含虾青素的万寿菊属植物或植物部分作为饲料的用途的制作方法

专利名称：含虾青素的万寿菊属植物或植物部分作为饲料的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及含虾青素的万寿菊属植物或其部分或含虾青素的万寿菊属植物或其部分的含虾青素提取物用于经口施用于动物的用途，生产动物饲料制品的方法，动物饲料制品本身，使动物或动物产品着色的方法，并且还涉及产生着色动物或动物产品的方法。
因为其着色特性，虾青素用作动物营养品中的色素，尤其是用于鳟鱼、鲑鱼和虾类养殖。
目前主要通过化学合成方法产生虾青素。目前通过培养藻类例如雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)，或者通过发酵遗传上优化的微生物并随后分离以生物技术方法产生少量天然虾青素。
通过分离产生的合成虾青素或天然虾青素是通过用来延长保存期的特殊制剂技术产生的化学或物理上稳定的，并且根据预期施用范围和生物利用度被制备用于各自的用途。
WO 9201754描述了一种含虾青素的野生型植物物种夏侧金盏花(Adonis aestivalis)。此外，该文献还公开了含虾青素的夏侧金盏花花瓣和其提取物作为鱼类食物，或作为鱼类食物中用于使鱼类着色的添加剂的用途。
然而，在现有技术中夏侧金盏花作为用于使鱼类着色的虾青素的植物来源具有这样的缺点，即含虾青素生物量的产量并因此每单位培养区含虾青素植物材料的产量非常低，并且因此只能通过高成本大面积培养获得满意量的含虾青素植物材料。这导致相应色素生产中的高成本。
因此提供不再具有现有技术的缺点的着色剂是本发明的目的。
如前所说已经发现含虾青素的万寿菊属植物或其部分或含虾青素的万寿菊属植物或其部分的含虾青素提取物能够用于经口施用于动物。
在优选的实施方案中，含虾青素的万寿菊属植物或其部分或含虾青素的万寿菊属植物或其部分的含虾青素提取物用于使动物着色和使相应的动物产品着色。
优选地认为含虾青素的万寿菊属植物是指至少在植物一个部分中含有一定量虾青素的万寿菊属植物。虾青素能够以游离的形式、以脂肪酸二酯或单酯形式存在。优选的万寿菊属植物选自以下种万寿菊(Tageteserecta)、孔雀草(Tagetes patula)(这两种万寿菊属植物也称为金盏菊)、香叶万寿菊(Tagetes lucida)、普林万寿菊(Tagetes pringlei)、Tagetespalmeri、小万寿菊(Tagetes minuta)、柠檬万寿菊(Tagetes lemmonii)、细叶万寿菊(Tagetes tenuifolia)或钟形万寿菊(Tagetes campanulata)，特别优选地为万寿菊或孔雀草。
优选地认为含虾青素的万寿菊属植物的部分是指至少在该植物部分的一个部分中含有一定量虾青素的植物部分。例如，优选的植物部分是花、头状花序(flower heads)或特别优选地为花叶，也称为花瓣。
万寿菊属野生型植物在花中不含虾青素，但含有类胡萝卜素，如叶黄素和玉米黄素。然而，根据本发明已经发现能够赋予万寿菊属植物产生虾青素的能力，例如通过遗传修饰。
在优选的实施方案中，例如通过在与野生型相比已经被遗传修饰的万寿菊属植物中引起酮酶活性赋予万寿菊属植物产生虾青素的能力。
认为酮酶活性是指酮酶的酶活性。
认为酮酶是指具有在类胡萝卜素任选取代的β-紫罗酮环处引入酮基的酶活性的蛋白质。
具体而言，认为酮酶是指具有将β-胡萝卜素转化成角黄素的酶活性的蛋白质。
因此，认为酮酶活性是指通过蛋白质酮酶在特定时间内转化的β-胡萝卜素的量或形成的角黄素的量。
根据本发明认为术语“野生型”是指相应的非遗传修饰万寿菊属来源植物。
根据上下文，术语“植物”能够被认为是指万寿菊属来源植物(野生型)或本发明遗传修饰的万寿菊属植物，或两者。
优选地，认为“野生型”在每一情况下是指对于产生酮酶活性、对于下文所述的羟化酶活性增加、对于下文所述的β-环化酶活性增加、以及对于下文所述的ε-环化酶活性降低和虾青素含量增加的参照植物。
万寿菊属参照植物是万寿菊、孔雀草、香叶万寿菊、普林万寿菊、Tagetes palmeri、小万寿菊或钟形万寿菊，特别优选地为万寿菊，非常特别优选地为万寿菊L.，登录号TAG 72，品系Orangenprinz，可从IPKGenebank，Corrensstr.3，D-06466 Gatersleben获得。
在本发明遗传修饰的万寿菊属植物和野生型或参照植物中酮酶活性优选地在以下条件下测定基于Frazer等的方法(J.Biol.Chem.272(10)6128-6135，1997)测定植物材料中的酮酶活性。当存在脂类(大豆卵磷脂)和去垢剂(胆酸钠)时，利用底物β-胡萝卜素以及利用角黄素测定植物提取物中的酮酶活性。来自酮酶测定的底物/产物比率可通过HPLC测定。
