体外肽表达文库的制作方法

专利名称：体外肽表达文库的制作方法
技术领域：
本发明广泛涉及重组DNA技术，特别是涉及体外构建和筛选DNA文库的方法以获得编码生物活性分子的DNA序列。
背景技术：
从重组DNA(脱氧核糖核酸)文库中分离编码所需肽的未知基因是一项困难的任务。使用杂交探针可以使所述过程变得容易些，但是该方法通常必须知道编码该蛋白的基因的至少部分序列。当序列为未知时，可将DNA文库在表达载体中表达，然后使用抗体对噬斑或菌落进行筛选，从而得到所需的蛋白质抗原。所述方法在对小型文库进行筛选时是有用的，但是在105个克隆中出现几率小于约1次的罕见序列很容易被遗漏，使筛选大于106个克隆的文库成为一项劳动量大而且困难的工作，所述罕见序列如罕见的cDNA(互补DNA)分子或合成的肽。筛选更大的文库需要开发出设计用于进行罕见序列分离的方法，该方法基于对分子和编码这些分子的DNA的共选择。已经开发了一些用于筛选大型文库的体内方法，例如噬菌体展示和使用lacI(半乳糖苷酶I)融合肽的“质粒上的肽”。
噬菌体展示基于以下原理将DNA文库与丝状噬菌体外壳蛋白的N末端融合，并且它们在细菌宿主中的表达导致外源肽展示在噬菌体颗粒的表面，而且将编码融合蛋白的DNA包装入噬菌体颗粒中(Smith G.P.，1985，《科学(Science)》2281315-1317)。然后可对整合入噬菌体的融合蛋白文库进行选择以获得结合在所需靶点(配体)上的噬菌体。然后可使结合的噬菌体再次感染大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)，之后扩增细菌并重复所述选择过程，从而使结合噬菌体富集(Parmley，S.F.，和Smith，G.P.1988，《基因(Gene)》73305～318；Barrett R.W.等，1992，《分析生物化学(Analytical Biochemistry)》204357～364；Williamson等，《美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》，904141～4145；Marks等，1991，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》，222581～597)。
lacI融合质粒展示基于DNA与lac阻遏物的结合能力。随机肽文库与lacI阻遏蛋白的C末端融合。通过质粒上的lacO序列，lacI-肽融合物与其编码DNA连接起来，形成了稳定的肽-LacI-肽复合物。通过细胞溶解，将所述复合物从宿主细菌中释放出来，然后在固定的受体靶点上通过亲和纯化分离得到感兴趣的肽。然后可采用电穿孔法将如此分离的质粒再次引入大肠杆菌以增加所选种群的数量，以用于更多次的筛选(Cull，M.G.等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，891865-1869)。
所述细菌方法受到下列因素限制通过当前的将DNA引入宿主细菌的方法可以制备的文库的大小，所引入的表达肽的潜在细胞毒性，和无法引入翻译后的修饰，或无法向表达肽中引入新的氨基酸整。
专利申请WO 91/05058中描述了一种完全体外核糖体系统，该系统以通过核糖体的肽与编码这些肽的RNA的连接为基础。核糖体展示还被用于对单链Fv抗体片段(scFv)进行选择(Matheakis，L.C.等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，919022～9026；Hanes，J.和Pluckthun A.，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，944937～4942)。该方法存在以下问题RNA遗传物质的稳定性低；和在可能存在有RNAse(核糖核酸酶)的某些选择条件下降解可能会增加。
通过在表达肽之前将DNA区室化，而后所述肽在该区室内对DNA进行修饰，Griffiths和Tawfik所描述的体外方法(WO 99/02671和WO00/40712)解决了部分上述问题。在后续步骤中选择因感兴趣的酶促活性而具有修饰能力的肽。然而，如果不修饰编码所述肽的DNA并从区室中释放出修饰后的DNA，则均不可能对肽和DNA的肽结合活性进行直接选择。
专利申请WO 9837186描述了另一种现有技术方法，即共价展示技术(CDT)。所述方法依赖于通过交联蛋白质的顺式(cis)作用的蛋白质和DNA的共价连接以保持基因型和表型的关联。这一方法教导说这一技术的成功应用需要两个条件。第一，需要蛋白质，该蛋白质在体外能够与编码它们的DNA序列相互作用(顺式作用)；第二，所述蛋白质必需与它们自己的DNA模板建立共价连接。该方法的问题在于DNA经化学修饰，这会妨碍对感兴趣的结合肽的回收和鉴定。
除了上述方法以外，还需要更通用的体外构建肽文库方法，该方法能够直接选择结合活性和酶促活性，能够高效生成复合肽结构，也能够回收编码感兴趣肽的完整遗传物质。

发明内容
因此，本发明提供了一种制备体外肽表达文库的方法，所述肽表达文库包含大量肽，其中每个肽与编码该肽的DNA构建体相连，所述方法包括以下步骤(a)提供DNA构建体，该DNA构建体包含(i)DNA靶序列；(ii)编码文库成员肽的DNA；和(iii)对能够直接或间接地与如(i)所述的DNA靶序列非共价结合的肽进行编码的DNA；其中，所述DNA构建体和编码生成的蛋白质经选择具有顺式活性；(b)表达如(a)所述的大量DNA构建体，其中所述DNA构建体编码大量文库成员肽，从而每个表达生成的肽与生成该肽的DNA非共价相连。
本发明还提供了一种制备体外肽表达文库的方法，该文库包含大量肽，其中每个肽与编码该肽的DNA构建体相连，所述方法包括以下步骤(a)提供DNA构建体，该DNA构建体包含(i)编码文库成员肽的DNA；和(ii)编码肽的DNA，所述肽能够与双功能试剂非共价结合；其中，所述DNA构建体和经编码的蛋白质经选择为具有顺式活性；(b)结合双功能试剂或DNA标签，该标签能够将双功能试剂与如(a)所述的DNA构建体结合，其中所述双功能试剂能够与由如(ii)所述的DNA所编码的肽结合；和(c)表达(b)所述的大量DNA构建体，其中所述DNA构建体编码大量文库成员肽，从而每个表达生成的肽通过所述双功能试剂与生成该肽的DNA相连。
本发明的范围扩展至由所述方法制备的肽文库和所述方法中使用的DNA构建体。
本发明还提供了筛选本发明的体外肽表达文库的方法。在第一个方面，本发明提供了一种在体外肽表达文库中对显示出所需特性的肽进行鉴定和/或纯化的方法，所述体外肽表达文库根据前述任一项权利要求所述的方法制备，所述对显示出所需特性的肽进行鉴定和/或纯化的方法至少包括以下步骤(a)筛选所述文库与(b)选择并分离相关的文库成员。在第二个方面，本发明提供了一种鉴定特定配体结合肽的方法，所述方法至少包括以下步骤(a)用选择性结合于固相支持物的配体分子筛选根据本发明的方法制备的体外肽表达文库；(b)选择和分离结合于所述靶点分子的文库成员；和(c)分离特异性结合于所述靶点分子的肽。在第三个方面，本发明提供了一种鉴定和/或纯化肽的方法，该肽具有与特定DNA靶序列结合的能力，所述方法至少包括以下步骤(a)提供本发明所述的体外表达文库，其中，(iii)的所述肽或蛋白质是具有DNA结合活性的文库成员肽，而其中(i)的所述DNA靶序列是感兴趣的靶序列；(b)选择和分离文库成员，其中，经编码的蛋白质结合于所述靶序列；(c)分离结合于所述靶序列的肽。
除了由本发明文库分离和/或鉴定特定肽以外，本发明的筛选方法也可用于从文库中分离和/或鉴定编码特定肽的DNA。


图1给出了一种方法的示意图，通过所述方法，本发明的DNA构建体可连接于由其编码的肽。
图2给出了本发明的一种方法的示意图，通过所述方法，DNA结合蛋白可被转化为顺式作用的DNA结合蛋白。
图3给出了如何将靶序列特异性DNA结合蛋白从本发明的文库中分离出来的示意图。
图4给出了如何通过顺式作用并使用双特异性结合分子将文库蛋白质与其编码DNA相连的示意图。
图5是对顺式活性进行说明根据各自抗体选择的两种不同大小的加入DNA(input DNA)(CK-RepA或V5-RepA)的1∶1混合物，。1标准分子量DNA；2用抗人CK抗体选择后的PCR(聚合酶链反应)扩增结果；3用抗V5肽抗体选择后的PCR扩增结果。
图6显示结合有抗V5抗体的克隆的特异性。对特异性结合于抗V5抗体的7个克隆(1-7)在450nm处进行ELISA(酶联免疫吸附试验)筛选。四个一组的条形图代表所筛选克隆的ELISA信号，从左至右为抗人κ区抗体；抗V5抗体；BSA(牛血清白蛋白)；和空白。图中也显示了既不表达CK也不表达V5的阴性对照(8)。
图7显示了培养物上清在450nm处进行ELISA检测OD(光密度)的肽信号，所述肽是通过实施例4中针对枯草芽孢杆菌(B.globigii)孢子进行5轮选择后回收得到的。A克隆1e；B克隆1f；C克隆1g；D克隆8a；E克隆10c；F克隆10e；G阴性对照。
图8显示了肽在450nm处的OD信号，所述肽为通过实施例5中针对抗V5抗体的4轮选择后分离得到的。AP1C12；BP2H1；CP1B5；DP2B8。针对抗V5抗体和抗ACTH肽抗体对肽-噬菌体进行检验。
图9显示了合成肽在450nm处的OD信号，所述肽为通过针对卵清蛋白的4轮选择后分离得到的。AC1；BC4；CC6；DC8；E阴性对照。针对卵清蛋白、抗V5抗体和封闭后的平板(塑料)对肽进行检验。
图10显示了用BSA或BSA-2甲4氯丙酸(mecoprop)选择后scFvDNA的PCR回收结果。A用BSA和2.5mM(毫摩尔每升)氧化型谷胱甘肽选择的抗2甲4氯丙酸scFv。B用2甲4氯丙酸-BSA和2.5mM氧化型谷胱甘肽选择的抗2甲4氯丙酸scFv。C用BSA而不用氧化型谷胱甘肽选择的抗2甲4氯丙酸scFv。D用2甲4氯丙酸-BSA而不用氧化型谷胱甘肽选择的抗2甲4氯丙酸scFv。
序列的简单描述SEQ ID No 1至11，19至23，26至35和45至47为实施例中所用的引物。
SEQ ID No12为TAC-MYC-CK-REPA-CIS-ORI构建体的序列；SEQID NO13为TAC-MYC-V5-REPA-CIS-ORI构建体的序列；SEQ ID NO24为TAC-V5-REPA-CIS-ORI-408构建体的序列；和SEQ ID NO25为TAC-NNB-REPA-CIS-ORI-408构建体的序列。
SEQ ID No14为雌激素受体上的靶识别序列。
SEQ ID No 15和16为来自于incFII不相容群R1质粒的repA基因的DNA和氨基酸序列。SEQ ID No 17和18为来自相同系统的CIS DNA元件序列和ori(复制起始)序列。
SEQ ID No 36至39为实施例5中经过选择后分离得到的肽的序列。SEQ ID Nos 39至43为实施例6中分离得到的克隆的序列。
具体实施例方式
本发明涉及构建和筛选文库以获得在体外编码感兴趣肽的核苷酸序列。对编码感兴趣肽的构建体进行设计以使被表达的肽对该构建体显示顺式活性。顺式活性的定义是肽与生成该肽的DNA的相结合的能力，其中，生成该肽的DNA指转录和翻译生成该肽的DNA。构建体的体外表达导致肽与编码该肽分子的DNA通过非共价相互作用结合。这一点与专利申请WO 98/37186中所述的教导不同，该专利不允许蛋白质与编码该蛋白质的DNA之间的体外非共价相互作用，实际上，其特地排除了所述相互作用在文库筛选中的任何实际应用。
非共价结合指可被本领域技术人员所熟知的方法所破坏的一种结合，所述方法为例如加入适当溶剂或改变离子环境，例如加入低pH的甘氨酸或高pH的三乙胺。在本发明中，非共价结合的典型例子是DNA结合蛋白和DNA分子之间的非共价相互作用。相反地，当DNA和经编码的多肽形成共价连接时，展示的肽或蛋白质不会由于离子环境和溶剂而从DNA解离，而所述离子环境和溶剂会破坏DNA结合蛋白DNA之间的非共价相互作用。例如，细菌复制蛋白repA非共价结合于其靶DNA序列oriR，并且在盐浓度大于0.2M(摩尔每升)KCl(氯化钾)时，其可从所述靶DNA解离下来(Giraldo R.和Diaz R.1992，J.Mol.Biol.228787-802)。该盐浓度不会影响共价连接，更为恶劣的条件才会使共价结合的蛋白质解离下来，而且会增加使回收的DNA受破坏的风险。
本发明描述了顺式活性和非共价结合，该顺式活性和非共价结合使经编码的肽或蛋白质持续结合于DNA构建体上，其半寿期的时间足以使单个肽和与其结合的编码该肽的DNA从所形成的蛋白质DNA复合体的混合物中分离出来，所述肽具有感兴趣的活性。例如，编码生成的蛋白质及其DNA之间的结合可以具有最大为30分钟、45分钟、1个小时、2个小时、6个小时或12个小时的半寿期。因此，本发明的筛选方法可在文库构建完成后立即实施或晚些时候实施，例如最晚为1小时、2小时、6小时、12小时或24小时或24小时后。
令人惊奇的是，本发明由此证明了可在体外表达所述经编码生成的肽或蛋白质，并在其他DNA序列存在的情况下与编码该肽的DNA结合。本发明还证明了蛋白质和DNA之间的共价连接无需维持该顺式活性，DNA和结合蛋白之间的非共价相互作用足以使肽的选择可以在体外表达和选择系统中进行。
根据本发明，DNA文库的单个成员均置于合适的DNA构建体中，每个文库成员均可编码肽表达文库中待表达的肽(文库成员肽)。包含有DNA文库成员的DNA构建体包括从该构建体表达文库成员肽所需的全部序列，也包括使该构建体编码的肽与其DNA构建体结合所需的全部序列。文库中的每个肽通常包括融合蛋白，该融合蛋白包含文库成员肽，该文库成员肽与参与所述融合蛋白与相关DNA构建体的结合的肽融合。所述融合蛋白可包含更多的序列，而且所述文库肽可通过连接序列与所述结合肽连接。
编码大量不同的文库成员肽的大量所述构建体构成了本发明的DNA文库。在存在编码其他文库成员的许多其他DNA分子的情况下，表达所述DNA分子文库可导致单个的编码生成的蛋白质与编码该蛋白质的DNA的非共价结合，所述蛋白质由所述DNA转录和翻译。因此，对存在于特定的经编码的蛋白质中的肽文库成员进行编码的序列也存在于与所述蛋白质结合的DNA中。由此，所述过程将生物学活性形式(通常具有结合活性)的文库成员肽与编码该肽的特定文库成员DNA序列连接，从而能够例如由于特定的结合活性对感兴趣的肽进行选择，并随后对编码所述文库成员肽的DNA进行分离和鉴定。
因此，根据本发明的目的，DNA文库是DNA构建体的集合。每个构建体包含对作为文库成员肽的待表达的肽进行编码的DNA序列，每个构建体还包含合适的启动子、翻译起始和终止信号。本发明的DNA文库包含大量所述DNA分子。本发明提供了大量DNA构建体，每个构建体编码一个文库成员肽，以提供大量不同的文库成员。DNA文库优选含有至少104个离散的DNA分子。例如，DNA文库可含有超过106个、超过108个、超过1010个、超过1012个或超过1014个离散的DNA分子。
肽表达文库的定义为由DNA分子文库表达得到的肽序列的集合。因此，本发明的肽表达文库包括与编码肽的DNA非共价结合的肽的文库。例如，本发明的肽表达文库可为至少具有104个离散的蛋白质的文库，每个蛋白质包括从DNA分子文库表达得到的文库肽序列。本发明的肽表达文库可以是本发明的DNA文库表达形成的任何文库。
肽文库成员可定义为具有可变组成的氨基酸链，其至少具有2个氨基酸的长度，或者部分或全部是天然存在的诸如酶等蛋白质，或为受体或抗体或其片段等结合分子。合适的肽文库成员可以是具有随机氨基酸组成的肽。具有可变或随机组成的肽可以在N和/或C末端旁侧具有已知的氨基酸序列以限制其结构。所述已知结构的长度可变。可将具有可变或随机组成的肽插入到已知蛋白质支架的不同位点上，例如受体或抗体或其他蛋白质或它们的片段。所述肽可一次或不止一次地插入到相同的蛋白质支架中，例如两次或更多次地插入到相同的蛋白质支架中。
本发明所述的DNA构建体可包含编码文库成员肽的DNA和用于使编码生成的肽与编码DNA构建体结合的手段。除了编码文库成员肽的DNA之外，本发明的合适的DNA构建体还包含至少一个DNA靶序列和编码肽的DNA，所述肽能够直接或间接与DNA靶序列结合。
根据本发明，DNA构建体和编码生成的蛋白质被选择为具有顺式活性。也就是说，编码生成的蛋白质具有与编码该蛋白质的DNA分子特异性结合的能力。例如，顺式活性的功能可以使编码生成的DNA结合肽与编码该肽的DNA构建体的靶序列特异性(直接或间接)结合，而不与其他DNA构建体的靶序列结合。
在某些情况下，由能够指导顺式活性的DNA元件提供顺式活性，即所述DNA元件允许或促使由DNA构建体编码生成的蛋白质具有顺式活性，并由此与其编码序列结合。在其他情况下，如果编码DNA的特性本来就使其编码生成的肽具有顺式活性，则单独的DNA元件本身是不需要的。
指导顺式活性的DNA元件可在DNA构建体中与编码肽的DNA一起提供，所述肽与所述顺式元件相互作用。例如，在来自于将在下文讨论的repA系统的顺式元件的情况下，编码repA序列片段的DNA可与顺式DNA元件一起提供，所述repA序列片段包含repA的C末端的至少20个氨基酸。通过把所述DNA元件和其发挥作用所必需的任何其他序列引入DNA构建体，将顺式活性赋予平常不具有顺式作用的DNA结合肽是可能的。例如，将编码肽的DNA引入DNA构建体中，所述肽与所使用的顺式元件相互作用。
替代性地，与顺式元件相互作用的肽也可以是DNA结合肽的一部分。例如，DNA结合肽可以是repA，其包含与repA顺式元件相互作用的序列。替代性地，DNA结合肽可顺式结合于其编码DNA，而无需单独的顺式元件。
合适的DNA元件可以是允许或指导顺式活性的任何元件。例如，所述DNA元件可通过与参与DNA构建体的翻译和转录的系统相互作用而起效，以延缓编码的肽的生成和释放。
能够允许编码生成的肽与编码该肽的DNA分子特异性结合的任何DNA元件，均可用作本发明所述的DNA元件。合适的DNA元件的一个例子是将在下文详细描述的repA顺式系统。在该系统中，在转录的ρ依赖性终止之前，RNA聚合酶被5’顺式序列的环终止。由此，DNA元件使编码生产的结合肽与构建体中生成了所述结合肽的DNA靶序列结合。
优选顺式DNA元件位于DNA构建体中文库成员肽和能够与所述DNA靶序列结合的肽或蛋白质的3’端。这意味着所述序列在RNA聚合酶到达顺式作用序列之前就可被转录和翻译。
根据本发明，结合肽可直接或间接地与DNA构建体连接。在直接结合的情况下，结合肽以非共价方式直接与DNA靶序列结合。在间接结合的情况下，由另一个分子提供结合肽与DNA构建体之间的连接。所述分子同时与肽和DNA靶序列连接，所述分子例如将在下文中描述的双功能试剂。
合适的DNA构建体可包含其他序列，例如合适的启动子序列，以表达所编码的肽。
存在顺式活性的系统的一个例子是具有顺式作用的不相容群质粒的复制蛋白系统，所述复制蛋白称为repA。如下文所述，该系统的某些方面可用于本发明中。
许多质粒含有编码repA和顺式DNA元件的序列。本发明的DNA构建体中存在的repA序列和顺式DNA元件可以来自于相同的质粒株，也可以来自不同的质粒株。
