNA1基因，研发含有大肠杆菌manXYZ序列的质粒。基于大肠杆菌manXYZ的公布序列(Blattner等，1997，Science 277(5331)，pp.1453-1474，将该文献的全部内容引入本文作为参考)合成引物以便使用标准PCR方法从大肠杆菌W3110基因组DNA扩增manXYZ操纵子及其侧翼区用于扩增的引物为正向引物07-87和反向引物07-88，它们具有如下序列07-875′GATGCGGCCGCACTGCAGTAATTACCGCATCCAAC3′(SEQ IDNO68)和07-885′GATGTCGACACCGATTGATGCAGCAAATGCATCC3′(SEQ ID NO69)。
引物07-87含有Not I限制性内切核酸酶位点(GCGGCCGC，以SEQ IDNO68的4-11位核苷酸表示)且起始于manX ATG起始密码子上游的905个碱基对处。引物07-8含有SalI位点(GTCGAC，以SEQ ID NO69的4-9位核苷酸表示)，并从来自manZ翻译终止密码子下游的1010个碱基对处开始。使用标准方案进行PCR以产生含有manXYZ与位于Not I和Sal I限制位点侧翼的侧翼区的片段。将该片段克隆入载体pCR○2.1-TOPO○(Invitrogen，Carlsbad，CA)，产生质粒pSW07-65#7。
为了在manXYZ中产生缺失，用限制酶HpaI消化质粒pSW07-65#7。该过程释放含有大部分manXYZ编码序列的质粒的2647bp的部分。另外，使用限制性内切核酸酶NaeI从质粒pSW07-62#25(上文实施例13中所述)上切下T7lac-ScGNA1片段。质粒pSW07-62#25在T7启动子上游的46个碱基对处和T7终止子下游的164个碱基对处含有Nae I位点。将含有T7lac-ScGNA1序列的Nae I片段连入pSW07-65#7的Hpa I位点。由于这种连接为平端连接时，T7lac-ScGNA1片段可以以任意方向连入质粒。因此，将限制酶消化用于筛选含有以与manXYZ相同方向插入的T7lac-ScGNA1盒的质粒。将所得质粒命名为pSW07-66#25。
为了产生温敏整合型载体，使用限制酶Not I和Sal I从质粒pKLN07-21上切下含有pMAK705(Hamilton等，1989，J.Bac.171(9)4617-4622，将该文献的全部内容引入本文作为参考)的温敏复制子和质粒pUC4K(AmershamPharmacia Biotech，Piscataway，NJ)的卡那霉素抗性盒的片段。如下构建质粒pKLN07-21通过PCR由质粒pSW07-4(实施例6中所述)扩增温敏复制子将PCR产物与载体pPCR-ScriptTM(+)(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)连接，并添加来自质粒pUC4K(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)的卡那霉素抗性盒。
用限制酶Not I和Sal I切下含有来自质粒pSW07-66#25的T7lac-ScGNA1以及manXYZ侧翼区的片段。然后将该片段与含有来自pKLN07-21的温敏复制起点和卡那霉素抗性标记的Not I/Sal I的片段连接，产生质粒pSW07-68#5。该质粒具有温敏复制起点、卡那霉素抗性标记和位与manXYZ基因座的5′上游和3′下游序列侧接的T7lac-ScGNA1表达盒。
用质粒pSW07-68#5产生含有在manXYZ位点上整合的T7lac-ScGNA1的大肠杆菌菌株。正如美国专利US6,372,457中所述，通过P1噬菌体转导使菌株7107-18中的manXYZ操纵子突变。在用pSW07-68#5转化大肠杆菌菌株7107-18后，将实施例6中所述的温度选择方案用于选择含有在manXYZ位点上整合的T7lac-ScGNA1序列的菌株。通过PCR筛选fuc调节子上存在T7lac-ScGNA1盒的卡那霉素敏感性菌株。通过使用标准高度严格条件并以ScGNA1编码序列作为探针进行Southern印迹杂交验证菌株。将所得含有一个拷贝的T7lac-ScGNA1的菌株命名为7107-92。
GNA1的第二个拷贝在fucIK位点的整合 使T7lac-ScGNA1的第二个拷贝的整合于编码利用L-果糖作为可选碳源中所涉及的酶的染色体的区域。fucP(编码L-岩藻糖通透酶)、fucI(编码L-岩藻糖异构酶)、fucK(编码L-fuculose激酶)和fucU(未知蛋白)基因形成L-岩藻糖异化中涉及的操纵子。fucR基因编码激活L-岩藻糖异化调节子的调节蛋白。在岩藻糖操纵子上整合T7lac-ScGNA1盒不应影响大肠杆菌在含有葡萄糖作为碳源的培养基中生长的能力，也不应影响其合成N-乙酰氨基葡糖的能力。
作为研发靶向fuc区的整合载体的策略的组成部分，基于岩藻糖调节子的公布序列(Chen等Mol.Gen.Genet.1987 210331-337)合成引物。在标准PCR条件下使用引物07-113和07-114由大肠杆菌W3110基因组DNA扩增FucIKU和fucR基因，所述的引物具有如下序列07-135′GATGCGGCCGCGCAAGGCAACAGCAAACTGGC-3′(SEQ IDNO.70)和07-1145′-GATCGGATCCTCAGGCTGTTACCAAAGAAGTTGCAACCTGGC-3′(SEQIDNO.71)。
引物07-113含有Not I限制性内切核酸酶位点(GCGGCCGC，以SEQ IDNO70的4-11位核苷酸表示)，并从fucl ATG起始密码子下游的824bp处扩增(以SEQ ID NO70的12-32位核苷酸表示)。引物07-114含有BamH I位点(GGATCC，以SEQ ID NO71的5-10位核苷酸表示)，其后面是在翻译终止密码子开始的fucR编码序列的32个核苷酸(以SEQ ID NO71的11-42位核苷酸表示)。在标准条件下进行PCR以产生含有位于BamH I和Not I限制性内切核酸酶位点侧翼的fucIKU和fucR序列的片段。将该片段连入pPCR-Script Amp SK(+)(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)，产生质粒pSW07-75。用限制性内切核酸酶消化质粒pSW07-75，除去含有部分fucl和fucK基因的1239个碱基对片段。
使用标准条件通过PCR由质粒pSW07-62#25扩增T7lac-ScGNA1盒。使用正向引物07-115和反向引物07-112进行PCR扩增，所述的引物具有如下序列07-1155′GATCTGTAC AAGCAACCGCACCTGTGGC3′(SEQ IDNO72)和07-1125′GATCAGCGCTACCGGATATAGTTCCTCCTTTCAGCAAAAAACCCC3′).(SEQ ID NO73)。
引物07-115含有BsrG I位点(TGTACA，以SEQ ID NO72的5-10位核苷酸表示)并从pSW07-62#25的T7启动子序列上游的76个碱基对处扩增。引物07-112含有Afe I位点(AGCGCT，以SEQ ID NO73的5-10位核苷酸表示)并在pSW07-62#25的T7终止子序列下游的25个碱基对处扩增。所述PCR片段用BsrG I和Afe I消化并连入质粒pSW07-75的BsrG I和HpaI位点，产生质粒pSW07-76。该重组质粒含有连入fucIK缺失位点的T7lac-ScGNA1盒。
为了产生温敏整合型载体，使用限制酶Not I和Kpn I从质粒pKLN07-21中切下含有pMAK705(Hamilton等，1989，J.Bac.171(9)4617-4622，将该文献的全部内容引入本文作为参考)的温敏复制子和质粒pUC4K(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)的卡那霉素抗性盒的片段。如下构建质粒pKLN07-21通过PCR扩增来自质粒pSW07-4(实施例6中所述)的温敏复制子，将PCR产物连入载体pPCR-ScriptTMSK(+)(StratageneCloning Systems，La Jolla，CA)，并添加来自质粒pUC4K(Amersham PharmaciaBiotech，Piscataway，NJ)的卡那霉素抗性盒。
用限制酶Not I和Kpn I切下含有来自质粒pSW07-76的T7lac-ScGNA1与fuc侧翼区的片段。然后将该片段与含有来自pKLN07-21的温敏复制起点和卡那霉素抗性标记的Not I/Kpn I片段连接，产生质粒pSW07-77。该质粒具有温敏复制起点、卡那霉素抗性标记和位于fuc调节子的5′上游和3′下游序列侧翼的T7lac-ScGNA1表达盒。质粒pSW07-77可以用于将T7lac-ScGNA1盒直接整合在大肠杆菌的fuc调节子上。
将质粒pSW07-77转入菌株7107-92#1。将温度选择方案用于选择含有在ΔfucIK位点上整合的T7lac-GNA1序列的菌株。将所得菌株命名为7107-607(2)、7107-607(3)和7107-607(4)。
GNA1的第三个拷贝在treB位点的整合 使T7-lac-ScGNA1盒的第三个拷贝的整合于编码利用海藻糖(trehalose)作为可选碳源中涉及的酶的染色体区。编码海藻糖转运蛋白和海藻糖6-P水解酶的treB和treC基因分别形成操纵子。treR基因编码控制可由海藻糖-6-磷酸诱导的操纵子的阻抑蛋白(Horlacher，R.，和Boos，W.，1997，J.Biol.Chem.，272(20)13026-13032)。当使用上述靶物时，在海藻糖调节子上整合T7lac-ScGNA1不应影响大肠杆菌在含有葡萄糖作为碳源的培养基中生长的能力，也不应影响其合成N-乙酰氨基葡糖的能力。
作为研发靶向treB区的整合型载体的策略的组成部分，基于的公布序列合成引物以从大肠杆菌W3110基因组DNA(Blattner等，1997，Science227(5331)1453-1474)扩增treR、treB和treC基因。使用引物07-117和07-118进行PCR扩增，所述的引物具有如下序列5′GAGCGGCCGCATGCAAAATCGGCTGACCATC3′(SEQ ID NO74)和07-1185′GATCGGGCCCTTACTTCTGTAACCACCAGACAGCCTC3′(SEQID NO75)。
引物07-117含有Not I限制位点(GCGGCCGC，以SEQ ID NO74的3-10位核苷酸表示)，其后面是来自ATG缺失密码子的treR编码序列的21个核苷酸(以SEQ ID NO75的11-31位核苷酸表示)。引物07-118含有ApaI位点(GGGCCC，以SEQ ID NO75的5-10位核苷酸表示)，其后面是从翻译终止密码子开始的treC编码序列的27个核苷酸(以SEQ ID NO75的11-37位核苷酸表示)。使用标准方案进行PCR扩增以产生含有位于Not I和Apa I限制位点侧翼的treR、treB和treC基因的DNA片段。将4.2bp PCR产物连入质粒pPCR-ScriptTMSK(+)(Stratagene Gloning Systems，La Jolla，CA)，产生质粒pSW07-78#20。
用限制性内切核酸酶Bgl II消化质粒pSW07-78#20并用T4DNA聚合酶在标准条件下处理以使该片段末端钝化。接下来用限制性内切核酸酶BsrG1消化该平端化片段。终止用Bgl II和BsrG I的双重消化导致从质粒pSW07-78#20中除去了treB编码序列的130个碱基对的区，得到了含有一端为粘端(BsrG I)、一端为平端的质粒。
下一步是将T7lac-ScGNA1盒连入质粒pSW07-78#20的BsrG I和BglII(填平的)位点。为了达到该目的，在标准条件下使用正向引物07-115(SEQID NO72)和反向引物07-112(SEQ ID NO73)通过PCR从质粒pSW07-62#25扩增T7lac-ScGNA1盒。引物07-115含有BsrG I位点(TGTACA，以SEQ ID NO72的5-10位核苷酸表示)并从pSW07-62#25的T7启动子序列上游的76个碱基对处扩增。引物07-112含有Afe I位点(AGCGCT，以SEQ ID NO73的5-10位核苷酸表示)并从pSW07-62#25的T7终止子序列下游的25个碱基对处扩增。所述PCR片段用BsrG I和Afe I消化并连入质粒pSW07-78#20的BsrG I和Bgl II(填平的)位点，产生质粒pSW07-83。
为了产生温敏整合型载体，使用限制酶Not I和Apa I从质粒pKLN07-21中切下含有pMAK705(Hamilton等，1989，J.Bac.171(9)4617-4622，将该文献的全部内容引入本文作为参考)的温敏复制子和质粒pUC4K(AmershamPharmacia Biotech，Piscataway，NJ)的卡那霉素抗性盒的片段。
用限制酶Not I和Kpn I切下含有来自质粒pSW07-83的T7lac-ScGNA1与tre侧翼区的片段。将该片段与含有温敏复制起点和卡那霉素抗性标记的来自pKLN07-21的Not I/Apa I片段连接，产生质粒pSW07-84。质粒pSW07-84可以用于将T7lac-ScGNA1盒直接整合在大肠杆菌的treB。
将质粒pSW07-84#1转入菌株7107-607(2)、7107-607(3)和7107-607(4)。将温度选择方案用于选择含有在treB位点上整合的T7-lac GNA1序列的菌株。通过PCR筛选在染色体中的treB处存在T7lac-ScGNA1盒的卡那霉素敏感性菌落。通过使用标准高严格条件并用ScGNA1编码序列作为探针进行Southern印迹杂交来验证菌株，所述的探针含有在染色体上整合的T7lac-ScGNA1盒的三个拷贝。将这些菌株命名为7107-608(1)和7107-608(2)。
GNA1的第四个拷贝在melRAB位点的整合 使T7-lac-ScGNA1的第四个拷贝的整合靶向染色体的melR和melAB区。在大肠杆菌中，该区编码蜜二糖(melibiose)吸收和水解中涉及的蛋白质。分别编码α-半乳糖苷酶和蜜二糖通透酶的melA和melB基因形成操纵子。背驰转录的melR基因编码蜜二糖操纵子的调节物。当使用上述靶物整合时，在基因组的melAB处整合T7lac-ScGNA1不应影响大肠杆菌在含有葡萄糖作为碳源的培养基中生长的能力，也不应影响其合成N-乙酰氨基葡糖的能力。
作为研发靶向melAB区的整合型载体的策略的组成部分，基于以从大肠杆菌melR、melA和melB基因的公布序列(Blattner等，1997，Science 227(5331)1453-1474)合成引物07-122和07-123。在标准条件下进行PCR以从大肠杆菌W3110基因组DNA扩增含有melR、melA和melB基因的片段。正向引物07-122和反向引物07-123具有如下序列07-1225′GATGCGGCCGCTTAGCCGGGAAACGTCTGGCGGC3′(SEQ IDNO76)和07-1235′GATCGTCGACTCAGGCTTTCACATCACTCACTGCACC3′(SEQ ID NO77)。
引物07-122含有Not I限制性内切核酸酶位点(GCGGCCGC，以SEQ IDNO76的4-11位核苷酸表示)，其后面从翻译终止密码子开始的melR编码序列的23个核苷酸(以SEQ ID NO76的12-34位核苷酸表示)。引物07-123含有Sal I限制性内切核酸酶位点(GTCGAC，以SEQ ID NO77的11-37位核苷酸表示)，其后面是从翻译终止密码子开始的melB编码序列的27个核苷酸(以SEQ ID NO77的11-37位核苷酸表示)。将含有位于Not I和Sal I限制性内切核酸酶位点侧翼的melR和melAB编码序列的PCR片段连入载体pPCR-Script Amp SK(+)(Stratagene)，产生质粒pSW07-81#5。
载体构建中的下一步是将T7lac-ScGNA1盒连入质粒pSW07-81#5的melAB区。用限制性内切核酸酶Bgl II和AsiS I消化质粒pSW07-81#5，除去含有完整melA编码序列和melB编码序列前199个核苷酸的长度为1676个碱基对的片段。
在标准条件下使用正向引物07-124和反向引物07-125通过PCR从质粒pSW07-62#25扩增T7lac-ScGNA1盒，所述引物具有如下序列07-1245′GATGGATCCAGCAACCGCACCTGTGGC3′(SEQ ID NO78)and07-1255′GATGCGATCGCTATAGTTCCTCCTTTCAGCAAAAAACCC3′(SEQ IDNO79)。
引物07-124含有BamH I位点(GGATCC，以SEQ ID NO78的4-9位核苷酸表示)并从pSW07-62#25的T7启动子上游的76个碱基对处扩增。引物07-125含有AsiS I位点(GCGATCGC，以SEQ ID NO79的4-11位核苷酸表示)并从pSW07-62#25的T7终止子下游的18个碱基对处扩增。用限制性内切核酸酶BamH I和AsiS I消化含有T7lac-ScGNA1的PCR片段，并将该片段与来自pSW07-81#5的Bgl II和AsiS I连接，产生质粒pSW07-82。质粒pSW07-82由此含有载体pPCR-Script(AmpSK(+)中的mel基因，其中1676个碱基对的melAB区被T7lac-ScGNA1盒取代。
为了产生温敏整合型载体，使用限制酶Not I和Sal I从质粒pKLN07-21上切下含有pMAK705(Hamilton等，1989，J.Bac.171(9)4617-4622，将该文献的全部内容引入本文作为参考)的温敏复制子和质粒pUC4K(AmershamPharmacia Biotech，Piscataway，NJ)的卡那霉素抗性盒的片段。
用限制性内切核酸酶Not I和Sal I消化质粒pSW07-82，分离含有被T7lac-ScGNA1盒中断的mel基因的片段。然后将该片段与来自质粒pKLN07-21的、含有温敏复制起点和卡那霉素抗性标记的Not I和SalI片段连接。可以将所得产生质粒pSW07-84用于将T7lac-ScGNA1盒直接整合在大肠杆菌的melAB上。
将质粒pSW07-84转入菌株7107-608(1)和7107-608(2)。将实施例6中所述的温度选择方案用于选择含有在melAB位点整合的T7-lac GNA1序列的菌株。通过PCR筛选在染色体中的melAB处存在T7lac-ScGNA1盒的卡那霉素敏感性菌落。通过使用标准高严格条件并以ScGNA1编码序列作为探针进行Southern杂交验证菌株含有整合在染色体上的T7lac-ScGNA1盒的四个拷贝。将这些从7107-608(1)和7107-608(2)得到的菌株分别命名为7107-612和7107-613。
还将质粒pSW07-84转入菌株7107-607(2)、7107-607(3)和7107-607(4)以便将T7lac-ScGNA1的第三个拷贝加入到染色体上。如上所述筛选菌株并通过使用标准高严格条件并以ScGNA1编码序列作为探针进行Southern印迹杂交验证该菌株含有整合在染色体上的T7lac-ScGNA1盒的三个拷贝。将这些从菌株7107-607(2)、7107-607(3和7107-607(4)得到的菌株分别命名为7107-609、7107-610和7107-611。
GNA1基因拷贝数对GNA1表达水平和N-乙酰氨基葡糖生产的影响 为了评价基因拷贝数对GNA1表达水平和N-乙酰氨基葡糖生产的影响，在摇瓶中检测含有不同拷贝数的整合的T7lac-ScGNA1盒的菌株。取样以通过酶活性实验分析GNA1蛋白质表达并测定NAG滴度。
进行摇瓶筛选53以评价整合的T7lac-ScGNA1盒的拷贝数对葡糖胺合酶(GlmS)活性、葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶(GNA1)活性和N-乙酰氨基葡糖产生的影响。使菌株生长在含有补充了0.6g l-1MgSO4-7H2O、0.05gl-1CaCl2-2H2O、10g l-1葡萄糖、40g l-1乳糖、5g l-1核糖和5g l-1酵母提取物的M9B生长培养基(上述)中。使培养物在30℃生长第一个24小时且然后置于25℃。在24和48小时时间点时将培养物的pH调节至7.2，基于HPLC结果将葡萄糖加入到各烧瓶中至每天总计约30g l-1，并向铵水平下降至1g l-1以下的烧瓶中加入5g l-1(NH4)2SO4。在24、48小时和72小时时取样以评价NAG产生和酶的试验。检测的所有菌株均生长至OD600相似并具有相似的的葡糖胺合酶活性(表18)。对于含有具有最高比活性的三个拷贝的菌株而言，发现在葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶与T7lac-ScGNA1拷贝数之间存在显著相关性。然而，这种增加的比活性不会使摇瓶实验中的NAG产量增加。
表18.含有整合在染色体中的T7-lac-ScGNA1盒的多个拷贝的菌株的生长、酶活性和GlcNAc产量的比较
1)从72小时时间点测定的酶活性和N-乙酰氨基葡糖水平。
2)以μmol分钟-1mg-1蛋白表示的酶活性。
3)括号内的数字表示不同的姊妹体。
对在1升发酵罐中的含有不同拷贝数的整合的T7lac-ScGNA1盒的菌株的评价 在1-L发酵罐中评价分别含有1-4个拷贝的整合的T7lac-ScGNA1盒的菌株7107-92(1)、7107-607(2)、7107-608(2)和7107-612(1)。将发酵罐237-240的起始体积设定为475ml。发酵培养基中的成分如表19中所列。使用75％NH4OH进行发酵以控制pH在6.9。在整个发酵过程中将温度维持在37℃。调节通气和搅拌以维持溶解氧浓度为空气饱和度的20％。以受到计算机程序控制的进料速率给培养物补充65％的葡萄糖以便在接种时获得0.40小时-1的生长率且到6小时时获得最大生长率5ml-1小时。用在第10小时按5g l-1添加的食品级乳糖来诱导培养物，同时连续补充葡萄糖。
表19.用于检测GNA1拷贝数对N-乙酰氨基葡糖产量的影响的发酵培养基
*痕量金属组成为5m l-1 FeSO4-7H2O、3.75mg l-1 ZnSO4-7H2O、0.6mgl-1MnSO4-H2O、0.1002mg l-1CuSO4-5H2O和0.1002mg l-1CoCl2-6H2O。
将发酵结果概括如下。GNA1盒拷贝数对NAG水平具有轻度影响。截至到发酵结束，含有T7lac-ScGNA1盒的三个拷贝的菌株7107-608(2)产生的NAG比含有该盒的一个拷贝的菌株高16％以上，且比含有该盒的两个拷贝的菌株高5％以上。在本实验中，添加T7lac-ScGNA1的第四个拷贝不会获得超过菌株7107-608(2)的改善。不过，在生产菌株中增加T7lac-ScGNA1拷贝数的应用已经得到验证。
实施例17 本实施例描述磷酸化的糖对葡糖胺合酶的影响。
在有不同磷酸化的糖存在的情况下检验葡糖胺合成酶的活性。由在乳糖诱导的条件下在摇瓶中生长24小时的7017-18细胞生产粗酶提取物。将结果概括在下表20中。数据表明以前观察到的葡糖胺-6-P在相对高浓度下对葡糖胺合成酶表现出强抑制作用。葡糖胺-1-P在10mM下也抑制该酶。使用N-乙酰氨基葡糖磷酸酯没有观察到抑制作用。
表20.不同磷酸化的糖类对大肠杆菌葡糖胺合酶GlmS*54的影响
实施例18 本实施例描述磷酸化的糖类对其它与N-乙酰氨基葡糖合成相关的酶的生化作用。
上述有关磷酸化的糖类(诸如葡糖胺-6-P这类化合物)的潜在毒性作用的讨论限于氨基糖类代谢中直接涉及的酶。然而，在糖代谢受影响的各种突变体中长期观察到了糖毒性的一般现象。这种现象通常归因于产生了异常高水平的磷酸化的糖中间体的累积，这些中间体抑制一种或多种酶靶并在代谢上毒害细胞。GlmS的产物抑制是这种情况的一个实例。
图3提示了其它可能靶物的许多可能性。涉及氨基糖代谢中受影响的突变体的论文(J.Bacteriol.101384.1970)描述了这种现象并证实戊糖类可以逆转这种抑制作用。因此，葡糖胺-6-P和N-乙酰氨基葡糖-6-P对数种酶的影响得到检验。
据在公开文献(Arch.Biochem.Biophys.64489.1956)中报导葡糖胺-6-P为Pgi抑制剂。图15表示Pgi(两种氨基糖类的葡糖磷酸异构酶抑制作用)。使用两种化合物都观察到了抑制作用，但使用N-乙酰氨基葡糖-6-PI的抑制作用明显较低。
葡糖胺-6-P被报导为为葡糖磷酸异构酶抑制剂(J.Biol.Chem.21667.1955)。图16表示磷酸化的氨基糖类对葡萄糖-6-P进入戊糖磷酸途经的进入点即葡萄糖-6-P脱氢酶(zwf)的影响。看起来葡糖胺-6-P是比N-乙酰氨基葡糖-6-P的更有效的抑制剂。使用葡糖磷酸变构酶(Pgm)观察到了类似的倾向。
葡糖胺-6-P对上述和碳水化合物代谢中可能涉及的其它酶的抑制作用当然可以解释在7017-18中观察到的对葡糖胺生产能力的表观上限(apparentceiling)。据推断高浓度的葡糖胺-6-P干扰数种酶的活性。据推定向该途经中添加乙酰转移酶(GNA1)baonei的葡糖胺-6-P胞内水平明显降低。这当然是生产能力增加与N-乙酰氨基葡糖稳定性增强的主要原因。
N-乙酰氨基葡糖-6-P确实不会在进行的体外试验中显著抑制Zwf或Pgi。核糖和葡糖酸对细胞生长和N-乙酰氨基葡糖合成的正面影响提示戊糖磷酸途经中的一个或多个步骤受到磷酸化的氨基糖类的影响。另一方面，葡糖胺N-乙酰转移酶不会显示N-乙酰氨基葡糖-6-P的任何明显产物抑制。
实施例19 本实施例描述了发酵罐中N-乙酰氨基葡糖生产过程中的酶活性。
在发酵罐中检验了与N-乙酰氨基葡糖产量相关的各种酶活性。检测的酶为葡糖胺合酶(GlmS)、葡糖胺N-乙酰转移酶(GNA1)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，其为戊糖磷酸途经中的关键酶(参见图3)。
含有GNA1质粒的菌株(发酵罐#102) 在来自发酵102的7017-87(25)样品中检验了相关酶的活性。该菌株含有质粒上的乙酰转移酶基因构建体。该试验(run)产生80g/l的N-乙酰氨基葡糖。酶活性和N-乙酰氨基葡糖浓度的结果如图17中所示。诱导后迅速观察到了高乙酰转移酶活性，且其在整个试验中保持较高。感兴趣的是，乙酰转移酶活性甚至在90+小时时仍存在，而截至到此时葡糖胺合成酶活性已经消失。N-乙酰氨基葡糖生产在约70小时时基本上停止。在整个试验中葡萄糖-6-P脱氢酶活性保持恒定。
含有整合的GNA1构建体的菌株(发酵罐#121-128) 这些试验使用含有整合的乙酰转移酶构建体的大肠杆菌菌株7017-92(1)。检验的发酵变量为培养基中加入的铁量、附加离子的进料和磷酸盐缓冲液的水平(1X＝40g l-1)。将酶活性概括在表21中。除发酵121中使用的最低铁水平外，整个实验过程中在其它7个发酵罐中，葡糖胺合成酶和乙酰转移酶活性极高。正如上述观察到的，乙酰转移酶活性倾向于保持在高水平上。葡糖胺合成酶活性在另外补充或不补充铁时检验的其它铁浓度(5-20PPM)条件下显然足够。较低的铁产生了较高的N-乙酰氨基葡糖活性，而葡糖胺合成酶活性较低。这种降低的活性对于高N-乙酰氨基葡糖产量显然足够。
表21.N-乙酰氨基葡糖发酵中酶的活性(发酵罐#121-128)
注意 1)培养基中的铁水平为FeSO4-7H2O的量(mg l-1)。
2)向以5μg FeSO4-7H2O/g葡萄糖在葡萄糖补料过程中提供铁进料。
3)磷酸盐浓度1X＝40g l-1磷酸钾。
实施例20 本实施例描述用于生产葡糖胺和N-乙酰氨基葡糖的酿酒酵母的代谢改造。具体地，将编码产物抗性葡糖胺合酶、大肠杆菌glmS*54和枯草芽孢杆菌glmS的基因和编码葡糖胺-6-磷酸N-乙酰转移酶的酿酒酵母GNA1基因克隆入酵母表达载体并导入酵母用于超表达。
用于上述葡糖胺和N-乙酰氨基葡糖生产的实施例中所述的主要元件为产物抗性GlmS酶和GNA1酶的超表达。在诸如酿酒酵母和白色念珠菌这类含有天然GNA1基因的宿主中，超表达产物抗性GlmS可以使N-乙酰氨基葡糖的生产水平提高。然而，氨基糖类的主要产物可以为葡糖胺或N-乙酰氨基葡糖。为了生产N-乙酰氨基葡糖作为主要产物，需要超表达GNA1基因。