在该优选的实施方案中，与非遗传修饰野生型相比，本发明遗传修饰的万寿菊属植物具有酮酶活性，优选地在花叶中具有酮酶活性，并因此优选地能够表达转基因酮酶。
在另一个优选的实施方案中，通过引起编码酮酶的核酸的基因表达使得在万寿菊属植物中具有酮酶活性。
在该优选的实施方案中，优选地通过将编码酮酶的核酸导入万寿菊属起始植物中引起编码酮酶的核酸的基因表达。
大体而言，任意酮酶基因，也就是说编码酮酶的任意核酸，能够用于该方面。
在说明书中提及的所有核酸可以是，例如，RNA、DNA或cDNA序列。
对于真核来源的含内含子的基因组酮酶序列，在万寿菊属宿主植物不能表达相应的酮酶或不能被赋予表达相应的酮酶的能力的情况下，优选地使用已经加工后的核酸序列，例如相应的cDNA。
编码酮酶的核酸和能够用于本发明方法的相应酮酶的例子为选自以下的序列雨生红球藻，尤其是来自雨生红球藻Flotow em.Wille(登录号X86782；核酸SEQ ID NO1，蛋白质SEQ ID NO2)，雨生红球藻，NIES-144(登录号D45881；核酸SEQ ID NO3，蛋白质SEQ ID NO4)，橙黄农杆菌(Agrobacterium aurantiacum)(登录号D58420；核酸SEQ IDNO5，蛋白质SEQ ID NO6)，产碱菌(Alicaligenes spec.)(登录号D58422；核酸SEQ ID NO7，蛋白质SEQ ID NO8)，Paracoccus marcusii(登录号Y15112；核酸SEQ ID NO9，蛋白质SEQID NO10)，聚球藻属(Synechocystis sp.)PC6803株(登录号NP442491；核酸SEQ IDNO11，蛋白质SEQ ID NO12)，慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium sp.)(登录号AF218415；核酸SEQ ID NO13，蛋白质SEQ ID NO14)，念珠藻属(Nostoc sp.)PCC7120株(登录号AP003592，BAB74888；核酸SEQ ID NO15，蛋白质SEQ ID NO16)，点形念珠藻(Nostoc punctiforme)ATTC 29133，核酸Acc.No.NZ_AABC01000195，碱基对55,604-55,392(SEQ ID NO81)；蛋白质Acc.No.ZP_00111258(SEQ ID NO82)(注解为推定蛋白质)，点形念珠藻ATTC 29133，核酸Acc.No.NZ_AABC01000196，碱基对140,571-139,810(SEQ ID NO83)，蛋白质(SEQ ID NO84)(无注解)，聚球藻属(Synechococcus)WH 8102种，核酸Acc.No.
NZ_AABD01000001，碱基对1,354,725-1,355,528(SEQ ID NO85)，蛋白质Acc.No.ZP 00115639(SEQ ID NO86)(注解为推定蛋白质)，雨生红球藻(登录号AF534876，AAN03484；核酸SEQ ID NO97，蛋白质SEQ ID NO98)，副球菌(Paracoccus)MBIC1143种，(登录号D58420，P54972；核酸SEQ ID NO99，蛋白质SEQ ID NO100)，橙黄短波单胞菌(Brevundimonas aurantiaca)(登录号AY166610，AAN86030；核酸SEQ ID NO101，蛋白质SEQ ID NO102)，泡沫节球藻(Nodularia spumigena)NSOR10(登录号AY210783，AAO64399；核酸SEQ ID NO103，蛋白质EQ ID NO104)和耐辐射奇异球菌(Deinococcus radiodurans)R1(登录号E75561，AE001872；核酸SEQ ID NO105，蛋白质SEQ ID NO106)。
通过将来自数据库的氨基酸序列或相应反向翻译的核酸序列与上述序列并且尤其是与序列SEQ ID NO2和/或16比较同一性，可以容易地发现，例如从多种其基因组序列已知的有机体发现能够用于本发明方法的酮酶和酮酶基因的其它天然实例。
通过杂交技术以本身已知的方式，还可以容易地自上述核酸序列尤其是SEQ ID NO2和/或16从来自多种其基因组序列已知的有机体的序列发现酮酶和酮酶基因的其它天然实例。
杂交能够在温和(低度严格)，或优选地在严格(高度严格)条件下进行。
此类杂交条件描述于，例如Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.，Molecular Cloning(A Laboratory Manual)，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989，9.31-9.57页或Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。