据信repA顺式系统的作用如图1所示。简而言之，在转录的ρ依赖性终止之前，RNA聚合酶被5’顺式序列中的环所终止。这使repA肽的C末端暂时与CIS(顺式序列)相互作用，并可能导致DNA弯曲。然后repA肽结合于ori，而ori与repA编码序列的终止氨基酸具有确定的距离(Prazkier等，2000，《细菌学杂志(J.Bacteriology)》1823972～3980；Praszkier和Pittard，1999，J.Bacteriol.1812765～2772；Masai和Arai，1988，《核酸研究(Nucleic.Acids.Res.)》166493～6514)。
通过监测repA与经选定的顺式序列之间的相互作用，可以很容易地确定来自一个质粒的repA序列与来自另一质粒的顺式序列的相容性。
合适的repA蛋白和序列以及顺式DNA元件包括以下质粒的repA蛋白和序列以及顺式DNA元件，所述质粒为IncI复合物质粒，或者IncF、IncB、IncK、IncZ和IncL/M质粒，这些质粒在DNA水平上的相关性很远，但是均通过具有顺式作用的repA蛋白的作用来控制质粒的复制(Nikoletti等，1986，J.Bacteriol.1701311～1318；Prazkier J.等，1991，J.Bacteriol.1732393～2397)。可用于提供所述序列的具体质粒包括IncII不相容群的R1质粒和IncB质粒pMU720(在Praskier J.和Pittard J.，1999，《顺式序列在IncB质粒的复制中的作用(Role of CIS in replication of anIncB plasmid)》，J.Bacteriol.1812765～2772一文中有所描述)。来自于IncII群R1质粒的repA的DNA和氨基酸序列在SEQ ID No15和16中给出。来自于IncII群R1质粒的顺式DNA元件的DNA序列在SEQ IDNo17中给出。通常，顺式元件的长度为150～200个核苷酸。只要更长或更短的序列能够维持与repA相互作用的能力并展现顺式活性，则也可以使用这样的序列。也可以考虑诸如顺式序列中的替换或缺失等较小的变异，例如野生型顺式序列中1、5、10直至20个核苷酸的改变。
对于repA蛋白的顺式活性，需要所述的顺式元件(Praszkier和Pittard，1999，J.Bacteriol.1812765～2772)。因此，所述顺式DNA元件也应位于DNA构建体中编码repA序列的DNA的3’端。在到达顺式序列后RNA多聚酶将被终止，从而使所编码的蛋白质与DNA靶序列结合。
在本发明的一个实施方案中，DNA结合蛋白自身包含具有DNA结合能力的repA或其片段或变异体，所述repA或其片段或变异体包含能与顺式DNA元件结合的repA的至少20个C末端氨基酸。在该实施方案中，DNA靶序列包含ori序列，例如oriR序列。在本发明的另一个方面，DNA结合蛋白由另一个蛋白质提供，并在该序列中整合入被该结合蛋白识别的相关DNA靶序列。在所述各个实施方案中，DNA-蛋白质的结合为直接结合，其中由DNA构建体编码的肽直接与该编码DNA构建体结合。在本发明的其他方面中，也可通过使用肽标签-DNA标签、双功能试剂和/或合适的接头来实现DNA-蛋白质的间接结合，该间接结合将在下文详述。
因此，在一个方面，同一个序列可以同时提供能够结合DNA靶序列的肽和repA的C末端氨基酸。所述序列可以是或可以包含完整的repA序列，或者repA序列的片段或变异体，所述片段或变异体保留了与所使用的DNA靶序列相结合的能力。在repA作为DNA结合蛋白的情况下，对于顺式活性(cis)和DNA结合(ori)，同时需要cis和ori序列(Praszkier和Pittard，1999，J.Bacteriol.1812765～2772)。因此在此方面，DNA靶序列是ori序列，能与所述靶序列结合的肽或蛋白质是repA蛋白。ori在本发明DNA构建体中的位置可以变化。如上所述，合适的repA、cis和ori序列可由一个或一个以上的质粒提供。例如，合适的序列可来自于IncI复合物质粒，或IncF、IncB、IncK、IncZ和IncL/M质粒。来自于IncII群R1质粒的ori的DNA序列在SEQ ID NO18中给出。该序列或其片段可包含于本发明的DNA构建体之中。本发明的DNA构建体可包含完整的ori序列或其片段，该片段能被所用的repA蛋白结合。
只要RepA的变异体或片段保留了与所选定的ori序列结合的能力，则本发明所使用的repA蛋白也可包括repA的变异体或片段。所述repA的变异体或片段可以包括替换，例如替换repA序列中的1、2、3直至20个氨基酸，而只要所述变异体保留了与ori序列结合的能力即可。合适的repA片段是repA的ori结合序列。ori序列包括那些存在于如前所述的野生型质粒中的序列。通常，这样的ori序列的长度为170～220个核苷酸。只要野生型ori序列的片段或变异体保留了被repA识别的能力，则也可使用这样的ori序列。可以使用repA蛋白家族的其他顺式作用成员。例如，在范围广泛的宿主的质粒中发现了repA蛋白质家族，即一种repA质粒可以在不同种类的细菌中被发现。从例如嗜热的、嗜硫的、嗜盐的或嗜酸的细菌中分离repA家族质粒可以提供repA-cis-ori DNA，所述DNA可在升高的温度或极端的盐、pH或硫浓度条件下在本发明中使用。repA家族的所述成员对在该极端条件下能够与靶分子结合的文库成员进行分离时是有优势的。通过监测repA与ori序列之间的相互作用，可以容易地确定与选定repA蛋白联合使用的适当的ori序列。
因此，通过参考如图1所示的repA/cis/ori系统可以描述本发明的基本原理。图中显示了本发明的DNA构建体的一个例子。从5’端到3’端，所述构建体包含启动子序列、编码文库成员肽的序列、编码repA蛋白的序列、顺式(cis)DNA元件和ori序列。简单地说，DNA序列从启动子开始被RNA聚合酶转录成RNA。所述cis DNA元件中存在的p依赖性终止功能使RNA聚合酶在序列的这一部分停止。这使repA蛋白和文库肽得以被翻译。然后repA蛋白能够与ori序列结合，从而将编码生成的蛋白质与其编码DNA构建体连接。
在一个优选的实施方案中，文库成员DNA序列与IncFII质粒R1的repA、cis和ori DNA融合(Masai H.等，1983，Proc Natl Acad Sci USA806814～6818)。在该实施方案中，感兴趣的文库成员DNA序列可以通过编码柔性的氨基酸接头的DNA区域，在用于体外转录/翻译的合适启动子和翻译序列的控制下与repA DNA的5’末端连接。许多合适的启动子对本领域技术人员是已知的，例如araB、tac启动子，或T7、T3或SP6启动子等。所述启动子应位于待表达的多肽序列的上游。
此处示例性地所用了repA蛋白家族，而非限制于仅可使用该类蛋白。其他无关的非共价结合的顺式作用DNA结合蛋白也可用于本发明。
在另一个实施方案中，非顺式作用的DNA结合蛋白可被转化为具有顺式活性的蛋白质(见图2)。这一目的可通过将这些蛋白质与赋予它们顺式活性的序列联合使用来实现所述蛋白质能直接或间接结合DNA靶序列。通过在DNA构建体中包含指导顺式活性的DNA元件，顺式活性可被赋予正常情况下并无顺式作用的结合蛋白，所述DNA元件例如repA系统的顺式元件。包含所述元件是为了确保通过DNA结合蛋白的DNA的结合是顺式的，即编码生成的DNA结合蛋白会与转录和翻译该蛋白的DNA构建体结合。
因此，在一个实施方案中，合适的DNA构建体可包含指导顺式活性的DNA元件(顺式DNA元件)，该DNA元件来自于repA系统。所述元件可进一步包含编码repA的一部分C末端的DNA，优选为repA的C末端部分的至少20个氨基酸，更优选为30个氨基酸，直至40、50、60或70个氨基酸，其中，repA的所述片段具有与所述构建体中的DNA元件相互作用的能力。在进一步的实施例中，可将Tn5和IS903等转顺式作用转座酶用于本发明中(McFall E.J Bacteriol.1986年8月，167429～432；Derbyshire KM和Grindley ND.《分子微生物学(Mol Microbiol.)》1996年9月，11261-72)。编码本发明序列的DNA可包含编码所需repA片段的野生型序列、编码野生型repA片段的简并序列，或者编码所述repA片段变异体的序列，所述变异体保留了与整合入DNA构建体的顺式元件相互作用的能力。所述变异体可包括在所述repA的C末端的20个氨基酸中替换1、2、3或4个氨基酸的变异体。
此处所用的repA蛋白家族用作示例，而非限制于仅可使用该类蛋白。能够将顺式活性赋予无顺式作用的蛋白质的任何DNA元件均可用于本发明。
用所述方式可以转化任何无顺式作用的蛋白质。例如雌激素受体的DNA结合域(DBD)可被转化为顺式作用DNA结合蛋白，该例仅作为示例，并不排除其他可能的例子。雌激素受体的DNA结合域片段(氨基酸176～282)已在大肠杆菌中表达，并显示与特定双链DNA雌激素受体上的靶HRE(激素效应元件)核苷酸序列结合，所述结合具有与母体分子相似的亲和力(0.5 nM(纳摩尔))(Murdoch等，1990，《生物化学(Biochemistry)》298377～8385；Mader等，1993，《DNA研究(DNAsResearch)》211125～1132)。在一个实施方案中，将编码所述序列的DNA与以下DNA融合编码repA的至少最后20个氨基酸的DNA，顺式DNA元件，以及直至ori序列的DNA，所述ori序列的下游是雌激素受体上的靶识别序列(5’-TCAGG TCAGA GTGAC CTGAG CTAAA ATAACACATT CAG-3’，SEQ ID NO14)，该识别序列代替了repA的ori识别序列，上述融合均优选在编码所述序列DNA的3’末端融合。然后可通过编码柔性氨基酸接头的DNA区域，在用于体外转录/翻译的适当启动子和翻译序列的控制下，将感兴趣的DNA序列与雌激素受体DNA片段的5’端连接。表达所述多肽使雌激素受体的DBD结合于编码该多肽的DNA上的DBD靶序列上，所述靶序列代替了正常ori序列。然后通过用目标蛋白捕获的方式来分离蛋白质-DNA复合体。未结合的蛋白质-DNA复合体被洗去，使编码感兴趣的肽或蛋白质的DNA得到富集，进而这些DNA可以通过PCR进行回收，并且可以使用前述方法进行另几轮体外表达和蛋白质-DNA复合体捕获操作，以进一步富集感兴趣的DNA。
显然，可以简单地通过使用以下物质将上述方法用于其他DNA结合蛋白顺式DNA元件和编码repA的至少C末端20个氨基酸的序列，或来自于DNA构建体中不同顺式作用系统的对等元件。
在另一个实施方案中，将随机DNA结合蛋白文库用于筛选与感兴趣的靶序列的特异性结合(见图3)，所述随机DNA结合蛋白例如锌指蛋白、螺旋-环-螺旋蛋白或螺旋-转角-螺旋蛋白。在所述实施方案中，repA的ori识别序列可被感兴趣的靶序列所替代，大部分repA编码序列可被随机锌指蛋白文库所替代。因此在这一方面，所述DNA结合蛋白既作为文库成员肽，也作为能够结合DNA靶序列的蛋白质。编码每个锌指蛋白的DNA可另外在5’末端与肽标签序列连接，所述标签序列可被抗体等另一个捕获蛋白质所识别，也可在3’末端与以下DNA连接编码repA的至少最后20个氨基酸的DNA，顺式DNA元件，和直至ori序列的DNA，所述ori序列的下游是感兴趣的靶序列。表达所述多肽使锌指蛋白与编码所述多肽的DNA上的感兴趣的靶序列结合，所述感兴趣的靶序列替换了正常ori序列。只有在随机锌指结构域能够与感兴趣的序列结合的前提下，与靶序列的结合才会发生。然后，用通过结合蛋白捕获的方式将蛋白质-DNA复合体分离出来，所述结合蛋白识别融合蛋白多肽的N端的肽标签。未结合的DNA可被洗去，使编码锌指蛋白的DNA得到富集，所述锌指蛋白能够结合靶序列，这些编码锌指蛋白的DNA进而可以通过PCR回收，并且可以进行另几轮体外表达和蛋白质-DNA复合体捕获操作，以进一步得以富集。
如上文所述，在诸如DNA结合蛋白-靶序列配对的情况，结合肽可直接与DNA靶序列结合；或者诸如通过双功能试剂和选择性的DNA标签，结合肽可间接与DNA靶序列结合(见图4)。
在一个实施方案中，在用于体外转录/翻译的适当启动子和翻译序列的控制下，编码肽标签的DNA连接于感兴趣的文库成员DNA的5’末端，或选择性地通过编码柔性氨基酸接头的DNA区域来连接，所述肽标签无法直接与DNA靶序列结合。由于编码生成的肽间接连接于DNA靶序列，所以上述情况形成了编码结合肽的DNA。选择性地位于文库成员DNA序列3’末端的序列是编码repA的至少最后20个氨基酸的DNA，和顺式DNA元件，而不是repA的ori靶序列。所述DNA靶序列可以是或可以包含DNA标签。所述DNA标签可以是修饰后的单个碱基。例如，当制备含有所述元件的文库DNA构建体时，可以用例如荧光素或生物素的分子在对所述DNA的3’末端进行标记，该分子仅为举例，而不是用于限制该分子的范围。
在体外表达前，文库DNA片段可与双功能试剂混合，且DNA片段与双功能分子的混合比例是1∶1，所述试剂的一个功能是识别靶序列并与靶序列结合，所述靶序列位于DNA的5’末端。该双功能试剂的另一种功能元件是结合试剂，该结合试剂可以识别肽标签并与肽标签结合，所述肽标签在DNA片段的5’末端编码。所述双功能试剂可以包含识别DNA上的荧光素或生物素标签的一个Fab片段(抗原结合片段)和另一个识别在DNA中编码的肽标签的Fab片段，所述仅为举例，并不排除其他可能。本领域技术人员清楚地知道，所述双功能试剂可由许多不同的方法来制备，所述方法例如将两种元件化学交联、或将两种元件表达为融合蛋白、或双特异性抗体。所述制备双功能试剂的方法仅为举例，并不排除其他可能。
所述双功能试剂可在表达编码生成的肽之前结合于DNA构建体，或者表达期间提供。
然后，由DNA构建体转录和翻译融合蛋白，同时结合于双功能试剂。首先翻译肽标签，且在信使RNA或RNA聚合酶从DNA解离之前，所述肽标签可由双功能试剂的第二元件结合。该过程产生了功能性的蛋白质-DNA复合体，其中表达生成的多肽和编码该多肽的DNA均通过双功能试剂连接。因此，肽标签分子间接而特异地连接于DNA靶点(标签)上。通过所述方式将蛋白质和DNA构建体连接起来，有可能筛选出具有特定特性的蛋白质，进而鉴定与所述蛋白质连接的编码DNA，所述筛选蛋白质的过程将于下文描述。通过利用双功能试剂而不是蛋白质和DNA之间的共价结合，可以更容易地从蛋白质中分离出DNA构建体，而没有破坏DNA的风险。
随后通过目标蛋白质的捕获来分离蛋白质-DNA复合体。未结合的蛋白质-DNA复合体可被洗去，使编码感兴趣的肽或蛋白质的DNA得到富集，进而这些DNA可以通过PCR回收，并且可以使用前述方法进行另几轮体外表达和蛋白质-DNA复合体捕获操作，以进一步富集感兴趣的DNA。
此外，在这个实施方案中，DNA可与聚合物等双功能试剂直接结合，所述直接结合例如共价结合。所述聚合物可含有不止一个识别肽标签的结合元件，从而可以在一个单位中多价展示肽表达文库分子，所述单位含有编码所展示肽的DNA。所述聚合物可以包括聚乙烯和其他能够与DNA融合的多聚化合物，所述仅为举例，并非限制该多聚体的范围。因此本发明的DNA构建体可与所述双功能试剂或如上所述的DNA标签结合，该标签能够被所述双功能试剂结合。
在本发明的全部实施方案中，DNA构建体包含用于体外转录/翻译的适当启动子和翻译序列。任何合适的启动子均可使用，例如ara B、tac启动子、T7、T3或SP6启动子，或其他启动子。将启动子如此放置，使其可操作地连接于本发明DNA序列，使所述序列得以表达。
编码文库成员肽的DNA可由任何来源(sourcible)的方法制备。特别地，所述DNA可包括分离自cDNA的DNA，从DNA改组获得的DNA，和合成DNA。
DNA构建体也可编码经表达生成的融合蛋白中的氨基酸接头。特别地，可包含柔性氨基酸接头以将DNA结合肽/repA连接于文库成员肽上。
根据本发明，并参考这一优选的实施方案，可以制备肽或者蛋白质表达文库，该肽或蛋白质表达文库与编码它们的DNA连接，且通过以下步骤选择具有所需活性的肽构建融合蛋白文库通过编码柔性氨基酸接头的DNA区域，在适当的启动子的控制下，使用翻译或核糖体结合位点、起始和终止密码子，以适于体外表达肽文库成员和结合蛋白质的方式，将肽或蛋白质的DNA文库与编码肽的DNA融合，所述肽能够结合于DNA靶序列，例如顺式作用DNA结合蛋白的DNA。以repA蛋白为例，所述DNA(例如是DNA)文库成员与repA的DNA结合蛋白的DNA或其片段融合。cis序列和ori序列可包含于构建体中其他元件的下游。在DNA文库的情况下，将所述DNA构建体设计为适于体外转录和翻译。
DNA文库融合蛋白的表达和顺式结合为了允许产生顺式活性，可使用细菌的偶联转录/翻译环境，例如S30提取物系统(Zubay，0G.，1973，《遗传学年度综述(Ann.Rev.Genet.)》7267)。在同时存在cis序列和ori序列的条件下，在所述环境中表达DNA文库成员肽-repA融合蛋白等肽，将会使融合蛋白结合在编码该融合蛋白的DNA上。当肽-repA融合蛋白文库以该方式表达时，该过程产生了蛋白质-DNA复合体文库，其中结合于DNA的蛋白质由表达该蛋白质的DNA的片段编码，由此可以进行后续的对感兴趣的肽或蛋白质的选择和进行对编码所述肽的DNA的选择。该方法的体外特性增加了这些文库的复杂度，如果不是更大的文库，至少1010～1014个DNA片段的文库是容易制备的。
在转录/翻译反应和顺式结合过程中，可加入抑制核酸酶活性或减少非特异性DNA-蛋白质或蛋白质-蛋白质相互作用的化合物。合适的所述化合物的例子包括去污剂和封闭蛋白，后者例如牛血清白蛋白(BSA)。
选择感兴趣的肽由本发明方法制备的体外肽表达文库可用于筛选文库的特定成员。例如，文库可用于筛选具有特定活性或特定结合亲和力的肽。通过例如亲和力或活性富集技术，可从文库中筛选出感兴趣的蛋白质-DNA复合体。该目的可由感兴趣蛋白质的特异性配体实现，例如，如果感兴趣的蛋白质是抗体，则所述配体就是抗原。配体可存在于固相表面上，例如ELISA平板孔的表面，也可例如与生物素化的配体一起存在于溶液中，然后在蛋白质文库-DNA复合体与配体温育以产生配体-配体相互作用之后，生物素化的配体被链霉亲和素包被的表面或磁珠所捕获。在固相上或液体中进行温育之后，未结合的复合体被洗去，而结合的复合体通过以下方法分离得到改变孔中的pH以破坏配体-配体相互作用；或者其他本领域技术人员已知的方法，例如蛋白酶消化；或者通过加热或苯酚-氯仿抽提使repA-ori DNA的结合变性而使DNA直接从复合物中解离下来。DNA也可通过上述一种方法解离下来，直接放入PCR缓冲液中进行扩增。或者，可以在DNA没有从复合物中解离下来时直接进行PCR扩增。选择性地，例如，可以通过组蛋白等非特异性DNA结合蛋白，保护未被例如repA蛋白的蛋白质结合的DNA以防止降解。本领域技术人员应当知晓还有许多其他非特异性DNA结合蛋白可用于所述目的。进一步地，在选择过程中也可存在抑制核酸酶活性或者降低非特异性DNA-蛋白质或蛋白质-蛋白质相互作用的化合物。合适的所述化合物的例子包括去污剂、例如在奶粉或牛血清白蛋白(BSA)中发现的封闭蛋白质、肝素或金精三羧酸。