葡糖胺降解是尝试在中性发酵pH条件下生产葡糖胺的瓶颈。由于诸如酿酒酵母的酵母和细菌适合于相对低的pH，且在葡糖胺可保持稳定4-5的pH范围内正常生长，在这种类型宿主中超表达产物抗性GlmS酶可以研发出可直接用于葡糖胺生产的商业化可行的方法。此外，由于酿酒酵母为GRAS生物体且不会产生内毒素，所以对于所述产物应用而言它可以是生产葡糖胺/N-乙酰氨基葡糖的优选发酵宿主。
用于在酵母中表达的大肠杆菌突变体glmS*54基因的克隆 将大肠杆菌突变体glmS*54基因克隆入表达载体yEp352-ADH1。使用标准技术由yEp352(Hill等，1986 Yeast 2163-167)衍生该载体。它复制至每个酵母细胞含多个拷贝，且它含有醇脱氢酶(ADH)启动子和终止子，该载体含有用于在大肠杆菌中进行选择的氨苄西林抗性标记和用于在酵母中进行选择的URA3标记。
为对大肠杆菌突变体glmS*54基因的编码序列进行PCR扩增设计正向引物nMD7107-021和反向引物nMD7107-022。将限制位点掺入末端以有利于克隆。在标准条件下使用正向引物nMD7107-021(Sac I)和反向引物nMD7107-022(Hind III)通过PCR扩增glmS*54编码序列，所述引物具有如下序列nMD7107-021(Sac I)5′-AGCTGAGCTCATGTGTGGAATTGTTGGCGCGA-3′(SEQ IDNO80)和nMD7107-022(Hind III)5′-TACGAAGCTTACTCAACCGTAACCGATTTTGC-3′(SEQ ID NO81)。引物nMD7107-021含有以SEQ ID NO80的11-32位核苷酸表示的glmS*54编码序列的22个核苷酸，而引物nMD7107-022含有以SEQ ID NO81的9-32位核苷酸表示的glmS*54编码序列的24个核苷酸。
将含有大肠杆菌glmS*54基因的质粒pKLN23-54(描述在美国专利US6,372,457中)用作PCR反应中的DNA模板。在标准PCR条件下使用Taq聚合酶产生了预计大小的PCR产物的单一带。所述PCR产物用限制酶SacI和Hind III消化、通过琼脂糖-凝胶纯化并克隆入用相同酶预消化的yEP352-ADH-1载体。在氨苄西林选择时将DNA连接产物转入大肠杆菌Top10细胞(获自Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)。首先通过PCR、使用正向和反向引物筛选菌落的10个收集物(10/收集)。然后通过PCR鉴定阳性收集物中的各个克隆并通过限制酶切消化验证。重组质粒MD7107-238和MD7107-239含有在具有ADH启动子和终止子的酵母表达盒中的大肠杆菌glmS*54基因。
按照Geitz等(1995)所述的LiOAc法将重组质粒转入酿酒酵母SWY5细胞。该酵母菌株含有ura和his营养缺陷型选择标记。在补充了20mg l-1L-组氨酸的SCE-(SCE-minus)培养基的平板上选择酵母转化体(表22)。分析转化的酵母细胞系以确定GlmS和GNA1活性以及葡糖胺和N-乙酰氨基葡糖的水平。
表22.用于酵母生长的SCE-培养基
克隆枯草芽孢杆菌glmS基因用于在酵母中表达 将枯草芽孢杆菌野生型glmS克隆入表达载体yEp352-ADH1。合成正向引物nMD7107-023和反向引物nMD7107-024以便扩增枯草芽孢杆菌野生型glmS基因的编码序列。将限制位点掺入末端以有利于克隆。在标准条件下使用正向引物nMD7107-023和反向引物nMD7107-024通过PCR扩增glmS编码序列，所述引物具有如下序列nMD7107-023(Kpn I)5′-AGCTGGTACCATGTGTGGAATCGTAGGTTATATC-3′(SEQ ID NO82)和nMD7107-024(Sph I)5′-TACGCATGCTTACTCCACAGTAACACTCTTCGC A-3′(SEQ ID NO83)。引物nMD7107-023含有以SEQ ID NO82的11-34位核苷酸表示的glmS编码序列的24个核苷酸，而引物nMD7107-024含有以SEQ ID NO83的10-34位核苷酸表示的glmS编码序列的25个核苷酸。
将含有芽孢杆菌glmS基因的质粒pSW07-15#83(描述在实施例2中的质粒)用作PCR反应中的DNA模板。在标准PCR条件下使用Taq聚合酶产生了预计大小的PCR产物的单一带。用适宜的限制酶消化PCR产物、通过琼脂糖-凝胶纯化并克隆入用相同的酶预消化的yEP352-ADH-1载体。在氨苄西林选择时将DNA连接产物转入大肠杆菌Top 10细胞(获自InvitrogenLife Technologies，Carlsbad，CA)。首先通过PCR、使用正向和反向引物筛选菌落的10组收集物(10个/每组收集物)。然后通过PCR鉴定阳性收集物中的各克隆并通过限制酶切消化验证。重组质粒MD7107-240和MD7107-241含有酵母表达盒中的芽孢杆菌属glmS基因以及ADH启动子和终止子。
将重组质粒转入酿酒酵母SWY5细胞。在补充了20mgl-1L-组氨酸的SCE-培养基的平板上选择酵母转化体。分析转化的酵母细胞系以确定GlmS和GNA1活性和葡糖胺和N-乙酰氨基葡糖的水平。
克隆酿酒酵母GNA1用于在酵母中超表达 使用限制性内切核酸酶EcoR I和SacI由质粒pSW07-60#3(上述实施例13中所述)消化含有ScGNA1编码序列的片段。将所得片段连入穿梭载体pADH313-956的EcoR I和Sac I位点。按照这种方式克隆将ScGNA1编码序列置于ADH1启动子与终止子之间。该载体含有组氨酸选择标记。将所得质粒pSW07-114(#1和#18)转入酿酒酵母SWY5细胞。在补充了酵母20mg1-1尿嘧啶的SCE-培养基的平板上选择酵母转化体。分析转化的酵母细胞系以确定GlmS和GNA1活性和葡糖胺和N-乙酰氨基葡糖的水平。
还将含有ScGNA1表达盒的质粒转入已经用大肠杆菌glmS*54构建体或芽孢杆菌属glmS构建体转化的酵母细胞系。
实施例21 本实施例描述了用于改善N-乙酰氨基葡糖生产的大肠杆菌菌株7107-92的随机诱变。
用UV光诱变菌株7107-92(含有整合入染色体的T7-glmS*54和T7-ScGNA1，实施例16中所述)并如美国专利6,372,457B1中所述用GlcN营养缺陷生物试验分析882个分离的菌落。将葡糖胺营养缺陷型菌株大肠杆菌2123-15用作指示菌株。基于晕圈大小选择19个突变体并用其划线以便分离且重新评价每种突变体的5个菌落。两种突变菌株7107-512和7107-513显示出最大晕圈直径。保留它们是为了在烧瓶培养中评价。根据布达佩斯条约有关专利程序中有关微生物保藏的国际认可规定，于2003年7月1日将突变体大肠杆菌菌株7107-512(ATCC No._____)和7107-513(ATCCNo._____)寄存在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)，P.O.Box1549，Manassas，Virginia 20108，USA。
将突变体与亲代菌株进行比较。在两种不同条件下使所有菌株生长在含有5g l-1核糖和5g l-1酵母提取物的M9B培养基中。使一组培养物生长在含有30g l-1葡萄糖和0.2mM IPTG(IPTG诱导)的培养基中。使另一组培养物生长在含有10g l-1葡萄糖和40g l-1乳糖的培养基中。一旦葡萄糖耗尽，则该培养物成为乳糖诱导型(乳糖诱导)。在IPTG诱导下，突变体7107-512产生的N-乙酰氨基葡糖与亲代菌株相差无几。在第71小时的时间点，突变体7107-513产生的葡糖胺比亲代菌株多36％以上。正如上述观察到的，亲代菌株产生在乳糖诱导下产生的N-乙酰氨基葡糖水平高于在IPTG诱导下产生的N-乙酰氨基葡糖水平。两种突变体产生了相同水平的葡糖胺，在71小时时间点时比亲代菌株约高28％。未确定突变的基因座且突变体中改善的N-乙酰氨基葡糖生产的机理尚不了解。由于仅筛选了约900个突变体克隆，所以所述数据清楚地证实通过随机诱变能够进一步改善生产宿主的可能性。
表23.UV光突变体中N-乙酰氨基葡糖的生产
实施例22 下面的实施例描述具有pfkA缺失的突变体NAG生产菌株的产生，使得生长与NAG生产相脱离。
果糖磷酸激酶是糖酵解中催化由果糖6磷酸(F-6-P)形成果糖-1，6-二磷酸的主要调节酶。由pfkA编码的大肠杆菌中的主要果糖磷酸激酶提供了90％的果糖磷酸激酶活性。剩余10％的活性由pfkB编码的次要果糖磷酸激酶提供。在NAG生产菌株中，超表达的GlmS*54催化F-6-P转化成葡糖胺-6-磷酸(GlcN-6-P)，后者然后通过来自酿酒酵母的超表达的葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶(GNA1)的作用被转化成GlcNAc-6-P。
实施例22中所述的实验原理如下。pfkA突变菌株在组合碳源(即葡萄糖和果糖)中生长可以使生长与NAG产生相脱离。由于使用葡萄糖作为碳源不会使pfkA突变体生长良好，所以果糖可以用于细胞生长。输入的果糖可以通过fruA和fruK基因产物被转化成果糖-1，6-二磷酸，使其进入糖酵解途经。葡萄糖可以在吸收时被磷酸化，且所得葡萄糖-6-磷酸被pgi基因产物即磷酸葡糖异构酶转化成F-6-P。由于pfkA基因缺失，所以仅次要PfkB同工酶可以将F-6-P转化成F-1，6-二磷酸。这种转化可以受到限制。结果是用于通过超表达的GlmS*54转化成葡糖胺-6-磷酸的F-6-P的量可能增加。因此，pfkA缺失可以减少F-6-P流入糖酵解途经，可能使更多的碳转向葡糖胺生产。在超表达ScGNA1的生产菌株中，这一结果最终使NAG滴度较高。
pfKA缺失菌株的产生 使用温敏选择法将pfkA缺失添加到生产菌株基因组上。这要求构建使pfkA区靶向缺失的整合载体。载体构建中的第一步是由大肠杆菌W3110基因组DNA扩增含有pfkA编码序列以及侧翼区的序列。基于来自大肠杆菌基因组的pfkA以及侧翼区的公布序列(Blattner等，1997，Science 277(5331)1453-1474)合成引物。用于PCR扩增的引物为正向引物07-89和反向引物07-90且具有如下序列07-895′GAGCGGCCGCATGAATCAATCTTATGGACGGC3′(SEQ ID NO86)和07-905′GAGTCGACTCAGCGTTTGCTGATCTGATCGAACGTAC3′(SEQID NO87)。
引物07-89含有Not I位点(GCGGCCGC，以SEQ ID NO86的3-10位核苷酸表示)且扩增位于pfkA ATG起始密码子上游的1083个碱基对处的yiiP编码序列的ATG起始密码子(以SEQ ID NO86的11-32位核苷酸表示)。引物07-90含有SalI位点(GTCGAC，以SEQ ID NO87的3-8位核苷酸表示)且从位于pfkA终止密码子下游的1310个碱基对处的sbp编码序列的翻译终止密码子扩增(以SEQ ID NO87的9-37位核苷酸表示)。使用标准方案进行PCR以产生含有位于Not I和Sal I限制性核酸酶位点侧翼的yiiP、pfkA和sbp编码序列的片段。使用制造商提供的物质和说明将该片段克隆入载体pPCR-ScriptAMPSK(+)(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)。将所得质粒命名为pSW07-61。
为了产生温敏整合型载体，用限制性核酸酶Not I和Sal I从质粒pKLN07-21中切下含有pMAK705(Hamilton等，1989，J.Bac.171(9)4617-462)的温敏复制子和pUC4K(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)的卡那霉素抗性盒的片段。用限制酶NotI和SalI从质粒pSW07-61中消化pfkA及侧翼区。将两种片段彼此连，产生质粒pSW07-63。
为了在pfkA的编码序列中生产缺失，用Pvu II将质粒pSW07-63消化质完全，随后用Ahd I进行部分消化。该过程除去了pfkA编码序列的781个碱基对的片段。用T4 DNA聚合酶处理含有pfkA缺失的片段以填补末端并将所得平端化片段与其自身连接，产生质粒pSW07-64。
为了产生含有pfkA缺失的菌株，将质粒pSW07-64转入大肠杆菌7107-18。按照温敏选择和传代方案筛选在含有葡萄糖作为碳源的已知成分培养基平板(defined medium plate)上缓慢生长的卡那霉素敏感性菌落。通过标准高度严格Southern杂交、使用含有部分yiiP和pfkA序列的1153个碱基对的片段验证菌株。将这些菌株命名为7107-90(1)和7107-90(2)。
在菌株7107-90(1)和7107-90(2)中分别观察到了0.054和0.035mmol分钟-1mg-1蛋白的Pfk比活性。在含有野生型pfkA基因的对照菌株7107-87(25)中检测到了0.78mmol分钟-1mg-1的比活性。因此，pfkA突变体具有在对照菌株中观察到Pfk比活性的约5-6％。这种残余的Pfk活性无疑是由PfkB同工酶提供的。
将T7-lac-ScGNA1盒整合入菌株7107-90(1)和7107-90(2)的染色体 7107-90菌株来源于葡糖胺生产菌株7107-18，因此，它们不会产生可测定的NAG。为了产生含有pfkA缺失的NAG生产菌株，需要将T7-lac-ScGNA1表达盒导入该菌株。按照上述策略将T7-lac-ScGNA1表达盒分别整合在菌株7107-90(1)和7107-90(2)染色体的manXYZ位点上。通过标准高度严格Southern杂交、使用含有ScGNA1编码序列的片段作为探针证实这些菌株含有在manXYZ缺失位点上整合的T7lac-ScGNA1。
菌株7107-602和7107-603的摇瓶分析 使用多种的葡萄糖/果糖混合物在摇瓶筛选48中检测菌株7107-602(1)和7107-603(1)。24小时后用0.2mM IPTG诱导培养物。感兴趣的是，这些菌株在任何检测条件下几乎不产生乙酸酯，不过它们产生的NAG也不会多于对照菌株7107-92(1)(数据未显示)。在乳糖诱导条件下再次用摇瓶筛选53检测了菌株7107-602(1)和7107-603(1)。此外，在这些菌株中没有产生乙酸酯且NAG水平与在对照菌株7107-92(1)中观察到的结果类似。
为了进一步评价菌株7107-602(1)中的乙酸酯形成，在通常增加乙酸酯形成的条件下进行摇瓶筛选56，包括添加酵母提取物(YE)、核糖或高微量元素(TE)。使培养物生长在改进的M9B生长培养基[6g/l KH2PO4、24g/lK2HPO4、1g/l Na3柠檬酸盐-2H2O、10g/l(NH4)2SO4(磷酸盐调节至pH 7.4)]。如表24中所示加入低水平痕量金属(0.3mg/l FeSO4-7H2O、0.375mg/lZnSO4-7H2O、0.02mg/l MnSO4-H2O、0.001mg/l CuSO4-5H2O、0.001mg/lNaMoO4-2H2O、0.001mg/l H3BO3和0.001mg/l CoCl2-6H2O)或高水平痕量金属(12mg/l FeSO4-7H2O、0.375mg/l ZnSO4-7H2O、0.8mg/l MnSO4-H2O、0.001mg/l CuSO4-5H2O、0.001mg/l NaMoO4-2H2O、0.001mg/l H3BO3和0.001mg/lCoCl2-6H2O)。给培养物补充0.6g/lMgSO4-7H2O、0.05g/l CaCl2-2H2O、10g/l葡萄糖和20g/l乳糖。另外，如表24中所示向培养物中加入5g/l核糖和/或5g/l酵母提取物。使培养物生长在37℃24小时且然后切换至25℃。在12小时时，向葡萄糖耗尽的培养物中加入20g/l葡萄糖并将pH调节至7.2。在24、30、48和54小时时，将培养物的pH调节至7.2且基于HPLC结果加入葡萄糖至每天总计30g/l，24、30、48和52小时，向铵浓度已降至1g/l以下的烧瓶中加入5g/l(NH4)2SO4。
表24.不同浓度的微量元素、核糖和酵母提取物对菌株7107-602(1)和7107-92(1)中乙酸酯形成的影响
甚至在为诱导的对照菌株7107-92(1)产生高浓度乙酸酯的而设计的条件下，菌株7107-602(1)中没有产生乙酸酯或产量相对较低(表23)。此外，尽管对菌株7107-607(2)而言OD测定值倾向于较低，但是一般在这些培养物中观察到的NAG滴度较高。因此，看起来pfkA突变菌株适合用作NAG生产宿主。
实施例23 本实施例描述谷氨酰胺合成酶(glnA)基因的克隆和超表达、T7lac-glnA盒整合入大肠杆菌染色体和glnA基因超表达对GlcN/GlcNAc产生的影响。
谷氨酰胺是为氨基糖类和其它化合物提供氮的氨同化的主要产物。由glnA编码的谷氨酰胺合成酶在需要NH3和ATP的反应中催化L-谷氨酸转化成L-谷氨酰胺。葡糖胺-6-磷酸的生物合成需要L-谷氨酰胺；GlmS催化L-谷氨酰胺和F-6-P转化成D-葡糖胺-6-P和L-谷氨酰胺的反应。为了最大化产生GlcN/GlcNAC，细胞中必需存在足够水平的谷氨酰胺。glnA基因的超表达可以增加谷氨酰胺水平且最终增加GlcN和或NAG滴度。
大肠杆菌glnA基因的克隆和超表达 为了克隆和超表达大肠杆菌glnA，基于glnA基因的公布序列(Blattner等，1997，Science 277(5331)1453-1474)合成引物。大肠杆菌glnA基因编码序列的核苷酸序列如鉴定为SEQ ID NO88的序列(sequencefile)所示。大肠杆菌GlnA蛋白的推定氨基酸序列如鉴定为SEQ ID NO89的序列所示。将所述引物用于使用PCR从大肠杆菌7101-17(DE3)基因组DNA扩增glnA编码序列。用于扩增的引物为正向引物07-gln和反向引物07-15且具有如下序列07-gln5′GATCGGTCTCGCATGTCCGCTGAACACGTACTGAC3′(SEQ ID NO90)和07-155′GATCCTCGAGTTAGACGCTGTAGTACAGCTC3′(SEQIDNO91)。
引物07-gln含有Bsa I位点(GGTCTC，以SEQ ID NO90的5-10位核苷酸表示)和从ATG起始密码子开始的glnA编码序列的23个核苷酸(以SEQID NO90的13-35位核苷酸表示)。引物07-15含有Xho I位点(CTCGAG，以SEQ ID NO91的5-10位核苷酸表示)和从翻译终止密码子开始的glnA编码序列的21个核苷酸(以SEQ ID NO91的11-31位核苷酸表示)。在标准条件下进行PCR以产生含有位于Bsa I和Xho I限制性核酸酶位点侧翼的glnA编码序列的片段。
用限制性核酸酶Bsa I和Xho I消化含有glnA的PCR片段并连接在载体pET24d(+)(Novagen，Inc.，Madison，WI)的Nco I和Xlao I位点，产生质粒pKLN07-28。按照这种方式克隆将glnA序列置于pET24d(+)的T7lac启动子之后，产生表达盒T7lac-glnA。
大肠杆菌中重组glnA的功能性表达 为了检测glnA的功能性表达，将重组质粒pKLN07-2转入菌株7107-18，产生菌株7107-163。通过用pET24d(+)空载体转化7107-18生产对照菌株7107-88。随后实施标准诱导方案，其中使细胞培养物生长在LB中并用1mMIPTG诱导。从诱导的培养物中取样进行SDS-PAGE以证实GlnA蛋白的超表达。GlnA蛋白的预计蛋白质大小约为52kDa。观察到约52kDa的超表达蛋白质。大部分超量产生的蛋白质看起来是不溶性的，在可溶性部分中几乎没有观察到这种蛋白质。在对照菌株中没有观察到这类超表达的蛋白质，表明超表达的蛋白质为GlnA酶。
指导T7lac-glnA整合入大肠杆菌染色体的载体的构建 由于证实了glnA基因的成功超表达，所以下一步是将T7lac-glnA盒整合入生产菌株的基因组。为该目的构建整合载体。将大肠杆菌pfkB基因选作整合的靶位点。PfkB编码大肠杆菌中果糖磷酸激酶的次要同工酶，它仅占总果糖磷酸激酶活性的10％。因此，在该基因座上整合所述盒不应显著影响该菌株的性能。
作为产生整合型载体的策略的组成部分，通过PCR从大肠杆菌W3110基因组DNA扩增pfkB及侧翼区。基于pfkB与其侧翼区的公布序列(Blattner等，1997，Science 277(5331)1453-1474)合成引物。用于扩增pfkB区的引物为正向引物07-16和反向引物07-17且具有如下序列07-165′GATCGCCGGCTTACATGCTGTAGCCCAGC3′(SEQ ID NO92)和07-175′GATCCTGCAGTCATGCTGCTAATAATCTATCC3′(SEQ ID NO93)。
引物07-16含有Nae I限制性内切核酸酶位点(GCCGGC，以SEQ IDNO92的5-10为核苷酸表示)和从位于pfkB起始密码子上游的1042个碱基对的推定翻译终止密码子开始的ORF b1722的19个碱基对(以SEQ IDNO92的11-29为核苷酸表示)。引物07-17含有Pst I限制性内切核酸酶位点(CTGCAG，以SEQ ID NO93的5-10位核苷酸表示)和从位于pfkB编码序列的翻译终止密码子下游的1357个碱基对的推定翻译终止密码子开始的ORF b1725的22个碱基对(以SEQ ID NO93的11-32位核苷酸表示)。在标准条件下进行PCR以产生含有位于Nae I和Pst I限制性核酸酶位点侧翼的ORFb1722、pfkB、ORFb1724和ORFb1725序列的片段。将所得片段连入载体pPCR-ScriptTMSK(+)(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)，产生质粒pKLN07-14。
下一步是将质粒pUC4K(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)的卡那霉素抗性盒添加到质粒pKLN07-14中。用限制性内切核酸酶PstI从pUC4K中切下卡那霉素抗性盒。同样用限制性核酸酶PstI消化质粒pKLN07-14，除去了该质粒的412个碱基对的片段，其中包括ORFb1725推定编码序列的386个碱基对。将卡那霉素抗性盒连入质粒pKLN07-14主链的Pst I位点，产生质粒pKLN07-17。接下来用限制性核酸酶SnaB I和Btr I消化质粒pKLN07-17，使得从该质粒上除去pfkB编码序列的870个碱基对。
用限制性核酸酶NaeI从质粒pKLN07-28中切下含有T7lac-glnA盒的片段，产生含有与来自载体pET24d(+)的T7启动子上游的50个碱基对和T7终止子下游的164个碱基对侧接的T7lac-glnA盒的片段。将Nae I片段连入质粒pKLN07-17的SnaB I和Btr I位点，产生质粒pKLN07-29。
最终的步骤是将来自pMAK705的温敏复制子添加到来自含有pfkB缺失位点的T7lac-glnA盒和卡那霉素抗性盒的质粒pKLN07-29的片段。用限制性核酸酶Not I和Kpn I消化质粒pKLN07-29以便从pPCR-Script主链上释放含有T7lac-glnA和卡那霉素抗性盒的片段。用Not I和Kpn I消化质粒pKLN07-20(上述)，切下含有温敏复制子的片段。将两种片段彼此连接，产生质粒pKLN07-30，其含有温敏复制子、卡那霉素抗性盒和带有连入pfkB缺失位点的T7lac-glnA盒的大肠杆菌基因组序列。可以按照温敏选择和传代方案将质粒pKLN07-30用于指导将T7l ac-glnA盒直接整合在染色体的pfkB上。
将质粒pKLN07-30转入葡糖胺生产菌株7107-18。温敏选择和传代后，使用标准PCR方案筛选pfkB缺失位点上存在T7lac-glnA盒的卡那霉素敏感性菌落。通过严格Southern印迹杂交、使用含有glnA编码序列的片段作为探针验证通过PCR鉴定的数种菌株。将这些菌株命名为7107-118-7107-123。
T7lac-ScGNA1盒整合入菌株7107-118、7107-119、和7107-120的染色体 菌株7107-118、7107-119和7107-120来源于葡糖胺生产菌株7107-18；因此，它们不会产生可测定的NAG。为了产生含有glnA表达盒的NAG生产菌，需要将T7lac-ScGNA1表达盒导入该菌株。如上所述，将T7-lac-ScGNA1的表达盒整合在菌株7107-118、7107-119和7107-120中染色体的manXYZ上，产生菌株7107-125(来源于7107-119)、7107-126(来源于7107-120)、7107-132(来源于7107-118)、7107-133(来源于7107-118)和7107-134(来源于7107-119)。通过标准高度严格Southern杂交、使用含有ScGNA1编码序列的片段作为探针验证这些菌株，所述的探针具有manXY缺失位点上整合的T7lac-ScGNA1。
摇瓶筛选51检测NAG生产背景中整合的T7lac-glnA的超表达 进行摇瓶筛选51以评价含有整合的T7lac-glnA盒的菌株7107-125、7107-126和7107-13。使培养物生长在补充了痕量金属和下列物质的M9B培养基中0.6g/l MgSO4-7H2O，0.05g/l CaCl2-2H2O、10g/l葡萄糖、40g/l乳糖、5g/l核糖和5g/l酵母提取物。使培养物在30℃生长24小时且然后变为至25℃。在24和48小时，将培养物的pH调节至7.2并加入葡萄糖至30g/l，在24和48时向铵浓度已降至1g/l以下的烧瓶中加入5g/l(NH4)2SO4。在24、48和72小时时取样用于OD和测定NAG浓度。在72小时时收集培养物用于分析酶活性。
正如表25中观察到的，超表达glnA的菌株在性能上稍优于对照菌株7107-92(1)，产生约多8％的NAG。没有菌株耗尽氨，所以氮不是限制性的。GlnA超表达菌株中GlmS和GNA1的酶活性与对照菌株7107-92(1)相差无几。概括地说，看起来glnA超表达可以稍改善NAG滴度，并可在最佳条件下增加。
表25.超表达glnA的菌株中的细胞生长、酶活性和和GlcNAc产生
1)测定72小时时间点的样品的OD、酶活性和GlcNAc浓度。
2)以μmol分钟-1mg-1蛋白表示酶活性。
检测含有整合的T7lac-glnA的NAG生产菌株的发酵实验 接下来在1升发酵罐中评价含有整合的T7lac-glnA盒的菌株7107-133。将发酵罐起始体积设定为475ml。将发酵培养基的成分列在表26中。使用75％NH4OH进行发酵以便将pH控制在6.9。在整个发酵过程中将温度维持在37℃。调节通气和搅拌以维持空气饱和的20％的溶解氧浓度。给培养物补充65％葡萄糖，进料速度由计算机程序控制，从而使接种时的生长速率为0.40小时-1，且到6小时达到5ml/小时的最大速率。在10小时时用以5g/l添加的食品级乳糖诱导培养物，同时连续补充葡萄糖。
将菌株7107-133的发酵结果与菌株7107-92(1)的发酵结果进行比较，这曾在上述相同条件下的发酵237中进行。这两种菌株均含有整合的T7lac-ScGNA1盒的一个拷贝。结果表明菌株7107-133中存在T7lac-glnA盒可以提供稍优于菌株7107-92(1)的优点。菌株7107-92(1)在59.8小时产生了96.6g/l NAG，而菌株7107-133在59.6小时时产生了107.1g/l的NAG。
表26.发酵培养基的成分
*痕量金属组成为5mg/l FeSO4-7H2O、3.75mg/l ZnSO4-7H2O、0.6mg/lMnSO4-H2O、0.1002mg/l CuSO4-5H2O、0.1002mg/l CoCl2-6H2O。
实施例24 本实施例描述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(zwf)基因的克隆、超表达，将T7lac-zwf盒整合入大肠杆菌染色体和在T7启动子控制下超表达zwf对NAG产生的影响。
戊糖磷酸途经为氨基酸、核苷酸和细胞壁的生物合成提供了中间体。此外，戊糖磷酸途经的氧化部分是细胞中NADPH的重要来源。大肠杆菌的zwf基因编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)，该酶催化戊糖磷酸途经中的第一步，将葡萄糖-6-磷酸转化成葡糖酸-1，5-内酯。zwf基因的表达与细胞生长率协调(Rowley，D.和Wolf，R.，J.Bac.，1991，173(3)968-977)。