例如，洗涤步骤中的条件能够选自低度严格(50℃用2×SSC)和高度严格(50℃，优选地在65℃，用0.2×SSC)(20×SSC0.3M柠檬酸钠，3M氯化钠，pH 7.0)条件限制的条件范围。
此外，洗涤步骤中的温度能够从室温22℃的温和条件上升至65℃的严格条件。
两个参数盐浓度和温度能够同时改变，并且也能够将这两个参数之一保持不变而仅另一个改变。杂交过程中，也能够使用变性剂，例如甲酰胺或SDS。当存在50％甲酰胺时，杂交优选地在42℃进行。
一些典型的杂交和洗涤步骤条件如下给出(1)杂交条件有，例如(i)65℃，4×SSC，或(ii)45℃，6×SSC，或(iii)68℃，6×SSC，100mg/ml变性鱼精子DNA，或(iv)68℃，6×SSC，0.5％ SDS，100mg/ml变性片段化鲑鱼精子DNA，或(v)42℃，6×SSC，0.5％ SDS，100mg/ml变性片段化鲑鱼精子DNA，50％甲酰胺，或(vi)42℃，50％甲酰胺，4×SSC，或(vii)42℃，50％(体积/体积)甲酰胺，0.1％牛血清白蛋白，0.1％菲可，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，50mM磷酸钠缓冲液pH 6.5，750mM NaCl，75mM柠檬酸钠，或(viii)50℃，2×或4×SSC(温和条件)，或(ix)42℃，30-40％甲酰胺，2×或4×SSC(温和条件)。
(2)每一情况下洗涤步骤为10分钟，例如使用(i)50℃，0.015M NaCl/0.0015M柠檬酸钠/0.1％ SDS，或(ii)65℃，0.1×SSC，或(iii)68℃，0.1×SSC，0.5％ SDS，或(iv)42℃，0.1×SSC，0.5％ SDS，50％甲酰胺，或(v)42℃，0.2×SSC，0.1％ SDS，或(vi)65℃，2×SSC(温和条件)。
在本发明万寿菊属经遗传修饰植物的优选的实施方案中，导入了核酸，这些核酸编码的蛋白质含有氨基酸序列SEQ ID NO2或通过对SEQ IDNO2进行氨基酸替代、插入或缺失所得序列，在氨基酸水平这些序列与序列SEQ ID NO2的同一性为至少20％，优选地为至少30％，更加优选地为至少40％，更加优选地为至少50％，更加优选地为至少60％，更加优选地为至少70％，更加优选地为至少80％，特别优选地为至少90％，并且具有酮酶的酶特性。
可包括天然的酮酶序列，如上所述，通过比较来自其它有机体的序列，或来自序列SEQ ID NO2已经通过人工改变，例如通过氨基酸替代、插入或缺失而修饰了的合成酮酶序列的同一性能够发现的天然酮酶序列。
在另一个本发明方法优选的实施方案中，导入了核酸，这些核酸编码的蛋白质含有氨基酸序列SEQ ID NO16或通过对SEQ ID NO16进行氨基酸替代、插入或缺失所得序列，在氨基酸水平这些序列与序列SEQ IDNO16的同一性为至少20％，优选地为至少30％，更加优选地为至少40％，更加优选地为至少50％，更加优选地为至少60％，更加优选地为至少70％，更加优选地为至少80％，特别优选地为至少90％，并且具有酮酶的酶特性。
可包括天然的酮酶序列，如上所述，通过比较来自其它有机体的序列，或来自序列SEQ ID NO16已经通过人工改变，例如通过氨基酸替代、插入或缺失而修饰了的合成酮酶序列的同一性能够发现的天然酮酶序列。
术语“替代”在说明书中被认为是指由一个或多个氨基酸互换一个或多个氨基酸。优选地，进行所定义的保守互换，其中所替代的氨基酸与原氨基酸具有相似的特性，例如Glu互换为Asp、Gln互换为Asn、Val互换为Ile、Leu互换为Ile、Ser互换为Thr。
缺失是由直接的键代替氨基酸。优选的缺失位置为多肽的末端和不同蛋白质结构域之间的连接。
插入是将氨基酸导入多肽链，形式上是由一个或多个氨基酸代替直接的键。
两个蛋白质之间的同一性在每一情况下被认为是指全长蛋白质中氨基酸的同一性，具体而言通过使用来自DNASTAR，inc.Madison，Wisconsin(USA)利用Clustal方法的Lasergene软件进行比较而计算的同一性(Higgins DG，Sharp PM.，在微型计算机上进行快速灵敏的多序列比对，Comput Appl.Biosci.1989 Apr；5(2)151-1)，设置参数如下
多重比对参数缺口罚分 10缺口长度罚分 10成对比对参数K-tuple(字/字长) 1缺口罚分 3窗口 5保留对角线(Diagonals saved) 5在氨基酸水平上与序列SEQ ID NO2或16具有至少20％同一性的蛋白质被相应的认为是指当将其序列与序列SEQ ID NO2或16比较时，尤其是根据具有上述参数设置的程序对数，具有至少20％同一性的蛋白质。