回收结合的复合体、再次扩增结合的DNA并重复所述选择过程可以使编码所需序列的克隆得到富集，而后可分离这些克隆用于测序、进一步克隆和/或表达。例如，编码感兴趣的肽的DNA可由例如PCR的方法进行分离和扩增。在一个实施方案中，可以使用连续巢式PCR引物来使重复数轮的选择过程和DNA回收更为便利。DNA末端通常在多次PCR步骤后会受到破坏。为了从该被破坏的分子中回收DNA，需要引物退火于DNA构建体末端以外的位置上，从而随着进行每轮选择连续缩短所述构建体。
在一个方面，可将DNA构建体和/或所编码的蛋白质设计为包含标签。这样的肽或DNA标签(例如上文所描述的)可用于隔离和分离感兴趣的文库成员。该标签也可用于在例如本发明所述的筛选方法所使用的固相支持物上固定文库成员。
因此，可以发现本发明的筛选方法可包括进一步的选择和分离相关文库成员肽的步骤，从而对显示所需特征的肽以及编码该肽的DNA进行鉴定和纯化。
因此，本发明包括由本发明的方法鉴定的肽和DNA。所述肽和DNA可被分离和/或纯化。可对本发明的方法分离的肽或DNA加以改造，例如缺失、增加或替换氨基酸或核苷酸。合适的经改造的肽或DNA在氨基酸或核苷酸序列上，可与由本发明方法分离的肽或DNA存在至少50％、至少75％、至少90％、至少90％或更多的同一性。出于运输和/或稳定的目的，可以对本发明方法鉴定的肽进行改造。例如，所述肽可被聚乙二醇化(与聚乙二醇结合)，以延长血清半寿期或防止蛋白酶的攻击。本发明方法鉴定的肽可在例如噬菌体展示等其他展示系统中加以改造，或通过合成和筛选肽变异体的方式加以改造。所述改造序列的集合可形成一个新的文库，该文库可被整合入本发明的构建体中，并进一步进行筛选以发现例如显示出与特定配体具有更优结合能力的变异序列。由此在一个实施方案中，在本发明方法中使用的肽文库可以是结构相关肽的文库。
或者，可以使用基本上随机的肽序列文库。在本实施方案中，可以筛选多种类型的与顺式作用DNA结合蛋白融合的肽文库，该肽文库包括(i)由合成的、长度可变的DNA编码的随机肽序列。
(ii)抗体或抗体片段，例如单链Fv抗体片段。所述单链Fv抗体片段由柔性接头肽将抗体重链和轻链的可变区结构域连接起来而组成，以产生单链抗原结合分子。
(iii)天然存在蛋白质的随机cDNA片段，所述蛋白质从含有感兴趣活性的细胞群中分离得到。
(iv)插入或替换已知蛋白质区域的随机肽序列，由此以所述已知蛋白质序列作为约束随机肽序列的骨架。许多所述蛋白支架已经被描述，例如CTLA-4(见专利WO 00/60070)已用作肽文库的支架，所述仅为举例，并非排除其他可能。
本发明的另一个实施方案涉及DNA文库的筛选方法，为了发挥活性，所述DNA文库成员需要超过一条链，例如，与配体结合需要多条抗体Fab片段。在该实施方案中，重链或轻链抗体DNA连接于编码DNA结合域的核苷酸序列上，所述DNA结合域例如repA的DNA结合域。未知抗体DNA文库的重链(VH和CH1)或轻链(VL和CL)基因序列通常插入到repA DNA的5’区域，该区域位于适当启动子和翻译序列的后方。由此，产生与DNA文库成员编码的蛋白质相融合的repA，并结合在编码该蛋白质的DNA上。编码轻链或重链蛋白的第二个已知链，可由以下两种情况分别进行表达(a)由相同的DNA片段表达，所述DNA片段含有repA和第一多肽融合蛋白文库，或(b)由不同的DNA片段表达，所述DNA片段存在于体外转录/翻译反应中。
已知链与未知融合蛋白文库有关，该文库与repA蛋白融合，由此能够与用于未知链的DNA结合。而后通过抗体特异性的配体，能够对功能性Fab文库进行选择。
使用本发明筛选方法鉴定的DNA可被克隆入载体中，所述DNA例如编码选定文库成员肽的DNA。在一个实施方案中，由本发明方法鉴定的DNA可操作地与控制序列连接，该控制序列可以由宿主细胞提供用于表达编码序列，即该载体是表达载体。术语“可操作地连接”指所描述的组分按某种关系并置，所述关系允许这些组分以其预定的方式发挥功能。将与编码序列“可操作地连接”的调节序列例如启动子以以下方式定位，以在与调节序列相容的条件下完成编码序列的表达。
所述表达载体按照分子生物学常规技术构建，例如可包括使用质粒DNA和合适的起始子、启动子、增强子和其他元件，所述其他元件例如多聚腺苷酸信号，该信号可能是必需的，且以正确的取向安置上，以允许蛋白质表达。其他合适的载体对本领域技术人员而言是显而易见的。其他这方面的例子可以参考Sambrook等在1989年编写的书籍。
所述载体例如可为质粒、病毒或噬菌体载体，均具有复制起点，选择性地具有用于表达所述DNA的启动子和选择性地具有该启动子的调节子。所述载体可含有一个或一个以上的可选择的标记基因，例如，用于细菌质粒的氨苄青霉素抗性基因，或用于真菌载体的抗性基因。载体可以用于体外操作，例如用于制备DNA或RNA，或用于转染或转化宿主细胞，所述宿主细胞例如哺乳动物宿主细胞。也可对所述载体进行改造以用于体内操作，例如基因治疗方法。
可以选择与宿主细胞相容的启动子和其他表达调节信号，表达是为所述宿主细胞而设计。例如，酵母启动子包括酿酒酵母(S.cerevisiae)GAL4和ADH启动子，裂殖酵母(S.pombe)的nmtl和adh启动子。哺乳动物启动子包括金属硫蛋白启动子，该启动子可被镉等重金属所诱导。也可使用SV40大T抗原启动子或腺病毒启动子等病毒启动子。所有上述启动子在本领域均易于获得。
也可使用β-肌动蛋白启动子等哺乳动物启动子。特别优选组织特异性启动子。也可使用病毒启动子，例如莫洛尼鼠白血病病毒的长末端重复(MMLV LTR)、rous肉瘤病毒(RSV)LTR启动子、SV40启动子、人巨细胞病毒(CMV)IE启动子、腺病毒、HSV(人单纯疱疹病毒)启动子(例如HSV IE启动子(立即早期启动子))或HPV(人乳头瘤病毒)启动子，尤其是HPV的上游调节区域(URR)。病毒启动子在本领域均易于获得。
所述载体可进一步包括侧接有感兴趣的多核苷酸的序列，从而产生包含以下序列的多核苷酸，所述序列为与真核基因组序列同源的序列，优选为与哺乳动物基因组序列或病毒基因组序列同源的序列。所述情况可使通过同源重组将本发明的多核苷酸引入真核细胞或病毒的基因组中。特别地，质粒载体可用于制备适于将本发明的多核苷酸转入哺乳动物细胞的病毒载体，该质粒载体所包含的表达盒位于病毒序列的旁侧。适当病毒载体的其他例子包括单纯疱疹病毒载体和逆转录病毒，所述逆转录病毒包括慢病毒、腺病毒、腺相关病毒和HPV病毒。使用所述病毒的基因转移技术为本领域中技术人员所知晓。例如，逆转录病毒载体可用于稳定地整合多核苷酸，从而使该多核苷酸整合入宿主基因组。与此相反，复制缺陷型腺病毒载体仍然是游离的，因而允许短暂表达。
通过标准结合检测可将所述表达载体用于鉴定感兴趣的配体，该配体即结合于肽文库成员的分子，所述检测例如为ELISA或酶检测分析，其中适当底物能够例如发生颜色改变、发光或产生荧光现象。可以使用其他可用的功能检测。
在另一个实施方案中，可将本发明方法鉴定的DNA克隆入非表达载体。所述载体可用于例如通过测序进一步表征该DNA。
或者可以不进行克隆而鉴定感兴趣的配体。合适方法的例子包括单个DNA序列的体外表达，该DNA序列由本发明的筛选方法回收得到；也包括对单个DNA进行测序，该DNA由所述筛选方法回收得到。所述单个DNA序列可选择性地加以扩增。
本发明还包括经改造以表达由本发明方法鉴定的肽的细胞，例如，通过将如上所述的表达载体引入细胞。所述细胞包括瞬时或优选稳定的高等真核细胞系，例如哺乳动物细胞或昆虫细胞，所述高等真核细胞系使用例如杆状病毒表达系统；低等真核细胞，例如酵母或诸如细菌细胞等原核细胞。所述细胞的具体例子可包括哺乳动物HEK293T、CHO、HeLa和COS细胞，其中，所述细胞通过插入对由本发明方法鉴定的肽进行编码的载体而进行了改造。优选所选定的细胞系不仅是稳定的，而且能够对肽进行成熟所需的糖基化和细胞表面表达。表达可以在转化的卵母细胞中进行。本发明的方法鉴定的肽可在转基因的非人类动物细胞中表达，所述动物优选为小鼠。本发明的方法鉴定的肽也可在光滑爪蟾(Xenopuslaevis)卵母细胞或黑素细胞中表达。
为了更彻底地理解本发明，现将参考附图更详尽地描述实施方案，但是所述实施方案仅为举例，不能用作对本发明范围的限制。
本发明一些实施方案的实施例如下。
材料与方法Sambrook，J.等，1989年出版的书(见上)中描述了当前申请人所使用的下列方法在琼脂糖凝胶上分析限制性内切酶的消化产物、使用苯苯酚/氯仿存储液纯化DNA、制备磷酸盐缓冲液。
常规试剂均购自SIGMA-Aldrich Ltd(Poole，多塞特，英国)。寡核苷酸购自SIGMA-Genosys Ltd(剑桥郡，英国)。氨基酸和S30提取物购自Promega Ltd(南安普敦，汉普郡，英国)。Deep Vent和Taq DNA多聚酶购自New England Biolabs(剑桥郡，英国)。Taqplus DNA多聚酶购自Stratagene Inc.(阿姆斯特丹，荷兰)。GeneClean DNA凝胶纯化试剂盒购自BIO101(La Jolla，加利福尼亚，美国)，抗人Igκ抗体购自Immunologicals Direct Ltd(牛津郡，英国)，抗c-myc多克隆抗体购自VectorLabs Inc(剑桥郡，英国)，抗V5抗体购自Abcam Ltd(剑桥郡，英国)。Superblock封闭试剂购自Perbio Science(柴郡，英国)。
实施例1.特异性顺式作用蛋白质-DNA复合体的分离通过PCR扩增依次把TAC启动子、c-myc表位、及人κ恒定区或V5表位中的一种插入到repA-CIS-ORI区域，制备体外表达构建体。所述构建体可由为本领域技术人员已知的多种方法来制备，例如，通过扩增不同的DNA片段，然后拼接PCR产物来制备。在本实施例中，初始扩增模板是R1质粒，该质粒含有repA-CIS-ORI区域(Masai，H.和Arai，K.(1988)，DNAs Res.16，6493～6514)。
(a)首轮扩增。从含有质粒R1的ECO K12菌株的单个菌落利用PCR扩增RepA-CIS-ORI区域，该反应体系为50μl，其中含有0.25mMdNTP(脱氧核苷三磷酸)，2.5单位Taqplus Precision DNA多聚酶，1×PCR反应缓冲液(Stratagene Inc，阿姆斯特丹，荷兰)，使用的引物REPAFOR(SEQ ID 01)和ORIREV(SEQ ID 02)均为12.5pmol(皮摩尔)。所述REPAFOR引物退火于repA编码区的5’末端。所述ORIREV引物退火于非编码ORI区的3’末端。
在Eppendorf Master循环仪上进行PCR反应，第一个循环的条件为94℃，4分15秒，之后30个循环的条件为94℃，45秒；60℃，45秒；72℃，45秒，随后进行72℃、10分钟的单循环。将反应产物在琼脂糖凝胶上电泳，切下所需产物，根据厂商说明书使用Geneclean II试剂盒(Bio101，La Jolla，加利福尼亚州，美国)将其从凝胶上纯化至40μl无菌水中。
(b)第二轮扩增。将1μl(500pg(皮克))稀释100倍的经凝胶纯化的首轮反应产物再次扩增，该反应体系为50μl，其中含有0.25mMdNTP，2.5单位Taqplus Precision DNA多聚酶，1×PCR反应缓冲液(Stratagene Inc，阿姆斯特丹，荷兰)，使用的引物CKREPFOR(SEQ ID 03)和ORIREV(SEQ ID 02)均为12.5pmol。所述CKREPFOR引物退火于首轮反应产物的5’末端，并附加有κ恒定区DNA的3’部分。所述ORIREV引物退火于首轮反应产物的3’末端。
在Eppendorf Master循环仪上进行PCR反应，第一个循环的条件为94℃，2分15秒，之后30个循环的条件为94℃，45秒；60℃，45秒；72℃，2分钟，随后进行72℃、10分钟的单循环。反应产物在琼脂糖凝胶上电泳，切下所需产物，根据厂商说明书使用Geneclean II试剂盒(Bio101，La Jolla，加利福尼亚州，美国)将其从凝胶上纯化至40μl无菌水中。
(c)第三轮扩增。将1μl(500pg)稀释100倍的经凝胶纯化的首轮反应产物再次扩增，反应体系为50μl，其中含有0.25mM dNTP，2.5单位Taqplus Precision DNA多聚酶，1×PCR反应缓冲液(Stratagene Inc，阿姆斯特丹，荷兰)，使用的引物V5REPFOR(SEQ ID 04)和ORIREV(SEQID 02)均为12.5pmol。所述V5REPFOR引物退火于首轮反应产物的5’末端，并附加有V5表位DNA的3’部分。所述ORIREV引物退火于首轮反应产物的3’末端。
在Eppendorf Master循环仪上进行PCR反应，第一个循环的条件为94℃，2分15秒，之后30个循环的条件为94℃，45秒；60℃，45秒；72℃，2分钟，随后进行72℃、10分钟的单循环。反应产物在琼脂糖凝胶上电泳，切下所需产物，根据厂商说明书使用Geneclean II试剂盒(Bio101，La Jolla，加利福尼亚州，美国)将其从凝胶上纯化至40μl无菌水中。
(d)第四轮扩增。将1μl(500pg)稀释100倍的pCKV5质粒进行扩增，反应体系为50μl，其中含有0.25mM dNTP，2.5单位TaqplusPrecision DNA多聚酶，1×PCR反应缓冲液(Stratagene Inc，阿姆斯特丹，荷兰)，使用的引物MYCCKFOR(SEQ ID 05)和CKREV(SEQ ID 06)均为12.5pmol。所述pCKV5质粒含有人κ恒定区cDNA(McGregor DP，MolloyPE，Cunningham C，和Harris WJ.1994《分子免疫学(Mol.Immunol.)》31219-26)和V5表位DNA(Southern JA，Young DF，Heaney F，BaumgartnerWK，Randall RE.1991《基因病毒学杂志(J.Gen.Virol.)》721551-7)。所述MYCCKFOR引物退火于κ恒定区DNA的5’末端，并附加有MYC表位DNA的3’部分。所述CKREV引物退火于κ恒定区DNA的3’末端。
在Eppendorf Master循环仪上进行PCR反应，第一个循环的条件为94℃，2分15秒，之后30个循环的条件为94℃，45秒；60℃，45秒；72℃，2分钟，随后进行72℃、10分钟的单循环。反应产物在琼脂糖凝胶上电泳，切下所需产物，根据厂商说明书使用Geneclean II试剂盒(Bio101，La Jolla，加利福尼亚州，美国)将其从凝胶上纯化至40μl无菌水中。
(e)第五轮扩增。将1μl(500pg)稀释100倍的pCKV5质粒进行扩增，反应体系为50μl，其中含有0.25mM dNTP，2.5单位TaqplusPrecision DNA多聚酶，1×PCR反应缓冲液(Stratagene Inc，阿姆斯特丹，荷兰)，使用的引物MYCV5FOR(SEQ ID 07)和V5REV(SEQ ID 08)均为12.5pmol。所述MYCV5FOR引物退火于V5表位DNA的5’末端，并附加有MYC表位DNA的3’部分。所述V5REV引物退火于V5表位DNA的3’末端。
在Eppendorf Master循环仪上进行PCR反应，第一个循环的条件为94℃，2分15秒，之后30个循环的条件为94℃，45秒；60℃，45秒；72℃，30秒，随后进行72℃、10分钟的单循环。反应产物在琼脂糖凝胶上电泳，切下所需产物，根据厂商说明书使用Geneclean II试剂盒(Bio101，La Jolla，加利福尼亚州，美国)将其从凝胶上纯化至40μl无菌水中。
(f)第六轮扩增。将1μl(500pg)稀释100倍的pTACP2A质粒(ref)进行扩增，反应体系为50μl，其中含有0.25mM dNTP，2.5单位TaqplusPrecision DNA多聚酶，1×PCR反应缓冲液(Stratagene Inc，阿姆斯特丹，荷兰)，所用的引物TAC3(SEQ ID 09)和MYCTACREV(SEQ ID 10)均为12.5pmol。所述TAC3引物退火于TAC启动子DNA的5’末端。所述MYCTACREV引物退火于TAC启动子DNA的3’末端，并附加有MYC表位DNA的5’部分。
在EppendorfMaster循环仪上进行PCR反应，第一个循环的条件为94℃，2分15秒，之后30个循环的条件为94℃，45秒；60℃，45秒；72℃，30秒，随后进行72℃、10分钟的单循环。反应产物在琼脂糖凝胶上电泳，切下所需产物，根据厂商说明书使用Geneclean II试剂盒(Bio101，La Jolla，加利福尼亚州，美国)将其从凝胶上纯化至40μl无菌水中。
(g)第一轮拼接PCR产物。对(f)和(d)的反应产物各1μl(50ng)进行扩增，反应体系为50μl，其中含有0.25mM dNTP，2.5单位TaqDeepVent DNA多聚酶混合物(20∶1)，1×PCR反应缓冲液(New EnglandBiolabs，Beverly，马萨诸塞州，美国)，使用的引物TAC5(SEQ ID 11)和CKREV(SEQ ID 06)均为50pmol。所述TAC5引物退火于(f)反应产物的5’末端，并加入了20个核苷酸。所述CKREV引物退火于(d)反应产物的3’末端。
在EppendorfMaster循环仪上进行PCR反应，第一个循环的条件为94℃，2分15秒，之后30个循环的条件为94℃，45秒；60℃，45秒；72℃，45秒，随后进行72℃、10分钟的单循环。反应产物在琼脂糖凝胶上电泳，切下所需产物，根据厂商说明书使用Geneclean II试剂盒(Bio101，La Jolla，加利福尼亚州，美国)将其从凝胶上纯化至40μl无菌水中。
(h)第二轮拼接PCR产物。对(f)和(e)的反应产物各1μl(50ng)进行扩增，反应条件为50μl反应体系，其中含有0.25mM dNTP，2.5单位TaqDeepVent DNA多聚酶混合物(20∶1)，1×PCR反应缓冲液(NewEngland Biolabs，Beverly，马萨诸塞州，美国)，使用的引物TAC5(SEQ ID11)和V5REV(SEQ ID 08)均为50pmol。所述TAC5引物退火于(f)反应产物的5’末端，并加入了20个核苷酸。所述V5REV引物退火于(e)反应产物的3’末端。
在Eppendorf Master循环仪上进行PCR反应，第一个循环的条件为94℃，2分15秒，之后30个循环的条件为94℃，45秒；60℃，45秒；72℃，45秒，随后进行72℃、10分钟的单循环。反应产物在琼脂糖凝胶上电泳，切下所需产物，根据厂商说明书使用Geneclean II试剂盒(Bio101，La Jolla，加利福尼亚州，美国)将其从凝胶上纯化至40μl无菌水中。
(i)第三轮拼接PCR产物。对(b)和(g)的反应产物各1μl(50ng)进行扩增，反应体系为50μl，其中含有0.25mM dNTP，2.5单位TaqDeepVent DNA多聚酶混合物(20∶1)，1×PCR反应缓冲液(New EnglandBiolabs，Beverly，马萨诸塞州，美国)，使用的引物TAC3(SEQ ID 09)和ORIREV(SEQ ID 02)均为50pmol。所述TAC3引物退火于(g)反应产物5’末端下游的20个核苷酸。所述ORIREV引物退火于(b)反应产物的3’末端。(i)的反应产物称为TAC-MYC-CK-REPA-CIS-ORI(SEQ ID 12)。