文献中描述了不能在NAG或GlcN上生长的大肠杆菌分离物(J.Bac.，1970，101384-391)。作者推测氨基糖磷酸酯的累积可以抑制磷酸己糖异构酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶催化的反应，产生戊糖饥饿。添加戊糖或葡糖酸使这些菌株的生长抑制得以逆转。
产生GlcN/GlcNAc的重组大肠杆菌菌株可以累积氨基糖磷酸酯至一定水平。如果是这种情况，那么添加葡糖酸或戊糖诸如核糖应使生长和NAG产生增加。使用NAG生产菌株7107-87#25进行的摇瓶实验证实添加核糖或葡糖酸使生长和NAG滴度均增加。因此，看起来NAG生产菌株正在经历戊糖饥饿，这可通过添加戊糖或葡糖酸缓解。
作为不添加外源性戊糖而减缓戊糖饥饿的策略，决定超表达NAG生产菌株中的zwf基因。据推测超表达zwf可以减少磷酸化的氨基糖类对戊糖磷酸途经的抑制作用。如果如此，那么可以消除为增加我们菌株中的NAG滴度而另外提供戊糖或葡糖酸的需求。
大肠杆菌zwf的克隆和表达 为了克隆和表达大肠杆菌zwf，基于zwf基因的公布序列(Blattner等，1997，Science 277(5331)1453-1474)合成引物。大肠杆菌zwf基因编码序列的核苷酸序列如鉴定为SEQ ID NO94的序列所示。大肠杆菌ZWF蛋白的推定氨基酸序列如鉴定为SEQ ID NO95的序列所示。使用PCR将引物用于从大肠杆菌W3110基因组DNA扩增zwf编码序列。用于扩增的引物为正向引物07-101和反向引物07-102且具有如下序列07-1015′GATCGGTCTCGCATGGCGGTAACGCAAACAGC 3′(SEQ ID NO96)和07-1025′GATCCTCGAGTTACTCAAACTCATTCCAGGAACGACC 3′(SEQID NO97)。
引物07-101含有Bsa I限制性内切核酸酶位点(GGTCTC，以SEQ IDNO96的5-10位核苷酸表示)和从ATG起始密码子开始的zwf编码序列的20个核苷酸(以SEQ ID NO96的13-32位核苷酸表示)。引物07-102含有Xho I限制性内切核酸酶位点(CTCGAG，以SEQID NO97的5-10位核苷酸表示)和从翻译终止密码子开始的zwf编码序列的27个核苷酸(以SEQ IDNO97的11-37位核苷酸表示)。在标准条件下进行PCR以产生含有位于Bsa I和Xho I限制性核酸酶位点侧翼的zwf编码序列的片段。
所述PCR片段用限制性核酸酶Bsa I和Xho I消化并连接在载体pET24d(+)(Novagen，Inc.，Madison，WI)的Nco I和Xho I位点，产生质粒pSW07-71。按照这种方式克隆使zwf序列位于pET24d(+)的T7lac启动子之后，产生表达盒T7lac-zwf。
大肠杆菌中重组ZWF蛋白的功能性表达 将各自含有pET24d(+)中的T7lac-zwf表达盒的质粒pSW07-71#17、#20和#33转入NAG生产菌株7107-92(1)，产生菌株7107-96(1)(用pSW07-71#17转化)、7107-96(2)和7107-96(3)(用pSW07-71#20转化)和7107-96(4)(用pSW07-71#33转化)。通过用pET24d(+)转化菌株7107-92(1)生产对照菌株7107-95。随后实施标准诱导方案，其中使细胞培养物生长在LB中并用1mMIPTG诱导。从诱导的培养物中取样进行SDS-PAGE。结果证实超量产生了约56kDa的蛋白质，相当于G6PDH蛋白的预计大小。然而，看起来大部分超量产生的蛋白质为不溶性形式。
IPTG诱导4小时后，收集细胞培养物以检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性。与对照菌株7107-95的0.04mmol分钟-1mg-1蛋白相比，菌株7107-96(2)、7107-96(3)和7107-96(4)具有的G6PDH活性为69.7、78.1和90.1mmol分钟-1mg-1蛋白。这一结果证实了zwf在NAG生产菌株中成功得到超表达。
T7lac-zwf盒整合入大肠杆菌染色体 由于证实了ZWF蛋白在大肠杆菌7107-92#1中的功能性表达，所以下一步是将T7lac-zwf盒稳定整合入NAG生产菌株的染色体。为将该盒靶向整合至基因组的rha区而设计整合型载体。大肠杆菌的rhaBAD基因分别形成编码rhamnulokinase、L-鼠李糖异构酶和rhamnulose-1-磷酸醛缩酶的操纵子。这些基因涉及将鼠李糖用作可选碳源且被认为是非必需基因。因此，打断这些区不应影响生长或NAG产生。
产生整合载体的第一步是从大肠杆菌W3110基因组DNA中克隆rhaBAD区。基于rhaBAD操纵子与其侧翼区的公布序列(Blattner等，1997，Science 277(5331)1453-1474)合成引物。用于扩增rha区的引物为正向引物07-107和反向引物07-108且具有如下序列07-1075′CGAATATCACGCGGTGACCAGTTAAAC 3′(SEQ ID NO98)和07-1085′CACAGTGTGCCGATGATTTTGACC 3′(SEQ ID NO99)。
引物07-107从rhaB起始密码子上游的1096个碱基处扩增。引物07-108从rhaD终止密码子的977个碱基下游扩增。在标准条件下进行PCR以产生含有rhaBAD操纵子及侧翼序列的片段。将该PCR片段克隆入载体pPCR-ScriptSK(+)(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)，产生质粒pSW07-72。
产生整合型载体的下一步是将T7lac-zwf盒添加入质粒pSW07-72。通过PCR、使用标准条件从质粒pSw07-71扩增T7-lac-zwf盒。使用向引物07-111和反向引物07-112进行PCR扩增，所述引物具有如下序列07-1115′GACCAATGGCCTAA TGGAGCAACCGCACCTGTGGC 3′(SEQ ID NO100)和07-1125′GATCAGCGCTATCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAGCAAAAAACCCC 3′(SEQ ID NO101)。
引物07-111含有Xcm I限制性内切核酸酶位点(CCANNNNNNNNNTGG，以SEQ ID NO100的3-17位核苷酸表示)且从pET24d(+)的T7启动子序列上游的80bp处扩增(以SEQ ID NO100的18-35位核苷酸表示)。引物07-112含有Afe I限制性内切核酸酶位点(AGCGCT，以SEQ ID NO101的5-10位核苷酸表示)且从T7终止子下游的25bp处扩增(以SEQ ID NO101的11-46位核苷酸表示)。用限制性核酸酶Xcm I和Afe I消化所得1.8-kb PCR产物。
用限制酶Xc7n I和AfeI消化质粒pSW07-72，从pSW07-72主链中切下3.6kb的片段。将含有带有Xcm I和Afe I末端的T7lac-zwf的PCR片段连入质粒pSW07-72中进行切除的位点，产生质粒pSW07-73。质粒pSW07-73由此含有几乎完整rhaBAD操纵子的3.6kb缺失，其中T7-lac zwf插在缺失位点上。
构建整合质粒的最终步骤是添加来自质粒pKLN07-21的温敏复制子和卡那霉素抗性盒。用Not I和KpnI消化质粒pKLN07-21，切下含有温敏复制子和卡那霉素抗性盒的片段。用限制酶Not I和Kpn I消化质粒pSW07-73，从pPCR-Script主链上释放含有T7-lac-zwf及rhaBAD侧翼区的片段。将两种片段彼此连接，产生质粒pSW07-74。可以将质粒pSW07-74用于指导T7lac-zwf整合在大肠杆菌染色体的rha区上。
将质粒pSW07-74转入NAG生产菌株7107-92(1)。在温敏选择和传代后，使用标准PCR方案筛选在rhaBAD缺失位点存在T7lac-zwf盒的卡那霉素敏感性菌落。通过高度严格Southern印迹杂交、使用zwf编码序列的1.0-kb片段作为探针验证通过PCR鉴定的数种菌株。将这些菌株命名为7107-606(1)、7107-606(2)、7107-606(3)和7107-606(4)。
含有整合的T7lac-zwf盒的菌株中NAG的产生 进行摇瓶筛选46以评价在T7启动子控制下超表达zwf对菌株7107-606(1)和7107-606(3)中NAG产生的影响。如上所述，据推测zwf的超表达可以减缓戊糖饥饿并消除磷酸化的氨基糖类导致的生长抑制。使培养物生长在补充了0.6g/l MgSO4-7H2O、0.05g/l CaCl2-2H2O、40g/l葡萄糖和0.2mM IPTG(就进行了晚期诱导的烧瓶而言，在24小时加入IPTG)的M9B培养基(上述)中。如表27中所示向培养物中加入10g/l核糖和5g/l酵母提取物。将培养物在30℃保温24小时且然后变为25℃。在24和48小时时，将培养物的pH调节至7.2并加入葡萄糖至每天总计30g/l。在24和48小时时向铵浓度已降至1g/l以下的烧瓶中加入5g/l(NH4)2SO4。在24、48和72小时时取样用于测定OD和NAG水平。在72小时时收集培养物用于酶分析。
表27.不同诱导时间、核糖添加和酵母提取物添加对超表达zwf的菌株中生长、酶活性和GlcNAc产生的影响
1在24小时添加IPTG用于晚期诱导 2以μmol/分钟/mg蛋白表示的酶活性 3ND未测定 结果表明由T7启动子驱动而超表达zwf的菌株具有的G6PDH活性高于对照菌株50-100倍。与对照菌株生长相比，zwf超表达确实稍改善了在不加入核糖的培养物的生长。然而，GlmS活性在超表达zwf的菌株中倾向于降低，而NAG生产水平不会达到在对照菌株7107-92(1)中观察到的水平。这表明过多的碳可以离开葡糖胺途径而进入戊糖磷酸途经。
实施例25 本实施例描述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(zwf)基因的克隆、zwf基因及其天然启动子整合入大肠杆菌染色体和zwf在其天然启动子控制下超表达对细胞生长和NAG产生的影响。
大肠杆菌zwf及其天然启动子和调节区的克隆 正如实施例24中所述，使用整合的T7lac-zwf盒构建菌株作为改善生长和NAG产生的策略的组成部分。据推测zwf的超表达可以减少磷酸化的氨基糖类对戊糖磷酸途经的抑制作用。如果如此，那么可以消除为增加我们菌株中的NAG滴度而另外提供戊糖或葡糖酸的需求。
含有整合的T7lac-zwf盒的7107-606菌株的生长在一定程度上确实优于对照菌株，表明戊糖饥饿得到部分缓解。然而，它们的NAG产生不如对照菌株。这可能是使用了强T7启动子所致，这种强T7启动子可以使ZWF蛋白的表达水平过高。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的过度活性可以使不需要的大量碳集中到戊糖磷酸途经。因此，决定超表达zwf及其天然启动子以便使zwf的表达可以受到细胞调节。在大肠杆菌中，zwf发生生长率依赖性调节。另外，zwf是soxRS调节子和多抗生素抗性(mar)调节子的成员。因此，克隆天然zwf不仅应包括天然启动子、而且还应包括调节区，诸如＂Soxbox＂(Fawcett，W.和Wolf，R.，1995，J.Bac.177(7)1742-1750)。染色体上存在zwf的两个拷贝可以导致通过戊糖磷酸途经的流量增加，但不会显著影响通过其它途经的碳流，诸如用于NAG产生的碳流。
为了克隆和表达大肠杆菌zwf，基于zwf基因的公布序列合成引物(Blattner等，1997，Science 277(5331)1453-1474)。使用PCR将引物用于从大肠杆菌W3110基因组DNA扩增zwf编码序列与调节区。用于扩增的引物为反向引物07-129和正向引物07-130且具有如下序列07-1295′GATGCTAGCTAACCGGAGCTCATAGGGC3′(SEQ ID NO102)和07-1305′GATTTCGAATGATCAGTGTCAGATTTTTACCC3′(SEQ ID NO103)。
正向引物07-130含有BstB I位点(TTCGAA，以SEQ ID NO102的4-9位核苷酸表示)且从zwf起始密码子上游的203个碱基对处扩增。反向引物07-129含有Nhe I位点(GCTAGC，以SEQ ID NO103的4-9位核苷酸表示)且从zwf终止密码子下游的154个碱基对处扩增。在标准条件下进行PCR以产生位于Nhe I和BstB I限制性核酸酶位点侧翼的1.8-kb片段。
重组zwf整合入大肠杆菌染色体 为将zwf盒靶向整合至基因组的rha区而设计整合载体。大肠杆菌的rhaBAD基因分别形成编码rhamnulokinase、L-鼠李糖异构酶和rhamnulose-1-磷酸醛缩酶的操纵子。这些基因参与将鼠李糖用作可选碳源且被认为是非必需基因。因此，打断这些区不应影响我们菌株中的生长或NAG产生。
将质粒pSW07-72#45(实施例24中所述)用于第一步以产生整合载体。用限制性核酸酶BstB I和NheI消化这种含有rhaBAD操纵子与侧翼序列的质粒。该步骤除去了含有来自质粒的部分rhaB和rhaA编码序列的702个碱基对的段。含有zwf编码序列与调节区的PCR片段用限制性核酸酶BstB I和Nhe I消化并被连入pSW07-72#45的BstB I和Nhe I位点，产生质粒pSW07-86。
用限制酶Kpn I和Not I消化质粒pSW07-86以释放含有位于rha基因侧翼的zwf的6.9-kb片段。将该片段与来自pKLN07-21的4.2kb的KpnI/Not I片段连接，后者含有来自pMAK705(Hamilton et al.，1989，J.Bac.171(9)4617-4622)的温敏复制子和来自pUC4K(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)的卡那霉素抗性盒。可以将所得质粒pSW07-87用于将zwf直接整合到大肠杆菌染色体的rhaBA区。
将质粒pSW07-87分别转入含有ScGNA1的一个或两个拷贝的菌株7107-92(1)和7107-607(2)中。在温敏选择和传代后，使用标准PCR方案筛选在rhaBA缺失位点上存在T7lac-zwf盒的卡那霉素敏感性菌落。通过严格Southern杂交、使用zwf编码序列的片段作为探针验证通过PCR鉴定的数种菌株。将来源于7107-607(2)的菌株命名为7107-633，并将来源于7107-92(1)的菌株命名为7107-634。
NAG生产菌株中zwf在天然启动子控制下的超表达 筛选菌株7107-633和7107-634，以评价在天然启动子控制下超表达zwf对NAG产生的影响。使培养物生长在补充了0.6g/l MgSO4-7H2O、0.05g/lCaCl2-2H2O、5g/l酵母提取物、10g/l葡萄糖和40g/l乳糖的M9B培养基(上述)中。使培养物在30℃生长24小时且然后切换至25℃进行剩余的实验。在24和48小时时，将培养物的pH调节至7.2并基于HPLC结果加入葡萄糖至每天30g/l，在24和48小时向铵浓度已降至1g/l以下的烧瓶中加入5g/l(NH4)2SO4。在24、48和72小时时取样用于测定OD和NAG浓度。结果如表28中所示。
表28.在天然启动子控制下超表达zwf的菌株的生长和GlcNAc产生
结果表明在天然或T7启动子控制下的超表达的zwf使细胞生长增加，从而证实戊糖饥饿得到了部分缓解。在数种菌株中NAG产量也得到增加。例如，菌株7107-634(2)产生的NAG多于对照菌株7107-92(1)约25％。在本实验中，含有T7lac-ScGNA1盒的两个拷贝盒超表达的zwf的菌株没有出现超过那些含有所述盒和一个拷贝的超表达的zwf的菌株的改善。
1升发酵罐中超表达zwf基因的菌株的评价 接下来在1-L发酵罐中评价超表达zwf的菌株。还将这些结果与那些来自在上述相同条件下单独进行的发酵中的菌株7107-92(1)的结果进行比较。将发酵罐起始体积设定为475ml。将发酵培养基的成分列在表26中。使用75％NH4OH进行发酵以便将pH控制到6.9。在整个发酵过程中将温度维持在37℃。调节通气和搅拌以维持空气饱和的20％的溶解氧浓度。给培养物补充65％的葡萄糖，进料速度由计算机程序控制，从而使接种时的生长速率为0.40小时-1，且到6小时达到5ml/小时的最大速率。在10小时时用以5g/l添加的食品级乳糖诱导培养物，并连续补充葡萄糖。
发酵结果表明菌株7107-606(1)获得了高于对照菌株的OD600，特别是在早期时间点。这可能是因在该菌株中戊糖供应增加所致。另一方面，借助于天然启动子超表达zwf的菌株生长至OD600与对照菌株大约相同时。在本实验中，没有一种超表达zwf的菌株在GlcNAc产量方面超过对照菌株7107-607(2)或7107-92(1)。然而，对生产菌株7107-92(1)和7107-607(2)而言，发酵条件得到最优化。可能的情况是超表zwf的菌株可能需要稍微不同的发酵条件以显示其在改善生长和NAG产生方面的全部潜能。
实施例26 本实施例描述磷酸葡糖异构酶(pgi)基因的克隆、T7lac-pgi盒整合入大肠杆菌染色体和pgi基因超表达NAG产生的影响 大肠杆菌pgi基因编码磷酸葡糖异构酶，该酶催化葡萄糖-6-磷酸与果糖-6-磷酸的互变。超表达pgi可以增加细胞中F-6-P的收集量且由此产生较高的GlcN/GlcNAc产量。为了检测这种可能性，在大肠杆菌NAG生产背景中克隆和超表达pgi基因。
大肠杆菌pgi的克隆和超表达 为了克隆和超表达大肠杆菌pgi，基于pgi基因的公布序列合成引物(Blattner等，1997，Science 277(5331)1453-1474)。大肠杆菌pgi基因编码序列的核苷酸序列如鉴定为SEQ ID NO104的序列所示。大肠杆菌PGI酶的推定氨基酸序列如鉴定为SEQ ID NO105的序列所示。将引物用于使用PCR从大肠杆菌W3110基因组DNA扩增pgi编码序列。正向引物07-103和反向引物07-104用于扩增且具有如下序列07-1035′GATCGGTCTCGCATGAAAAACATCAATCCAACGCAGAC 3′(SEQ ID NO106)和07-1045′GATCCTCGAGTTAACCGCGCCACGCTTTATAGC 3′(SEQID NO107)。
引物07-103含有Bsa I位点(GGTCTC，以SEQ ID NO106的5-10位核苷酸表示)和从ATG起始密码子开始的pgi编码序列的26个核苷酸(以SEQID NO106的13-38位核苷酸表示)。引物07-104含有Xho I位点(CTCGAG，以SEQ ID NO107的5-10位核苷酸表示)和从翻译终止密码子开始的pgi编码序列的23个核苷酸(以SEQ ID NO107的11-33位核苷酸表示)。在标准条件下进行PCR以产生含有位于Bsa I和Xho I限制性核酸酶位点侧翼的pgi编码序列的片段。
所述PCR片段用限制性核酸酶Bsa I和Xho I消化并连接在载体pET24d(+)(Novagen，Inc.，Madison，WI)的Nco I和Xlao I位点上，产生质粒pKLNO736和pKLNO7-37。按照这种方式克隆使pgi序列位于pET24d(+)的T7lac启动子之后，产生表达盒T7lac-pgi。
大肠杆菌中重组pgi的功能性表达 将质粒pKLN07-36转入NAG生产菌株7107-92(1)，产生菌株7107-124。通过用pET24d(+)空载体转化7107-92(1)产生对照菌株7107-95。随后实施标准诱导方案，其中使细胞培养物生长在LB中并用1mM IPTG诱导。从诱导和未诱导的培养物中取样进行SDS-PAGE。结果证实超量产生的蛋白质约为62kDa，相当于PGI蛋白的预计大小。在IPTG诱导后4小时通过SDS-PAGE测定总蛋白和可溶性蛋白量。来自菌株7107-124(1)和7107-124(2)的样品显示62kDa的蛋白质超量产生，表明重组PGI蛋白超过超表达。在诱导和未诱导的培养物中存在超量产生的蛋白质表明在没有诱导物存在的情况下pgi基因的渗漏表达。在来自对照菌株7107-95的样品中没有这类蛋白质带。看起来总PGI蛋白中至少一半是可溶性形式。
在诱导4小时后，收集培养物以便测定磷酸葡糖异构酶活性。与对照菌株7107-95中0.94mmol分钟-1mg-1蛋白的比活性相比，发现菌株7107-124(1)、7107-124(2)和7107-124(3)基于的比活性分别为242、158和215mmol分钟-1mg-1蛋白。这一结果证实Pgi蛋白成功超表达，达到高于对照品100-200倍的水平。
指导T7lac-pgiA整合入大肠杆菌染色体的载体的构建 由于证实了pgi基因的功能性表达，所以下一步是构建将T7lac-pgi盒靶向整合入大肠杆菌染色体的载体。为整合选择的靶物为大肠杆菌基因组的araBAD区。编码L-ribulokinase、L-阿拉伯糖异构酶和L-核酮糖-5-P4-差向异构酶蛋白的araBAD操纵子参与将L-阿拉伯糖用作碳源。这些蛋白质催化L-阿拉伯糖转化成戊糖磷酸支路中的中间体D-木酮糖-5-磷酸。由于不将L-阿拉伯糖用作NAG发酵过程中的碳源，所以在该位点上的基因整合不应影响细胞生长或NAG产生。
产生整合载体的第一步是克隆含有araBAD操纵子的基因组区。基于araBAD操纵子的公布序列(Blattner等，1997，Science 277(5331)1453-1474)合成引物。用于扩增araBAD区的引物为正向引物07-105和反向引物07-106且具有如下序列07-1055′GGATCCTACCTGACGCTTTTTATCGCAACTC 3′(SEQ ID NO108)和07-1065′CGGACGCACATCGGCCTCGTAGAC 3′(SEQID NO109)。
引物07-105从araB的ATG起始密码子的74个碱基对下游扩增，而引物07-106从araD翻译终止密码子的404个碱基对下游扩增。将所得含有araBAD操纵子的4.7-kb PCR片段连入载体PCR-ScriptTMSK(+)(StratageneCloning Systems，La Jolla，CA)，产生质粒pKLN07-38。
下一步是将来自质粒pKLN07-37的T7lac pgi盒添加到质粒pKLN07-38中。使用具有如下序列的正向引物07-109和反向引物07-110通过PCR从质粒pKLN07-37扩增T7lacpgi盒07-1095′GATTCCGGAAGCAACCGCACCTGTGGC 3′(SEQ ID NO110)和07-1105′GATCACCTGGTTATAGTTCCTCCTTTCAGCAAAAAACCC 3′(SEQ IDNO111)。
引物07-109含有BspE I限制性内切核酸酶位点(TCCGGA，以SEQ IDNO110的4-9位核苷酸表示)且从pET24d(+)的T7启动子上游的80个碱基对处扩增。引物07-110含有SexA I限制性内切核酸酶位点(ACCTGGT，以SEQ ID NO111的5-11位核苷酸表示)且从pET24d(+)的T7启动子下游的18个碱基对处扩增。在标准条件下进行PCR以产生含有位于BspE I和SexA I限制性核酸酶位点侧翼的T7lac-pgi盒的片段。随后用限制性核酸酶BspE I和SexAI消化PCR片段。
用限制性核酸酶BspE I和SexA I消化质粒pKLN07-38，切下含有araB编码序列最后621个碱基对、完整的araA编码序列和araD编码序列的前59个碱基对的2477个碱基对片段。将消化的T7lac-pgi PCR片段(上述)连入pKLN07-38的位点BspE I和SexA I，产生质粒pKLN07-41。因此，质粒pKLN07-41含有部分araBAD操纵子的2.4kb的缺失，其中T7-lac-pgi插在缺失位点上。
为了进行最终的克隆步骤，用限制性核酸酶Not I和Sal I从质粒pKLN07-41消化含有插入了T7lac-pgi的araBAD序列的片段。将该片段与来自pKLN07-21的4.2kb Sal Il Not I片段连接，所述的pKLN07-21含有来自pMAK705(Hamilton等，1989，J.Bac.171(9)4617-4622)的温敏复制子和来自pUC4K(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)的卡那霉素抗性盒。可以将所得质粒pKLN07-47用于指导将pgi整合在大肠杆菌染色体的araBAD区。
用质粒pKLN07-47转化菌株7107-92(1)。实施温敏选择方案。通过在标准条件下的PCR筛选染色体上araBAD缺失位点上存在T7lac-pgi的卡那霉素敏感菌落。通过严格Southern杂交、使用含有pgi编码序列的片段作为探针验证通过PCR鉴定的数种菌株。将这些菌株命名为7107-136-7107-141。
菌株7107-136和7107-141的摇瓶评价 筛选的菌株包括菌株7107-136和7107-141，所述菌株用于评价pgi超表达对NAG产生的影响。使培养物生长在补充了0.6g/l MgSO4-7H2O、0.05g/lCaCl2-2H2O、5g/l酵母提取物、5g/l核糖、10g/l葡萄糖和40g/l乳糖的M9B培养基(上述)中。使菌株在30℃生长24小时且然后在实验的剩余部分中变为25℃。在24和48小时时将各培养物的pH调节至7.2并基于HPLC结果加入葡萄糖至30g/l每天。在24和48小时，向铵浓度已降至1g/l以下的烧瓶中加入5g/l(NH4)2SO4。在24、48和72小时时取样用于测定OD和NAG水平。在72小时时收集培养物用于酶分析。结果如表29中所示。
表29.超表达pgi的菌株的生长和GlcNAc产量
在本实验中，在超表达的pgi的菌株中没有观察到显著改善。然而，在最优化摇瓶或发酵条件下，超表达的pgi可以正面影响生长和/或NAG产量。
在1升发酵中评价菌株7107-141 接下来在1-L发酵罐中评价超表达pgi的菌株7107-141。将上述结果与在相同条件下进行的单独发酵的菌株7107-92(1)的结果进行比较。将发酵罐起始体积设定为475ml。将发酵培养基的成分列在表3中。使用75％NH4OH进行发酵以便将pH控制到6.9。在整个发酵过程中将温度维持在37℃。调节通气和搅拌以维持空气饱和的20％的溶解氧浓度。给培养物补充65％葡萄糖，进料速度由计算机程序控制，从而使接种时的生长速率为0.40小时-1，且到6小时达到5ml/小时的最大速率。在10小时时用以5g/l添加的食品级乳糖诱导培养物，并连续补充葡萄糖。
与摇瓶实验相似，在超表达pgi基因的菌株中没有观察到葡糖胺产量的显著改善。然而，如上所述，在对这些菌株的最优化条件下，pgi超表达可以正面影响生长和/或NAG产量。
实施例27 下面的实施例描述葡糖胺/N-乙酰氨基葡糖生产菌株的研发，其中通过缺失glgXCA基因阻断糖原合成。还证实了阻断糖原合成对葡糖胺/N-乙酰氨基葡糖产生的影响。
细菌细胞累积糖原作为储存的碳储备的主要形式。糖原合成涉及三种酶ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、糖原合酶和分支酶。这些酶分别催化从葡萄糖-1-磷酸合成单糖供体(ADP-葡萄糖)、将这些单糖单位聚合形成葡萄糖的(1-4)聚合物和该聚合物重排而在链上产生(1-6)分支。ADP-葡萄糖焦磷酸化酶使糖原合成中的关键酶且受到别构剂的强烈调节。糖原合成和降解中涉及的基因排列成glg操纵子(glgBXCAP)，包括glgB(1，4-α-葡聚糖分支酶)、glgX(糖基水解酶(glycosyl hydrolase)、脱支酶)、glgC(ADP-葡萄糖焦磷酸化酶)、glgA(糖原合酶)和glgP(糖原-麦芽四糖磷酸化酶)。在尝试使葡糖胺和N-乙酰氨基葡糖生产途经的碳流增加的过程中，糖原合成途经因产生葡糖胺和N-乙酰氨基葡糖的菌株中的基因缺失而受到阻断。
合成下列序列的PCR引物以便克隆来自glg操纵子的序列。GNglgBXCAPl-55′-GAGTCATCCGGATACAGTACGCGA-3′(SEQ ID N0112)和GNglgBXCAP2-35′-ATAAACCAGCCGGGCAAATGG-3′(SEQ IDNO113)。
使用标准条件用引物进行PCR扩增导致产生来自大肠杆菌菌株W3110的glg操纵子的5737-bp片段。扩增的序列跨越glgB到glgP。将该PCR产物连入