例如，适当的核酸序列可通过按照遗传密码进行多肽序列的反向翻译而获得。
对于这方面，优选地使用那些与万寿菊特异密码子选择相一致的频繁使用的密码子。基于万寿菊属植物其它已知基因的计算机评估可以容易地确定密码子选择。
在特别优选的实施方案中，将含有序列SEQ ID NO1的核酸导入万寿菊属植物中。
在另一个特别优选的实施方案中，将含有序列SEQ ID NO15的核酸导入万寿菊属植物中。
此外，所有上述酮酶基因能够通过化学合成法以本身已知的方式从核苷酸结构单元产生，例如通过双螺旋各个重叠互补核酸结构单元的片段缩合。例如，通过亚磷酰胺法(Voet，Voet，第二版，Wiley Press New York，896-897页)以已知的方式进行寡核苷酸的化学合成。合成寡核苷酸的添加和利用DNA聚合酶克列诺片段进行缺口补平和连接反应以及常规的克隆方法描述于Sambrook等(1989)，Molecular cloningA laboratory manual，冷泉港实验室出版社。
在本发明方法特别优选的实施方案中，使用万寿菊属经遗传修饰植物，其花瓣中具有最高的酮酶表达率。
这优选地是通过在花特异启动子控制下表达酮酶基因而实现的。例如，对于这方面，核酸构建体中与花特异启动子功能性连接的上述核酸，在下文中广泛描述，被导入万寿菊属植物。
作为起始植物或本发明经遗传修饰植物特别优选万寿菊属植物，优选选自以下种万寿菊、孔雀草(它们也称为金盏菊)、香叶万寿菊、普林万寿菊、Tagetes palmeri、小万寿菊、柠檬万寿菊、细叶万寿菊或钟形万寿菊，特别优选地是万寿菊或孔雀草。
在优选的实施方案中，使用与野生型相比另外具有提高了的羟化酶活性和/或β-环化酶活性的万寿菊属经遗传修饰植物。
认为羟化酶活性是指羟化酶的酶活性。
认为羟化酶是指具有在类胡萝卜素任选取代的β-紫罗酮环处引入羟基的酶活性的蛋白质。
具体而言，认为羟化酶是指具有将β-胡萝卜素转化成玉米黄素，或将角黄素转化成虾青素的酶活性的蛋白质。
因此，认为羟化酶活性是指通过蛋白质羟化酶在特定时间内转化的β-胡萝卜素或角黄素的量或形成的玉米黄素或虾青素的量。
因此，与野生型相比羟化酶活性提高是指与野生型相比在特定时间内转化的β-胡萝卜素或角黄素的量增加，或形成的玉米黄素或虾青素的量增加。
优选地，该羟化酶活性增加至少为野生型羟化酶活性的5％，更加优选地为至少20％，更加优选地为至少50％，更加优选地为至少100％，更加优选地为至少300％，甚至更加优选地至少500％，尤其是至少600％。
认为β-环化酶活性是指β-环化酶的酶活性。
认为β-环化酶具有将番茄红素末端线性残基转化为β-紫罗酮环的酶活性的蛋白质。
具体而言，认为β-环化酶是指具有将γ-胡萝卜素转化为β-胡萝卜素的酶活性的蛋白质。
因此，认为β-环化酶活性是指在特定时间内由蛋白质β-环化酶转化的γ-胡萝卜素的量或形成的β-胡萝卜素的量。
因此，当与野生型相比β-环化酶活性提高时，由蛋白质β-环化酶转化的γ-胡萝卜素的量或形成的β-胡萝卜素的量在特定时间内与野生型相比增加。
优选地，该β-环化酶活性的增加至少是野生型β-环化酶活性的5％，更加优选地是至少20％，更加优选地是至少50％，更加优选地是至少100％，更加优选地是至少300％，甚至更加优选地至少500％，尤其是至少600％。
本发明经遗传修饰植物和野生型或参照植物中羟化酶活性优选地在以下条件下测定按照Bouvier等(Biochim.Biophys.Acta 1391(1998)，320-328)方法体外测定羟化酶的活性。将铁氧还蛋白、铁氧还蛋白-NADP氧化还原酶、过氧化氢酶、NADPH和β-胡萝卜素，与单-或二-半乳糖苷甘油一起，加入到一定量的植物提取物中。
特别优选地，按照Bouvier、Keller、d’Harlingue和Camara(叶黄素的生物合成来自辣椒(Capsicum annuum L.)的类胡萝卜素羟化酶的分子和功能特性(Biochim.Biophys.Acta 1391(1998)，320-328)方法在以下条件下测定羟化酶活性体外测定在0.250ml体积中进行。测定混合物含有50mM磷酸钾(pH 7.6)、0.025mg菠菜铁氧还蛋白、0.5单位铁氧还蛋白-NADP+菠菜氧化还原酶、0.25mM NADPH、0.010mg β-胡萝卜素(乳化于0.1mg吐温80)、0.05mM单-和二-半乳糖苷甘油混合物(1∶1)、1单位过氧化氢酶、200单-和二-半乳糖苷甘油(1∶1)、0.2mg牛血清白蛋白和不同体积的植物提取物。将反应混合物在30℃孵育2小时。用有机溶剂诸如丙酮或氯仿/甲醇(2∶1)，抽提反应产物并且用HPLC测定。