在Eppendorf Master循环仪上进行PCR反应，第一个循环的条件为94℃，2分15秒，之后30个循环的条件为94℃，45秒；60℃，45秒；72℃，1分钟，随后进行72℃、10分钟的单循环。反应产物在琼脂糖凝胶上电泳，切下所需产物，根据厂商说明书使用Geneclean II试剂盒(Bio101，La Jolla，加利福尼亚州，美国)将其从凝胶上纯化至40μl无菌水中。
(j)第四轮PCR产物拼接。对(b)和(h)的反应产物各1μl(50ng)进行扩增，反应体系为50μl，其中含有0.25mM dNTP，2.5单位TaqDeepVent DNA多聚酶混合物(20∶1)，1×PCR反应缓冲液(New EnglandBiolabs，Beverly，马萨诸塞州，美国)，所用的引物TAC3(SEQ ID 09)和ORIREV(SEQ ID 02)均为50pmol。所述TAC3引物退火于(g)反应产物5’末端下游的20个核苷酸。所述ORIREV引物退火于(b)反应产物的3’末端。(j)的反应产物称为TAC-MYC-V5-REPA-CIS-ORI(SEQ ID13)。
在Eppendorf Master循环仪上进行PCR反应，第一个循环的条件为94℃，2分15秒，之后30个循环的条件为94℃，45秒；60℃，45秒；72℃，1分钟，随后进行72℃、10分钟的单循环。反应产物在琼脂糖凝胶上电泳，切下所需产物，根据厂商说明书使用Geneclean II试剂盒(Bio101，La Jolla，加利福尼亚州，美国)将其从凝胶上纯化至40μl无菌水中。
体外转录/翻译反应的准备。将反应体系置于冰上，采用Promega的细菌线性模板S30偶联体外转录/翻译反应试剂盒进行反应，反应体系如下20μl TAC-MYC-CK-REPA-CIS-ORI模板(0.5μg最终构建体DNA，即上述SEQ ID 012)；20μl TAC-MYC-V5-REPA-CIS-ORI模板(0.5μg最终构建体DNA，即上述SEQ ID 013)；20μl完全氨基酸混合物(Promega)；80μl S30预混合液；60μl S30混合液；将反应体系在25℃反应30分钟后置于冰上，用封闭缓冲液(Superblock(Perbio Ltd)，0.1％Tween 20(吐温20)，200μg/ml鲱精DNA)稀释10倍。
DNA-蛋白质复合体的捕获。用每管内500μl PBS(磷酸缓冲盐溶液)中的10μg/ml的抗c-myc抗体、抗V5抗体或抗人κ链抗体包被NUNC star免疫管(immunotube)，4℃过夜。另一只空管作为阴性对照。将所述免疫管用PBS洗两次，用Superblock/PBS/0.1mg/ml鲱精DNA/0.1％Tween20在室温封闭1小时，再用PBS洗两次。将500μl稀释的转录/翻译反应体系加入各个管中，室温温育1小时。然后用PBS/0.1％Tween 20洗管5次，用2ml Superblock/PBS/0.1mg/ml鲱精DNA/0.1％Tween 20洗30分钟，再用PBS洗5次。用300μl T.E.缓冲液和300μl苯酚/氯仿振摇5分钟，以回收DNA。所述反应混合物以13,200g离心5分钟，用0.5倍体积的7.5M(摩尔每升)醋酸铵、20μg糖原和三倍体积的纯乙醇沉淀DNA。离心后，用70％乙醇洗涤沉淀，真空干燥，并重悬于20μl水中。使用引物TAC3(SEQ ID 09)和ORIREV(SEQ ID 02)，将10μl回收的DNA在50μl反应体系中再次扩增。反应产物在1％琼脂糖/TAE凝胶上进行电泳(图5)。
实施例2.repA-DNA复合体的分离将已在实施例1中描述的两个体外表达构建体(SEQ ID 12和SEQ ID13)用于针对如实施例1描述的抗人κ恒定区抗体的选择实验，不同之处是使用以下任意一种方法从repA回收和解离的DNA；甘氨酸、三乙胺、苯酚/氯仿、蛋白酶K和EDTA(乙二胺四乙酸)。所述方法描述如下。
甘氨酸将管用500μl的200mM甘氨酸和150mM NaCl(pH2.0)温育10分钟。然后将甘氨酸洗脱物转至新的eppendorf管中，并加入50μl的2M的Tris(pH8.5)。
三乙胺用500μl的0.1M三乙胺温育免疫管10分钟，然后将三乙胺洗脱物转至新的eppendorf管中，并加入250μl的1M Tris(pH7.4)。
苯酚/氯仿如实施例1所述。
蛋白酶K将管用500μl的100mM Tris(pH8.0)、10mM EDTA(pH8.0)和0.5％SDS(二十烷基磺酸钠)在37℃温育30分钟。将蛋白酶K洗脱物转至新的eppendorf管中。
EDTA将管用250μl的10mM Tris(pH8.0)、1mM EDTA、500mMNaCl和250μl苯酚/氯仿温育5分钟。然后将EDTA洗脱物转至新的eppendorf管中。
将回收后的DNA用苯酚/氯仿抽提，如果合适，随后再进行如实施例1所述的乙醇沉淀。将10μl重悬的DNA在50μl反应体系中再次扩增，使用TAC3(SEQ ID 09)和CISREV(SEQ ID 019)引物。CISREV引物退火于ORIREV(SEQ ID 02)结合位点上游的196个碱基处。反应产物在1％琼脂糖/TAE凝胶上电泳(数据未给出)。只有含有CK-DNA的构建体(SEQ ID 12)以大致的相当的量被扩增。
所述结果不仅证明上述用于从repA回收和解离DNA的方法均可使用，而且提示repA以非共价方式与其相应DNA相互作用。
实施例3.使用CIS展示技术在V5掺入(V5-spiking)实验中检测特异性抗V5结合物体外表达构建体通过在repA-CIS-ORI区域加入TAC启动子和V5表位或12聚体的NNB文库两者中的一种，由PCR扩增方法制备。所述构建体可由本领域技术人员已知的许多方法来制备，例如扩增DNA的不同片段后进行PCR产物拼接。在本实施例中，初始扩增模板是R1质粒，其含有repA-CIS-ORI区域(Masai，H.和Arai，K.(1988).Nucleic Acids Res.16，6493～6514)。
(a)首轮扩增。从含有质粒R1的ECO K12菌株的单个菌落中扩增RepA-CIS-ORI区域，反应体系为50μl，其中含有0.25mM dNTP，2.5单位TaqDeepVent DNA多聚酶混合物(20∶1)，1×PCR反应缓冲液(NewEngland Biolabs，Beverly，马萨诸塞州，美国)，所用的引物REPAFOR(SEQID 01)和ORIREV408(SEQ ID 20)均为12.5pmol。所述REPAFOR引物退火于repA编码区域的5’末端。所述ORIREV408引物退火于非编码ORI区域3’末端的下游。
在Eppendorf Master循环仪上进行PCR反应，第一个循环的条件为94℃，4分30秒，之后25个循环的条件为94℃，30秒；60℃，45秒；72℃，1分钟，随后进行72℃、10分钟的单循环。反应产物在琼脂糖凝胶上电泳，切下所需产物，根据厂商说明书使用Geneclean II试剂盒(Bio101，La Jolla，加利福尼亚州，美国)将其从凝胶上纯化至40μl无菌水中。
(b)第二轮扩增。将1μl(500pg)100倍稀释的经凝胶纯化的首轮反应产物再次扩增，反应体系为50μl，其中含有0.25mM dNTP，2.5单位TaqDeepVent DNA多聚酶混合物(20∶1)，1×PCR反应缓冲液(NewEngland Biolabs，Beverly，马萨诸塞州，美国)，所用的引物V5(NNB)REPFOR(SEQ ID 21)和ORIREV408(SEQ ID 20)均为12.5pmol。所述V5(NNB)REPFOR引物退火于首轮反应产物的5’末端，并附加有V5表位DNA。所述ORIREV408引物退火于首轮反应产物的3’末端。
在Eppendorf Master循环仪上进行PCR反应，第一个循环的条件为94℃，4分30秒，之后25个循环的条件为94℃，30秒；60℃，45秒；72℃，1分钟，随后进行72℃、10分钟的单循环。反应产物在琼脂糖凝胶上电泳，切下所需产物，根据厂商说明书使用Geneclean II试剂盒(Bio101，La Jolla，加利福尼亚州，美国)将其从凝胶上纯化至40μl无菌水中。
(c)第三轮扩增。将1μl(500pg)100倍稀释的经凝胶纯化的首轮反应产物再次扩增，反应体系为50μl，其中含有0.25mM dNTP，2.5单位TaqDeepVent DNA多聚酶混合物(20∶1)，1×PCR反应缓冲液(NewEngland Biolabs，Beverly，马萨诸塞州，美国)，所用的引物NNBREPFOR(SEQ ID 22)和ORIREV408(SEQ ID 20)均为12.5pmol。所述NNBREPFOR引物退火于首轮反应产物的5’末端，并附加有一个随机12聚体NNB文库DNA。所述ORIREV408引物退火于首轮反应产物的3’末端。
在Eppendorf Master循环仪上进行PCR反应，第一个循环的条件为94℃，4分30秒，之后25个循环的条件为94℃，30秒；60℃，45秒；72℃，1分钟，随后进行72℃、10分钟的单循环。反应产物在琼脂糖凝胶上电泳，切下所需产物，根据厂商说明书使用Geneclean II试剂盒(Bio101，La Jolla，加利福尼亚州，美国)将其从凝胶上纯化至40μl无菌水中。
(d)第四轮扩增。将1μl(500pg)100倍稀释的pTACP2A质粒(ref)扩增，反应体系为50μl，其中含有0.25mM dNTP，2.5单位TaqDeepVentDNA多聚酶混合物(20∶1)，1×PCR反应缓冲液(New England Biolabs，Beverly，马萨诸塞州，美国)，所用的引物TACFARUP(SEQ ID 23)和TACREV(SEQ ID 27)均为12.5pmol。所述TACFARUP引物退火于TAC启动子DNA的5’末端。所述TACREV引物退火于TAC启动子DNA的3’末端。
在Eppendorf Master循环仪上进行PCR反应，第一个循环的条件为94℃，1分45秒，之后25个循环的条件为94℃，15秒；60℃，30秒；72℃，30秒，随后进行72℃、10分钟的单循环。反应产物在琼脂糖凝胶上电泳，切下所需产物，根据厂商说明书使用Geneclean II试剂盒(Bio101，La Jolla，加利福尼亚州，美国)将其从凝胶上纯化至40μl无菌水中。
(e)第一轮PCR产物拼接。对(b)和(d)的反应产物各1μl(50ng)进行扩增，反应体系为50μl，其中含有0.25mM dNTP，2.5单位TaqDeepVent DNA多聚酶混合物(20∶1)，1×PCR反应缓冲液(New EnglandBiolabs，Beverly，马萨诸塞州，美国)，所用的引物TACFARUP(SEQ ID 23)和ORIREV408(SEQ ID 20)均为50pmol。所述TACFARUP引物退火于(d)反应产物的5’末端。所述ORIREV480引物退火于(b)反应产物的3’末端。(e)的反应产物称为TAC-V5-REPA-CIS-ORI-408(SEQ ID 24)。
在Eppendorf Master循环仪上进行PCR反应，第一个循环的条件为94℃，1分45秒，之后25个循环的条件为94℃，15秒；60℃，30秒；72℃，1分30秒，随后进行72℃、10分钟的单循环。反应产物在琼脂糖凝胶上电泳，切下所需产物，根据厂商说明书使用Geneclean II试剂盒(Bio101，La Jolla，加利福尼亚州，美国)将其从凝胶上纯化至40μl无菌水中。
(f)第二轮PCR产物拼接。对(c)和(d)的反应产物各1μl(50ng)进行扩增，反应体系为50μl，其中含有0.25mM dNTP，2.5单位TaqDeepVent DNA多聚酶混合物(20∶1)，1×PCR反应缓冲液(New EnglandBiolabs，Beverly，马萨诸塞州，美国)，所用的引物TACFARUP(SEQ ID 23)和ORIREV408(SEQ ID 20)均为50pmol。所述TACFARUP引物退火于(d)反应产物的5’末端。所述ORIREV480引物退火于(c)反应产物的3’末端。
在Eppendorf Master循环仪上进行PCR反应，第一个循环的条件为94℃，1分45秒，之后25个循环的条件为94℃，15秒；60℃，30秒；72℃，1分30秒，随后进行72℃、10分钟的单循环。反应产物在琼脂糖凝胶上电泳，切下所需产物，根据厂商说明书使用Geneclean II试剂盒(Bio101，La Jolla，加利福尼亚州，美国)将其从凝胶上纯化至40μl无菌水中。(f)的反应产物称为TAC-NNB-REPA-CIS-ORI-408(SEQ ID 25)。
体外转录/翻译反应的准备。将反应体系置于冰上，使用Promega的细菌线性模板S30偶联体外转录/翻译反应试剂盒进行反应，所述反应体系如下20μl 5000倍稀释的TAC-V5-REPA-CIS-ORI-408模板(0.1ng的最终构建体DNA，如上所述SEQ ID 24)20μl 5 TAC-NNB-REPA-CIS-ORI-408模板(0.5μg最终构建体DNA，如上所述SEQ ID 25)20μl完全氨基酸混合物(Promega)80μlS30预混合液
60μl S30混合液将所述反应体系在25℃继续进行30分钟后置于冰上，用2％Marvel/PBS稀释10倍。
DNA-蛋白质复合体的捕获。用溶于500μl PBS的10μg/ml的抗V5抗体包被NUNC star免疫管，4℃过夜。另一只空管留作阴性对照。所述免疫管用PBS洗两次，用封闭缓冲液(2％Marvel，0.1％Tween 20，0.1mg/ml鲱精DNA)室温封闭1小时，再用PBS洗两次。将1ml稀释的转录/翻译反应体系加入各个管中，室温温育1小时。然后用PBS/0.1％Tween20洗管5次，再用PBS洗5次。用500μl TE缓冲液和500μl苯酚/氯仿回收DNA。所述反应混合物以13,200g离心5分钟，用0.1倍体积的3M(摩尔每升)醋酸钠、50μg/ml糖原和2倍体积的纯乙醇沉淀DNA。离心后，用70％乙醇洗涤沉淀，真空干燥，并重悬于40μl水中。使用生物素化的bTAC6(SEQ ID 26)和bCISREV(SEQ ID 19)引物，将20μl回收的DNA在50μl反应体系中再次扩增。将反应产物在1％琼脂糖/TAE凝胶上进行电泳。
将回收的DNA克隆入表达载体pDMG-K(SEQ ID 27)中。根据厂商说明书使用QIAquick Gelextracation试剂盒(QIAGEN Ltd，West Sussex，英国)对所述反应产物进行凝胶纯化并用50μl无菌水洗脱。将纯化的反应产物和质粒pDMG-K均用20单位的NcoI和NotI(New England Biolabs，Beverly，马萨诸塞州，美国)消化。根据厂商说明书(QIAGEN Ltd，WestSussex，英国)使用QIAquick Gelextracation试剂盒对所述酶切质粒进行凝胶纯化，然后用0.01单位的牛小肠碱性磷酸酶(Promega，南安普敦，英国)处理，再进行如上所述的苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀。将沉淀DNA溶解于20μl水中。在1×TBS(Tris缓冲盐溶液)、0.3mg/ml BSA、0.1％Tween20的溶液中把经酶切的PCR产物转至链霉亲和素包被的小条上(RocheDiagnostics Ltd，East Sussex，英国)，并且室温振荡温育30分钟。所述操作去除了PCR产物NcoI和NotI位点上下游的生物素化的旁侧DNA，从而能够回收含有所选肽序列的小DNA片段。采用如上所述的苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀方法处理上清。将沉淀DNA溶解于10μl水中。根据厂商说明书使用Quick连接试剂盒(New England Biolabs，Beverly，马萨诸塞州，美国)将酶切质粒和含有所选肽序列的分离后的小DNA片段相连，所述两者均具有NcoI和NotI突出端，然后进行如上所述的苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀。将沉淀DNA溶解于10μl水中后，按照厂商说明书(Stratagene，美国)将所述DNA电激转化入电感受态TG1细胞中，并在2×TY、100μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖的平板上进行选择。
所选克隆的抗V5抗体ELISA筛选。挑选88个克隆放入400μl的2×TY、2％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的培养液中，于37℃、300rpm(转每分钟)振荡培养过夜。将50μl过夜培养物转入1ml的2×TY、2％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的培养液中，于37℃、300rpm振荡培养至OD为0.5。然后以1000g将所述细胞离心10分钟。弃上清，将沉淀重悬于600μl的2×TY、0.4M蔗糖、100μg/ml氨苄青霉素和1mM IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)的培养液中，以37℃、300rpm培养4小时。诱导后，将所述细胞以1000g离心10分钟。将150μl上清用于ELISA试验。用1×PBS配制的100μl的1μg/ml抗人κ区抗体或抗V5抗体溶液或50μg/ml的BSA，室温包被NUNC Maxisorp板7小时。另一块板留作空白，仅包被PBS。将孔用PBS冲洗2次，然后用1×PBS配制的300μl的4％Marvel、0.1％Tween室温封闭1小时。将孔用PBS冲洗2次，再在孔中加入150μl上清和用1×PBS配制的150μl的4％Marvel、0.1％Tween 20，室温温育1小时。然后将孔用PBS、0.1％Tween 20清洗2次，再用PBS清洗2次。偶联有辣根过氧化物酶(HRP)的抗人κ区抗体(终浓度为1.6μg/ml)在1×PBS中配制的4％Marvel、0.1％Tween 20中稀释500倍，然后加入孔中，室温温育1小时。将孔用PBS、0.1％Tween 20清洗4次，再用PBS清洗2次。加入200μl的TMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)底物以检测HRP信号。用100μl的0.5M硫酸终止反应。在450nm处读取吸收值。根据抗人κ区抗体筛选的克隆的HRP信号进行评价，88个克隆中的35个表达良好。所述35个克隆中的7个显示其能够特异性结合于抗V5抗体，因此V5肽从5000个中有1个富集到5个中有1个，即富集因子为1000(图6)。