M2.1-

(Invitrogen TOPO TA Cloning Kit，Catalog#K4500-01)，产生重组质粒pCALG18-1。
用Age I消化pCALG 18-1以便从质粒中缺失glgX的3′部分、完整的glgC和glgP的5′部分。使质粒的剩余部分再循环至产生pCALG21-1。该重组质粒含有截短的glg操纵子(glgXCAD)。
为了产生将glgXCAD整合入葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖生产菌株基因组中所需要的质粒，还需要两个步骤。第一个步骤是将来自pUC4K的Kan′基因(Amersham Pharmacia Biotech，Catalog#27-4958-01，GenBankAccession#X06404)添加到pCALG21-1上以产生pCALG23-1。第二步是将来自pMAK705(Hamilton，C.等，1989，Journal of Bacteriology，1719，pp4617-4622)的温敏复制起点添加到pCALG23-1上以产生pCALG28-1。为了完成第一个步骤，用BamH I消化pCALG21-1和pUC4K。BamH I消化使glgXCA缺失位点上游的pCALG21-1线性化并从pUC4K中释放Kan′片段。连接线性化pCALG21-1和Kan′片段而产生pCALG23-1。为了产生pCALG28-1，使用寡核苷酸GNTOP2-5(SEQ ID NO114)和GNTOP3-4(SEQID NO115)对来自pCALG23-1的Kan′-glgXCAD片段进行PCR扩增。GNTOP2-5的序列5′-CGCCAAGCTTGGTACCG-3′(SEQ ID NO114)。引物序列与

2.1-

的230-246位核苷酸相同。GNTOP3-4的序列5′-CCCTCTAGATGCATGCTCGAG-3′(SEQ ID NO115)。该序列与

2.1-

的334-354位核苷酸反向互补。
将PCR产物与含有分离自pMAK705的温敏复制起点的Sma I片段连接。所得重组质粒pCALG28-1含有Kan′、glgXCAD序列和温敏复制起点。
通过用重组glgXCAD序列取代内源性glgBXCAP序列产生糖原合成缺陷型菌株。将pCALG28-1转入大肠杆菌菌株7107-18，并使用温度选择方法产生其中的内源性glgBXCAP序列被用来自pCALG28-1的重组glgXCAD序列取代的克隆。通过PCR筛选进一步鉴定所需的克隆并通过碘蒸汽试验验证。使用寡核苷酸GNglgBXCAP3-5(SEQ ID NO136)和GNglgBXCAP4-3(SEQ ID NO137)进行PCR筛选。GNglgBXCAP3-5的序列如下5′-GGCGGCTTAAAATGTCCTGAATG-3′(SEQ ID NO136)。该引物的进一步位于由寡核苷酸GNglgBXCAP1-5(SEQ ID NO112)和GNglgBXCAP2-3(SEQ ID NO113)产生的glgBXCAP PCR片段的5′端的上游。GNglgBXCAP4-3的序列如下5′-CGAAATCATCGTTGCCAGTAACTTTACG-3′(SEQ ID NO137)。该引物还进一步位于由寡核苷酸GNglgBXCAP1-5(SEQ ID NO112)和GNglgBXCAP2-3(SEQ ID NO113)产生的glgBXCAP PCR片段的3′端的下游。
在PCR筛选中，两种菌株产生了glgXCAD序列所用的预计大小(2295bp)的PCR产物。将这两种菌株命名为7107-308和7107-309。然后使菌株进行碘蒸汽试验以证实这些菌株均不能累积糖原。为了进行该试验，使含有7107-18、7107-308和7107-309细胞的平板暴露于来自碘晶体的蒸汽。仅菌株7107-18变深棕色，表明存在糖原。
检测糖原缺乏菌株中NAG产量的摇瓶实验 用摇瓶筛选评价其糖原合成被glg缺失阻断的菌株。使菌株生长在补充了40gl-1-′葡萄糖、10gl-1核糖和5gl-1酵母提取物的M9B培养基中。看起来在含有glg缺失的菌株之间存在一些感兴趣的差异。一些glg缺失菌株(连入7107-604)的生长优于对照菌株，但生产的NAG浓度较低。菌株7107-605-1表现出的生长与对照菌株相差无几，但NAG滴度有12％的改善。
表30.摇瓶实验中glg缺失菌株的生长和NAG产量
实施例28 下面的实施例证实两个lacI基因之一缺失和用lacUV5启动子取代lac启动子对减缓葡萄糖抑制和葡糖胺/N-乙酰氨基葡糖产生的影响。
已知培养基中存在葡萄糖抑制了大肠杆菌中来自lac启动子的表达。Lac操纵子编码三种蛋白LacZ、LacY和LacA。lacZ基因编码β-半乳糖苷酶，它将乳糖裂解成葡萄糖和半乳糖且还将乳糖转化成所述操纵子的确切诱导物异乳糖。异乳糖通过与阻抑蛋白(由lacI基因编码)发生相互作用诱导lac操纵子并防止其结合在lac操纵子上。LacY基因编码控制乳糖流入细胞的乳糖通透酶。lacA基因编码硫代半乳糖苷转乙酰基酶(半乳糖苷乙酰转移酶)，它是一种可以有助于对不可代谢的吡喃糖苷类的细胞解毒的酶。
Lac操纵子的转录需要复合物CRPcAMP结合lac启动子序列，所述的复合物CRPcAMP是cAMP与其受体蛋白(CRP)形成的复合物。认为葡萄糖通过降低细胞中cAMP水平抑制lac操纵子。lacUV5启动子是含有特异性核苷酸改变的lac启动子的突变体形式。由于这些改变，所以lac启动子不再需要通过CRPcAMP复合物结合而激活转录。这提示在lacUV5控制下的lac操纵子不易受到葡萄糖抑制的影响。因此，在产生N-乙酰氨基葡糖和/或葡糖胺的大肠杆菌菌株中lac启动子被lacUV5启动子(本文由SEQID NO135表示)取代而将葡萄糖抑制作用减少到最低限度。
一些产生N-乙酰氨基葡糖和/或葡糖胺的菌株含有lacI阻抑基因的两个拷贝。一个是天然lac操纵子的成分，而另一个在DE3元件中发现。细胞lacI阻抑蛋白的量可以影响抑制的强度。因此，lacI基因之一缺失可以影响乳糖对葡糖胺/N-乙酰氨基葡糖产生的诱导。
用lacUV5启动子取代lac启动子 在构建用于将lacUV5启动子整合入产生N-乙酰氨基葡糖和/或葡糖胺的菌株的质粒前产生数种前体质粒。
第一前体质粒的产生包括使用寡核苷酸引物GNmphRlacIlacZ1-5(SEQID NO116)和GNmphRlacIlacZ2-3(SEQ ID NO117)产生从大肠杆菌菌株W3110 PCR扩增mphRlacIlacZ片段。GNmphRlacIlacZ1-5的序列如下5′-ATTGTGCGCTCAGTATAGGAAGG-3′(SEQ ID NO116)；且和GNmphRlacIlacZ2-3的序列为5′-CGATACTGACGGGCTCCAG-3′(SEQ ID NO117)。将含有mphRlacIlacZ序列的正确大小的PCR产物克隆入

2.1-

而产生pCALG3-1。
使用寡核苷酸GNlacdel2-5(SEQ ID NO118)和GNlacdel3-5(SEQ IDNO119)由pCALG3-1的定点诱变(

QuikChange#XL定点诱变试剂盒，Catalog#200517)得到下一个前体质粒。GNlacdel2-5的序列为5′-(磷酸化的)GCAAAACCTTTCGCGGTCACCCATGATAGCGCCCG-3′(SEQ ID NO118)。该引物序列与W3110 lacI序列相同，但其中ATGG变为CACC以便在lacI起始密码子的5′添加BstE II位点(以SEQ ID NO118的15-21位核苷酸表示)。GNlacdel3-5的序列为5′-(磷酸化)CGGGCGCTATCATGGGTGACCGCGAAA-GGTTTTGC-3′(SEQ ID NO119)。该寡核苷酸序列与W3110 lacI序列反向互补，但其中CCAT变为GGTG以便在lacI起始密码子的5′添加BstE II位点(以SEQ ID NO119的15-21位核苷酸表示)。
使用寡核苷酸GNlacdel2-5(SEQ ID NO118)和GNlacdel3-5(SEQ IDNO119)的定点诱变在lacI起始密码子5′添加BstE II位点而产生pCALG5-1。这种重组质粒由含有

2.1-

主链上lacI起始密码子5′的、BstE II位点的mphRlacIlacZ序列组成。
接下来用BstE II消化pCALG5-1，并分离含有lacI的3′序列、带有lac启动子的lacZ基因的部分、

2.1-

和来自mphR的序列的片段。将从pCALG5-1分离的片段与其自身连接以产生pCALG10-1。重组pCALG10-1质粒含有

2.1-

主链中的mphR序列、lacID、lac启动子、lacZ序列。
下一步用BstE II和Nde I消化pCALG10-1并分离含有

2.1-

和mphR序列的片段。然后将分离的pCALG10-1片段与两种PCR产物连接。由pCAL610-1产生的第一种PCR产物含有Nde I位点与lacZ起始密码子的5′紧密连接的lacZ序列。在标准条件下使用PCR和寡核苷酸引物GNLacZ1-5(SEQ ID NO120)和GNLacZ2-3(SEQ ID NO121)扩增含有lacZ序列的pCALG10-1部分。GNLacZ1-5的序列如下5′-CACAGGAAACACATATGACCATGATTACGG-3′(SEQ ID NO120)。该引物序列与pCALG10-1的1921-1950位核苷酸(lac启动子/lacZ接点)相同，但除外用以添加Nde I位点的G1932C和C1933A的核苷酸改变(以SEQ IDNO120的12-17位核苷酸表示)。GNLacZ2-3的序列为5′-CCACCATGATATTCGGCAAGCAG-3′(SEQ ID NO121)。该序列与pCALG10-1的6523-6545位核苷酸反向互补。
在标准条件下使用PCR和寡核苷酸引物GNLacuv53-5(SEQ ID NO122)和GNLacuv54-3(SEQ ID NO123)扩增第二种PCR产物，即来自菌株7101-17(DE3)的lacUV5启动子。GNLacuv53-5的序列如下5′-CCTTTCGCGGTCACCAGCAAA-3′(SEQ ID NO122)。该序列与pCALG10-1的1253-1273位核苷酸相同且包括lacI中的内源性BstE II位点(以SEQ ID NO122的9-15位核苷酸序列表示)。GNLacuv54-3的序列为5′-CCGTAATCATGGTCATATGTGTTTCCTGTG-3′(SEQ ID NO123)。该序列与pCALG10-1的1921-1950位核苷酸(lac启动子/lacZ接点)反向互补，但不包括用来添加Nde I位点的G1932G和C1933T的核苷酸改变(以SEQ IDNO123的14-19位核苷酸表示)。
PCR-产生的lacUV5启动子片段用BstE II与NdeI消化并纯化。类似地，用Nde I消化含有lacZ序列的PCR产物并纯化。为了产生下一个前体质粒，将来自pCALG10-1的mphR片段(Nde I-BstE II)、lacUV5启动子片段(BstE11-Ael)和lacZ片段(Nde I-NdeI)彼此连接。所得重组质粒pCALG 16-3含有载体

2.1-

中的mphR序列、lacID、lacUV5启动子、lacZ序列(与该序列的天然形式的次序相反)。通过测序验证pCALG16-3的正确lacUV5启动子序列。
下一步使用标准条件和寡核苷酸引物GNLacZ1-5(SEQ ID NO120)和GNlacZ3-3(SEQ ID NO124)对pCALG10-1中的lacZ片段进行PCR扩增。
GNlacZ3-3的核苷酸序列为5′-GACGAAGCGGCCGCGTAAACG-3′(SEQ ID NO124)。该序列与pCALG10-1的3618-3638位核苷酸反向互补，但不包括用来添加Not I位点的T3625C、C3626G和C3630G核苷酸改变(以SEQID NO124的7-14位核苷酸表示)。
用Nde I和Not I消化lacZ PCR片段并分离。另外，用Nde I-Not I消化pCALG16-3并分离含有

2.1-

来自mphR的序列、lacID和lacUV5启动子的片段。将lacZ PCR片段和含有

2.1-

来自mphR的序列、lacID和lacUV5启动子的pCALG16-3片段彼此连接而产生pCALG20-1。该重组CALG20-1质粒含有

2.1-

来自mphR的序列、lacID、lacUV5启动子(带有与lacZ起始密码子的5′紧密连接的Nde I位点)和5′-3′方向的lacZ编码区。
将上述构建的pCALG3-1与pCALG20-1一起用于产生下一个前体质粒。用Apa I消化pCALG3-1和pCALG20-1。分离含有lacUV5启动子和lacZ序列的pCALG20-1片段和含有

2.1-

mphR序列和全长lacI的pCALG3-1片段并将它们彼此连接而产生pCALG22-1。该重组pCALG22-1含有mphR序列、全长lacI、lacUV5启动子(含有与lacZ起始密码子的5′紧密连接的Nde I位点)、lacZ序列和

2.1-
将pCALG22-1和pUC4K(Amersham Pharmacia Biotech，Catalog#27-4958-01，GenBank保藏号#X06404)用于产生下一个前体质粒。用BamH I消化pCALG22-1和pUC4K。分离含有mphR序列、全长lacI、lacUV5启动子、lacZ序列和

2.1-

的pCALG22-1片段和含有Kan′的pUC4K片段，并将它们彼此连接而产生pCALG25-1。该重组pCALG25-1由Kan′、mphR序列、全长lacI、lacUV5启动子(带有与lacZ起始密码子5′紧密连接的Nde I位点)、lacZ序列和

2.1-

组成。
为了产生下一个前体质粒，用Kpn I和NotI消化pCALG25-1和pKLN07-20(另有描述)。分离含有Kan′、mphR序列、全长lacI、lacUV5启动子和lacZ序列的pCALG25-1片段和含有来自pMAK705(上述)的温敏复制起点的pKLN07-20片段，并将它们彼此连接而产生pCALG29-1。该重组pCALG29-1质粒含有Kan′、mphR序列、全长lacI、lacUV5启动子(带有与lacZ起始密码子5′紧密连接的Nde I位点)、lacZ序列和来自pMAK705的温敏区。
在构建pCALG29-1后，认为它可以为最终的整合型载体。然而，随后发现在lacZ起始密码子5′处添加Nde I位点抑制了lacZ的适当表达。因此，对pCALG29-1进行定点诱变(

Quik

XL定点诱变试剂盒，Catalog#200517)以破坏Nde I位点，并用内源性lacUV5核苷酸进行取代NdeI核苷酸的改变。为了对pCALG29-1进行必要的改变，使用寡核苷酸GNlacZ-Nde 1(SEQ ID NO125)和GNlacZ-Nde 2(SEQ ID NO126)对pCALG29-1进行定点诱变以产生pCALG31-1。
GNlacZ-Ndel的核苷酸序列如下5′-CACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGGATTC-ACTGG-3′(SEQ ID NO125)。该序列与pCALG10-1的1919-1959位核苷酸相同。GNlacZ-Nde2的核苷酸序列如下5′-CCAGTGAATCCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTG-TGTG-3′(SEQ ID NO126)。该序列与pCALG10-1的1919-1959位核苷酸反向互补。
所得重组pCALG31-1质粒含有Kan′、mphR序列、全长lacI、lacUV5启动子(带有与lacZ起始密码子5′紧密连接的内源性核苷酸)、lacZ序列和来自pMAK705的温敏复制起点。
将该重组pCALG31-1转入7107-18并使用温敏选择法产生含有lacUV5启动子取代的克隆。为了鉴定正确的克隆，制备基因组DNA并对lacUV5启动子区进行PCR扩增。然后对PCR产物进行测序以证实存在lacUV5启动子。一种菌株产生了预计大小的PCR产物且具有正确的DNA序列。将该菌株命名为7107-310。
LacI缺失和用lacUV5启动子取代lac启动子 为了在N-乙酰氨基葡糖和/或葡糖胺生产菌株中产生需要从lac操纵子中缺失lacI并用lacUV5启动子取代lac启动子的质粒，研发两种前体质粒。为了产生第一种前体质粒，用BamH I消化pCALG20-1(参见上文)和pUC4K(Amersham Pharmacia Biotech，Catalog#27-4958-01，GenBankAccession#X06404)。分离含有mphR序列、lacID、lacUV5启动子(带有与lacZ起始密码子5′紧密连接的Nde I位点)、lacZ序列和

2.1-

的pCALG20-1片段和含有Kan′的pUC4K片段，并将它们彼此连接而产生pCALG26-1。该重组pCALG26-1由Kan′、mphR序列、lacID、lacUV5启动子(带有与lacZ起始密码子5′紧密连接的Nde I位点)、lacZ序列和

2.1-

组成。
为了产生下一个前体质粒，用Kpn I和NotI消化pCALG26-1和pKLN07-20(另有描述)。分离含有Kan′、mphR序列、lacID、lacUV5启动子(带有与lacZ起始密码子5′紧密连接的Nde I位点)和lacZ序列的pCALG26-1片段和含有来自pMAK705(上述)的温敏复制起点的pKLN07-20片段并将它们彼此连接而产生pCALG30-1。该重组pCALG30-1质粒含有Kan′、mphR序列、lacID、lacUV5启动子(带有与lacZ起始密码子5′紧密连接的Nde I位点)、lacZ序列和来自pMAK705的温敏复制起点。
在构建pCALG30-1后，认为它可以为最终的整合型载体。然而，随后发现在lacZ起始密码子5′处添加Nde I位点抑制了lacZ的适当表达。因此，使pCALG30-1进行定点诱变(


XL定点诱变试剂盒，Catalog#200517)以破坏Nde I位点并用内源性lacUV5核苷酸进行取代Nde I核苷酸的改变。为了对pCALG30-1进行必要的改变，使用寡核苷酸GNlacZ-Nde 1(SEQ ID NO125)和GNlacZ-Nde 2(SEQ ID NO126)对pCALG30-1进行定点诱变以产生pCALG32-2。该重组pCALG32-2质粒含有Kan′、mphR序列、lacID、lacUV5启动子(带有与lacZ起始密码子5′紧密连接的Nde I位点)、lacZ序列和来自pMAK705的温敏区。
将该重组pCALG32-2转入7107-18并使用温敏选择法产生含有lacUV5启动子取代的克隆。为了鉴定正确的克隆，生产基因组DNA并对lacUV5启动子区进行PCR扩增。然后对PCR产物进行测序以证实存在lacUV5启动子。三种菌株产生了预计大小的PCR产物且具有正确的DNA序列。将这些菌株命名为7107-313、7107-314和7107-315。
从DE3元件缺失LacI 为了从生产菌株基因组的DE3元件中缺失lacI基因，使用实施例13中所述的温敏选择法。这种策略包括构建使DE3靶向lacI缺失的整合型载体。就构建的第一步而言，通过PCR从大肠杆菌7107-73基因组DNA扩增含有DE3元件的lacI的区。基于T7RNAP和大肠杆菌基因组attB区的公布序列(Blattner等，1997，Science 277(5331)1453-1474)合成引物。将正向引物07-74和反向引物07-48用于扩增且它们具有如下序列07-745′GATCCCGGGAACGGACGATTAGAGATCACC 3′(SEQ ID NO127)和07-485′GTCAGAGAAGTCGTTCTTAGCGATG 3′(SEQ ID NO128)。
正向引物07-74添加了Sma I位点(CCCGGG，以SEQ ID NO127的4-9位核苷酸表示)并从大肠杆菌基因组的attB位点上游的1194个碱基对处扩增。反向引物07-48从T7基因1ATG起始密码子上游的36个碱基对处扩增。将所得～3.2kb PCR片段连入载体pPCR-ScriptTMSK(+)(Stratagene CloningSystems，La Jolla，CA)，产生质粒pSW07-53#7和#17。DNA测序揭示出PCR产物含有attB位点上游的基因组区与来自DE3元件的lacI lacZ′片段。
为了产生lacI缺失，用限制性核酸酶Mlu I和Sfo I消化质粒pSW07-53#17以除去lacI编码序列的640个碱基对片段。用T4 DNAP处理pSW07-53质粒的剩余部分以产生平端且然后与其自身连接，产生质粒pSW07-55#13。
用限制性核酸酶Not I和Sal I从质粒pSW07-55#13消化含有带有lacI缺失的DE3序列的片段。将该片段与来自pKLN07-21的4.2kbSal I和Not I片段连接，后者含有来自pMAK705(Hamilton等，1989，J.Bac.171(9)4617-4622)的温敏复制子和来自pUC4K(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)的卡那霉素抗性盒。将所得质粒pKLN07-56#13用于产生大肠杆染色体上DE3元件的lacI缺失。
为了产生在DE3元件中具有lacI缺失的菌株，用质粒pSW07-56#13转化大肠杆菌7107-18。在温敏选择和传代方案后，使用标准PCR方案筛选存在这种缺失的菌株。通过严格Southern杂交、使用含有部分lacI和部分DE3元件的lacZ片段的片段作为探针验证通过PCR鉴定的数种菌株。将这些菌株命名为7107-84(1)-7107-84(4)。
摇瓶中含有lacID和/或lacUV5启动子取代的菌株中葡糖胺的产量 菌株7107-84(1)仅含有一种功能性lacI基因，与含有两种功能性lacI基因的菌株7107-18相反。进行摇瓶筛选42以确定菌株7107-84(1)的lacI缺失对乳糖诱导的影响。在有过量葡萄糖和乳糖存在的情况下，乳糖的诱导在菌株7107-18中因LacI阻抑蛋白结合lac操纵子从而阻止转录而应受到抑制。葡萄糖的这种抑制作用在菌株7107-84(1)中应减少，因为应存在较少LacI阻抑蛋白以便与lac操纵子结合，从而使从lac启动子的转录增加。这一结果应增加细胞中T7RNAP的池，导致从T7lac-glmS*54盒的转录增加。最终高水平的葡糖胺应在菌株7107-84(1)中产生。同样，其中的lac操纵子含有LacI缺失为的菌株(例如7107-313、7107-314和7107-315)在乳糖诱导时应有高浓度的GlcN产生。
在摇瓶实验中将其中的lac操纵子(7107-310)缺失LacI基因的、其中的DE3元件(7107-84#1)缺失LacI基因的和其中的lac操纵子(lac启动子被lacUV5启动子取代)缺失lacI的(7107-313、7107-314、和7107-315)的大肠杆菌菌株与菌株7107-18进行比较。使全部菌株生长在含有如下组分的M9B培养基的烧瓶中6g/l KH2PO4、24g/l K2HPO4、1g/l Na3柠檬酸盐-2H2O、10g/l(NH4)2SO4(用磷酸将pH调节至7.4)和痕量金属(0.2mg/l FeSO4-7H2O、0.015mg/l ZnSO4-7H2O、0.015mg/l MnSO4-H2O、0.001mg/l CuSO4-5H2O、0.001mg/l NaMoO4-2H2O、0.001mg/l H3BO3和0.001mg/l CoCl2-6H2O)，该培养基中还补充了0.6g/l MgSO4-7H2O和0.05g/l CaCl2-2H2O。为了检测葡萄糖的抑制作用，烧瓶中含有不同量的葡萄糖和乳糖。烧瓶中所用的葡萄糖和乳糖的量如表4和表5中所示。在以225rpm振摇下使培养物在30℃生长24小时且然后放置在25℃，在本实验剩余部分中以225rpm振摇。在24和48小时时将各培养物调节至pH7.0，向烧瓶中加入葡萄糖至约30g/l并向氨的浓度已经降至1g/l以下的培养物中5g/l(NH4)2SO4。在24和48小时时采样。在各时间点处使用如美国专利US6,372,457B1中所述改进的Elson-Morgan试验测定培养物上清液中的葡糖胺浓度。葡糖胺浓度如表31中所示。
正如预计的，在有单独的葡萄糖或单独的乳糖存在的情况下菌株7107-18、7107-84(1)、7107-310和7107-313的性能类似。因为没有诱导物存在，所以当上述菌株在葡萄糖中生长时，几乎没有GlcN产生。当使用乳糖作为诱导物使菌株生长时，两种菌株均出现了显著的葡糖胺累积。然而，当菌株在有葡萄糖和乳糖存在的情况下生长时，除去来自染色体的lacI基因的一个拷贝显著影响了乳糖诱导且由此影响了葡糖胺滴度。在48小时时间点处菌株7107-313和7107-84(1)产生的葡糖胺水平为在菌株7107-18中观察到的约6-8倍。这一结果证实了LacI阻抑蛋白的减少使得从lac启动子的转录增加从而使产生的葡糖胺水平增加的设想。
表31.摇瓶筛选42中不同样品中的葡糖胺浓度