本发明经遗传修饰植物和野生型或参照植物中β-环化酶活性优选地在以下条件下测定
按照Fraser和Sandmann(Biochem.Biophys.Res.Comm.185(1)(1992)9-15)方法体外测定β-环化酶的活性。将磷酸钾缓冲液(pH 7.6)、作为底物的番茄红素、红辣椒基质蛋白质、NADP+、NADPH和ATP加入到一定量的植物提取物中。
特别优选地，按照Bouvier、d’Harlingue和Camara(类胡萝卜素环化酶抑制的分子分析；Arch.Biochem.Biophys.346(1)(1997)53-64)方法在以下条件下测定羟化酶活性体外测定在250μl体积中进行。测定混合物含有50mM磷酸钾(pH 7.6)、不同量的植物提取物、20nM番茄红素、250μg红辣椒色质体基质蛋白质、0.2mM NADP+、0.2mM NADPH和1mM ATP。当加入孵育介质之前，立即将NADP/NADPH和ATP与1mg吐温80一起溶于10ml乙醇中。30℃反应60分钟后，加入氯仿/甲醇(2∶1)终止反应。用HPLC方法分析所提取的反应产物。
另一种利用放射性底物的测定法描述于Fraser和Sandmann(Biochem.Biophys.Res.Comm.185(1)(1992)9-15)。
通过多种方式能够增加羟化酶活性和/或β-环化酶活性，例如在表达和蛋白质水平通过关闭抑制性调控机制，或者通过与野生型相比，增加编码羟化酶的核酸或编码β-环化酶的核酸的基因表达。
同样与野生型相比，通过多种方式能够增加编码羟化酶的核酸或编码β-环化酶的核酸的基因表达，例如通过激活剂诱导羟化酶基因和/或β-环化酶基因或者通过将一个或多个羟化酶基因拷贝和/或β-环化酶基因拷贝也就是说将至少一个编码羟化酶的核酸或至少一个编码β-环化酶的核酸导入万寿菊属植物中。
编码羟化酶和/或β-环化酶的核酸的基因表达增加也被认为根据本发明是指对万寿菊属植物内源性羟化酶和/或β-环化酶的表达的操纵。
例如，这能够通过修饰编码羟化酶和/或β-环化酶基因的启动子DNA序列而实现。例如，通过DNA序列缺失或插入能够实现此种引起基因表达率增加的修饰。
如上所述，通过应用外源刺激物可能改变内源羟化酶和/或β-环化酶的表达。这能够通过特殊的生理学条件也就是说通过应用外来物质而进行。
而且，通过使用在非转化植物中不存在的调节蛋白与该基因启动子相互作用能够得到改变了的或增加了的内源羟化酶和/或β-环化酶基因的表达。
此种调节剂可以是由DNA-结合结构域和转录激活子结构域组成的嵌合蛋白质，例如描述于WO 96/06166中的调节剂。
在优选的实施方案中，通过将至少一个编码羟化酶的核酸或通过将至少一个编码β-环化酶的核酸导入万寿菊属植物中增加编码羟化酶的核酸的基因表达和/或编码β-环化酶的核酸的基因表达。
对于这方面，原则上能够使用任意羟化酶基因或任意β-环化酶基因，也就是说任意编码羟化酶的核酸和任意编码β-环化酶的核酸。
对于真核来源的含有内含子的基因组羟化酶或β-环化酶核酸序列，在宿主植物没有或不能被赋予表达相应羟化酶或β-环化酶的能力的情况下，优选地使用经事先加工的核酸序列，诸如相应的cDNA。
羟化酶基因的一个实例是来自雨生红球藻(登录号AX038729，WO 0061764)；(核酸SEQ ID NO17，蛋白质SEQ ID NO18)的编码羟化酶的核酸。
也可使用具有以下登录号的羟化酶|emb|CAB55626.1、CAA70427.1、CAA70888.1、CAB55625.1、AF499108_1、AF315289_1、AF296158_1、AAC49443.1、NP_194300.1、NP_200070.1、AAG10430.1、CAC06712.1、AAM88619.1、CAC95130.1、AAL80006.1、AF162276_1、AAO53295.1、AAN85601.1、CRTZ_ERWHE、CRTZ_PANAN、BAB79605.1、CRTZ_ALCSP、CRTZ_AGRAU、CAB56060.1、ZP_00094836.1、AAC44852.1、BAC77670.1、NP_745389.1、NP_344225.1、NP_849490.1、ZP_00087019.1、NP_503072.1、NP_852012.1、NP_15929.1、ZP_00013255.1此外特别优选的羟化酶为来自番茄的羟化酶(登录号Y14809)(核酸SEQ ID NO107；蛋白质SEQ ID NO.108)。
β-环化酶基因的实例是编码来自番茄的β-环化酶的核酸(登录号X86452)(核酸SEQ ID NO19，蛋白质SEQ ID NO20)。