实施例4.针对枯草芽孢杆菌(Bacillus globigii)的CIS展示文库的构建、选择和筛选文库构建为了创建文库DNA，首先必需构建启动子文库DNA片段和repA-CIS-ori片段，然后通过消化-连接作用将其连接起来。本实施例中使用来自P2A-HA载体的tac启动子，但是也可以使用许多可获得的启动子，所述启动子为本领域技术人员所熟知。初始repA-CIS-ori和TAC片段的PCR产物，分别附加有Bsp120I位点和随机文库/NotI位点。制备2种主要混合物使用10μl 1∶50稀释的P2A-HA质粒DNA(25ng/反应)进行20次PCR扩增，每次反应体系的体积为50μl，含有200μM dNTP，1×NEB多聚酶扩增缓冲液(10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，20mM Tris-HCl pH8.8，2mM MgSO4，0.1％TritonX-100)，均为10pmol的TACFARUP(SEQ ID 23)和NTERM18MER(SEQ ID 28)引物，2单位的Taq DNA多聚酶∶DeepVent DNA多聚酶为20∶1的混合物(NEB)，反应条件为94℃，40秒；60℃，40秒；72℃，60秒的25个循环，然后在72℃延伸5分钟。将20μl反应产物在1％琼脂糖/TAE凝胶中电泳并照相，剩余产物用Qiagen柱纯化至200μl水中。
使用10μl Bsp120I校正的Rep-CIS-ori DNA(50ng/反应)进行10次PCR扩增，每次反应体系的体积为50μl，含有200μM dNTP，1×NEB多聚酶扩增缓冲液(10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，20mM Tris-HCl pH8.8，2mM MgSO4，0.1％TritonX-100)，均为10pmol的BSPREPAFOR(SEQ ID 29)和ORIREV(SEQ ID 02)引物，2单位的Taq DNA多聚酶∶Deep Vent DNA多聚酶为20∶1的混合物(NEB)，反应条件为94℃，40秒；60℃，40秒；72℃，90秒的30个循环，然后72℃延伸5分钟。将20μl反应产物在1％琼脂糖/TAE凝胶中电泳并照相，剩余产物用Qiagen柱纯化至120μl水中。
然后用10μl NotI(NEB)(100u(单位))消化文库-TAC产物，消化条件为300μl反应体积、37℃温育1小时，再用Qiagen柱纯化至120μl的水中。所述两种产物由以下条件的限制性酶切-连接作用而连接起来

使所述反应在37℃进行2小时。从反应产物中取20μl利用凝胶电泳进行评估，取30μl直接进行10次50μl反应体系的PCR扩增，剩余产物经凝胶纯化后切下文库条带，用Qiagen柱纯化，再以TACFAR4(SEQID 30)和ORIREV(SEQ ID 02)为引物进行20次50μl反应体系的PCR扩增，条件为94℃，40秒；60℃，40秒；72℃，90秒的30个循环，而后在72℃延伸5分钟。在4个Qiagen柱中凝胶纯化DNA，汇集200μl洗脱物以进行ITT(体外转录/翻译)反应/选择。
第一轮选择准备2个200μl的ITT反应体系，室温温育1小时，所述反应体系如下

将1ml封闭缓冲液加入到各个反应体系中(封闭缓冲液为用TBS配制的4％Marvel，100μg/ml经剪切的鲑精DNA，0.1％Tween 20，2.5mg/ml肝素)，10,000g离心2分钟，转入新的管中后置于冰上。
将100μl枯草芽孢杆菌(Bg)的孢子悬液用1ml TBS/0.1％Tween 20洗涤2次，然后重悬于100μl封闭缓冲液中。将其再加入封闭缓冲液中，在搅拌下在室温结合1小时。
将上述混合物以16,100g离心1分钟，在离心前通过用移液管混合并用涡旋的方式，将孢子沉淀用1ml的TBS/0.1％Tween 20洗涤6次。最后用1ml TBS洗涤所述沉淀，并弃上清。
在搅拌器上通过在120μl 0.5M醋酸钠(pH5.5)中对所述孢子温育10分钟，以洗提DNA。将所述孢子在16,100g离心1分钟，上清用120μl Tris(pH8.0)中和，然后以16,100g离心5分钟进行苯酚/氯仿抽提。用20μg载体糖原和2.5倍体积乙醇沉淀DNA。以16,100g离心20分钟来使DNA沉淀，再用0.75ml 70％乙醇将沉淀洗涤3次，每次洗涤之间以16,100g离心3分钟，然后在空气中干燥，并重悬于20μl水中。
将10μl回收的DNA在10个50μl反应体系中进行PCR扩增，引物为CISREV(SEQ ID 19)和TACFAR5(SEQ ID 31)，使用2单位的Taq DNA多聚酶∶Deep Vent DNA多聚酶为20∶1的混合物(NEB)，反应条件为94℃，40秒；60℃，40秒；72℃，90秒的30个循环，而后在72℃延伸5分钟。对DNA进行纯化、乙醇沉淀，并重悬于10μl水中。5μl产物以上述条件进一步进行PCR扩增，但是使用的引物改为NOTRECREV2(SEQ ID 32)和TACFAR5(SEQ ID 31)，扩增10个循环。该产物用QiagenPCR纯化试剂盒纯化，并洗脱入50μl 5mM Tris(pH8.0)中。
限制性酶切-连接该反应在30μl的体系中在37℃进行1小时，以再次将repA-CIS-oriDNA与所回收的肽结合，以进行另一轮选择。

将20μl所述反应产物在10个50μl反应体系中直接进行PCR扩增，以TACFAR5.1(SEQ ID 33)和ORIREV(SEQ ID 02)为引物，反应条件为94℃，40秒；60℃，40秒；72℃，90秒的20个循环，而后在72℃延伸5分钟。在1个Qiagen柱中凝胶纯化DNA，将洗脱物用于第二轮ITT反应/选择(第二轮中使用58μl)。
第二轮用如第一轮所述方法进行第二轮选择，其中更改如下所使用的加入DNA约为3μg。封闭缓冲液为用TBS配制的2％牛血清白蛋白、1％明胶、100μg/ml经剪切的鲑精DNA、2.5mg/ml肝素。每次选择时使用10μl经洗涤的孢子。使用TACFAR5.2(SEQ ID 34)和NOTRECREV2(SEQID 32)引物回收PCR产物。最后，使用TACFAR5.2(SEQ ID 34)和ORIREV(SEQ ID 02)引物拼接(pull through)PCR产物，进行10个循环。
第三轮用如第二轮所述方法进行第三轮选择，其中更改如下所使用的加入DNA约为2.5μg。使用TACFAR6(SEQ ID 35)和NOTRECREV2(SEQID 32)引物回收PCR产物。最后，使用TACFAR6(SEQ ID 35)和ORIREV(SEQ ID 02)引物拼接PCR产物，进行10个循环。
第四轮用如第三轮所述方法进行第四轮选择，不同之处是选择过程中所使用的加入DNA约为2μg。使用TAC3(SEQ ID 09)和NOTRECREV2(SEQ ID 32)引物回收PCR产物。最后，使用TAC3(SEQ ID 09)和ORIREV(SEQ ID 02)引物拼接PCR，进行10个循环。
第五轮用如第四轮所述方法进行第五轮选择。
为了克隆出NcoI-NotI片段，使用生物素化的TAC6(SEQ ID 26)引物和NOTRECREV2(SEQ ID 32)引物对储存的从第五轮选择回收的DNA进行PCR扩增。用NotI消化后用Qiagen PCR纯化试剂盒纯化，用NcoI消化后在包被有链霉亲和素的平板上温育。在苯酚/氯仿纯化和乙醇沉淀后，将消化后的DNA连接入用相似方法消化的pVIII噬菌粒载体中，并转化入ER2738大肠杆菌中，然后涂于含2％葡萄糖、2×TY、100μg/ml氨苄青霉素的平板上，在37℃温育过夜(o/n)。
挑选单个菌落放入96孔板中的200μl的含2％葡萄糖、2×TY、100μg/ml氨苄青霉素的培养液里，以37℃/200rpm振荡培养6小时。然后，将其中100μl转移至深孔板，每孔含有100μl的2％葡萄糖、2×TY、100μg/ml氨苄青霉素和10μl M13K07辅助噬菌体，在37℃不加振荡温育1小时。每孔加入500μl含有2×TY、100μg/ml氨苄青霉素/25μg/ml卡那霉素/20μM IPTG的培养液，在37℃/200rpm振荡温育过夜。
ELISA筛选将圆底96孔板用以TBS配制的4％Marvel和以PBS配制的0.1％Tween 20室温封闭1小时。取出噬菌体培养物，以3000g离心5分钟，用ELISA检测噬菌体上清。在每个孔中，将50μl噬菌体上清与5μl Bg孢子混合于50μl的用TBS配制的4％牛血清白蛋白、1％明胶中，室温振荡温育1小时。用200μl TBS/0.1％Tween20洗涤所述孔5次，每次洗涤之间以3000g离心5分钟，然后与偶联有辣根过氧化物酶的抗M13抗体温育，所述抗体以0.2μg/ml的浓度溶于用TBS配制的4％牛血清白蛋白、1％明胶溶液中。于室温振荡温育所述孢子1小时。将孔用TBS/0.1％Tween20清洗5次后，将孢子转入新平板中。在用TMB底物显色之前，用上述TBS将所述孢子洗涤1次。用0.5M的H2SO4使显色反应终止，然后将所述溶液转入新的平底平板中，用于在450nm处读数。选择得到的肽的结合数据见图7。
实施例5.针对抗V5抗体的CIS展示文库的构建、选择和筛选采用如实施例4所述的方法进行文库构建。
第一轮选择配制1个200μl的体外转录/翻译(ITT)反应体系，如实施例4所述在室温温育1小时。将1ml封闭缓冲液(封闭缓冲液是TBS配制的5％脱脂奶粉，100μg/ml经剪切的鲑精DNA，2.5mg/ml肝素)加入各个反应体系中，然后置于冰上。
在第一轮文库筛选中，用1ml PBS配制的10μg/ml多克隆抗V5肽抗体(Harlan-Seralab)于37℃包被70×11mm的NUNC Maxisorp免疫管(LifeTechnologies，Paisley，英国苏格兰)1小时。用PBS洗管3次(注满再倾空)后，用3ml封闭缓冲液于37℃封闭1小时，再以如前方法洗管。加入含有文库蛋白-DNA复合体的缓冲液，室温静置温育1小时。用PBS/0.1％Tween 20洗管5次，再仅用PBS进一步洗管5次。
在血液混合器上将DNA洗脱入500μl 1M的醋酸钠(pH5.2)中，洗脱时间为10分钟，再用100μl 1M的Tris-HCl(pH8.0)中和，然后用苯酚/氯仿在16,100g下抽提5分钟。以20μg载体糖原、0.5倍体积7.5M醋酸铵和3倍体积乙醇沉淀DNA。以16,100g离心20分钟来使DNA沉淀，用0.5ml的70％乙醇在16,100g将沉淀洗涤5分钟，然后真空干燥，并重悬于20μl水中。
在1个50μl反应体系中对10μl回收的DNA进行PCR扩增，引物为NOT1RECREV2(SEQ ID 32)和TACFAR4(SEQ ID 30)，使用2单位的Taq DNA多聚酶∶Deep Vent DNA多聚酶为20∶1的混合物(NEB)，反应条件为94℃，40秒；60℃，40秒；72℃，90秒的30个循环，之后在72℃延伸5分钟。将50μl反应产物在1％琼脂糖/TAE凝胶上电泳并照相，然后用GeneClean纯化至10μl水中。将所述DNA再连接于RepA DNA，并采用如实施例4第二轮所述的方法再次扩增，所使用的引物为TACFAR5(SEQ ID 31)和ORIREV(SEQ ID 02)。
采用第一轮的方法进行第二轮选择，使用与实施例4所述相同的引物对，变更如下将抗V5抗体的包被浓度减至5μg/ml。加入DNA约为4μg。采用第二轮的方法进行第三轮选择，变更如下所使用的加入DNA约为4μg。使用TACFAR5.1(SEQ ID 33)和NOTRECREV2(SEQ ID 32)引物回收PCR产物。最后，使用TACFAR6(SEQ ID 35)和ORIREV(SEQID 02)引物拼接PCR，进行10个循环。采用第三轮的方法进行第四轮选择。
为了克隆出NcoI-NotI片段，用生物素化的TAC6(SEQ ID 26)和NOTIREPRECREV2(SEQ ID 32)引物对所储存的从第四轮选择回收的DNA进行PCR扩增，并克隆入pVIII噬菌粒载体，然后电激转化入电感受态TG-1大肠杆菌，所述过程如实施例4所述。
挑选单个菌落放入96孔板上的200μl的含2％葡萄糖、2×TY、100μg/ml氨苄青霉素的培养液中，以37℃/200rpm振荡培养6小时。将其中100μl转至深孔平板，每孔含有2％葡萄糖、2×TY、100μg/ml氨苄青霉素和109kru M13K07辅助噬菌体的培养液100μl，于37℃不加振荡地温育1小时。每孔加入400μl含有2×TY、100μg/ml氨苄青霉素/25μg/ml卡那霉素/20μM IPTG的培养液，将噬菌体在37℃以200rpm振荡持续扩增16小时。然后，将细菌培养物在微量滴定板载体中以4℃、2000g的条件在台式离心机中离心10分钟，以分离沉淀的细菌和用于ELISA检测的培养物上清。
于37℃用100μl/孔PBS中的100ng/孔的抗V5肽抗体包被NUNCMaxisorp ELISA板1小时。每孔用200μl的PBS洗2次，然后在37℃每孔用200μl的2％BSA/PBS封闭1小时，再用200μl/每孔的PBS洗2次。每孔加入50μl噬菌体培养物上清，室温结合1小时，所述每孔中含有50μl的4％BSA/PBS。每孔用200μl的PBS/0.1％Tween 20洗2次，再用200μl的PBS洗2次。向每孔加入100μl的2％BSA/PBS，其中含有1∶5000稀释的结合有HRP的抗M13抗体(Amersham-Pharmacia)，室温温育1小时，以检测结合的噬菌体，再用上述方法洗板4次。每孔加入100μl的TMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)底物缓冲液，室温显色5分钟。然后加入100μl/孔的0.5N(当量)H2SO4以终止反应，并在450nm处读数。使用标准pUC正向测序引物和反向测序引物，对ELISA阳性克隆的噬菌粒DNA进行测序。所述分离得到克隆的氨基酸序列在下文中给出。取4个ELISA阳性克隆使其在10ml培养液中生长，然后用PEG-NaCl沉淀噬菌体颗粒，并重悬于1ml的PBS中，取其中50μl用上述方法再次进行ELISA检测。图8显示了针对抗V5抗体和作为对照的抗ACTH(促肾上腺皮质激素)肽抗体在450nm处的OD信号。
选择后分离得到的肽序列如下P1C12(SEQ ID 36)C G C P T M A A R V R P V L N S K HP2H1(SEQ ID 37) M T T V P V L M I S VP1B5(SEQ ID 38) T L S T R H H N V I D R F N L R N FP2B8(SEQ ID 39) S I R T L T G S T P A Q F D A T A D实施例6.从CIS展示文库中选择卵清蛋白结合肽对于任何选择技术而言，重要的是在选择和筛选过程中，使被选择的实体能够与选择所针对的靶点结合，且不依赖于与其有关的载体分子。在本实施例中，选择和合成一些选定肽，以确保与靶点的结合。如实施例3所述，构建由12个氨基酸组成的肽的随机文库。使用100μg/ml卵清蛋白(SIGMA，Dorset，英国)包被的免疫管，进行如实施例4所述的四轮选择。
为了克隆出NcoI-NotI片段，采用生物素化的TAC6(SEQ ID 26)和NOTIREPRECREV2(SEQ ID 32)引物，对第四轮选择中回收的DNA进行PCR扩增，并将此PCR产物克隆入pVIII噬菌粒载体，电激转化入电感受态TG-1大肠杆菌中，上述过程如实施例4所述。
挑出单个菌落放入96孔板上的200μl含2％葡萄糖、2×TY、100μg/ml氨苄青霉素的培养液中，以37℃/200rpm振荡培养6小时。将其中100μl转到深孔平板，每孔含有2％葡萄糖、2×TY、100μg/ml氨苄青霉素和109kru M13K07辅助噬菌体的培养液100μl，于37℃不加振荡地培养1小时。每孔加入400μl含有2×TY、100μg/ml氨苄青霉素/25μg/ml卡那霉素/20μM IPTG的培养液，将噬菌体在37℃以200rpm振荡持续扩增16小时。然后，将细菌培养物在微量滴定板载体中以4℃、2000g的条件在台式离心机中离心10分钟，以分离沉淀的细菌和用于ELISA检测的培养物上清。
用100μl/孔PBS中100μg/孔的卵清蛋白包被NUNC MaxisorpELISA板，4℃过夜。每孔用200μl PBS洗2次，然后在37℃用200μl的2％BSA/PBS封闭1小时，再用200μl/孔PBS洗2次。每孔加入50μl噬菌体培养物上清，室温结合1小时，所述每孔中含有50μl 4％BSA/PBS。每孔用200μl PBS/0.1％Tween 20洗2次，再用200μl PBS洗2次。每孔加入100μl的2％BSA/PBS，其中含有1∶5000稀释的偶联有HRP的抗M13抗体(Amersham-Phamacia)，室温温育1小时，以检测结合的噬菌体，再用上述方法洗板4次。每孔加入100μl TMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)底物缓冲液，室温显色5分钟。然后每孔加入100μl 0.5N(当量)H2SO4以终止反应，并在450nm处读数。使用M13REV引物，对ELISA阳性克隆的噬菌粒DNA测序。从这些克隆分离得到的肽序列如下C1(SEQ ID 40)A N L W R I V L H G W WC4(SEQ ID 41)V S F M L L G P H R H RC6(SEQ ID 42)L V L H W L S L G S RC8(SEQ ID 43)S N Q V V L I L H L R P对照(SEQ ID 44) A E S W L H Q S W I H L合成了4个具有代表性来自的ELISA阳性克隆的肽序列(SIGMA-Genosys Ltd)，并在其C末端加入生物素，以有助于ELISA检测。与先前针对枯草芽孢杆菌的孢子由噬菌体展示选择方法分离得到的、作为对照的肽一起，针对卵清蛋白对所述肽进行了ELISA检测。用以下物质包被NUNC Maxisorp ELISA平板，4℃过夜，所述物质为每孔100μlPBS中的100μg卵清蛋白或PBS中的200ng抗V5多克隆抗体。用200μlPBS冲洗每孔2次，每孔以200μl PBS配制的2％脱脂奶粉于37℃封闭1小时，再用200μl PBS冲洗2次。在含有100μl 2％BSA/PBS的孔中加入1μg稀释的肽，室温结合1小时。用200μl PBS/0.1％Tween20将各孔冲洗2次，再用200μl PBS冲洗2次。在每孔中加入100μl的2％BSA/PBS，其中含有1∶2000稀释的偶联有HRP的链霉亲和素(Pierce)，室温温育1小时，以检测结合的肽，用上述方法冲洗平板4次。每孔加入100μl TMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)底物缓冲液，室温显色5分钟。然后加入100μl 0.5N的H2SO4以终止反应，并在450nm处读数(图9)。