T 7lac-ScGNA1盒在含有lacID和/或lacUV5启动子取代的菌株中的整合 为了评价NAG生产菌株中lacI缺失对葡萄糖脱阻抑的影响，必须向菌株7107-84(1)和7107-84(2)的染色体上添加T7lac-ScGNA1盒。如另外部分中详述的应用对使用质粒pSW07-68#5通过温敏选择进行GNA1的克隆和整合的方法和方案。通过标准高度严格Southern杂交、使用ScGNA1编码序列作为探针证实所得菌株7107-97和7107-98含有在染色体manXYZ缺失位点上整合的T7lac-ScGNA1。
类似地构建潜在的萄糖脱阻抑的菌株的其它形式。通过将lac操纵子的启动子改变成该启动子的lacUV5形式构建菌株7107-310。通过缺失lacI基因的染色体拷贝、并将lac操纵子的启动子改变成该启动子的lacUV5形式构建菌株7107-313。7107-314和7107-315。为了评价这些突变对NAG生产背景中的葡萄糖脱阻抑的影响，必须向菌株的染色体上添加T7lac-ScGNA1盒。将所述使用质粒pSW07-68#5通过温敏选择进行GNA1克隆和整合的方法和方案用于菌株7107-310和7107-313。使用高度严格Southern杂交、将ScGNA1编码序列用作探针证实所得菌株7107-129和7107-130(来自菌株710-310)和7107-131(来自菌株7107-313)为含有整合在染色体manXYZ缺失位点的T7lac-ScGNA1。
摇瓶中含有lacID和/或lacUV5启动子取代的菌株的N-乙酰氨基葡糖产量 进行筛选以评价DE3元件的lacI缺失对NAG生产菌株中葡萄糖脱阻抑的影响。使用不同水平的葡萄糖和乳糖在添加或不添加核糖的情况下检测菌株7107-97和7107-98(2)。含有lacI的两个拷贝的NAG生产菌株7107-92(1)作为对照菌株。使培养物生长在补充了0.6g/l MgSO4-7H2O、0.05g/l CaCl2-2H2O、不同浓度的葡萄糖和乳糖和5g/l酵母提取物的M9B培养基(上述)中生长。开始使菌株在10g/l的葡萄糖上生长，一旦葡萄糖耗尽，则变为利用乳糖。还用过量的葡萄糖条件(在有乳糖存在的情况下)来测定对葡萄糖阻抑的敏感性。每次改变均在添加或不添加核糖的条件下进行。使培养物在30℃生长24小时且然后变为25℃并在本实验剩余部分中持续。在24和48小时时间点将pH调节至7.2，并加入葡萄糖至总计约30g/l。在24和48小时时向铵浓度已降至1g/l以下的烧瓶中加入5g/l(NH4)2SO4。在24、48和72小时时分析样品的NAG产量。
在非阻抑性条件下对照菌株性能良好，产生超过20g/l NAG，但在过量葡萄糖存在下仅产生约5g/l(表32)。一种突变菌株(7107-98)的性能与对照菌株类似，而另一种菌株(7107-97)表现出葡萄糖抵抗性，甚至在存在过量葡萄糖时，仍产生超过20g/l NAG。实际上，在非阻抑条件下该菌株在NAG产量和乙酸酯累积方面的性能均优于对照菌株。在本实验中，向培养物中添加核糖不会显著增加生长或NAG滴度。总体结果表明DE3元件的lacI缺失至少部分缓解了葡萄糖阻抑，使生长菌株中的NAG滴度得到提高。
表32.在有不同量葡萄糖和乳糖存在的情况下DE3元件的lacI缺失对葡萄糖脱阻抑的影响
1)菌株对照菌株7107-92(1)两个laI基因。
7107-97和7107-98(2)仅一个lacI基因(DE3中的一个lacI基因缺失)。
2)OD600、乙酸酯水平和NAG水平来自72-小时时间点。
进行另一种筛选以评价菌株7107-129、7107-130和7107-131的葡萄糖脱阻抑。包括含有两个lacI拷贝的NAG生产菌株7107-92(1)作为对照菌株。使培养物生长在补充了0.6g/l MgSO4-7H2O、0.05g/l CaCl2-2H2O、不同浓度的葡萄糖和乳糖、5g/l核糖和5g/l酵母提取物的M9B培养基(上述)中生长。开始使菌株在10g/l葡萄糖上生长，一旦葡萄糖耗尽，则变为乳糖以证实乳糖的诱导作用。还在总存在葡萄糖的过量葡萄糖条件(在有乳糖存在的情况下)下检测菌株7107-131以测定其对葡萄糖诱导的敏感性。使培养物在30℃生长24小时且然后变为25℃并在本实验剩余部分中持续。将pH调节至7.2并在24和48小时时时间点加入葡萄糖至每天总计约30g/l。在24和48小时时向铵浓度已降至1g/l以下的烧瓶中加入5g/l(NH4)2SO4。在24、48和72小时时分析样品的NAG产量。
正如在表33中观察到的，当开始在葡萄糖中生长、并在葡萄糖耗尽后变为乳糖时，lacUV5突变菌株(7107-130)和含有lacI缺失的lacUV5突变菌株(7107-131)之一的性能优于对照菌株7107-92(1)。在葡萄糖过量的条件下，菌株7107-131的性能优于对照菌株7107-92(1)，产生的NAG高约30％。这一结果证实lacI的任意拷贝缺失有助于缓解葡萄糖阻抑，使诱导在有过量葡萄糖存在的情况下发生并改善了NAG滴度。
表33.在葡萄糖限制或过量条件下lacI缺失和/或lacUV5启动子度NAG产量的影响
1)菌株对照菌株7107-92(1)lacI(lac)、lacI(DE3) 7107-129，7107-130lacUV5、lacI(lac)、lacI(DE3) 7107-131lacUV5、lacIΔ(lac)、lacI(DE3) 2)OD600、乙酸酯浓度和NAG浓度得自72-小时时间点。
实施例29 下面的实施例表示半乳糖利用恢复对N-乙酰氨基葡糖和/或葡糖胺累积的影响。
乳糖-诱导的含有galKΔ::T7-lac-glmS*54构建体的N-乙酰氨基葡糖和/或葡糖胺生产菌株因galKΔ而不能利用半乳糖作为碳源。这些菌株因通过β-半乳糖苷酶使乳糖裂解成葡萄糖和半乳糖而累积了半乳糖。为减少这些菌株中的半乳糖累积，需要将T7-lac-glmS*54表达盒整合入不同染色体位置。已构建的N-乙酰氨基葡糖和/或葡糖胺生产菌株含有nagΔ::Tetr。如美国专利6,372,457B1中所述，通过P1噬菌体转导从亲代菌株IBPC590(Plumbridge(1991)Mol.Microbiol.5，2053-2062)转移基因组的nagΔ::Tetr部分。生产菌株中存在Tetr是不需要的。因此，用T7-lac-glmS*54取代Tetr不仅可以用作T7-lac-glmS*54的整合位点，还可以在相同过程中除去Tetr。
为产生菌株7107-18(上文实施例7中所述)而将ΔgalkT7-lac-glmS*54构建体整合入7101-17(DE3)已经导致葡糖胺产量显著增加。另外，如上文实施例16中所述，将manXYZΔ::T7-lac-Sc GNA1构建体整合入7107-18导致产生N-乙酰氨基葡糖。为了研发能够代谢半乳糖的N-乙酰氨基葡糖生产菌株，将T7-lac-glmS*54表达盒整合在nagD::Tetr位点，随后将T7-lac-Sc GNA1表达盒插在manXYZ位点上。
构建含有nagΔ::T7-lac-glmS*54和manXYZΔ::T7-lac-Sc GNA1的菌株中涉及的步骤包括产生三种前体质粒。为了产生第一种前体质粒，使用标准条件与寡核苷酸引物GNglmSnagE3-5(SEQ ID NO129)和GNglmSnagE4-3(SEQ ID NO130)对来自pKLN23-54(专利号US 6,372,457B1中所述)的T7-lac-glmS*54片段进行PCR扩增。
GNglmSnagE3-55′-GGATCTAAACCTCAGTAGCGACCGGTCTAGAACTA-GTG-3′(SEQ IDNO129)。除以下位置外引物与pKLN23-54的1109-1146位核苷酸相同C1115A、C1116A、G1120T、G1122A、G1125A、G1129A和C1133G。在pKLN23-54的1115-1125位进行改变(相当于SEQ ID NO129的8、12、14、17、21和25位核苷酸)以增加引物在PCR中的稳定性，pKLN23-54的1129和1133位的改变使Age I位点添加到SEQ ID NO129(SEQ ID NO129的21-26位表示)。
GNglmSnagE4-35′-CCCTCGCCCCTCTAGAGCATTTAAATTCAGTCAATT-AC-3′(SEQ IDNO130)。除以下位置外该引物与pKLN23-54的3237-3274位核苷酸反向互补T3251A、G3253T、G3256A、A3270C、和T3273C(分别由SEQ ID NO130的位置24、22、19、5和2表示)。在3251-3256位上进行改变以添加Swa I位点(由SEQ ID NO130的19-26位表示)并在3270和3273位上进行改变以增加PCR中引物的稳定性。
将所得PCR产物连入

-Blunt

(Invitrogen Zero


PCR克隆试剂盒，Catalog#K2800-20)。该重组质粒pCALG38-2含有与Age I位点5′和Swa I位点3′侧接的T7-lac-glmS*54表达盒。
为了产生第二种前体质粒，使用GnnagEtetR1-5(SEQ ID NO131)和GNnagEtetR2-3(SEQ ID NO132)通过PCR从大肠杆菌菌株7107-18扩增nagΔ::Tetr::asn片段。GNnagEtetR1-5的核苷酸序列如下5′-CACGCAGGCAGGCTTTACCTTCTTC-3′(SEQ ID NO131)且GNnagEtetR2-3的核苷酸序列如下5′-CGGAAGAACAAGCGACGGAAGGAC-3′(SEQ ID NO132)。
将PCR产物连入

-Blunt II-

以产生重组质粒pCALG35-1。
为了产生第三种前体质粒，用Age I和Swa I消化pCALG38-2并纯化T7-lac-glmS*54片段。另外，用Age I和Nru I消化pCALG35-1并纯化