也可使用具有以下登录号的β-环化酶S66350番茄红素β-环化酶(EC 5.5.1.-)-番茄CAA60119 番茄红素合酶[辣椒(Capsicum annuum)]S66349番茄红素β-环化酶(EC 5.5.1.-)-普通烟草CAA57386 番茄红素环化酶[烟草(Nicotiana tabacum)]AAM21152 番茄红素β-环化酶[甜橙(Citrus sinensis)]AAD38049 番茄红素环化酶[葡萄柚(Citrus x paradisi)]AAN86060 番茄红素环化酶[温州蜜柑(Citrus unshiu)]AAF44700 番茄红素β-环化酶[甜橙]AAK07430 番茄红素β-环化酶[巴勒斯提纳侧金盏花(Adonispalaestina)]AAG10429 β-环化酶[万寿菊]AAA81880 番茄红素环化酶AAB53337 番茄红素β-环化酶AAL92175 β-番茄红素环化酶[宫灯百合(Sandersonia aurantiaca)]CAA67331 番茄红素环化酶[黄水仙(Narcissus pseudonarcissus)]AAM45381 β-环化酶[万寿菊]AAO18661 番茄红素β-环化酶[玉米(Zea mays)]AAG21133 色质体特异的番茄红素β-环化酶[食用番茄(Lycopersiconesculentum)]AAF18989 番茄红素β-环化酶[胡萝卜(Daucus carota)]ZP_001140 推定蛋白质[海洋原绿球菌(Prochlorococcus marinus)MIT9313株]ZP_001050 推定蛋白质[海洋原绿球菌马斯德亚种CCMP1378株]
ZP_001046 推定蛋白质[海洋原绿球菌马斯德亚种CCMP1378株]ZP_001134 推定蛋白质[海洋原绿球菌MIT9313株]ZP_001150 推定蛋白质[聚球藻属WH 8102种]AAF10377 番茄红素环化酶[耐辐射奇异球菌(Deinococcusradiodurans)]BAA29250 393aa长度推定蛋白质[霍氏火球菌(Pyrococcus horikoshii)]BAC77673 番茄红素β-单环化酶[海产细菌P99-3]AAL01999 番茄红素环化酶[黄色杆菌属(Xanthobacter)Py2种]ZP_000190 推定蛋白质[橙色绿曲挠丝状菌(Chloroflexus aurantiacus)]ZP_000941 推定蛋白质[Novosphingobium aromaticivorans]AAF78200 番茄红素环化酶[慢生根瘤菌属ORS278]BAB79602 crtY[鸡血藤成团泛菌(Pantoea agglomerans pv.Milletiae)]CAA64855 番茄红素环化酶[灰色链霉菌(Streptomyces griseus)]AAA21262 番茄红素环化酶[成团泛菌(Pantoea agglomerans)]C37802 crtY蛋白质-噬夏孢欧文菌(Erwinia uredovora)BAB79602 crtY [鸡血藤成团泛菌]AAA64980 番茄红素环化酶[成团泛菌]AAC44851 番茄红素环化酶BAA09593 番茄红素环化酶[副球菌MBIC1143种]ZP_000941 推定蛋白质[Novosphingobium aromaticivorans]CAB56061 番茄红素β-环化酶[Paracoccus marcusii]BAA20275 番茄红素环化酶[长红色杆菌(Erythrobacter longus)]ZP_000570 推定蛋白质[嗜高温放线菌(Thermobifida fusca)]ZP_000190 推定蛋白质[橙色绿曲挠丝状菌]AAK07430 番茄红素β-环化酶[巴勒斯提纳侧金盏花]CAA67331 番茄红素环化酶[黄水仙]AAB53337 番茄红素β-环化酶BAC77673 番茄红素β-单环化酶[海产细菌P99-3]
此外，特别优选的β-环化酶是来自番茄色质体特异的β-环化酶(AAG21133)(核酸SEQ ID No.109；蛋白质SEQ ID No.110)。
因此，在该优选的实施方案中，与野生型植物相比，在本发明优选的万寿菊属转基因植物中，至少额外有一个羟化酶基因和/或β-环化酶基因。
例如，在优选的实施方案中经遗传修饰植物具有至少一种编码羟化酶的外源核酸，或至少两种编码羟化酶的内源核酸，和/或至少一种编码β-环化酶的外源核酸，或至少两种编码β-环化酶的内源核酸。
优选地，在上述优选的实施方案中，作为羟化酶基因，使用的核酸编码含有氨基酸序列SEQ ID NO18或通过对该序列进行氨基酸替代、插入或缺失所得到的序列的蛋白质，在氨基酸水平，后述蛋白质与序列SEQ IDNO18的同一性至少为30％，优选地至少为50％，更加优选地至少为70％，甚至更加优选地为至少90％，最优选地为至少95％，并且该蛋白质具有羟化酶的酶特性。