实施例7.在CIS展示系统中展示单链Fv抗体(scFv)片段基本上如实施例1所述，由PCR重叠延伸方法构建tac-scFv-repA-CIS-ori构建体。在50μl反应体系中扩增抗2甲4氯丙酸scFvDNA(Haptogen Ltd，阿伯丁，英国)，该反应体系中含有200μM dNTP、1×NEB多聚酶扩增缓冲液(10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，20mMTris-HCl pH8.8，2mM MgSO4，0.1％TritonX-100)、浓度均为10pmol的TACMECOFOR(SEQ ID 45)和REPAMECOBAK(SEQ ID 46)引物和2单位的Taq DNA多聚酶∶Deep Vent DNA多聚酶为20∶1的混合物(NEB)，反应条件为94℃，40秒；60℃，40秒；72℃，80秒的30个循环，之后在72℃延伸5分钟。将所述PCR产物在1％琼脂糖/TAE凝胶上电泳，用Geneclean II试剂盒纯化至20μl水中。将该产物在50μl的反应体系中与RepA-CIS-ori DNA和Tac启动子DNA组装，所述RepA-CIS-ori DNA由ORIREV408(SEQ ID 20)和MECOREPAFOR(SEQ ID 47)制备而成，所述Tac启动子DNA由TACFARUP(SEQ ID 23)和MECOTACBAK(SEQ ID48)制备而成，所述反应体系含有200μM dNTP、1×NEB多聚酶扩增缓冲液(10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，20mM Tris-HCl pH8.8，2mM MgSO4，0.1％TritonX-100(曲通X-100))、浓度均为10pmol的TAC3(SEQ ID 09)和ORIREV(SEQ ID 02)引物和2单位的Taq DNA多聚酶∶Deep VentDNA多聚酶为20∶1的混合物(NEB)，反应条件为94℃，40秒；60℃，40秒；72℃，80秒的30个循环，之后在72℃延伸5分钟。所述PCR产物在1％琼脂糖/TAE凝胶上电泳，用Geneclean II试剂盒纯化至20μl水中。
所述DNA再次以50μl体系扩增10次，反应体系中含有200μMdNTP、1×NEB多聚酶扩增缓冲液(10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，20mMTris-HCl pH8.8，2mM MgSO4，0.1％ TritonX-100)、浓度均为10pmol的TAC3(SEQ ID 09)和ORIREV(SEQ ID 02)引物和2单位的Taq DNA多聚酶∶Deep Vent DNA多聚酶为20∶1的混合物(NEB)，反应条件为94C，40秒；60℃，40秒；72℃，80秒的30个循环，之后在72℃延伸5分钟。所述PCR产物在1％琼脂糖/TAE凝胶上电泳，用Geneclean II试剂盒纯化至100μl水中。
然后，将scFv DNA在下述两个反应条件中进行翻译

将上述体系在30℃温育30分钟，然后在反应2中加入1μl的0.25M氧化型谷胱甘肽，继续在30℃再温育30分钟。在每个反应体系中加入1ml封闭缓冲液(封闭缓冲液为用TBS配制的1％明胶，100μg/ml经剪切的鲑精DNA，2.5mg/ml肝素)，用10,000g离心2分钟，然后置于冰上。
使用0.5ml用PBS配制的10μg/ml的BSA-2甲4氯丙酸偶联物或10μg/ml BSA在37℃包被NUNC star免疫管1小时。用PBS洗管2次，在血液混合器上用3ml封闭缓冲液于室温封闭1小时，再用PBS洗管2次。
将稀释的ITT各0.5ml加入到已封闭的BSA包被的或BSA-2甲4氯丙酸包被的管中，于室温温育1小时。然后所述管用TBS/0.1％Tween 20洗5次，用TBS洗5次。
将结合的DNA用0.5ml的0.5M NaCl/10mM Tris(pH8)、1mMEDTA(乙二胺四乙酸)于室温洗脱10分钟，然后用0.5ml苯酚/氯仿抽提，用20μg载体糖原、0.5倍体积7.5M醋酸铵和3倍体积乙醇沉淀。以14,000g离心20分钟来使DNA沉淀，用0.5ml 70％乙醇以14,000g漂洗沉淀5分钟，然后真空干燥、并重悬于20μl水中。
将10μl回收的DNA以50μl反应体系进行PCR扩增，所述反应体系含有200μM dNTP、1×NEB多聚酶扩增缓冲液(10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，20mM Tris-HCl pH8.8，2mM MgSO4，0.1％TritonX-100)、浓度均为10pmol的TACMECOFOR(SEQ ID 45)和REPAMECOBAK(SEQID 46)引物和2单位的Taq DNA多聚酶∶Deep Vent DNA多聚酶为20∶1的混合物(NEB)，反应条件为94℃，40秒；60℃，40秒；72℃，80秒的30个循环，之后在72℃延伸5分钟。所述反应产物在1％琼脂糖/TAE凝胶上电泳并照相。观察到由抗体靶点选择回收得到的DNA量比由BSA包被的管回收的DNA多，该现象提示选择得到了功能性scFv-repA-DNA复合体(图10)。
序列表<110>伊索杰尼卡有限公司<120>体外肽表达文库<130>FCI05GB0365<150>GB 0220759.5<151>2002-09-06<150>GB 0304521.8<151>2003-02-27<150>GB 0304657.0<151>2003-02-28<160>48<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>1actgatcttc accaaacgta tta 23<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>引物<400>10attcagatcc tcttctgaga tgagtttttg ttcctcgagc atggtagatc ctgtttcc58<210>11<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>11cgatacctag cgttcggatc catattgtcg ttagaacgcg gc 42<210>12<211>1788<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA构建体<400>12catattgtcg ttagaacgcg gctacaatta atacataacc ttatgtatca tacacatacg 60atttaggtga cactatagaa tacaagctta ctccccatcc ccctgttgac aattaatcat 120ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acaggatcta 180ccatgctcga ggaacaaaaa ctcatctcag aagaggatct gaatggggga ggagggtcca 240ctgtggctgc accatctgtc ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa 300ctgcctctgt tgtgtgcctg ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga 360aggtggataa cgccctccaa tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca 420aggacagcac ctacagcctc agcaacaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac 480acaaagtcta cgcctgcgaa gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct 540tcaacagggg agggggagga ggatcaactg atcttcacca aacgtattac cgccaggtaa 600agaacccgaa tccggtgttc actccccgtg aaggtgccgg aacgccgaag ttccgcgaaa 660aaccgatgga aaaggcggtg ggcctcacct cccgttttga tttcgccatt catgtggcgc 720atgcccgttc ccgtggtctg cgtcggcgca tgccaccggt gctgcgtcga cgggctattg 780atgcgctgct gcaggggctg tgtttccact atgacccgct ggccaaccgc gtccagtgtt 840ccatcaccac actggccatt gagtgcggac tggcgacaga gtccggtgca ggaaaactct 900ccatcacccg tgccacccgg gccctgacgt tcctgtcaga gctgggactg attacctacc 960agacggaata tgacccgctt atcgggtgct acattccgac cgacatcacg ttcacactgg1020ctctgtttgc tgcccttgat gtgtctgagg atgcagtggc agctgcgcgc cgcagtcgtg1080ttgaatggga aaacaaacag cgcaaaaagc aggggctgga taccctgggt atggatgagc1140tgatagcgaa agcctggcgt tttgtgcgtg agcgtttccg cagttaccag acagagcttc1200agtcccgtgg aataaaacgt gcccgtgcgc gtcgtgatgc gaacagagaa cgtcaggata1260tcgtcaccct agtgaaacgg cagctgacgc gtgaaatctc ggaaggacgc ttcactgcta1320atggtgaggc ggtaaaacgc gaagtggagc gtcgtgtgaa ggagcgcatg attctgtcac1380gtaaccgcaa ttacagccgg ctggccacag cttctccctg aaagtgatct cctcagaata1440atccggcctg cgccggaggc atccgcacgc ctgaagcccg ccggtgcaca aaaaaacagc1500gtcgcatgca aaaaacaatc tcatcatcca ccttctggag catccgattc cccctgtttt1560taatacaaaa tacgcctcag cgacggggaa ttttgcttat ccacatttaa ctgcaaggga1620cttccccata aggttacaac cgttcatgtc ataaagcgcc agccgccagt cttacagggt1680gcaatgtatc ttttaaacac ctgtttatat ctcctttaaa ctacttaatt acattcattt1740aaaaagaaaa cctattcact gcctgtcctg tggacagaca gatatgca 1788<210>13<211>1518
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA构建体<400>13catattgtcg ttagaacgcg gctacaatta atacataacc ttatgtatca tacacatacg 60atttaggtga cactatagaa tacaagctta ctccccatcc ccctgttgac aattaatcat 120ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acaggatcta 180ccatgctcga ggaacaaaaa ctcatctcag aagaggatct gaatggggga ggagggtccg 240gaaaacctat cccaaaccct ctcctaggac tggattcaac ggggggagga ggatcaactg 300atcttcacca aacgtattac cgccaggtaa agaacccgaa tccggtgttc actccccgtg 360aaggtgccgg aacgccgaag ttccgcgaaa aaccgatgga aaaggcggtg ggcctcacct 420cccgttttga tttcgccatt catgtggcgc atgcccgttc ccgtggtctg cgtcggcgca 480tgccaccggt gctgcgtcga cgggctattg atgcgctgct gcaggggctg tgtttccact 540atgacccgct ggccaaccgc gtccagtgtt ccatcaccac actggccatt gagtgcggac 600tggcgacaga gtccggtgca ggaaaactct ccatcacccg tgccacccgg gccctgacgt 660tcctgtcaga gctgggactg attacctacc agacggaata tgacccgctt atcgggtgct 720acattccgac cgacatcacg ttcacactgg ctctgtttgc tgcccttgat gtgtctgagg 780atgcagtggc agctgcgcgc cgcagtcgtg ttgaatggga aaacaaacag cgcaaaaagc 840aggggctgga taccctgggt atggatgagc tgatagcgaa agcctggcgt tttgtgcgtg 900agcgtttccg cagttaccag acagagcttc agtcccgtgg aataaaacgt gcccgtgcgc 960gtcgtgatgc gaacagagaa cgtcaggata tcgtcaccct agtgaaacgg cagctgacgc1020gtgaaatctc ggaaggacgc ttcactgcta atggtgaggc ggtaaaacgc gaagtggagc1080gtcgtgtgaa ggagcgcatg attctgtcac gtaaccgcaa ttacagccgg ctggccacag1140cttctccctg aaagtgatct cctcagaata atccggcctg cgccggaggc atccgcacgc1200ctgaagcccg ccggtgcaca aaaaaacagc gtcgcatgca aaaaacaatc tcatcatcca1260ccttctggag catccgattc cccctgtttt taatacaaaa tacgcctcag cgacggggaa1320ttttgcttat ccacatttaa ctgcaaggga cttccccata aggttacaac cgttcatgtc1380ataaagcgcc agccgccagt cttacagggt gcaatgtatc ttttaaacac ctgtttatat1440ctcctttaaa ctacttaatt acattcattt aaaaagaaaa cctattcact gcctgtcctg1500tggacagaca gatatgca 1518<210>14<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>雌激素受体上的靶识别序列<400>14tcaggtcaga gtgacctgag ctaaaataac acattcag 38<210>15
<211>828<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>repA序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(828)<223>
<400>15atg gta aag aac ccg aat ccg gtg ttc act ccc cgt gaa ggt gcc gga 48Met Val Lys Asn Pro Asn Pro Val Phe Thr Pro Arg Glu Gly Ala Gly1 5 10 15acg ccg aag ttc cgc gaa aaa ccg atg gaa aag gcg gtg ggc ctc acc 96Thr Pro Lys Phe Arg Glu Lys Pro Met Glu Lys Ala Val Gly Leu Thr20 25 30tcc cgt ttt gat ttc gcc att cat gtg gcg cat gcc cgt tcc cgt ggt144Ser Arg Phe Asp Phe Ala Ile His Val Ala His Ala Arg Ser Arg Gly35 40 45ctg cgt cgg cgc atg cca ccg gtg ctg cgt cga cgg gct att gat gcg192Leu Arg Arg Arg Met Pro Pro Val Leu Arg Arg Arg Ala Ile Asp Ala50 55 60ctg ctg cag ggg ctg tgt ttc cac tat gac ccg ctg gcc aac cgc gtc240Leu Leu Gln Gly Leu Cys Phe His Tyr Asp Pro Leu Ala Asn Arg Val65 70 75 80cag tgt tcc atc acc aca ctg gcc att gag tgc gga ctg gcg aca gag288Gln Cys Ser Ile Thr Thr Leu Ala Ile Glu Cys Gly Leu Ala Thr Glu85 90 95tcc ggt gca gga aaa ctc tcc atc acc cgt gcc acc cgg gcc ctg acg336Ser Gly Ala Gly Lys Leu Ser Ile Thr Arg Ala Thr Arg Ala Leu Thr100 105 110ttc ctg tca gag ctg gga ctg att acc tac cag acg gaa tat gac ccg384Phe Leu Ser Glu Leu Gly Leu Ile Thr Tyr Gln Thr Glu Tyr Asp Pro115 120 125ctt atc ggg tgc tac att ccg acc gac atc acg ttc aca ctg gct ctg432Leu Ile Gly Cys Tyr Ile Pro Thr Asp Ile Thr Phe Thr Leu Ala Leu130 135 140