-Blunt II-

-nagD片段。将来自pCALG38-2和pCALG35-1的纯化片段连接而产生pCALG40。该重组pCALG40质粒含有

-Blunt

中的nagD::T7-lac-glmS*54::asn片段。
为了产生将重组nagD::T7-lac-glmS*54::asn片段整合入基因组需要的最终质粒，进行如下工作。用Kpn I和NotI消化pCALG40并分离含有nagD::T7-lac-glmS*54::asn的片段。另外，用Kpn I和Not I消化pKLN07-21(上述)以分离含有Kanr(来自上述pUC4K)和温敏复制起点(来自pMAK705)的片段。将来自pCALG40的nagD::T7-lac-glmS*54::asn片段与Kanr和温敏复制起点pKLN07-21的片段连接而产生pCALG43-2。
将质粒pCALG43-2转入7101-17(DE3)并产生基因组中含有的nagD::T7-lac-glmS*54的克隆。通过PCR鉴定正确的克隆并通过Southern杂交分析验证。还通过四环素抗性的丧失证实克隆。
为了对含有nagD::T7-lac-glmS*54::asn的菌株进行PCR筛选，合成寡核苷酸引物对。正向引物GNnagET7glmS1-5含有5′-CAC GAT AAA CGGTGA AGC CAT GTCG-3′(SEQ ID NO133.)的序列。反向引物GNnagET7glmS2-3含有5′-CGT CCA TTT TCT TGA ACG CTT CAT CCC-3′(SEQ ID NO134.)的序列。正向引物和反向引物分别位于由寡核苷酸GnnagEtetR1-5(SEQ ID NO133)和GNnagEtetR2-3(SEQ ID NO134)产生的nagD::Tetr::asn PCR片段的5′和3′。通过PCR鉴定四种菌株并命名为7107-321#1、#2、#3和#4。
为了证实nagΔ::T7-lac-glmS*54在7107-321菌株中的整合，分离基因组DNA并在标准条件下通过DNA印迹、使用nagE特异性探针进行分析。通过Southern印迹分析发现7107-321菌株是正确的。另外，因7107-321菌株在含有四环素的培养基中不能生长而证实不存在nagΔ::Tetr::asn。
为了添加manXYZΔ::T7-lac-Sc GNA1构建体，将重组pSW07-68质粒(上述)转入各7107-321菌株。使用温度选择法产生含有整合入基因组的manXYZA::T7-lac-ScCNA1的克隆。通过PCR鉴定克隆并通过Southern印迹分析验证。12种菌株产生了预计大小的PCR产物。将这些菌株命名为7107-325#1、#2和#3(来源于7107-321#1)；7107-326#1、#2和#3(来源于7107-321#2)；7107-327#1、#2和#3(来源于7107-321#3)；和7107-328#1、#2和#3(来源于7107-321#4)。通过Southern印迹分析、使用GNA1特异性探针证实所有这些菌株均是正确的。
摇瓶实验中能够代谢半乳糖的N-乙酰氨基葡糖生产菌株的评价 在摇瓶实验中检测能够代谢半乳糖的N-乙酰氨基葡糖生产菌株(7107-325#1、7107-326#1、7107-327#1和7107-328#1)(表34)。在含有补充了0.6g l-1 MgSO4-7H2O和0.05g l-1CaCl2-2H2O的M9B培养基的烧瓶中检测所述菌株。筛选54和55的痕量金属补充包括0.2mg l-1FeSO4-7H2O、0.015mg l-1 ZnSO4-7H2O、0.015mg l-1MnSO4-H2O、0.001mg l-1CuSO4-5H2O、0.001mg l-1NaMoO4-2H2O、0.001mg l-1H3BO3和0.001mg l-1CoCl2-6H2O，而筛选59和66的痕量金属补充包括0.5mg l-1FeSO4-7H2O、0.38mg l-1ZnSO4-7H2O、0.033mg l-1MnSO4-H2O、0.01mg l-1CuSO4-5H2O和0.01mg l-1CoCl2-6H2O。正如表34中所示，将不同量的葡萄糖(Glu)、乳糖(Lac)、酵母提取物(YE)和乳清渗透物(WP，Formost Whey，Wisconsin)用于烧瓶中。对于筛选54和55而言，使培养物在以225rpm振摇下、在30℃生长24小时，且然后在余下的实验中将其保持在25℃并以225rpm振摇下。就筛选59和66而言，使培养物在以225rpm振摇下、在37℃生长8-10小时且然后在余下的实验中将其置于30℃并以225rpm振摇。在筛选59和66中，在10小时时将pH调节至7.2且如果培养物耗尽了葡萄糖，则加入20-25g l-1葡萄糖。就全部四种筛选而言，在24和48小时时，将各培养物的pH调节至7.2，向烧瓶中加入葡萄糖至约30g l-1，并向氨浓度已经降至1g l-1以下的培养物中加入5gl-1(NH4)2SO4。在筛选66中，如果必要，在30和54小时时加入葡萄糖，将pH调节至7.2，且如果氨的浓度低于1g l-1，则加入2.5g l-1(NH4)2SO4。就全部四种筛选而言，在24和48小时时采样并使用HPLC碳水化合物柱(carbohydrate column)测定培养物上清液中N-乙酰氨基葡糖和半乳糖的浓度。
N-乙酰氨基葡糖在不同样品中的浓度如表34中所示。从这些实验中可以推断在一些条件下，在nagΔ位点而不是glaK位点上整合T7lac-glmS*54改善了N-乙酰氨基葡糖的产量。表34还表示了不同培养物中半乳糖的浓度。正如预计的，在nagΔ位点而不是glaK位点上整合T7lac-glmS*54消除了半乳糖累积。
表34.在不同生长条件下N-乙酰氨基葡糖和半乳糖的浓度
*对照菌株非半乳糖利用者菌株7107-92 所有其它菌株为半乳糖利用者的姊妹体 Glu＝葡萄糖，Lac＝乳糖，YE＝酵母提取物，WP＝乳清渗透物 1升发酵罐中能够代谢半乳糖的N-乙酰氨基葡糖生产菌株的评价 在1-升发酵罐中比较能够利用半乳糖的菌株(7107-325#和7107-328#)与非半乳糖利用者(7107-92#1)。将发酵罐设定为含有起始体积为475ml的发酵培养基4.79g l-1 H3PO4、3.15g l-1 KOH、3.56 l-1柠檬酸-H2O、5g l-1(NH4)2SO4、2.5g l-1 MgSO4-7H2O、0.05g l-1 CaCl2-2H2O、痕量金属(5mg l-1FeSO4-7H2O、3.75mg l-1 ZnSO4-7H2O、0.6mg l-1 MnSO4-H2O、0.1002mg l-1CuSO4-5H2O和0.1002mg l-1 CoCl2-6H2O)和0.25g l-1Mazu 204消泡剂。使用4％KOH将pH调节至7.0。使用75％NH4OH维持培养基的pH(6.9)，将温度维持在37℃并使用通气和搅拌速率维持空气饱和的20％的溶解氧浓度。给培养物补充65％葡萄糖，进料速度由计算机程序控制，从而使接种时的生长速率为0.40小时-1，且到6小时的时候达最大速率5ml/小时。在10小时时用以5g/l添加的食品级乳糖诱导培养物，并连续补充葡萄糖。
在发酵试验过程中的约10、21、28、35、45、52和60小时时采集7份样品。对每份样品使用HPLC糖柱测定N-乙酰氨基葡糖和半乳糖浓度以及数种用于监测培养物卫生的其它成分的浓度。正如预计的，尽管在来自对照菌株7107-92#1的培养基中检测到了半乳糖(样品7中0.6g l-1)，但是在含有菌株7107-325#1和7107-328#1的培养基中没有半乳糖累积。在这些条件下在能够消耗半乳糖的菌株中表达GlmS*54不会改善N-乙酰氨基葡糖产量，然而，用于这种发酵的培养基对7107-92#1而言最佳。半乳糖-利用者菌株可能需要一定程度的不同发酵条件才能达到最佳性能。很可能能够产生可以使7107-325#1和7107-328#1菌株产生的N-乙酰氨基葡糖量高于7107-92#1的培养基。因此，预计可以证实在nagD位点而不是galK位点整合T7-lac-glmS*54表达盒对N-乙酰氨基葡糖和/或葡糖胺产量有益。
为N-乙酰氨基葡糖生产研发的发酵法 实施例30 本实施例描述用于使用含有ScGNA1质粒的菌株的NAG产量最优化的摇瓶实验。
由于确定ScGNA1的超表达使大肠杆菌葡糖胺生产菌株中的NAG水平较高，所以下一步是使生产NAG的条件最优化。采取的手段是增加细胞密度且由此在摇瓶中不产生过量乙酸酯的情况下增加NAG滴度。将表达来自质粒pET24d(+)T7启动子的ScGNA1的菌株7107-87#25用于最初的最优化实验。
酵母提取物的添加和晚期诱导 摇瓶筛选检测了添加酵母提取物对菌株7107-87#25中生长、乙酸酯累积和NAG产量的影响。还检测了使用0.2mM IPTG进行早期与晚期诱导的影响。使菌株生长在M9B培养基(上述)中，但将(NH4)2SO4降至7.5g l-1。给M9B培养基补充30g l-1葡萄糖、0.6g l-1MgSO4-7H2O、0.05g l-1CaCl2-2H2O和25mg/ml卡那霉素。向除用于晚期诱导外的所有烧瓶中加入0.2mMIPTG，而在接种后24小时向用于晚期诱导的烧瓶中加入0.2mM IPTG。不向对照烧瓶中加入酵母提取物。对检测烧瓶而言，在开始时或接种后24小时加入酵母提取物(0.5-4.0g-1)。使培养物在30℃生长至24小时且然后置于25℃。在24和48小时时，向各烧瓶中加入5g l-1(NH4)2SO4和20g l-1葡萄糖并将pH调节至7.2。
正如表35中所观察到的，添加酵母提取物使生长和NAG产量增加。实际上，与在对照烧瓶中产生的2.9g l-1NAG相比，在开始时添加4g l-1酵母提取物的烧瓶的表现最佳，得到8.9g l-1NAG。然而，3.0g l-1乙酸酯也累积在这些烧瓶中。24小时后添加酵母提取物的烧瓶中的生长与在开始时添加酵母提取物的烧瓶中的培养物生长一样好且累积的乙酸酯较少。然而，在这些条件下，在添加4g l-1酵母提取物的烧瓶中，NAG产量在48时仅达到4.9g l-1。此外，进行晚期诱导的烧瓶中的生长优于开始时使用0.2mMIPTG诱导的烧瓶中的生长，不过NAG的产生被延缓。这一结果提示N-乙酰氨基葡糖合成的诱导对细胞生长具有一定的负面作用。
表35.酵母提取物添加和晚期诱导对菌株7107-87#25的生长、乙酸酯累积和NAG产量的影响
1)取自48-小时时间点的结果。
不同糖类和酵母提取物的添加 进行摇瓶筛选以评价不同糖类与酵母提取物对菌株7107-87#25中生长、乙酸酯累积和NAG产量的影响。使菌株生长在M9B培养基(上述)中，但其中的(NH4)2SO4降至7.5g l-1。给M9B培养基补充0.6g l-1MgSO4-7H2O、0.05g l-1CaCl2-2H2O和25mg/ml卡那霉素。由于在上述实验中观察到酵母提取物的正面影响，所以所有烧瓶中均包括5gl-1酵母提取物。如表36中所示向烧瓶中加入0.2mM IPTG和不同浓度的乳糖、葡萄糖、果糖和核糖的混合物。重要的是注意到在有乳糖存在情况下生长的菌株7107-87#25不需要IPTG诱导，因为它为乳糖诱导型。使培养物在30℃生长24小时且然后变温至25℃。
在24小时时，将各培养物的pH调节至7.2。向各烧瓶中加入5gl-1l(NH4)2SO4并基于HPLC结果加入葡萄糖至每天总计约30g l-1。32.5小时是，向烧瓶7中加入15g l-1葡萄糖、2.5g l-1核糖和2.5g l-1(NH4)2SO4。在48小时时，向各烧瓶中加入10g l-1葡萄糖。在49.5小时时向烧瓶7中再加入2.5g l-1核糖和5.0g l-1(NH4)2SO4。在约24、48和72小时从烧瓶中取样用于监测OD600、N-乙酰氨基葡糖水平和乙酸酯水平。
表36.不同糖混合物对菌株7107-87#25中生长、于是在累积和NAG产量的影响
1)取自72-小时时间点的结果。
2)所有烧瓶中包括酵母提取物(5.0g l-1)。
表36中的结果表明三种糖(乳糖、葡萄糖和核糖)支持良好生长并导致大量NAG累积。含有果糖的烧瓶没有获得高OD600，不过NAG滴度达到9.1g l-1。含有果糖或乳糖的烧瓶中开始包括葡萄糖改善了生长和NAG滴度。然而，在开始含有葡萄糖和核糖的烧瓶中获得了最佳结果。
文献描述了不能在NAG或GlcN上生长的大肠杆菌分离物(J.Bac.，1970，101384-391)。作者推测氨基糖磷酸酯的累积可以抑制磷酸己糖异构酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶催化的反应，产生戊糖饥饿。添加戊糖或葡糖酸使这些突变体的生长抑制逆转。产生NAG的菌株7107-87#25也可以累积氨基糖磷酸酯(GlcN-6-P/GlcNAc-6-P)，由此产生戊糖饥饿。如果是这种情况，那么添加核糖或葡糖酸应使生长和NAG产量增加。实际上，通过添加核糖改善了生长和N-乙酰氨基葡糖。在本实验中，含有20g l-1葡萄糖与10g l-1核糖的烧瓶产生了最高水平的NAG，达27g l-1。它是含有30g l-1葡萄糖的烧瓶中产生量的两倍。含有核糖和葡萄糖的烧瓶中的生长也得到改善。
葡萄糖和核糖浓度 上述实验表明向含有葡萄糖的烧瓶中添加核糖对菌株7107-87#25中NAG的产量具有显著的确定影响。进行摇瓶筛选#35以检测不同葡萄糖/核糖混合物对生长和NAG产量的影响。使菌株7107-87#25生长在补充了0.6g l-1MgSO4-7H2O、0.05g l-1CaCl2-2H2O、25mg/ml卡那霉素、0.2mM IPTG和5.0g l-1酵母提取物的M9B培养基(上述)中。如表37中所示向烧瓶中加葡萄糖和核糖的不同混合物。使培养物在30℃生长24小时且然后变温至25℃。在约24和48小时时，将烧瓶的pH调节至7.2。在24小时时向所有烧瓶中加入5g l-1(NH4)2SO4。向烧瓶4-9中再加入2.5g l-1(NH4)2SO4且在29小时时再加入5.0g l-1(NH4)2SO4。在约48小时时向烧瓶7-9中加入5gl-1(NH4)2SO4并向烧瓶10-15中加入2.5g l-1(NH4)2SO4。加入葡萄糖以便在24和48小时时将葡萄糖浓度调节至30g l-1。在24、29、48和72小时时从烧瓶中取样以监测OD600、N-乙酰氨基葡糖水平和乙酸酯水平。在72小时时从选择的烧瓶中收集样品用于酶分析。
正如表37中所观察到的，只要存在残余的葡萄糖，那么葡萄糖浓度不会显著影响NAG产量。另一方面，与不使用核糖的烧瓶中约14g l-1相比，低至5g l-1核糖导致NAG浓度显著增加，截至到72小时时使烧瓶4、5和6中的NAG达到约30g l-1。使用10g l-1核糖获得了最佳结果。在这些烧瓶中，NAG浓度在72小时时达到约36g l-1。在含有核糖的培养物中生长受到正面影响。对选择的烧瓶进行的酶分析揭示添加核糖不会直接影响GlmS或GNA1活性，因为两种酶的活性水平的培养基中加入或不加入核糖时相同。这提示添加核糖的影响最可能是戊糖途经中间体的缺乏被缓解的结果。
表37.葡萄糖和核糖对菌株7107-87#25中生长、乙酸酯累积和NAG产量的影响
1)获自72小时时间点的结果。
2)所有烧瓶中包括酵母提取物(5.0g l-1)。
戊糖磷酸途经中的核糖和其它中间体 根据使用在葡萄糖和核糖中生长的培养物观察到的正面结果，进行摇瓶筛选#36以测定数种其它5-碳糖类和葡糖酸对生长和NAG产量的影响。使菌株7107-87#25生长在补充了0.6g l-1 MgSO4-7H2O、0.05g l-1CaCl2-2H2O、25mg/ml卡那霉素和0.2mM IPTG的M9B培养基(上述)中。如表38中所示向烧瓶中加入葡萄糖、核糖、木糖、阿拉伯糖和葡糖酸(钾盐)。使培养物在30℃生长24小时且然后变温至25℃。在约24和48小时时，将pH调节至7.2。在约24小时时，基于来自24小时样品的HPLC结果加入葡萄糖至每天总计约30g l-1。还向所有烧瓶中加入5g l-1(NH4)2SO4。在24和48小时时向烧瓶11和12中再加入10g l-1核糖并在48小时时向烧瓶3和4中加入5g l-1核糖。在28.5小时时向烧瓶10中加入10g l-1葡糖酸。在约48小时时加入葡萄糖以便将葡萄糖浓度调节至30g l-1。向烧瓶11和12中另外加入5g l-1(NH4)2SO4。在约24、30、48、54和72小时时从烧瓶中取样以监测OD600、N-乙酰氨基葡糖浓度和乙酸酯浓度。在72小时时从选择的烧瓶中收集样品用于酶分析。
表38.5-碳化合物和葡糖醛酸对生长和N-乙酰氨基葡糖产量的影响
1)来自72-小时时间点的结果。
2)在24和48小时时再向烧瓶11和12中加入核糖(10g l-1)。
3)所有烧瓶中包括酵母提取物(5.0g l-1)。
当与对照组相比时，添加戊糖和葡糖酸使NAG滴度增加和生长改善(图18)。这些培养物中含有的乙酸酯浓度低于对照培养物。然而，添加核糖使NAG产量最高。葡糖酸的昂贵程度低于其它糖类且由此在工业化规模应用中具有吸引力。因为添加葡糖酸导致NAG产量与对照菌株相比而言增加，所以本实验证实了它在工业化发酵中减少戊糖饥饿的潜在价值。从所选烧瓶中得到的酶活性水平证实核糖和葡糖酸对N-乙酰氨基葡糖产量的显著影响不能归因于对GlmS或GNA1活性的影响。正如在比较不同浓度葡萄糖/核糖对生长和产量的摇瓶筛选中观察到的，在含或不含核糖的培养基中活性水平相似。
实施例31 本实施例描述使用含有ScGNA1质粒的菌株7107-87#25在1升发酵罐中进行实验以使NAG产量最优化。
IPTG诱导的定时 进行发酵实验以评价从生长开始和生长24小时后的IPTG诱导作用(细胞量约为13g l-1)。早期诱导显著抑制了生长，还导致远低于晚期诱导(到70小时时50g l-1)的NAG滴度(<5g/l)，正如图9中所示。认为生长受到抑制，因为细胞中累积的氨基糖磷酸酯抑制了戊糖途经中的特异性酶。这一推定得到了戊糖磷酸中间体对细胞生长和NAG产量的正面影响的发现的支持。
戊糖磷酸途经(PPP)中间体的影响 给发酵罐接种三种不同密度的细胞低(OD＝20)、中等(OD＝30)和高(OD＝40)。使用晚期诱导方案(接种后约24小时诱导)。较高细胞密度的接种导致NAG产量较高。无论接种细胞密度如何，添加核糖均表现出改善的NAG产量，甚至使用晚期诱导方案也是如此。
实施例32 本实施例描述使用含整合的ScGNA1构建体的菌株使NAG产量最优化的不同发酵实验。在上述使用含有ScGNA1质粒的菌株进行的实验中，因乳糖极不充足而必须使用IPTG以诱导NAG产生。由于使用了整合的ScGNA1构建体，通过添加乳糖可以有效诱导NAG产生。
乳糖诱导 含有在染色体中整合的ScGNA1构建体的一个拷贝的菌株7107-92#1的研发使得可开发用于NAG生产的乳糖诱导法。鉴于早期IPTG诱导表现出生长抑制的摇瓶结果，在发酵罐中检测晚期诱导方案。首先接种细胞并使其生长至约15和-20g l-1细胞。然后在停止葡萄糖进料期间在7个小时中补充乳糖至10、20或30g l-1。随后恢复葡萄糖进料以便重新生长和NAG产生。发现乳糖浓度低至10g l-1是有效的，到78小时达到50g l-1NAG。
因为单独的乳糖补充法使所述方法复杂，所以进行实验以评价不同选择补充10g l-1乳糖，停止葡萄糖进料；IPTG诱导与持续补充葡萄糖；和单点添加10g l-1乳糖与停止和不停止补充萄糖。另一种可变的检测为扩展乳糖进料至40g l-1，随后补充葡萄糖。单点添加乳糖与其它诱导策略同样有效。所有实验获得的NAG产量水平均在45-55g l-1。尽管葡萄糖进料是持续的，但是其浓度对细胞而言仍然受限(添加时很快即被消耗)。因为lac操纵子通常受到存在的葡萄糖的阻抑，所以限制性的葡萄糖进料率显然为乳糖诱导提供了非阻抑性条件。单点乳糖添加的应用显著简化了该方法。
实验评价初始生长期后的单点乳糖诱导水平(1.25-10g l-1)。还尝试了两点诱导(每次5g l-1)。乳糖低至1.25g l-1极为有效，使滴度接近100g l-1NAG。然而，5g l-1的乳糖诱导使NAG浓度超过100g l-1。因此，在进一步检测中将5g l-1乳糖诱导作为安全水平。两点诱导也是有效的，甚至产生较快的初始NAG产生速率，但最终滴度不会超过使用5或10g l-1乳糖的单点诱导的水平。
较高的操作pH和温度的影响 低温和pH的应用是稳定GLcN发酵的关键因素，主要是因在较高pH和温度GLcN的不稳定性所致。然而，证实NAG在中性pH条件下是稳定的。整个过程中在6.7-7.0pH条件范围操作NAG生产发酵。实验数据表明在7℃和pH 7.0条件下停止葡萄糖进料后NAG稳定至少50小时。
用于GLcN工艺中的相对低温(30℃和25℃)是昂贵的且难以在工业化规模下维持。此外，在30℃细胞生长率远低于37℃时的细胞生长率。应用的30℃温度需要相对长的期限获得高NAG产量所需的生物质。因此，在37℃进行试验以评价在诱导前的四种不同生长率。按照这种方式，可以较早获得所需的生物质，产生总体上更有生产价值的方法。与30℃所需的22-24小时相反，在10小时对所有发酵罐进行诱导且均进行良好，在50小时内得到超过100g l-1NAG，且截至到70小时时获得近120g l-1。从这点开始，将37℃用作生长和生产温度。
葡萄糖进料速率的影响 在大部分试验中使用的标称速率为6g l-1小时-1(基于接种后的体积)。为了观察NAG产率是否受到葡萄糖限制的局限，检测较高的葡萄糖进料速率。将进料速率增加至7.5g l-1小时-1导致NAG产生的初始速率加快，而最终的滴度并不较高或不能较快达到。进一步将进料速率增加至9.5g l-1小时-1显示甚至NAG开始产生的速率也加快。然而，看起来这些培养物在更早时停止了生产且实际上最终的滴度(85-65g l-1NAG)已经降低。在相同实验中，缓慢的进料速率(6g l-1小时-1)使NAG浓度为100g l-1。从这一时间点开始，在NAG发酵中将葡萄糖进料速率保持在6.5g l-1小时-1。
磷酸盐浓度的影响 发酵培养基含有多至30g l-1总磷酸钾盐。高磷酸盐浓度为回收提出了明显的难题，因为大部分盐不能被细胞利用且必须在产物纯化过程中除去。在NAG法中，证实高磷酸盐浓度并不是关键。总磷酸盐减少4倍至7.5g l-1对NAG产量几乎没有影响。将这种磷酸盐水平用于随后的实验中。
镁和铁的重要性 镁和铁是获得高生物质和使培养物稳定的两种所需的营养物在GLcN法中，观察到铁浓度是关键因素。需要一定的水平获得高生物质和乳糖诱导，但过多的铁使乙酸酯水平较高，而GLcN水平较低。在通过在葡萄糖进料(5μg g-1葡萄糖)中包括FeSO4-7H2O而额外补充铁的培养基中，GLcN法测定的铁水平为3mg l-1 FeSO4-7H2O。选择相同的铁浓度用于起始的NAG生产实验。向葡萄糖进料中添加铁使方法复杂化。因此，尝试评价初始铁浓度和铁的进料量的影响。还研究了镁进料的影响。
第一次实验结果表明5-10mg l-1 FeSO4-7H2O浓度产生了相差无几的NAG生产水平且铁浓度可能并非如在GLcN法中那样重要。随后使用铁、镁的研究证实铁在进料中并非绝对必要。进料中的镁可以具有稳定作用。在7.5g l-1小时-1的高进料速率下进行这种检测且在6.5g l-1小时-1下进行的另一种跟随性检测(follow up test)表明可以从进料中除去两者而不会显著降低产率。
尽管认可铁和镁的重要性，但是从简化生产工艺的观点来看，从进料中除去它们是需要的。因此，从葡萄糖进料中除去铁和镁并使铁保持在5mgl-1 FeSO4-7H2O的初始浓度下。以0.6g l-1 FeSO4-7H2O加入镁且如果在葡萄糖进料中使用，则以5-10mgg-1葡萄糖的比例添加。
另外，认为镁在培养中是重要的且不应受限。在一定无菌条件(过热、暴露时间和pH)下镁可以被磷酸盐螯合，作为不溶性磷酸镁盐沉淀而变得不能被生物体利用。使用过量镁或有限镁的烧瓶研究证实浓度对NAG产量确实重要，且如果镁的浓度较高，那么需要在灭菌后添加镁以减少沉淀作用。进行发酵实验以便比较灭菌前后镁的添加量。结果证实在灭菌前添加镁的培养表现较差。
初始的镁浓度近似1g l-1 FeSO4-7H2O的两倍，且研究表明如果在灭菌后添加或如果添加增加浓度的柠檬酸并在灭菌前酸化培养基，那么可以使用该浓度。它对简化方案具有十分积极的影响。酸化还要求在灭菌前加入所有微量元素。因此，研发培养基制备方案，其中在灭菌前添加除葡萄糖外的所有成分。开始通过使用磷酸而不是磷酸钾盐提供磷对培养基进行酸化。灭菌后用氢氧化钾将pH调节至所需操作pH(7.0)，该过程还对培养基提供了钾。然而，该方法引入了不必要高量的钾。通过使用磷酸二氢钾(monobasic potassium phosphate)酸化培养基并在灭菌后用氢氧化铵调节pH以进一步改进该方案。甚至通过要求从培养基中除去硫酸铵进一步简化了方案。
微量元素的除去和锌的重要性 微量元素包装开始由下列以μg-mg/l计的量添加的元素的盐组成铁、锌、锰、铜、钴、钼和硼。如果在终产物中发现，那么钼和硼存在毒性且一些其它元素的影响尚不了解。因此，进行单消除实验以确定是否可以除去它们(如果有的话)。第一种试验证实消除钼和硼不会对NAG产量产生显著的负面影响，所以从其它实验中除去它们。消除钴也具有正面影响，但不消除它，因为认为它是维生素B12的整体功能必不可少的，且随后的研究显示对消除没有影响。
结果证实除去锌对NAG产量具有正面影响。进一步的研究证实完全限制锌使生物质的浓度较低而NAG的浓度明显较高，到60小时时达到118gl-1 NAG(图20)。这一结果特别有意义，因为甚至可以使用至多10mgl-1 FeSO4-7H2O的较高的初始铁浓度。
实施例33 本实施例描述用于NAG生产的优选发酵方案。该发酵方案如下所示。
菌株重组大肠杆菌 诱导细胞密度达到15-20g l-1后在单点添加中加入的5-10g l-1乳糖。在该过程中不暂停葡萄糖进料，但稳定在6.5g l-1小时-1(基于初始体积)。
进料65％葡萄糖，不进行任何改变，以限定浓度使葡萄糖进料。
发酵时间60-72小时 发酵方式补料分批，其中按需要添加65％葡萄糖，维持限定的葡萄糖浓度 接种物 按体积计2.5％-5％ pH 整个过程6.9，用12N NH4OH控制 温度37℃，自始至终 氧 20％或20％以上溶解的O2，通过搅拌控制 通气0.5-1vvm 培养基
在灭菌前加入除葡萄糖(逐步添加)外的所有成分。初始pH在灭菌后接近3.0并在接种前用NH4OH调节至6.9。
实施例34 本实施例描述通过双重结晶纯化N-乙酰氨基葡糖。
通过过滤和微量过滤(micro-filtration)从发酵肉汤中除去细胞。随发酵条件的不同，N-乙酰氨基葡糖在溶解固体中的百分比为70-87％(w，以干固体为基准)。因此，必须纯化粗N-乙酰氨基葡糖产物。该过程可以通过组合阳离子和阴离子去离子化步骤来进行以增加粗肉汤中N-乙酰氨基葡糖的纯度。还可以使用不同的结晶方案。在下面的实施例中描述用于建立纯化N-乙酰氨基葡糖的方案和条件的不同实验。正如所述的，使用实施例34、35、36、40和41中所述的方法获得的N-乙酰氨基葡糖纯度>98％。通过实施例37中所述的方法进一步增加纯度。
使用Supelcosil LC-18-DB(250x4.6mm，5μm)柱(获自Supelco，Bellefonte，PA)并以1ml分钟-1 10％(v)乙腈为流动相的通过液相层析法测定N-乙酰氨基葡糖。使用商品N-乙酰氨基葡糖(Sigma，≥99％)作为外部标记在210nm处测定N-乙酰氨基葡糖。当注射体积为4μL时，检测器对达5g l-1N-乙酰氨基葡糖显示为线性反应。通常以约3g l-1制备样品和标准品且至少注射两次。峰面积中的误差与平均值相差小于2％。
向在溶解固体中含有70％(w)N-乙酰氨基葡糖的发酵样品(30g/L)中加入活性炭(100目G-60，购自Norit Americas，Atlanta，GA)并将该混合物在室温搅拌1小时，随后使用中级孔滤纸(medium filter paper)过滤。滤液显示颜色变浅且为淡黄褐色。测定固体的量且N-乙酰氨基葡糖在固体中的百分比为75％(w)。
在45℃-50℃、在真空条件下将上述获得的含有77.5g溶解固体(其中58.1g为N-乙酰氨基葡糖)的碳处理后的样品浓缩至51％(w)固体(根据推定在浓缩过程中没有固体损耗的样品重量计算)。将其保持在室温，间断性(occasional mixing)混合2小时。通过用中级滤纸过滤收集沉淀并重新溶于100-ml水。然后将固体含量测定为19.7％(w)固体(总固体26.2g)。
将再溶解的样品再次浓缩至44％(w)溶解固体。加入约2mg纯N-乙酰氨基葡糖粉末并将所述样品在室温、在摇动器上混合2小时。通过过滤收集沉淀并用乙醇洗涤(不悬浮固体两次；和通过悬浮固体洗涤两次)。在室温在真空条件下将白色固体干燥至重量保持恒定而得到5.32g产物(98％N-乙酰氨基葡糖，9％总回收率)。
实施例35 本实施例描述在50℃通过单结晶来纯化N-乙酰氨基葡糖。
如实施例34中所述用活性炭处理另一批在溶解的固体中含有87％(w)N-乙酰氨基葡糖的发酵样品。测定溶解的固体量且N-乙酰氨基葡糖在固体中的百分比为88％(w)。在45℃-50℃、真空条件下将含有80.5g固体(其中71g为N-乙酰氨基葡糖)的碳处理的样品浓缩至45％(w)固体(根据推定在浓缩过程中没有固体损耗的样品重量计算)并在室温振摇16小时。通过用中级滤纸过滤收集沉淀并用乙醇洗涤(两次，但不悬浮固体；和通过悬浮洗涤两次)。在真空条件下干燥后，得到33.2g白色固体(100％纯N-乙酰氨基葡糖，47％回收率)。
实施例36 本实施例描述在70℃通过单结晶来纯化N-乙酰氨基葡糖。
可以通过对碳处理的发酵样品一次结晶获得部分纯化的N-乙酰氨基葡糖(参见实施例34)。N-乙酰氨基葡糖的纯度在86％-90％，这取决于结晶前浓缩的程度和N-乙酰氨基葡糖在溶解固体中的初始百分比。
将含有86％或90％N-乙酰氨基葡糖的固体样品与水混合至44％(w)固体。将该混合物在70℃加热，间断混合至溶解。然后将其保持在室温约16小时。通过过滤收集晶体并用乙醇洗涤(不悬浮固体两次；和通过悬浮洗涤两次)。在室温、真空条件下干燥后，该产物含有99％的N-乙酰氨基葡糖(24-30％回收率)。
实施例37 本实施例描述通过阳离子交换处理纯化N-乙酰氨基葡糖。
将脱色的发酵肉汤用作阳离子交换柱的输入进料。该柱为1.6x15cm且含有20g氢形式的DOWEXTM Monosphere 88树脂(购自Dow Corp.，Midland，MI)。在4℃使用Pharmacia FPLCTM设置(购自AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)进行本实验。以固体为基准，输入进料约为76％N-乙酰氨基葡糖、电导率为10.5mS/cm，且pH约为6.5。以1ml/分钟的速率泵入物质。开始输出的pH约为2.3。当达到柱容量时，pH升高且最终与输入进料的pH相同。电导率在约125ml时从约10.5mS/cm降至约2.5mS/cm。然后电导率随pH升高而增加。基于固体测定的N-乙酰氨基葡糖纯度也快速增加，而pH保持在约2.5。纯度增加至约85％N-乙酰氨基葡糖。当柱容量耗尽时纯度下降，且到200ml时基本上与输入流量相同。通过阳离子处理增加N-乙酰氨基葡糖纯度。
实施例38 本实施例描述通过阴离子交换处理纯化N-乙酰氨基葡糖。将已经脱色并用阳离子交换树脂处理的N-乙酰氨基葡糖肉汤用作阴离子交换树脂DowMonosphere 77的输入物质。实验条件如上述对阳离子交换树脂实验所述。输入进料以固体为基准约为81％N-乙酰氨基葡糖、电导率为3.8mS/cm且pH约为3.0。输出pH快速升至约8.0且随后在250ml时降至约3.8。电导率快速降至低于1mS/cm并在整个实验过程中保持在该水平。N-乙酰氨基葡糖纯度增加且还保持显著较高的水平。N-乙酰氨基葡糖纯度从输入流量的约81％纯度增加至约87％N-乙酰氨基葡糖。
合并阳离子和阴离子处理提供了显著增加粗肉汤中总的N-乙酰氨基葡糖干固体纯度的简便方法。
实施例39 本实施例描述用活性炭和混合床离子交换处理发酵肉汤。
首先如实施例34中所述用活性炭处理发酵样品且然后用柱中的混合床离子交换树脂AG501-X8(D)(来自Bio-Rad，Hercules，CA)，基于制造商的建议处理。缓慢上样并通过重力驱使流动。上样量消耗至床的三分之二，此时蓝色指示剂改变成金色。最初在溶解固体中含有70％(w)和87％(w)的N-乙酰氨基葡糖的样品表现出在溶解固体中最终N-乙酰氨基葡糖的纯度分别为89％(w)和93％(w)。
实施例40 本实施例描述纯化的N-乙酰氨基葡糖的稳定。
通过上述结晶产生的样品N-乙酰氨基葡糖(98％纯)在105℃、2小时内变淡棕色并减少了4.7％重量。可以使用下列包括异丙醇(IPA)的处理方法之一(下述)消除加热时的这种颜色改变和重量减轻。已经证实IPA(异丙醇)可用于沉淀N-乙酰氨基葡糖和去除样品在105℃变为深色的试剂。然而，本领域技术人员极有可能选择与水混溶的其它有机溶剂、诸如乙腈或乙醇取代IPA并获得相同效果。
预加热、随后水/IPA沉淀 将样品(0.30g)在105℃加热2.5小时。在冷却至室温后，加入0.7ml水以形成黄色混悬液。加入IPA(2.8ml)并将该混合物搅拌2小时。通过过滤收集沉淀并通过悬浮固体用IPA洗涤两次。母液为淡黄色。在真空中干燥固体至恒重(0.18g，60％回收率)。
在80:20或85:15IPA/水(v/v)中浸入处理 以5或12ml溶剂混合物/克固体将样品在80:20或85:15(v/v)IPA/中搅拌3小时或过夜。回收率(步骤与上述相同)为56-67％。
溶解和用IPA沉淀 将样品(0.50g)溶于2.27ml水。加入IPA(12.86ml，IPA/水＝85:15v/v)并将该混合物在室温搅拌过夜。回收步骤(56％)与上述相同。
溶于水、随后浓缩并用IPA沉淀 将样品(89.6g)溶于水至20％固体(w/w)。将其在45-50℃、真空条件下浓缩。当固体浓度达到约42％(w/w)时，沉淀开始形成。将其进一步浓缩至55％固体(基于推定浓缩过程中没有固体损耗时的总样品重量计算)。加入IPA(IPA/水＝85:15v/v)并将其搅拌过夜。通过过滤收集固体并通过悬浮固体用IPA洗涤两次。将母液浓缩至干而得到13g湿固体，随后将其悬浮于20ml 85:15IPA/水(v/v)。过滤并用IPA洗涤两次。将湿固体与第一次过滤后得到的固体合并且在真空条件下干燥至获得恒重(82.1g，98％N-乙酰氨基葡糖，92％回收率)。
实施例41 本实施例描述用IPA纯化N-乙酰氨基葡糖。
将IPA用于纯化N-乙酰氨基葡糖以便获得较高的回收率。将IPA和水的混合物(可能为70:30-85:15v/v比例)用于沉淀N-乙酰氨基葡糖，同时保持所有杂质在溶液中。由此获得的纯化N-乙酰氨基葡糖在105℃时没有显示出变深色。这种溶剂混合物的所需量取决于初始样品中杂质的量及其溶解度。