例如，如上所述，通过将来自数据库的氨基酸序列或相应的反向翻译核酸序列与SEQ ID.NO18进行同源性比较，可以容易地从多种基因组序列已知的有机体发现其它羟化酶和羟化酶基因。
例如，如上所述，通过杂交和PCR技术以本身已知的方式，也可以自序列SEQ ID NO17起始容易地从来自其基因组序列未知的多种有机体发现其它羟化酶和羟化酶基因。
在另一个特别优选的实施方案中，将核酸导入有机体以增加羟化酶活性，其中核酸编码的蛋白质含有序列SEQ ID NO18的羟化酶的氨基酸序列。
例如，按照遗传密码通过多肽序列的反向翻译可获得适当的核酸序列。
对于这方面，优选地使用那些依照植物特异的密码子选择频繁使用的密码子。基于对相关有机体其它已知基因的计算机评估可以快速确定密码子选择。
在特别优选的实施方案中，将含有序列SEQ ID NO17的核酸导入有机体。
在上述优选的实施方案中，作为β-环化酶基因，优选使用的核酸编码含有氨基酸序列SEQ ID NO20或通过对该序列进行氨基酸替代、插入或缺失所得到的序列的蛋白质，在氨基酸水平，后述蛋白质与序列SEQ IDNO20的同一性至少为30％，优选地至少为50％，更加优选地至少为70％，甚至更加优选地为至少90％，最优选地为至少95％，并且该蛋白质具有β-环化酶的酶特性。
例如，如上所述，通过将来自数据库的氨基酸序列或相应的反向翻译核酸序列与SEQ ID.NO20进行同源性比较，可以容易地从多种基因组序列已知的有机体发现其它β-环化酶和β-环化酶基因。
例如，通过杂交和PCR技术以本身已知的方式，也可以容易地自序列SEQ ID NO19起始从来自其基因组序列未知的多种有机体发现其它β-环化酶和β-环化酶基因。
在另一个特别优选的实施方案中，将核酸导入有机体以增加β-环化酶活性，其中核酸编码的蛋白质含有序列SEQ ID NO20的β-环化酶的氨基酸序列。
例如，按照遗传密码通过多肽序列的反向翻译可获得适当的核酸序列。
对于这方面，优选地使用那些依照植物特异的密码子选择频繁使用的密码子。基于对相关有机体其它已知基因的计算机评估可以快速确定密码子选择。
在特别优选的实施方案中，将含有序列SEQ ID NO19的核酸导入有机体。
此外，所有上述羟化酶基因或β-环化酶基因能够通过化学合成法以本身已知的方式从核苷酸结构单元产生，例如通过双螺旋各个重叠互补核酸结构单元的片段缩合。例如，通过亚磷酰胺法(Voet，Voet，第二版，WileyPress New York，896-897页)以已知的方式进行寡核苷酸的化学合成。合成寡核苷酸的添加和利用DNA聚合酶克列诺片段进行缺口补平和连接反应以及常规的克隆方法描述于Sambrook等(1989)，Molecular cloningAlaboratory manual，冷泉港实验室出版社。
此外，在本方法另一个优选的实施方案中，与野生型相比，万寿菊属植物具有降低的ε-环化酶活性。
认为ε-环化酶活性是指ε-环化酶的酶活性。
认为ε-环化酶是指具有将番茄红素末端线性残基转化为ε-紫罗酮环的酶活性的蛋白质。
因此认为ε-环化酶具体而言是指具有将番茄红素转化为δ-胡萝卜素的酶活性的蛋白质。
因此，认为ε-环化酶活性是指在特定时间内由蛋白质ε-环化酶转化的番茄红素的量或形成的δ-胡萝卜素的量。
因此，当ε-环化酶活性与野生型相比降低时，在特定时间内与野生型相比由蛋白质ε-环化酶转化的番茄红素的量或形成的δ-胡萝卜素的量减少。
基于不同的细胞生物学机制，优选地认为降低的ε-环化酶活性是指部分或基本上全部抑制或阻断植物细胞、植物或其部分、组织、器官、细胞或种子中ε-环化酶的功能。
例如，与野生型相比，通过降低植物中ε-环化酶蛋白质的量或ε-环化酶mRNA的量能够降低植物中ε-环化酶活性。因此，与野生型相比，能够直接或通过测定本发明植物中ε-环化酶蛋白质的量或ε-环化酶mRNA的量测定与野生型相比降低了的ε-环化酶活性。
ε-环化酶活性的降低包括ε-环化酶在量上降低至基本上完全缺乏ε-环化酶(也就是说缺乏可检测的ε-环化酶活性或缺乏免疫学可检测的ε-环化酶)。优选地，植物中特别优选地是在花中ε-环化酶活性(或ε-环化酶蛋白质的量或ε-环化酶mRNA的量)与野生型相比降低至少5％，更加优选地降低至少20％，更加优选地降低至少50％，更加优选地降低100％。具体而言，“降低”也是指完全缺乏ε-环化酶活性(或ε-环化酶蛋白质或ε-环化酶mRNA)。
本发明经遗传修饰植物中以及野生型或参照植物中ε-环化酶活性优选地在以下条件下测定
按照Fraser和Sandmann(Biochem.Biophys.Res.Comm.185(1)(1992)9-15)方法能够体外测定ε-环化酶的活性，测定时，将作为缓冲液的磷酸钾(pH 7.6)、作为底物的番茄红素、红辣椒基质蛋白质、NADP+、NADPH和ATP加入到一定量的植物提取物中。