ttt gct gcc ctt gat gtg tct gag gat gca gtg gca gct gcg cgc cgc480Phe Ala Ala Leu Asp Val Ser Glu Asp Ala Val Ala Ala Ala Arg Arg145 150 155 160agt cgt gtt gaa tgg gaa aac aaa cag cgc aaa aag cag ggg ctg gat528Ser Arg Val Glu Trp Glu Asn Lys Gln Arg Lys Lys Gln Gly Leu Asp165 170 175acc ctg ggt atg gat gag ctg ata gcg aaa gcc tgg cgt ttt gtg cgt576Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Ile Ala Lys Ala Trp Arg Phe Val Arg180 185 190gag cgt ttc cgc agt tac cag aca gag ctt cag tcc cgt gga ata aaa624Glu Arg Phe Arg Ser Tyr Gln Thr Glu Leu Gln Ser Arg Gly Ile Lys195 200 205cgt gcc cgt gcg cgt cgt gat gcg aac aga gaa cgt cag gat atc gtc672Arg Ala Arg Ala Arg Arg Asp Ala Asn Arg Glu Arg Gln Asp Ile Val210 215 220acc cta gtg aaa cgg cag ctg acg cgt gaa atc tcg gaa gga cgc ttc720Thr Leu Val Lys Arg Gln Leu Thr Arg Glu Ile Ser Glu Gly Arg Phe225 230 235 240act gct aat ggt gag gcg gta aaa cgc gaa gtg gag cgt cgt gtg aag768Thr Ala Asn Gly Glu Ala Val Lys Arg Glu Val Glu Arg Arg Val Lys245 250 255gag cgc atg att ctg tca cgt aac cgc aat tac agc cgg ctg gcc aca816Glu Arg Met Ile Leu Ser Arg Asn Arg Asn Tyr Ser Arg Leu Ala Thr260 265 270gct tct ccc tga828Ala Ser Pro275<210>16<211>275<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>repA序列<400>16Met Val Lys Asn Pro Asn Pro Val Phe Thr Pro Arg Glu Gly Ala Gly1 5 10 15
Thr Pro Lys Phe Arg Glu Lys Pro Met Glu Lys Ala Val Gly Leu Thr20 25 30Ser Arg Phe Asp Phe Ala Ile His Val Ala His Ala Arg Ser Arg Gly35 40 45Leu Arg Arg Arg Met Pro Pro Val Leu Arg Arg Arg Ala Ile Asp Ala50 55 60Leu Leu Gln Gly Leu Cys Phe His Tyr Asp Pro Leu Ala Asn Arg Val65 70 75 80Gln Cys Ser Ile Thr Thr Leu Ala Ile Glu Cys Gly Leu Ala Thr Glu85 90 95Ser Gly Ala Gly Lys Leu Ser Ile Thr Arg Ala Thr Arg Ala Leu Thr100 105 110Phe Leu Ser Glu Leu Gly Leu Ile Thr Tyr Gln Thr Glu Tyr Asp Pro115 120 125Leu Ile Gly Cys Tyr Ile Pro Thr Asp Ile Thr Phe Thr Leu Ala Leu130 135 140Phe Ala Ala Leu Asp Val Ser Glu Asp Ala Val Ala Ala Ala Arg Arg145 150 155 160Ser Arg Val Glu Trp Glu Asn Lys Gln Arg Lys Lys Gln Gly Leu Asp165 170 175Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Ile Ala Lys Ala Trp Arg Phe Val Arg180 185 190Glu Arg Phe Arg Ser Tyr Gln Thr Glu Leu Gln Ser Arg Gly Ile Lys195 200 205Arg Ala Arg Ala Arg Arg Asp Ala Asn Arg Glu Arg Gln Asp Ile Val210 215 220Thr Leu Val Lys Arg Gln Leu Thr Arg Glu Ile Ser Glu Gly Arg Phe225 230 235 240Thr Ala Asn Gly Glu Ala Val Lys Arg Glu Val Glu Arg Arg Val Lys245 250 255Glu Arg Met Ile Leu Ser Arg Asn Arg Asn Tyr Ser Arg Leu Ala Thr260 265 270
Ala Ser Pro275<210>17<211>172<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CIS DNA元件<400>17aagtgatctc ctcagaataa tccggcctgc gccggaggca tccgcacgcc tgaagcccgc 60cggtgcacaa aaaaacagcg tcgcatgcaa aaaacaatct catcatccac cttctggagc120atccgattcc ccctgttttt aatacaaaat acgcctcagc gacggggaat tt172<210>18<211>195<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>ori序列<400>18tgcttatcca catttaactg caagggactt ccccataagg ttacaaccgt tcatgtcata 60aagcgccagc cgccagtctt acagggtgca atgtatcttt taaacacctg tttatatctc 120ctttaaacta cttaattaca ttcatttaaa aagaaaacct attcactgcc tgtcctgtgg 180acagacagat atgca 195<210>19<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>19aattccccgt cgctgaggcg 20<210>20<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物<400>20cgtaagccgg tactgattga 20<210>21<211>110<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>21cacaggaaac aggatctacc atggccggaa aacctatccc aaaccctctc ctaggactgg 60attcaacggg gggaggagga tcagcggccg caactgatct tcaccaaacg 110<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<220>
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<221>misc_feature<222>(32)..(33)<223>n＝a，g，c或t<220>
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<220>
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<221>mi sc_feature<222>(56)..(57)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(59)..(60)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(62)..(63)<223>n＝a，g，c或t<400>22cacacaggaa acaggatcta ccatggccnn bnnbnnbnnb nnbnnbnnbn nbnnbnnbnn 60bnnbggggga ggaggatcag cggccgcaac tgatcttcac caaacg 106<210>23<211>20<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>引物<400>23cagttgatcg gcgcgagatt 20<210>24<211>2390<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TAC-V5-REPA-CIS-ORI-408构建体<400>24cagttgatcg gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc gacggcgcgt gcagggccag 60actggaggtg gcaacgccaa tcagcaacga ctgtttgccc gccagttgtt gtgccacgcg 120gttgggaatg taattcagct ccgccatcgc cgcttccact ttttcccgcg ttttcgcaga 180aacgtggctg gcctggttca ccacgcggga aacggtctga taagagacac cggcatactc 240tgcgacatcg tataacgtta ctggtttcac attcaccacc ctgaattgac tctcttccgg 300gcgctatcat gccataccgc gaaaggtttt gcaccattcg gctagcgatg accctgctga 360ttggttcgct gaccatttcc ggggtgcgga acggcgttac cagaaactca gaaggttcgt 420ccaaccaaac cgactctgac ggcagtttac gagagagatg atagggtctg cttcagtaag 480ccagatgcta cacaattagg cttgtacata ttgtcgttag aacgcggcta caattaatac 540ataaccttat gtatcataca catacgattt aggtgacact atagaataca agcttactcc 600ccatccccct gttgacaatt aatcatggct cgtataatgt gtggaattgt gagcggataa 660caatttcaca caggaaacag gatctaccat ggccggaaaa cctatcccaa accctctcct 720aggactggat tcaacggggg gaggaggatc agcggccgca actgatcttc accaaacgta 780ttaccgccag gtaaagaacc cgaatccggt gtttacaccc cgtgaaggtg caggaacgct 840gaagttctgc gaaaaactga tggaaaaggc ggtgggcttc acttcccgtt ttgatttcgc 900cattcatgtg gcgcatgccc gttcgcgtgg tctgcgtcga cgcatgccac cagtgctgcg 960tcgacgggct attgatgcgc tcctgcaggg gctgtgtttc cactatgacc cgctggccaa1020ccgcgtccag tgctccatca ccacgctggc cattgagtgc ggactggcga cggagtctgc1080tgccggaaaa ctctccatca cccgtgccac ccgggccctg acgttcctgt cagagctggg1140actgattacc taccagacgg aatatgaccc gcttatcggg tgctacattc cgaccgatat1200cacgttcaca tctgcactgt ttgctgccct cgatgtatca gaggaggcag tggccgccgc1260gcgccgcagc cgtgtggtat gggaaaacaa acaacgcaaa aagcaggggc tggataccct1320gggcatggat gaactgatag cgaaagcctg gcgttttgtt cgtgagcgtt ttcgcagtta1380tcagacagag cttaagtccc ggggaataaa gcgtgcccgt gcgcgtcgtg atgcggacag1440ggaacgtcag gatattgtca ccctggtgaa acggcagctg acgcgcgaaa tcgcggaagg1500gcgcttcact gccaatcgtg aggcggtaaa acgcgaagtt gagcgtcgtg tgaaggagcg1560catgattctg tcacgtaacc gtaattacag ccggctggcc acagcttccc cctgaaagtg1620acctcctctg aataatccgg cctgcgccgg aggcttccgc acgtctgaag cccgacagcg1680cacaaaaaat cagcaccaca tacaaaaaac aacctcatca tccagcttct ggtgcatccg1740gccccccctg ttttcgatac aaaacacgcc tcacagacgg ggaattttgc ttatccacat1800taaactgcaa gggacttccc cataaggtta caaccgttca tgtcataaag cgccatccgc1860
cagcgttaca gggtgcaatg tatcttttaa acacctgttt atatctcctt taaactactt 1920aattacattc atttaaaaag aaaacctatt cactgcctgt cctgtggaca gacagatatg 1980cacctcccac cgcaagcggc gggcccctac cggagccgct ttagttacaa cactcagaca 2040caaccaccag aaaaaccccg gtccagcgca gaactgaaac cacaaagccc ctccctcata 2100actgaaaagc ggccccgccc cggcccgaag ggccggaaca gagtcgcttt taattatgaa 2160tgttgtaact acttcatcat cgctgtcagt cttctcgctg gaagttctca gtacacgctc 2220gtaagcggcc ctgacggccc gctaacgcgg agatacgccc cgacttcggg taaaccctcg 2280tcgggaccac tccgaccgcg cacagaagct ctctcatggc tgaaagcggg tatggtctgg 2340cagggctggg gatgggtaag gtgaaatcta tcaatcagta ccggcttacg 2390<210>25<211>2384<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TAC-NNB-REPA-CIS-ORI-408构建体<220>
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<220>
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aaaactctcc atcacccgtg ccacccgggc cctgacgttc ctgtcagagc tgggactgat 1140tacctaccag acggaatatg acccgcttat cgggtgctac attccgaccg atatcacgtt 1200cacatctgca ctgtttgctg ccctcgatgt atcagaggag gcagtggccg ccgcgcgccg 1260cagccgtgtg gtatgggaaa acaaacaacg caaaaagcag gggctggata ccctgggcat 1320ggatgaactg atagcgaaag cctggcgttt tgttcgtgag cgttttcgca gttatcagac 1380agagcttaag tcccggggaa taaagcgtgc ccgtgcgcgt cgtgatgcgg acagggaacg 1440tcaggatatt gtcaccctgg tgaaacggca gctgacgcgc gaaatcgcgg aagggcgctt 1500cactgccaat cgtgaggcgg taaaacgcga agttgagcgt cgtgtgaagg agcgcatgat 1560tctgtcacgt aaccgtaatt acagccggct ggccacagct tccccctgaa agtgacctcc 1620tctgaataat ccggcctgcg ccggaggctt ccgcacgtct gaagcccgac agcgcacaaa 1680aaatcagcac cacatacaaa aaacaacctc atcatccagc ttctggtgca tccggccccc 1740cctgttttcg atacaaaaca cgcctcacag acggggaatt ttgcttatcc acattaaact 1800gcaagggact tccccataag gttacaaccg ttcatgtcat aaagcgccat ccgccagcgt 1860tacagggtgc aatgtatctt ttaaacacct gtttatatct cctttaaact acttaattac 1920attcatttaa aaagaaaacc tattcactgc ctgtcctgtg gacagacaga tatgcacctc 1980ccaccgcaag cggcgggccc ctaccggagc cgctttagtt acaacactca gacacaacca 2040ccagaaaaac cccggtccag cgcagaactg aaaccacaaa gcccctccct cataactgaa 2100aagcggcccc gccccggccc gaagggccgg aacagagtcg cttttaatta tgaatgttgt 2160aactacttca tcatcgctgt cagtcttctc gctggaagtt ctcagtacac gctcgtaagc 2220ggccctgacg gcccgctaac gcggagatac gccccgactt cgggtaaacc ctcgtcggga 2280ccactccgac cgcgcacaga agctctctca tggctgaaag cgggtatggt ctggcagggc 2340tggggatggg taaggtgaaa tctatcaatc agtaccggct tacg 2384<210>26<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>26ccccatcccc ctgttgacaa ttaatc 26<210>27<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>27ggtagatcct gtttcctgtg tg 22