实施例42 本实施例描述用乙醇纯化N-乙酰氨基葡糖。将95％纯的NAG样品(40g)溶于160-ml水。缓慢加入乙醇(640ml)，同时搅拌该混合物。将该混悬液在室温搅拌过夜。通过过滤收集固体并通过将其悬浮于乙醇中洗涤两次。在真空中干燥得到16.12g白色固体(98％NAG，NAG回收率42％)。该物质在105℃ 2小时内没有显示变深色。本领域技术人员可以使用其它水混溶性溶剂诸如IPA、乙腈、或甲醇取代乙醇而获得相同的效果。
实施例43 本实施例表示将N-乙酰氨基葡糖化学水解成葡糖胺的方法。
预计可以回收通过发酵产生的N-乙酰氨基葡糖并以N-乙酰氨基葡糖的形式纯化为终产物。还可以在分离和纯化前或之后通过化学方式将通过发酵产生的N-乙酰氨基葡糖转化成葡糖胺进行纯化。进行简单前导(pilot)实验以证实N-乙酰氨基葡糖到葡糖胺的化学转化。在首次实验中，在100℃用不同浓度的盐酸水解N-乙酰氨基葡糖(在不含葡萄糖的M9A培养基中10g/l)。在平行实验中，对葡糖胺进行相同处理以测定其在水解条件下的稳定性。结果如图21和22中所示。
通过监测水解反应产生的葡糖胺的量测定N-乙酰氨基葡糖到葡糖胺的转化。通过基于Way等所述的HPLC法测定葡糖胺(Journal of LiquidChromatography and Related Technologies，232861，2000)。下面给出了HPLC法的一些具体内容柱Phenomenex prodigy ODS(3)C18-5um(购自Phenomenex，Torrance，CA)，150 x 4.6mm；流动相含有10mM乙酸钠的甲醇水缓冲液(4:1，v:v)，10mM辛磺酸钠(octanesulfonate)，pH 5.1；流速0.7ml/分钟；检测器在30℃的折射率检测器。
图21表示当在足够低的pH(<1)下加热时N-乙酰氨基葡糖到葡糖胺的定量转化。在较高pH条件下，不发生水解或形成的葡糖胺降解。图22表示葡糖胺在1.0或1.0以下的pH条件下加热时保持稳定。在较高pH条件下，大量葡糖胺损耗。
在不同温度检验使用1.0N盐酸(pH<1)对N-乙酰氨基葡糖进行的酸水解。监测剩余的N-乙酰氨基葡糖铵量和形成的葡糖胺量。通过HPLC、使用标准碳水化合物系统测定N-乙酰氨基葡糖。下面给出了一些具体内容柱Bio-Rad HPX-87H，7.8mm x 300mm；流动相0.1％在H2O中的HNO3；流速0.8ml/分钟；检测器在30℃的折射率检测器。如上所述使用离子对HPLC柱测定葡糖胺。在35℃、60℃或100℃下保温在用1N盐酸酸化至pH<1.0的M9A培养基(本文上述)中的N-乙酰氨基葡糖(20g/l)。结果如图23中所示。在100℃，到2.5小时时转化完成。没有观察到形成的葡糖胺发生明显降解。在低温下，观察到一定程度的水解，但这种情况缓慢得多。
在平行实验中，在上述不同温度将葡糖胺(20g/l)与1N盐酸一起保温。正如通过HPLC测定的，保温24小时后没有观察到降解(数据未显示)。
概括地说，显然易于通过化学方式将N-乙酰氨基葡糖转化成葡糖胺且水解产物葡糖胺在用于这些实验的水解条件下极为稳定。
N-乙酰氨基葡糖到葡糖胺的酸水解在整个葡糖胺生产过程中是关键步骤。因此，使用从发酵中结晶的N-乙酰氨基葡糖或纯化的N-乙酰氨基葡糖进行水解实验。
实施例44 本实施例描述N-乙酰氨基葡糖在高盐酸浓度和短时条件下的脱乙酰化。
在90℃对N-乙酰氨基葡糖进行酸水解。使用在盐酸(按体积计由37％稀释至12％和16％)溶液中的N-乙酰氨基葡糖(10％和20％w/v)。使用一系列带有特氟隆衬盖(Teflon lined cap)的12-ml玻璃螺帽管(glass screw cappedtubes)。每支管代表一个单独的时间点(0、15、30、45、60、90分钟)并含有2ml N-乙酰氨基葡糖/盐酸溶液。将管于在90℃平衡的加热区中加热。在适宜的时间取出管并快速在冰水中冷却。进行适当稀释并通过HPLC分析样品的葡糖胺和N-乙酰氨基葡糖。图24表示N-乙酰氨基葡糖的消失和葡糖胺的形成。N-乙酰氨基葡糖消除的动力学对所有四份溶液而言基本上相同。水解在90℃极快。到30分钟时在全部四份样品中约95％的N-乙酰氨基葡糖已经水解。45分钟后，保留了低于1％初始浓度的N-乙酰氨基葡糖。在60或90分钟时没有检测到N-乙酰氨基葡糖。在90℃ 1小时后，甚至使用20％N-乙酰氨基葡糖也不再检测到N-乙酰氨基葡糖。图24还表示在含有10％葡糖胺的管中形成葡糖胺。90分钟后没有观察到大量葡糖胺损耗。
实施例45 本实施例描述N-乙酰氨基葡糖在高盐酸浓度条件下在较长时间内(24小时)的脱乙酰化。
在90℃和100℃使用5％和10％葡糖胺盐酸盐(w/w)与12％和20％重量的盐酸检验葡糖胺降解。将样品保温1-24小时并使用谷氨酸脱氢酶通过酶方法检测氨。葡糖胺指的是葡糖胺盐酸盐。所有百分比均为w/w。葡糖胺降解基于氨形成。降解百分比对5％和10％溶液而言基本上相同。在较高的酸浓度下降解明显较高。类似的倾向可以在100℃的实验中观察到。温度增加10℃显然显著增加了葡糖胺降解。
实施例46 本实施例描述N-乙酰氨基葡糖在高盐酸浓度(30％)下的化学脱乙酰化。
在90℃使用杂交烘箱使N-乙酰氨基葡糖水解成葡糖胺。该反应在螺帽玻璃管内进行。在90℃将30％盐酸(30g)预保温1小时。此后，加入10g固体N-乙酰氨基葡糖、快速溶解并取T0样品。在接下来的3个小时内间隔30分钟取样。溶液在30分钟内快速变成深橙色/棕色。这种颜色变深显然快于上述使用较低酸浓度观察到的结果。到45-60分钟时，观察到大量固体葡糖胺，在盐酸中将该混合物转化成葡糖胺盐酸盐浆(slurry)。通过酶方法分析样品中的氨。结果如图25中所示。图25还表示来自在90℃使用较低浓度盐酸进行的葡糖胺降解实验的数据。N-乙酰氨基葡糖降解明显且以氨浓度为基准在3小时时约为3.5％。这一结果显然远高于在12％或20％盐酸中用葡糖胺观察到的结果。
实施例47 本实施例描述N-乙酰氨基葡糖的酶促脱乙酰化。
下面描述了在发酵肉汤中或回收后的N-乙酰氨基葡糖水解的酶促方法。三种类型的酶为候选物N-乙酰氨基葡糖-6-P脱乙酰酶(EC 3.5.1.25，NagA)、N-乙酰氨基葡糖脱乙酰酶(EC 3.5.1.33)、壳多糖脱乙酰酶和酰基转移酶。
N-乙酰氨基葡糖-6-P脱乙酰酶和N-乙酰氨基葡糖脱乙酰酶 存在已经证实使N-乙酰氨基葡糖脱乙酰化的酶。Roseman报导了催化大肠杆菌、尸毒杆菌(Bcillus cadaveris)和链球菌属中的N-乙酰氨基葡糖(EC3.5.1.33)脱乙酰化的酶huoxing(Roseman S.1957.J.Biol.Chem.，226115-124)。日本小组(Yamano，Fujishima等，Osaka National Research Institute，Agency of Industrial Science and Technology)研究了来自产生壳多糖酶的细菌霍乱弧菌(Vibrio cholerae)non-O 1和海洋细菌异单胞菌属(Alteromonas)的N-乙酰氨基葡糖脱乙酰酶。来自具体的天然生物体的N-乙酰氨基葡糖-6-P脱乙酰酶和N-乙酰氨基葡糖脱乙酰酶的制备性质和应用公开在下列专列和公开出版物中Fujishima S.等，1996，标题为N-乙酰氨基葡糖6-磷酸脱乙酰酶，JP9234064A2；Fujishima S.等，1997，标题为用于生产N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸脱乙酰酶的方法；US5744325；和Fujishima等，1996，标题为用于生产N-乙酰基-D-葡糖胺脱乙酰酶的方法；EP 0 732 400B 1，将这些文献的全部内容引入本文作为参考。
将Fujishima等所述的脱乙酰酶鉴定为N-乙酰氨基葡糖-6-P脱乙酰酶(EC 3.5.1.25，NagA)。其对N-乙酰氨基葡糖6-P的亲合力和的功效远高于对N-乙酰氨基葡糖的亲合力和功效。然而，纯化自大肠杆菌的N-乙酰氨基葡糖-6-P脱乙酰酶对N-乙酰氨基葡糖没有影响。
众所周知N-乙酰氨基葡糖-6-P脱乙酰酶(EC 3.5.1.25，NagA)在将N-乙酰氨基葡糖-6-P转化成葡糖胺-6-P中的影响，这是N-乙酰氨基葡糖、N-乙酰甘露糖胺和神经氨酸细胞代谢中必不可少步骤。这种酶、诸如这类重组大肠杆菌NagA蛋白一般对非磷酸化的N-乙酰氨基葡糖没有活性。测定了许多不同生物体中编码N-乙酰氨基葡糖6-P脱乙酰酶(nagA基因)的DNA序列。尚不了解是否存在仅对N-乙酰氨基葡糖具有活性的脱乙酰酶(由此不同于NagA)。
壳多糖脱乙酰酶 壳多糖脱乙酰酶(EC 3.5.1.41)催化壳多糖中N-乙酰氨基葡糖单位的脱乙酰化，产生脱乙酰壳多糖。通常通过使用在N-乙酰基上放射性标记的底物羰基壳多糖(部分O-羟乙基化的壳多糖)测定壳多糖脱乙酰酶活性。该酶还对微晶壳多糖(microcrystalline chitin)和羧甲基壳多糖(可溶性衍生物)起作用。然而，据报导来自鲁氏毛霉的壳多糖脱乙酰酶不会使N-乙酰氨基葡糖单体或2-3寡聚体脱乙酰化(Araki和Ito，1975.Eur.J.Biochem.5571-78，将该文献的全部内容引入本文作为参考)。尽管没有证明一般的壳多糖脱乙酰酶使葡糖胺单体脱乙酰化，但是可以从天然分离或在体外产生具有这类活性的壳多糖脱乙酰酶变体。
可以使用具有天然脱乙酰酶的生物体或含有重组脱乙酰酶的生物体中所含的或分离的脱乙酰酶对N-乙酰氨基葡糖进行脱乙酰化。
可以通过随机或定向诱变改善重组脱乙酰酶。
下面描述使用N-乙酰氨基葡糖脱乙酰酶和/或N-乙酰氨基葡糖-6-P脱乙酰酶的N-乙酰氨基葡糖水解实验。
酰基转移酶 许多酰基转移酶可以从底物上除去乙酰基并将其转移到另一种底物(Konecny等)。尽管没有证明这类酶可以使N-乙酰氨基葡糖脱乙酰化，但是可以从天然分离或在体外产生具有这类活性的酰基转移酶变体。
可以使用具有天然酰基转移酶的生物体或具有重组酰基转移酶的生物体中含有的或分离的重组酰基转移酶对N-乙酰氨基葡糖进行脱乙酰化。可以通过随机诱变或定向诱变和/或通过蛋白质改造改进重组酰基转移酶。
确定酶水解的条件 使表达脱乙酰酶的天然或重组细胞在标准条件或最佳条件生长。使用完整细胞、粗酶提取物或纯化的酶作为催化剂进行N-乙酰氨基葡糖水解。首先向0.1ml200mM磷酸盐缓冲溶液(pH 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0)中加入0.3ml10％的N-乙酰氨基葡糖溶液作为底物。第二步加入0.1ml酶溶液。将该反应混合物在25、30、35、40、45和50℃保温30、60和120分钟。通过HPLC法测定形成的水解产物葡糖胺。通过不同的HPLC法监测剩余的底物N-乙酰氨基葡糖。上述实施例中描述了两种HPLC法。
发酵中产生的N-乙酰氨基葡糖的水解 使用粗酶提取物或纯化的脱乙酰酶作为催化剂在上述定义的条件下水解发酵肉汤中或回收后的N-乙酰氨基葡糖。通过在盐酸溶液中结晶回收葡糖胺并通过乙醇、甲醇或异丙醇洗涤。
实施例48 本实施例描述高纯度N-乙酰氨基葡糖的水解。
用于本试验的仪器由使用加热罩加热的1升圆底容器组成。将组分150g水、21g 98％N-乙酰氨基葡糖和238g 36.7％盐酸彼此混合并加入到反应容器中。将搅拌的反应混合物加热至70℃并混合3小时，此时将该混合物转入烧杯并冷却至20℃。几乎不出现晶体。将该混合物转回反应容器并加入10g N-乙酰氨基葡糖。将反应器重新加热至70℃并反应3小时、冷却至4℃过夜。过滤存在的晶体并用乙醇洗涤、真空干燥并检测(20g葡糖胺盐酸盐，99.9％)。将滤液转回反应容器并加入10g N-乙酰氨基葡糖。将反应器再次加热至70℃、反应3小时、冷却过夜至4℃、乙醇洗涤、真空干燥并检测(16.1葡糖胺盐酸盐，99.6％)。将滤液再次转回反应器、加入41.5g并重复反应循环。从第4次循环得到33g葡糖胺盐酸盐，经检测为99.5％。试验中的总产率为86％，其中产生的所有葡糖胺盐酸盐为99+且颜色为白色。该物质不需要重结晶。
实施例49 本实施例描述低纯度N-乙酰氨基葡糖的水解。
本试验重复了使用从发酵肉汤中浓缩并干燥的N-乙酰氨基葡糖的实施例47的条件。固体含有52％N-乙酰氨基葡糖。进行三次循环。每次循环中的葡糖胺盐酸盐的颜色都加深。首次两份样品具有的检测值为99.7％和99.4％且不需要重结晶。第三次样品具有的检测值为97.7％且颜色较深并需要重结晶。总产率为71％。最终滤液为淡棕-黑色，与实施例48最终滤液的半透明淡棕色相反。
实施例50 本实施例描述对浓缩至N-乙酰氨基葡糖含量为21.8％的发酵肉汤的水解。
用于本试验的仪器由4升套层玻璃容器组成。将水用于加热反应容器至所需温度。向该反应容器中加入2000ml含有218g/l N-乙酰氨基葡糖的浓发酵肉汤。加入1500ml 36.7％的盐酸。将反应容器在真空中搅拌并加热至70℃。使反应进行90分钟，收集310ml缩合物。将该反应混合物冷却至4℃并过滤。用265ml乙醇洗涤固体并干燥。基于对肉汤和滤液中N-乙酰氨基葡糖进行的分析的转化率为89.5％。将洗涤的葡糖胺盐酸盐溶于水而得到1550-ml溶液。向该溶液中加入15g Darco G-60活性炭。混合30分钟后，过滤该溶液；得到无色滤液。在50℃与55-cmHg真空中对滤液进行真空蒸发。用乙醇洗涤固体并干燥。总产率为82％。
实施例51 本实施例描述低纯度N-乙酰氨基葡糖的水解与附加的冲洗步骤。
本试验的目的在于测定水解后附加洗涤步骤是否可以产生不需要重结晶的高纯度产物。使用实施例49中所用的仪器，但不回收缩合物。将含有54％N-乙酰氨基葡糖的干燥后的发酵肉汤加入到20％盐酸中。酸与N-乙酰氨基葡糖之比为2.5∶1。用于该系列的反应条件为80℃ 103分钟。用500g水、529g 37％的酸和407g乙醇洗涤过滤后的湿饼。目的在于确定附加洗涤步骤是否可以产生不需要重结晶的产物。葡糖胺盐酸盐晶体仍然稍显褐色且仍然需要重结晶。总产率为70％，其中因第一次水洗涤而存在7％的产率损耗。酸洗涤导致1％的产率损耗，而乙醇洗涤产生了1.6％的损耗。
实施例52 本实施例描述N-乙酰氨基葡糖水解过程中的碳处理。
水解后和重结晶前使用活性炭除去杂质。本试验包括在反应前向水解溶液中加入活性炭。向N-乙酰氨基葡糖和盐酸反应混合物中总计加入34gDarco G-60活性炭并混合30分钟，然后过滤并加入到反应器中。向反应器中加入1000-g水冲洗活性炭。所得葡糖胺盐酸盐颜色较浅，但仍然需要重结晶。反应条件为80℃ 60分钟。因再加入将最初的盐酸浓度降至14％的水使反应介质稀释而导致总产率低至29％。
实施例53 本实施例描述低纯度N-乙酰氨基葡糖的水解。
用于本实施例的反应条件为90℃ 30分钟。使用3:1比例的30％盐酸与N-乙酰氨基葡糖。此处使用实施例49中所用的仪器。水解产率为86％。将粗葡糖胺盐酸盐再溶于水、用活性炭处理、过滤并在50℃和60cm HG下进行真空结晶。最终检测值为99.7％，总产率为58％。
实施例54 本实施例描述N-乙酰氨基葡糖水解过程中的碳处理。
尝试使用活性炭处理水解溶液的第二种试验。使用实施例52中的那些反应条件，但将50g活性炭加入到水解混合物中、过滤并用1,000g水冲洗活性炭。反应在90℃进行30分钟，其中20％盐酸与N-乙酰氨基葡糖为3:1。没有明显超过实施例52中所述结果的颜色改善。因为在上述试验中在水解前使用了活性炭，所以在过滤和冷却过程中加入酸以降低溶解度并改善产率。终产率为36％，检测值为98.4％。
实施例55 本实施例描述高纯度N-乙酰氨基葡糖的水解。
本实施例的目的在于确定是否可以产生高质量的葡糖胺而不需要在90℃从高质量的N-乙酰氨基葡糖中重结晶。使用实施例49的仪器，将320g N-乙酰氨基葡糖与941g 30％w/w盐酸混合。将该混合物加入套层容器且然后加热至90℃。使反应在加热过程中发生并保持在90℃再进行47分钟。在冷却至20℃后，过滤湿饼、用乙醇洗涤并在50℃进行真空干燥。总产率为71％，与单一使用水解液的结果一致。产生的葡糖胺盐酸盐呈带有黑色的白色且需要重结晶。
实施例56 本实施例描述了不纯N-乙酰氨基葡糖的水解。
使用分离自发酵肉汤的固体N-乙酰氨基葡糖进行实施例54中所述的相同步骤。N-乙酰氨基葡糖固体的纯度为48％。使含有1,411g N-乙酰氨基葡糖的混合物与4,236g 30％w/w盐酸在70℃反应3小时且然后冷却至20℃。用乙醇洗涤过滤后的湿饼并在50℃进行真空干燥。总产率为90％。
实施例57 本实施例描述高纯度的N-乙酰氨基葡糖的水解。
使用2:1比例的36.7％盐酸与纯N-乙酰氨基葡糖进行水解。使用实施例49的仪器使2,004g N-乙酰氨基葡糖与4,009g 36.7％w/w盐酸在80℃反应58分钟且然后冷却至20℃，不洗涤过滤后的湿饼，而在室温保持至干燥过夜。最终的饼中含有6％盐酸和75.2％葡糖胺盐酸盐。该反应混合物相当粘且在反应器壁上存在黑色固体。总产率为70％。
实施例58 本实施例描述使用再循环的盐酸水解高纯度的N-乙酰氨基葡糖。
增加葡糖胺盐酸盐的总回收率的方式之一在于使水解母液再循环。在水解反应后，将该混合物冷却并过滤。称重滤液并使其再循环回反应器。加热新制的36.7％盐酸以补充初始酸重与返回的滤液之间的重量差。该系列包括使2.5∶1比例的36.7％盐酸与N-乙酰氨基葡糖在80℃反应60分钟。将盐酸加入到含有纯的固体N-乙酰氨基葡糖的74℃反应器且中。将该反应混合物加热至温度并反应60分钟，然后冷却至20℃并过滤。在首次使用盐酸后通过过滤回收葡糖胺盐酸盐固体，并测定产率为88％。称重滤液并使其返回反应器。加入第二批和等量的固体N-乙酰氨基葡糖与足量的36.7％盐酸以使酸恢复至第一次反应循环的水平。将该反应重复与第二次使用酸时相同的时间和的温度，并在冷却和过滤后回收产率为105％，表明在第二次循环过滤过程中回收了一定的从第一次酸循环中保留在溶液中的葡糖胺盐酸盐。按照与第二次相同的方式进行第三次循环，收率为60％。三次循环的总收率为87％。保留来自第三次循环的滤液用于未来的循环。
实施例59 本实施例描述N-乙酰氨基葡糖的层析纯化。
为了纯化N-乙酰氨基葡糖，进行使用DOWEXTM Monosphere 99/K树脂的层析法。将该树脂用于填充2.6 x 23cm柱。柱床体积约为120ml，空隙容积估计为35ml(使用注射器根据从柱上排下的液体测定)。就这些实验而言，使用通过用阳离子和阴离子树脂处理去离子化的肉汤。这种输入的物质具有约75.7g/l的N-乙酰氨基葡糖浓度，总固体约为83.4g/l，得到约91％的纯度。电导率约为0.1mS/cm。
在首次实验中，以2ml/分钟使30ml样品泵过柱。显然N-乙酰氨基葡糖按照一定方式与树脂发生相互作用。至60ml时开始检测N-乙酰氨基葡糖，并在远离空隙容积的集中在90ml的极宽峰中洗脱。N-乙酰氨基葡糖的纯度也显著改变，在90ml时的最高值约为94.5％N-乙酰氨基葡糖。在该窄区内测定的纯度高于输入物质的纯度。获得的纯度值的变异约为2-3％。在含有低浓度N-乙酰氨基葡糖的级分中，在125ml以上和75ml以下时纯度快速下降。
进行使用相同柱进行的第二次实验。此处以1ml/分钟的较缓慢流速上样较小的5-ml样品。结果与使用较大样品和较快流速观察到的结果相似。唯一的差别在于N-乙酰氨基葡糖的峰集中在80ml左右而非90ml。
作为总固体百分比测定的N-乙酰氨基葡糖纯度在试验过程中显著改变。这提示在反应中N-乙酰氨基葡糖与所述树脂和推定存在的其它非离子化合物之间存在一些层析分离或差异。如果其它化合物与树脂发生相互作用的方式与N-乙酰氨基葡糖相同，那么N-乙酰氨基葡糖在含有N-乙酰氨基葡糖的所有级分中的纯度应具有相同水平，而并非这样。
然后使用本领域中公知的方法并使用与如上所述相同的步骤将本实施例中所用的树脂转化成钙形式。
实施例60 本实施例描述同时进行的高纯度N-乙酰氨基葡糖水解和乙酸除去。
来自N-乙酰氨基葡糖盐酸水溶液水解的主要副产物为乙酸，它具有相对高的沸点且在水解步骤过程中不易除去。在水解步骤过程中提供醇、诸如乙醇或甲醇使乙酸酯化，分别形成乙酸乙酯或乙酸甲酯作为因沸点降低而更易于除去的副产物。除去副产物即主要存在于消耗的水解产物中的杂质允许增加水解溶液中重新使用的盐酸的量。
将173g甲醇、189.4g 36.7w％盐酸水溶液和201g N-乙酰氨基葡糖的混合物加入到搅拌过的加热玻璃容器中并在65℃和回流状态下混合。在1小时时取样。该分析通过滴定显示8.3％葡糖胺盐酸盐、11.6％盐酸且无明显量的乙酸。2小时后终止反应并冷却至20℃。用甲醇冲洗固体并干燥。葡糖胺盐酸盐的初始产率为25.6％。然后将水解产物在4℃冷却过夜并过滤。又得到10％葡糖胺盐酸盐。初始固体的纯度为85％。滤出液中不存在乙酸。
尽管已经具体描述了本发明的不同实施方案，但是本领域技术人员显然可以对这些实施方案进行修改和改变。不过，显然可以理解这类修改和改变属于如下面的权利要求中所述的本发明的范围。
权利要求
1.通过发酵生产葡糖胺或N-乙酰氨基葡糖的方法，包括
a)在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包含至少一种增加葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶活性的遗传修饰；和
b)收集从培养步骤中产生的产物，所述产物选自葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸或N-乙酰氨基葡糖。
2.权利要求1所述的方法，其中增加葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶活性的遗传修饰提供了选自下组的结果葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶的酶活性增加；葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶由所述微生物超表达；葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶的N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸产物抑制作用降低；和葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶对葡糖胺-6-磷酸的亲合力增加。
3.权利要求1所述的方法，其中所述的微生物用至少一种包含编码葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶的核酸序列的重组核酸分子转化。
4.权利要求3所述的方法，其中编码葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶的核酸序列含有至少一种增加葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶的酶活性的遗传修饰。
5.权利要求3所述的方法，其中所述的葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶具有与选自SEQ ID NO30、SEQ ID NO32或SEQ ID NO34的氨基酸序列至少约35％相同的氨基酸序列，其中所述的葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶具有酶活性。
6.权利要求3所述的方法，其中所述的葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶具有与选自SEQ ID NO30、SEQ ID NO32或SEQ ID NO34的氨基酸序列至少约50％相同的氨基酸序列，其中所述的葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶具有酶活性。
7.权利要求3所述的方法，其中所述的葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶具有与选自SEQ ID NO30、SEQ ID NO32或SEQ ID NO34的氨基酸序列至少约70％相同的氨基酸序列，其中所述的葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶具有酶活性。
8.权利要求3所述的方法，其中所述的葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶具有选自SEQ ID NO30、SEQ ID NO32或SEQ ID NO34的氨基酸序列。
9.权利要求3所述的方法，其中所述重组核酸分子的表达是可诱导的。
10.权利要求9所述的方法，其中所述重组核酸分子的表达可由乳糖诱导。
11.权利要求10所述的方法，其中所述的微生物进一步包含遗传修饰，所述遗传修饰减少对乳糖的转录诱导作用的抑制。
12.权利要求11所述的方法，其中所述的遗传修饰包含编码LacI阻抑蛋白的基因的部分或完全缺失或失活。
13.权利要求1所述的方法，其中所述的微生物进一步包含至少一种增加葡糖胺-6-磷酸合酶活性的遗传修饰。
14.权利要求13所述的方法，其中所述的微生物用至少一种重组核酸分子转化，所述重组核酸分子包含编码葡糖胺-6-磷酸合酶的核酸序列。
15.权利要求14所述的方法，其中所述的葡糖胺-6-磷酸合酶包含与选自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ IDNO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18或SEQ ID NO20的氨基酸序列至少约35％相同的氨基酸序列，其中所述的葡糖胺-6-磷酸合酶具有酶活性。
16.权利要求14所述的方法，其中所述的葡糖胺-6-磷酸合酶包含与选自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ IDNO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18或SEQ ID NO20的氨基酸序列至少约50％相同的氨基酸序列，其中所述的葡糖胺-6-磷酸合酶具有酶活性。
17.权利要求14所述的方法，其中所述的葡糖胺-6-磷酸合酶包含与选自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ IDNO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18或SEQ ID NO20的氨基酸序列至少约70％相同的氨基酸序列，其中所述的葡糖胺-6-磷酸合酶具有酶活性。
18.权利要求14所述的方法，其中所述的葡糖胺-6-磷酸合酶包含选自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18或SEQ ID NO20的氨基酸序列。
19.权利要求14所述的方法，其中所述的葡糖胺-6-磷酸合酶与野生型葡糖胺-6-磷酸合酶相比具有减少葡糖胺-6-磷酸合酶的产物抑制的修饰。
20.权利要求19所述的方法，其中所述的葡糖胺-6-磷酸合酶包含选自SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQID NO10、SEQ ID NO12或SEQ ID NO14的氨基酸序列。
21.权利要求1所述的方法，其中所述的微生物进一步包含至少一种降低葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性的遗传修饰。
22.权利要求21所述的方法，其中降低葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性的遗传修饰包括微生物中编码葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的内源性基因的部分或完全缺失或失活。
23.权利要求13所述的方法，其中所述的微生物进一步包括至少一种降低葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性的遗传修饰。
24.权利要求23所述的方法，其中降低葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性的遗传修饰包括微生物中编码葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的内源性基因的部分或完全缺失或失活。
25.权利要求1所述的方法，其中所述的培养步骤包括将发酵培养基中的碳源维持在约0.5％-约5％的浓度的步骤。
26.权利要求1所述的方法，其中所述的培养步骤在包含酵母提取物的发酵培养基中进行。
27.权利要求1所述的方法，其中所述的培养步骤在包含碳源的发酵培养基中进行，所述的碳源选自葡萄糖、果糖、戊糖、乳糖或葡糖酸。
28.权利要求27所述的方法，其中所述的戊糖选自核糖、木糖或阿拉伯糖。
29.权利要求1所述的方法，其中所述的培养步骤在包括葡萄糖和核糖的发酵培养基中进行。
30.权利要求1所述的方法，其中所述的培养步骤在包括葡萄糖和葡糖酸的发酵培养基中进行。
31.权利要求1所述的方法，其中所述的培养步骤在约25℃-约45℃的温度进行。
32.权利要求1所述的方法，其中所述的培养步骤在约37℃的温度进行。
33.权利要求1所述的方法，其中所述的培养步骤在约pH 4-约pH 7.5的pH进行。
34.权利要求1所述的方法，其中所述的培养步骤在约pH 6.7-约pH7.5的pH进行。
35.权利要求1所述的方法，其中所述的培养步骤在约pH 4.5-约pH 5的pH进行。
36.权利要求1所述的方法，其中所述的微生物选自细菌或真菌。
37.权利要求1所述的方法，其中所述的微生物选自细菌或酵母。
38.权利要求1所述的方法，其中所述的微生物为选自埃希氏菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌属、假单胞菌属或链霉菌属的细菌。
39.权利要求1所述的方法，其中所述的微生物为选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短乳杆菌、铜绿假单胞菌或浅青紫链霉菌的细菌。
40.权利要求1所述的方法，其中微生物选自糖酵母属、念珠菌属、汉逊酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属或Phaffia的酵母。
41.权利要求1所述的方法，其中微生物选自酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、白色念珠菌、多形汉逊酵母、巴氏毕赤酵母、P.canadensis、马克斯克鲁维酵母或Phaffa rhodozyma的酵母。
42.权利要求1所述的方法，其中所述的微生物为选自曲霉属、犁头霉属、根霉属、金孢子菌属、脉孢霉属或木霉属的真菌。
43.权利要求1所述的方法，其中所述的微生物为选自黑曲霉、构巢曲霉、蓝色犁头霉、米根霉、Chrysosporium lucknowense、粗糙脉孢霉、间型脉孢霉或Trichoderm reesei的真菌。
44.权利要求1所述的方法，其中所述的微生物进一步包含增加微生物中葡糖磷酸异构酶活性的遗传修饰。
45.权利要求44所述的方法，其中所述的微生物用包含编码葡糖磷酸异构酶的核酸序列的重组核酸分子转化。
46.权利要求44所述的方法，其中所述的葡糖磷酸异构酶包含SEQ IDNO105的氨基酸序列。
47.权利要求1所述的方法，其中所述的微生物进一步包含微生物中果糖磷酸激酶的部分或完全缺失或失活。
48.权利要求1所述的方法，其中所述的微生物进一步包含增加谷氨酰胺合成酶活性的遗传修饰。
49.权利要求48所述的方法，其中所述的微生物已经用包含编码谷氨酰胺合成酶的核酸序列的重组核酸分子转化。
50.权利要求48所述的方法，其中所述的谷氨酰胺合成酶包含SEQ IDNO89的氨基酸序列。
51.权利要求1所述的方法，其中所述的微生物进一步包含增加葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的遗传修饰。
52.权利要求51所述的方法，其中所述的微生物已经用包含编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的核酸序列的重组核酸分子转化。
53.权利要求51所述的方法，其中所述的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶包含SEQ ID NO95的氨基酸序列。
54.权利要求1所述的方法，其中所述的微生物进一步包含编码负责微生物中糖原合成的酶的基因的部分或完全缺失或失活。
55.权利要求54所述的方法，其中所述基因编码负责糖原合成的酶，所述酶包括ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、糖原合酶和分支酶。
56.权利要求1所述的方法，其中所述的遗传修饰不抑制微生物代谢半乳糖的能力。
57.权利要求1所述的方法，其中所述的收集步骤包括从微生物回收细胞内的选自葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖或葡糖胺的胞内产物，或从该发酵培养基中回收选自葡糖胺或N-乙酰氨基葡糖的胞外产物。
58.权利要求1所述的方法，进一步包括选自下组的步骤
a)从发酵培养基中纯化选自葡糖胺或N-乙酰氨基葡糖的产物；
b)所述微生物回收选自葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸或N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸的产物；
c)使选自葡糖胺-6-磷酸或葡糖胺-1-磷酸的产物去磷酸化而产生葡糖胺；和
d)使选自N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸或N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸的产物去磷酸化而产生N-乙酰氨基葡糖；
e)处理选自N-乙酰氨基葡糖、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸或N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸的产物而产生选自葡糖胺、葡糖胺-6-磷酸或葡糖胺-1-磷酸的葡糖胺产物。
59.权利要求54所述的方法，其中步骤(e)包括在酸性和加热条件下或通过酶促脱乙酰化作用水解选自N-乙酰氨基葡糖、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸或N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸的产物。
60.权利要求1所述的方法，其中通过所述发酵方法产生的N-乙酰氨基葡糖通过从发酵肉汤中沉淀含有N-乙酰氨基葡糖的固体来回收。
61.权利要求1所述的方法，其中通过所述发酵方法产生的N-乙酰氨基葡糖通过从发酵肉汤中结晶含有N-乙酰氨基葡糖的固体来回收。
62.通过发酵生产葡糖胺或N-乙酰氨基葡糖的方法，包括
a)在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包含至少一种增加葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性的遗传修饰；和
b)收集从培养步骤中产生的产物，所述产物选自葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸或N-乙酰氨基葡糖。
63.权利要求62所述的方法，其中所述的遗传修饰提供了选自下组的结果所述微生物超表达葡糖胺-6-磷酸脱氨酶；葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的酶活性增加；葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的逆向反应增加以形成增加的葡糖胺-6-磷酸；葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的正向反应减少以形成减少的果糖-6-磷酸；葡糖胺-6-磷酸脱氨酶对果糖-6-磷酸的亲合力增加；葡糖胺-6-磷酸脱氨酶对葡糖胺-6-磷酸的亲合力降低；或葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的葡糖胺-6-磷酸产物抑制减少。
64.权利要求62所述的方法，其中所述的微生物用包含编码葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的核酸序列的重组核酸分子转化。
65.权利要求64所述的方法，其中编码葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的核酸序列含有至少一种增加葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的酶活性的遗传修饰。
66.权利要求64所述的方法，其中所述的葡糖胺-6-磷酸脱氨酶含有与SEQ ID NO42氨基酸序列至少约35％相同的氨基酸序列，其中所述的葡糖胺-6-磷酸脱氨酶具有酶活性。
67.权利要求64所述的方法，其中所述的葡糖胺-6-磷酸脱氨酶具有SEQ ID NO42的氨基酸序列。
68.权利要求62所述的方法，其中所述的微生物进一步包括降低葡糖胺-6-磷酸合酶活性的遗传修饰。
69.权利要求68所述的方法，其中降低葡糖胺-6-磷酸合酶活性的遗传修饰为微生物中编码葡糖胺-6-磷酸合酶的内源性基因的部分或完全缺失或失活。
70.权利要求62所述的方法，其中所述的微生物进一步包括增加葡糖胺-6-磷酸N-乙酰转移酶活性的遗传修饰。
71.权利要求70所述的方法，其中所述的遗传修饰提供了选自下组的结果葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶的酶活性增加，所述微生物超表达葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶；葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶的N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸产物抑制减少；或葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶对葡糖胺-6-磷酸的亲合力增加。
72.权利要求70所述的方法，其中所述的微生物用包括编码葡糖胺-6-磷酸N-乙酰转移酶的核酸序列的重组核酸分子转化。
73.权利要求70所述的方法，其中所述的葡糖胺-6-磷酸N-乙酰转移酶包括与选自SEQ ID NO30、SEQ ID NO32或SEQ ID NO34的氨基酸序列至少约35％相同的氨基酸序列，其中所述的葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶具有酶活性。
74.权利要求70所述的方法，其中所述的葡糖胺-6-磷酸N-乙酰转移酶包含选自SEQ ID NO30、SEQ ID NO32或SEQ ID NO34的氨基酸序列。
75.权利要求70所述的方法，其中所述的微生物进一步包括降低葡糖胺-6-磷酸合酶活性的遗传修饰。
76.权利要求75所述的方法，其中降低葡糖胺-6-磷酸合酶活性的遗传修饰为微生物中编码葡糖胺-6-磷酸合酶的内源性基因的部分或完全缺失或失活。
77.权利要求62所述的方法，其中所述的微生物进一步包括增加葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶活性的遗传修饰。
78.权利要求77所述的方法，其中所述的遗传修饰提供了选自下组的结果葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶的酶活性增加；N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的酶活性降低；所述微生物超表达具有葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶活性的酶；葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶对葡糖胺-1-磷酸的亲合力增加；葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶对N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸的亲合力降低；或葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶的N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸产物抑制减少。
79.权利要求77所述的方法，其中所述的微生物包含双功能葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶，其中所述的葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶活性增加。
80.权利要求77所述的方法，其中所述的微生物用重组核酸分子转化，所述的重组核酸分子包括编码葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的核酸序列或编码葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶的核酸序列。
81.权利要求80所述的方法，其中编码葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶或葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶的核酸序列具有至少一种遗传修饰，这种遗传修饰可分别增加葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶或葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶的活性。
82.权利要求80所述的方法，其中所述的葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶含有与SEQ ID NO56的氨基酸序列至少约35％相同的氨基酸序列，其中所述的葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶具有葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶的酶活性。
83.权利要求80所述的方法，其中所述的葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶具有SEQ ID NO56的氨基酸序列。
84.权利要求80所述的方法，其中所述的核酸序列编码截短的葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶，所述酶具有葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶活性和降低的或无N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶活性。
85.权利要求84所述的方法，其中所述截短的葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶具有与SEQ ID NO58的氨基酸序列至少约35％相同的氨基酸序列，其中截短的葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶具有葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶的酶活性。
86.权利要求84所述的方法，其中所述截短的葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶具有SEQ ID NO58的氨基酸序列。
87.权利要求77所述的方法，其中所述的微生物进一步包括降低葡糖胺-6-磷酸合酶活性的遗传修饰。
88.权利要求87的方法，其中降低葡糖胺-6-磷酸合酶活性的遗传修饰为微生物中编码葡糖胺-6-磷酸合酶的内源性基因的部分或完全缺失或失活。
89.权利要求62所述的方法，其中所述的收集步骤包括从微生物回收胞内的选自葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖或葡糖胺的胞内产物，或从发酵培养基回收选自葡糖胺或N-乙酰氨基葡糖的胞外产物。
90.通过发酵产生葡糖胺或N-乙酰氨基葡糖的方法，包括
a)在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包括至少一种降低葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性的遗传修饰和至少一种增加葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶活性的遗传修饰；和
b)收集培养步骤中产生的产物，所述产物选自葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸或N-乙酰氨基葡糖。
91.权利要求90的方法，其中降低葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性的遗传修饰包括微生物中编码葡糖胺-6-磷酸脱氨酶的内源性基因的部分或完全缺失或失活。
92.权利要求90的方法，其中增加葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶活性的遗传修饰提供了选自下组的结果葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶的酶活性增加；N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的酶活性降低；所述微生物超表达具有葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶活性的酶；葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶对葡糖胺-1-磷酸的亲合力增加；葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶对N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸的亲合力降低；或葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶的N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸产物抑制减少。
93.权利要求90的方法，其中所述的微生物包含双功能葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶，其中所述的葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶的活性增加。
94.权利要求90的方法，其中所述的微生物用重组核酸分子转化，所述的重组核酸分子包含编码葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的核酸序列或编码葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶的核酸序列。
95.权利要求94的方法，其中编码葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶或葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶的核酸序列具有至少一种遗传修饰，这种遗传修饰可分别增加葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶或葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶的活性。
96.权利要求94的方法，其中所述的葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶含有与SEQ ID NO56的氨基酸序列至少约35％相同的氨基酸序列，其中所述的葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶具有葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶的酶活性。
97.权利要求94的方法，其中所述的葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶具有SEQ ID NO56的氨基酸序列。
98.权利要求94的方法，其中所述的核酸序列编码截短的葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶，所述酶具有葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶活性和降低的或无N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶活性。
99.权利要求98的方法，其中所述截短的葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶具有与SEQ ID NO58的氨基酸序列至少约35％相同的氨基酸序列，其中截短的葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶具有葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶的酶活性。
100.权利要求98的方法，其中所述截短的葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶/N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸尿苷酰转移酶具有SEQ ID NO58的氨基酸序列。
权利要求90的方法，其中所述的微生物进一步包括至少一种增加葡糖胺-6-磷酸合酶活性的遗传修饰。
权利要求101的方法，其中增加葡糖胺-6-磷酸合酶活性的遗传修饰包括用重组核酸分子转化所述微生物，所述的重组核酸分子包含编码葡糖胺-6-磷酸合酶的核酸序列。
权利要求101的方法，其中所述的葡糖胺-6-磷酸合酶包含与选自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18或SEQ ID NO20的氨基酸序列至少约35％相同的氨基酸序列，其中所述的葡糖胺-6-磷酸合酶具有酶活性。
权利要求101的方法，其中所述的葡糖胺-6-磷酸合酶包含选自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18或SEQ ID NO20的氨基酸序列。
权利要求101的方法，其中所述的葡糖胺-6-磷酸合酶与野生型葡糖胺-6-磷酸合酶相比具有减少葡糖胺-6-磷酸的产物抑制的修饰。
权利要求105的方法，其中所述的葡糖胺-6-磷酸合酶包含选自SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12或SEQ ID NO14的氨基酸序列。
权利要求90的方法，其中所述的收集步骤包括从微生物回收细胞内的选自葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖胺或葡糖胺的胞内产物，或从发酵培养基回收选自葡糖胺或N-乙酰氨基葡糖的胞外产物。
通过发酵生产葡糖胺或N-乙酰氨基葡糖的方法，包括
a)在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包含内源性葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶和至少一种增加葡糖胺-6-磷酸合酶活性的遗传修饰；和
b)收集从所述培养步骤中产生的产物，所述产物选自葡糖胺-6-磷酸、葡糖胺、葡糖胺-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸或N-乙酰氨基葡糖。
权利要求108的方法，其中所述的微生物用至少一种包含编码葡糖胺-6-磷酸合酶的核酸序列的重组核酸分子转化。
110.权利要求109的方法，其中所述的葡糖胺-6-磷酸合酶包含与选自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18或SEQ ID NO20的氨基酸序列至少约35％相同的氨基酸序列，其中所述的葡糖胺-6-磷酸合酶具有酶活性。
111.权利要求109的方法，其中所述的葡糖胺-6-磷酸合酶包含选自SEQ ID NO2、SEQID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18或SEQ ID NO20的氨基酸序列。
112.权利要求109的方法，其中所述的葡糖胺-6-磷酸合酶与野生型葡糖胺-6-磷酸合酶相比具有减少葡糖胺-6-磷酸合酶的产物抑制的修饰。
113.权利要求112的方法，其中所述的葡糖胺-6-磷酸合酶包含选自SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12或SEQ ID NO14的氨基酸序列。
114.权利要求108的方法，其中所述的微生物进一步包含至少一种降低葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性的遗传修饰。
115.权利要求108的方法，其中该方法为通过发酵生产N-乙酰氨基葡糖的方法，且其中所述的收集步骤包括收集所述的培养步骤中产生的产物，所述产物选自N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸或N-乙酰氨基葡糖。
116.一种基因修饰微生物，其包含至少一种增加葡糖胺-6-磷酸乙酰转移酶活性的遗传修饰。
117.权利要求116所述的基因修饰微生物，其中所述的微生物进一步包含至少一种增加葡糖胺-6-磷酸合酶活性的遗传修饰。
118.权利要求116所述的基因修饰微生物，其中所述的微生物进一步包含至少一种降低葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性的遗传修饰。
119.权利要求116所述的基因修饰微生物，其中所述的微生物进一步包含至少一种增加葡糖胺-6-磷酸合酶活性的遗传修饰。
120.基因修饰微生物，包含至少一种增加葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性的遗传修饰。
121.权利要求120所述的基因修饰微生物，其中所述的微生物进一步包含降低葡糖胺-6-磷酸合酶活性的遗传修饰。
122.权利要求120所述的基因修饰微生物，其中所述的微生物进一步包含增加葡糖胺-6-磷酸N-乙酰转移酶活性的遗传修饰。
123.权利要求122所述的基因修饰微生物，其中所述的微生物进一步包含降低葡糖胺-6-磷酸合酶活性的遗传修饰。
124.权利要求120所述的基因修饰微生物，其中所述的微生物进一步包含增加葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶活性的遗传修饰。
125.权利要求124所述的基因修饰微生物，其中所述的微生物进一步包含降低葡糖胺-6-磷酸合酶活性的遗传修饰。
126.基因修饰微生物，包括至少一种降低葡糖胺-6-磷酸脱氨酶活性的遗传修饰和至少一种增加葡糖胺-1-磷酸N-乙酰转移酶活性的遗传修饰。
127.权利要求126所述的基因修饰微生物，其中所述的微生物进一步包括至少一种增加葡糖胺-6-磷酸合酶活性的遗传修饰。
128.制备N-乙酰氨基葡糖的方法，包括
a)获得含有溶解的N-乙酰氨基葡糖的发酵肉汤，所述N-乙酰氨基葡糖是发酵过程的产物；和
b)从所述发酵肉汤中回收含有N-乙酰氨基葡糖的固体。
129.权利要求128所述的方法，进一步包括从发酵肉汤中除去细胞物质。
130.权利要求128所述的方法，进一步包括使发酵肉汤脱色。
131.权利要求130所述的方法，其中所述的脱色步骤选自多次N-乙酰氨基葡糖结晶、活性炭处理和层析脱色。
132.权利要求128所述的方法，进一步包括使发酵肉汤与离子交换树脂接触的步骤。
133.权利要求132所述的方法，其中使发酵肉汤与离子交换树脂接触的步骤包括使所述发酵肉汤与阴离子交换树脂和阳离子交换树脂接触。
134.权利要求133所述的方法，其中使发酵肉汤与阴离子交换树脂和阳离子交换树脂接触的步骤包括使所述发酵肉汤与阴离子和阳离子交换树脂的混合床接触。
135.权利要求128所述的方法，其中所述回收步骤包括从发酵肉汤中沉淀含有N-乙酰氨基葡糖的固体。
136.权利要求128所述的方法，其中所述回收步骤包括使含有N-乙酰氨基葡糖的固体从发酵肉汤中结晶。
137.权利要求128所述的方法，其中所述回收步骤包括浓缩含有溶解的N-乙酰氨基葡糖的发酵肉汤。
138.权利要求137所述的方法，其中所述浓缩步骤在低于大气压的条件下进行。
139.权利要求137所述的方法，其中所述浓缩步骤通过膜分离进行。
140.权利要求137所述的方法，其中所述浓缩步骤在约40℃-约75℃的温度进行。
141.权利要求137所述的方法，其中所述浓缩步骤在约45℃-约55℃的温度进行。
142.权利要求137所述的方法，其中进行所述浓缩步骤以使发酵肉汤中的固体含量为至少约30％固体。
143.权利要求137所述的方法，其中进行所述浓缩步骤以使发酵肉汤中的固体含量为至少约40％固体。
144.权利要求137所述的方法，其中进行所述浓缩步骤以以使发酵肉汤中的固体含量为至少约45％固体。
145.权利要求137所述的方法，进一步包括在所述浓缩步骤后冷却发酵肉汤。
146.权利要求145所述的方法，所述的发酵肉汤冷却至约-5℃-约45℃。
147.权利要求145所述的方法，所述的发酵肉汤冷却至约-5℃到约室温。
148.权利要求145所述的方法，所述的发酵肉汤冷却至约室温。
149.权利要求145所述的方法，进一步包括用N-乙酰氨基葡糖晶体接种发酵肉汤。
150.权利要求149所述的方法，其中所述N-乙酰氨基葡糖晶种选自通过在发酵肉汤中成核形成的N-乙酰氨基葡糖晶体或外部提供的N-乙酰氨基葡糖晶体。
151.权利要求128所述的方法，其中所述回收步骤包括使N-乙酰氨基葡糖与水混溶性溶剂接触。
152.权利要求151所述的方法，其中水混溶性溶剂选自异丙醇(IPA)、乙醇、甲醇、丙酮、四氢呋喃、二甲亚砜、二甲基甲酰胺、二噁烷或乙腈。
153.权利要求128所述的方法，进一步包括干燥回收的含N-乙酰氨基葡糖的固体。
154.权利要求153所述的方法，进一步包括用水混溶性溶剂洗涤含干燥的含N-乙酰氨基葡糖的固体。
155.权利要求128所述的方法，进一步包括溶解回收的含N-乙酰氨基葡糖的固体而形成N-乙酰氨基葡糖溶液，并从该溶液中回收含N-乙酰氨基葡糖的固体。
156.权利要求128所述的方法，进一步包括过滤发酵肉汤以除去细菌内毒素。
157.由N-乙酰氨基葡糖源生产葡糖胺的方法，包括
a)从N-乙酰氨基葡糖、N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸或N-乙酰氨基葡糖-1-磷酸获得N-乙酰氨基葡糖源；和
b)处理(a)的N-乙酰氨基葡糖源从而由该N-乙酰氨基葡糖源产生选自葡糖胺、葡糖胺-6-磷酸或葡糖胺-1-磷酸的葡糖胺产物。
158.权利要求157所述的方法，其中所述N-乙酰氨基葡糖源中干固体N-乙酰氨基葡糖的百分比为至少约40％。
159.权利要求157所述的方法，其中所述N-乙酰氨基葡糖源为通过发酵法产生的N-乙酰氨基葡糖。
160.权利要求157所述的方法，其中所述N-乙酰氨基葡糖源为含有通过发酵法生产的N-乙酰氨基葡糖的发酵肉汤，其中发酵肉汤已经过处理而基本上除去了细胞物质。
161.权利要求157所述的方法，其中将所述N-乙酰氨基葡糖源作为固体或以溶液形式提供。
162.权利要求161所述的方法，其中将所述N-乙酰氨基葡糖源悬浮于含水的低沸点伯醇或仲醇中。
163.权利要求157所述的方法，其中处理步骤(b)包括在酸性和加热条件下水解N-乙酰氨基葡糖源。
164.权利要求163所述的方法，其中所述水解步骤在约60℃-约100℃的温度进行。
165.权利要求163所述的方法，其中所述水解步骤在约70℃-约90℃的温度进行。
166.权利要求163所述的方法，其中所述水解步骤使用浓度为约10％-约40％重量/重量的盐酸溶液进行。
167.权利要求166所述的方法，其中盐酸溶液与纯干重的N-乙酰氨基葡糖源的重量比为约1:1-约5:1。
168.权利要求163所述的方法，其中水解步骤进行约10分钟到约24小时。
169.权利要求163所述的方法，包括下列步骤
a)通过在加热条件下将所述N-乙酰氨基葡糖源与盐酸溶液或再循环的水解母液合并来水解N-乙酰氨基葡糖源，以产生含有葡糖胺盐酸盐的溶液；
b)冷却(a)的溶液以沉淀葡糖胺盐酸盐；和
c)从(b)中回收含有沉淀的葡糖胺盐酸盐的固体。
170.权利要求169所述的方法，其中水解步骤(a)通过连续混合所述N-乙酰氨基葡糖源与盐酸溶液或再循环的水解母液以将该N-乙酰氨基葡糖源保持为溶解的溶液来进行，随后在加热条件下向(a)的溶液中添加无水盐酸以启动水解并将N-乙酰氨基葡糖转化成葡糖胺盐酸盐。
171.权利要求169所述的方法，其中所述的水解母液为回收步骤(c)中沉淀的葡糖胺盐酸盐后保留的水解溶液，其中在进行水解步骤前、过程中或之后向该水解溶液中添加伯醇或仲醇。
172.权利要求171所述的方法，其中所述的伯醇或仲醇选自甲醇、异丙醇、乙醇、正丙醇、正丁醇或仲丁醇。
173.权利要求169所述的方法，其中将所述冷却步骤进行至溶液为约-5℃-约40℃。
174.权利要求169所述的方法，其中所述回收步骤包括
i)收集沉淀的含有葡糖胺盐酸盐的固体；
ii)用水混溶性溶剂洗涤该含有葡糖胺盐酸盐的固体；和
iii)干燥该含有葡糖胺盐酸盐的固体。
175.权利要求169所述的方法，其中所述回收步骤包括
i)收集沉淀的含有葡糖胺盐酸盐的固体；
ii)将来自(i)的固体溶于水而形成溶液；
iii)将(ii)的溶液的pH调节至约2.5-4；
iv)使(iii)的溶液与活性炭接触以使该含有葡糖胺盐酸盐的固体脱色；
v)从(iv)的溶液中除去活性炭；
vi)使葡糖胺盐酸盐从(v)的溶液中结晶。
176.权利要求175所述的方法，其中所述结晶步骤包括在低于约70℃的温度浓缩葡糖胺盐酸盐。
177.权利要求175所述的方法，其中结晶步骤包括在低于约50℃的温度浓缩葡糖胺盐酸盐。
178.权利要求175所述的方法，其中所述结晶步骤包括在低于大气压的条件下浓缩葡糖胺盐酸盐。
179.权利要求175所述的方法，进一步包括使结晶步骤(vi)后剩余的溶液再循环到随后回收过程中的步骤(i)。
180.权利要求175所述的方法，进一步包括使结晶步骤(vi)后剩余的溶液再循环到随后的结晶步骤。
181.权利要求175所述的方法，进一步包括用水混溶性溶剂洗涤来自步骤(vi)的结晶的葡糖胺盐酸盐。
182.权利要求181所述的方法，其中所述的水混溶性溶剂选自甲醇、异丙醇、乙醇、乙腈、丙酮、四氢呋喃、二甲亚砜、二甲基甲酰胺或二噁烷。
183.权利要求181所述的方法，进一步包括进行洗涤以后，在低于约70℃的温度将结晶的葡糖胺盐酸盐干燥少于约6小时。
184.权利要求183所述的方法，其中所述干燥步骤在低于大气压的条件下进行。
185.权利要求183所述的方法，其中所述干燥步骤采用通风进行。
186.权利要求169所述的方法，其中将所述N-乙酰氨基葡糖源悬浮于含水的低沸点伯醇或仲醇中，且其中该方法在步骤(a)-(b)之间还包括另外的步骤，即在水解后或再循环水解溶液以便重新利用前除去与醇形成的乙酸酯。
187.权利要求186所述的方法，其中的乙酸酯通过在低于大气压的条件下进行蒸馏、急骤蒸发或浓缩除去。
188.权利要求186所述的方法，其中所述水解步骤在约60℃-约100℃的温度进行。
189.权利要求186所述的方法，其中所述水解步骤在1个大气压、溶液的沸点进行。
190.权利要求169所述的方法，其中所述水解步骤在下列条件下进行盐酸溶液与N-乙酰氨基葡糖源的干重之重量比为约3:1-约5:1，且温度低于约80℃。
191.权利要求190所述的方法，包括用水混溶性溶剂洗涤步骤(c)中回收的葡糖胺盐酸盐。
192.权利要求191所述的方法，其中所述的水混溶性溶剂选自甲醇、异丙醇、乙醇、乙腈、丙酮、四氢呋喃、二甲亚砜、二甲基甲酰胺或二噁烷。
193.权利要求191所述的方法，进一步包括进行洗涤以后在低于约70℃的温度干燥已结晶的葡糖胺盐酸盐少于约6小时。
194.权利要求193所述的方法，其中所述干燥步骤在低于大气压的条件下进行。
195.权利要求193所述的方法，其中所述干燥步骤采用通风进行。
196.权利要求157所述的方法，其中处理步骤(b)包括使N-乙酰氨基葡糖源与去乙酰化酶接触以产生葡糖胺产物。
197.权利要求196所述的方法，其中所述的去乙酰化酶选自N-乙酰氨基葡糖-6-P脱乙酰酶或N-乙酰氨基葡糖脱乙酰酶。
198.权利要求196所述的方法，其中所述的去乙酰化酶为壳多糖脱乙酰酶，所述酶已经过修饰或选择而具有使N-乙酰氨基葡糖单体脱乙酰化从而产生葡糖胺的能力。
199.权利要求196所述的方法，进一步包括通过结晶回收所述葡糖胺产物的步骤。
200.权利要求196所述的方法，进一步包括通过沉淀回收所述葡糖胺产物的步骤。
权利要求196所述的方法，其中将所述的去乙酰化酶固定在底物上。
权利要求196所述的方法，其中所述接触步骤包括在有氯化钠或氯化钙水溶液存在的情况下使N-乙酰氨基葡糖源与去乙酰化酶接触。
权利要求202所述的方法，进一步包括通过结晶或沉淀回收所述葡糖胺产物。
权利要求196所述的方法，其中所述接触步骤包括在有醇存在时使N-乙酰氨基葡糖源与去乙酰化酶接触以使所述醇发生酯化。
权利要求196所述的方法，进一步包括将盐与葡糖胺产物混合并使该混合物与离子交换介质接触。
权利要求205所述的方法，其中所述的盐选自氯化物盐、磷酸盐、硫酸盐、碘化物或硫酸氢盐。
通过发酵生产葡糖胺的方法，包括
a)在发酵培养基中培养用重组核酸分子转化的微生物，所述重组核酸分子包含编码葡糖胺-6-磷酸合酶的核酸序列，其中所述重组核酸分子的表达通过乳糖诱导来控制，且其中所述培养步骤包括
i)使所述微生物在包括葡萄糖作为碳源、pH为约pH 4.5-约pH 7的发酵培养基之中，且温度为约25℃-约37℃的条件下生长；
ii)在不向所述发酵培养基中添加葡萄糖的条件下，通过向所述培养基中添加乳糖诱导核酸序列转录；
iii)在有葡萄糖存在、pH约pH 4.5-约pH 6.7且温度为约25℃-约37℃的条件下发酵步骤(ii)后的微生物；和
b)收集从培养步骤中产生的产物，其选自葡糖胺-6-磷酸或葡糖胺。
权利要求207所述的方法，其中下发酵步骤(iii)中加入微量元素源。
权利要求208所述的方法，其中所述的微量元素包括铁。
210.权利要求207所述的方法，其中步骤(ii)包括使所述微生物生长在包含葡萄糖作为碳源、pH为约pH 6.9的发酵培养基中。
211.权利要求207所述的方法，其中步骤(iii)包括在有葡萄糖存在、pH为约4.5-约5的条件下发酵步骤(ii)后的微生物。
212.权利要求207所述的方法，其中步骤(iii)包括在有葡萄糖存在、pH为约6.7的条件下发酵步骤(ii)后的微生物。
全文摘要
本发明公开了用于生产葡糖胺和N-乙酰氨基葡糖的生物合成方法。这类方法包括发酵基因修饰微生物以产生葡糖胺和/或N-乙酰氨基葡糖。本发明还公开了用于生产葡糖胺和N-乙酰氨基葡糖的基因修饰微生物。此外，本发明描述了回收通过发酵法生产的N-乙酰氨基葡糖的方法，包括产生高纯度N-乙酰氨基葡糖的方法。本发明还公开了由N-乙酰氨基葡糖生产葡糖胺的方法。
文档编号C12N1/21GK101365785SQ03820734
公开日2009年2月11日 申请日期2003年7月1日 优先权日2002年7月1日
发明者邓明德, J·戴维·安杰勒, 唐·西伦, 艾伦·D·格伦德, 小托马斯·A·杰里尔, 坎迪斯·利纳, 欧文·马思里, 莱因哈特·罗森, 杰夫·朗宁, 戴夫·西弗森, 宋林生, 萨拉·沃辛克 申请人:阿基昂生命科学公司,以生物技术资源部的名义经营