<210>28<211>110<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<220>
<221>misc_feature<222>(37)..(38)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(40)..(41)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(43)..(44)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(46)..(47)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(49)..(50)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(52)..(53)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(55)..(56)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(58)..(59)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(61)..(62)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(64)..(65)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(67)..(68)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(70)..(71)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(73)..(74)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(76)..(77)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(79)..(80)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(82)..(83)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(85)..(86)<223>n＝a，g，c或t<220>
<221>misc_feature<222>(88)..(89)<223>n＝a，g，c或t
<400>28acataccgtc atgcggccgc tgatcctcct cccccvnnvn nvnnvnnvnn vnnvnnvnnv 60nnvnnvnnvn nvnnvnnvnn vnnvnnvnng gccatggtag atcctgtttc 110<210>29<211>49<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>29ctggagatgg catcaagggc cccaactgat cttcaccaaa cgtattacc 49<210>30<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>30ggcgctatca tgccataccg 20<210>31<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>31accattcggc tagcgatgac 20<210>32<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物
<400>32ggtgaagatc agttgcggcc gctgatcctc ctc 33<210>33<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>33gattggttcg ctgaccattt cc 22<210>34<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>34cggcgttacc agaaactcag a 21<210>35<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>35aaccgactct gacggcagtt20<210>36<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽
<400>36Cys Gly Cys Pro Thr Met Ala Ala Arg Val Arg Pro Val Leu Asn Ser1 5 10 15Lys His<210>37<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽<400>37Met Thr Thr Val Pro Val Leu Met Ile Ser Val1 5 10<210>38<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽<400>38Thr Leu Ser Thr Arg His Hi s Asn Val Ile Asp Arg Phe Asn Leu Arg1 510 15Asn Phe<210>39<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽<400>39Ser Ile Arg Thr Leu Thr Gly Ser Thr Pro Ala Gln Phe Asp Ala Thr1 5 10 15Ala Asp
<210>40<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽<400>40Ala Asn Leu Trp Arg Ile Val Leu His Gly Trp Trp1 5 10<210>41<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽<400>41Val Ser Phe Met Leu Leu Gly Pro His Arg His Arg1 5 10<210>42<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽<400>42Leu Val Leu His Trp Leu Ser Leu Gly Ser Arg1 5 10<210>43<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽
<400>43Ser Asn Gln Val Val Leu Ile Leu His Leu Arg Pro1 5 10<210>44<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽<400>44Ala G1u Ser Trp Leu His Gln Ser Trp Ile His Leu1 5 10<210>45<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>45caggaaacag gatctaccat gctgcaggag tcaggacctg ag42<210>46<211>53<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>46gtttggtgaa gatcagttga tcctcctccc ccccgctcga ggaagatgga tac53<210>47<211>53<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>47gtatccatct tcctcgagcg ggggggagga ggatcaactg atcttcacca aac53<210>48<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>48ctcaggtcct gactcctgca gcatggtaga tcctgtttcc tg4权利要求
1.一种制备体外肽表达文库的方法，所述肽表达文库包含大量肽，其中每个肽与编码该肽的DNA构建体相连，所述方法包括以下步骤(a)提供DNA构建体，该DNA构建体包含(i)DNA靶序列；(ii)编码文库成员肽的DNA；和(iii)对能够直接或间接地与如(i)所述的DNA靶序列非共价结合的肽进行编码的DNA；其中，所述DNA构建体和编码生成的蛋白质经选择具有顺式活性；(b)表达如(a)所述的大量DNA构建体，其中所述大量DNA构建体编码大量文库成员肽，从而每个表达生成的肽与生成该肽的DNA非共价相连。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述的DNA构建体还包含(iv)指导顺式活性的DNA元件。
3.如权利要求2所述的方法，其中如(a)所述的DNA构建体还包含(v)编码一段片段的DNA，所述片段至少包含repA蛋白C末端的20个氨基酸，其中所述片段能够与如(iv)所述的DNA元件相互作用；其中，如(iv)所述的DNA元件位于如(ii)、(iii)和(v)所述的DNA的3’端。
4.如前述任一项权利要求所述的方法，其中由如(iii)所述的DNA编码的肽能够识别如(i)所述的DNA靶序列并与如(i)所述的DNA靶序列直接结合。
5.如权利要求4所述的方法，其中由如(iii)所述的DNA编码的肽是repA蛋白，并且其中如(i)所述的DNA靶序列是ori。
6.如权利要求4或5所述的方法，其中，通过限制酶消化和连接，如(ii)所述的DNA与如(i)和(iii)所述的DNA相连。
7.如权利要求3至6中任一项所述的方法，其中所述repA选自IncI复合物质粒的repA；或选自IncF、IncB、IncK、IncZ或IncL/M质粒的repA。
8.如权利要求5所述的方法，其中所述DNA构建体包含编码IncFII质粒R1的repA、顺式DNA元件和ori DNA的序列。
9.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述repA蛋白具有SEQID NO16所示的序列，并且其中所述顺式DNA元件具有SEQ ID NO17所示的序列。
10.如前述任一项权利要求所述的方法，其中未与由如(iii)所述的DNA编码的肽结合的DNA被非特异性DNA结合蛋白所结合。
11.如权利要求4所述的方法，其中由如(iii)所述的DNA编码的肽是雌激素受体的DNA结合域，并且其中如(i)所述的DNA靶序列是雌激素受体靶序列。
12.如权利要求9所述的方法，其中所述DNA结合域包含雌激素受体的DNA结合片段的氨基酸176～282，并且其中所述DNA靶序列包含如SEQ ID NO14所示的雌激素受体靶序列。
13.如权利要求1、2或3所述的方法，其中由如(iii)所述的DNA编码的肽与如(i)所述的DNA靶序列通过双功能试剂间接结合，该双功能试剂的一部分与如(i)所述的DNA靶序列结合，而第二部分与由如(iii)所述的DNA编码的肽结合。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述DNA靶序列包含能够被所述双功能试剂结合的DNA标签，该标签选择性地选自生物素或荧光素。
15.如权利要求13或14所述的方法，其中所述双功能试剂的结合活性由两种抗体或其片段赋予。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述结合活性中的一种或两种由Fab片段赋予。
17.如权利要求13至16任一项所述的方法，其中在步骤(b)之前提供所述双功能试剂。
18.如权利要求13所述的方法，其中所述双功能试剂与如(i)所述的DNA靶序列结合，并能够与由如(iii)所述的DNA编码的肽结合。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述双功能试剂是聚合物。
20.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述DNA受合适启动子和翻译序列的控制，以允许进行体外转录和翻译。
21.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述文库成员肽是抗体或其片段。
22.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述文库至少包含104个分子。
23.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，在抑制核酸酶活性、或者减少非特异性DNA-蛋白质或蛋白质-蛋白质相互作用的化合物存在的条件下，进行所述表达。
24.如前述任一项权利要求所述的方法，其中在细菌的偶联转录/翻译环境中进行所述表达。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述的细菌的偶联转录/翻译环境是S30提取物系统。
26.一种制备体外肽表达文库的方法，所述肽表达文库包含大量肽，其中每个肽与编码该肽的DNA构建体相连，所述方法包括以下步骤(a)提供DNA构建体，该DNA构建体包含(i)编码文库成员肽的DNA；和(ii)编码能够与双功能试剂结合的肽的DNA；其中，所述DNA构建体和编码生成的蛋白质经选择具有顺式活性；(b)结合双功能试剂或DNA标签，该DNA标签能够将双功能试剂与如(a)所述的DNA构建体结合，其中所述双功能试剂能够与由如(ii)所述的DNA所编码的肽结合；和(c)表达(b)的大量DNA构建体，其中所述大量DNA构建体编码大量文库成员肽，从而每个表达生成的肽通过所述双功能试剂与生成该肽的DNA结合。
27.一种从体外肽表达文库中对显示出所需特性的肽进行鉴定和/或纯化的方法，所述文库由前述任一项权利要求所述的方法制备，所述鉴定和/或纯化显示所需特性的肽的方法至少包括以下步骤(a)筛选所述文库；和(b)选择和分离相关的文库成员。
28.一种鉴定特异性配体结合肽的方法，所述方法至少包括以下步骤(a)用选择性地结合于固相支持物上的配体分子筛选体外肽表达文库，该体外肽表达文库由权利要求1至26中任一项所述的方法制备；(b)选择和分离与所述配体分子结合的文库成员；和(c)分离与所述配体分子特异性结合的肽。
29.如权利要求27或28所述的方法，其中所述文库成员肽是抗体或其片段。
30.一种鉴定和/或纯化肽的方法，所述肽具有与特定DNA靶序列结合的能力，所述方法至少包括以下步骤(a)提供由权利要求1至26中任一项所述的方法制备的体外表达文库，其中由如(iii)所述的DNA编码的肽是文库成员肽，该肽具有DNA结合活性，并且其中如(i)所述的DNA靶序列是感兴趣的靶序列；(b)选择和分离文库成员，其中编码生成的蛋白质与所述靶序列结合；和(c)分离与所述靶序列结合的肽。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述文库成员肽是锌指蛋白、螺旋-环-螺旋蛋白或螺旋-转角-螺旋蛋白。
32.如权利要求27至31中任一项所述的方法，其中在抑制核酸酶活性，或者减少非特异性DNA-蛋白质或蛋白质-蛋白质相互作用的化合物存在的条件下，进行所述筛选和/或选择步骤。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述化合物是肝素。
34.如权利要求27至33中任一项所述的方法，其中对表达所述分离得到的肽的DNA进行额外分离。
35.如权利要求34所述的方法，所述方法还包括将所述DNA克隆入表达载体中。
36.如权利要求35所述的方法，所述方法还包括在体外将所述表达载体引入细胞中。
37.如权利要求35或36所述的方法，所述方法还包括表达由所述DNA编码的肽。
38.一种体外肽表达文库，该文库由权利要求1至26中任一项所述的方法制备。
39.一种DNA构建体，所述DNA构建体为如权利要求1至26任一项中所述的DNA构建体。
全文摘要
本发明提供了一种制备体外肽表达文库的方法，以及用于分离编码感兴趣肽的核苷酸序列，其中，通过蛋白质DNA的非共价结合，所述肽或蛋白质与编码它们的DNA特异性结合。所述方法描述了制备所述文库自身和编码该文库的DNA分子的方法，并且描述了该表达文库的用途。
文档编号C12N15/10GK1681924SQ03821134
公开日2005年10月12日 申请日期2003年9月5日 优先权日2002年9月6日
发明者邓肯·麦格雷戈, 理查德·奥迪格雷普, 凯文·菲茨杰拉德, 罗斯玛丽·黑德雷尔, 比尔·埃尔德里奇, 克里斯·厄尔曼, 菲利普·库尔曼, 戴维·孔伯 申请人:伊索杰尼卡有限公司