特别优选地，按照Bouvier、d’Harlingue和Camara(类胡萝卜素环化酶抑制的分子分析；Arch.Biochem.Biophys.346(1)(1997)53-64)方法测定本发明经遗传修饰植物和野生型或参照植物中ε-环化酶的活性体外测定在0.25ml体积中进行。测定混合物含有50mM磷酸钾(pH 7.6)、不同量的植物提取物、20nM番茄红素、0.25mg红辣椒基质蛋白质、0.2mM NADP+、0.2mM NADPH和1mM ATP。在加入孵育介质之前立即将NADP/NADPH和ATP与1mg吐温80一起溶于0.01ml乙醇。在30℃反应60分钟后，加入氯仿/甲醇(2∶1)终止反应。用HPLC分析氯仿中所提取的反应产物。
利用放射性底物的另一种测定法描述于Fraser和Sandmann(Biochem.Biophys.Res.Comm.185(1)(1992)9-15)。另一种分析法描述于Beyer、Kr_ncke和Nievelstein(黄水仙色质体中番茄红素异构酶/环化酶反应的机制；J.Biol.Chem.266(26)(1991)17072-17078)。
优选地通过至少一种下述方法降低植物中ε-环化酶的活性a)导入至少一种双链ε-环化酶核糖核酸序列，在下文中也称为ε-环化酶-dsRNA，或确保其表达的一个表达盒或多个表达盒。包括那些其中ε-环化酶-dsRNA针对ε-环化酶基因(也就是说诸如启动子序列的基因组DNA序列)或ε-环化酶转录本(也就是说mRNA序列)的方法b)导入至少一种ε-环化酶反义核糖核酸序列，在下文中也称为ε-环化酶-反义RNA，或确保其表达的表达盒。包括那些其中ε-环化酶-反义RNA针对ε-环化酶基因(也就是说基因组DNA序列)或ε-环化酶转录本(也就是说RNA序列)的方法。还包括α-异头(anomeric)核酸序列c)导入至少一种与核酶组合的ε-环化酶反义RNA或确保其表达的表达盒d)导入至少一种ε-环化酶有意核糖核酸序列，在下文中也称为ε-环化酶-有意RNA，以诱导共抑制，或导入确保其表达的表达盒e)导入至少一种针对ε-环化酶基因、RNA或蛋白质的DNA-或蛋白质-结合因子，或者导入确保其表达的表达盒f)导入至少一种引起ε-环化酶RNA降解的病毒核酸序列，或者导入确保其表达的表达盒g)导入至少一种构建体以产生ε-环化酶基因功能缺失，诸如产生终止密码子或读码框移位，例如通过在ε-环化酶基因中产生插入、缺失、倒位或突变。优选地，通过同源重组以靶向插入所述ε-环化酶基因或导入针对ε-环化酶基因序列的序列特异性核酸酶的方式产生敲除突变。
对于本领域技术人员已知的其它方法也能够用于本发明的内容中以降低ε-环化酶或其活性或功能。例如，导入ε-环化酶显性失活(dominantnegative)变体或确保其表达的表达盒可能也是有利的。这些方法中每个方法都能够引起ε-环化酶蛋白质的量、mRNA的量和/或活性降低。也可以组合应用这些方法。其他方法对于本领域技术人员也是已知的并且可包括阻止或抑制ε-环化酶的加工、ε-环化酶或其mRNA的转运，抑制核糖体附着，抑制RNA剪接，诱导ε-环化酶RNA-降解酶和/或抑制翻译延伸或终止翻译。
各种优选的方法可以通过示例性的实施方案描述于下文a)导入双链ε-环化酶核糖核酸序列(ε-环化酶-dsRNA)以双链RNA方式(“双链RNA干扰”；dsRNAi)进行基因调控的方法是已知的并描述于诸如Matzke MA等(2000)Plant Mol Biol43401-415；Fire A.等(1998)Nature 391806-811；WO 99/32619；WO 99/53050；WO 00/68374；WO 00/44914；WO 00/44895；WO 00/49035或WO 00/63364。因此描述于所报道引文中的步骤和方法明确引用于本申请作为参考。
根据本发明，认为“双链核糖核酸序列”是指由于互补序列，理论上如按照Watson和Crick的碱基配对规则和/或事实上如基于杂交实验，能够体外和/或体内形成双链RNA结构的一条或多条核糖核酸序列。
本领域技术人员已知双链RNA结构的形成是一种平衡态。优选地，双链分子与相应解链形式的比率至少为1∶10，优选地为1∶1，特别优选地为5∶1，最优选地为10∶1。
认为双链ε-环化酶核糖核酸序列或ε-环化酶-dsRNA优选地是指具有含双链结构区域并且在该区域中含有以下核酸序列的RNA分子a)与植物固有的ε-环化酶的至少部分转录本相同和/或b)与植物固有的ε-环化酶的至少部分启动子序列相同。
在本发明方法中，为了降低ε-环化酶活性，优选地将这样的RNA导入植物，所述RNA具有含双链结构的区域并且在该区域中含有以下核酸序列a)与植物固有的ε-环化酶的至少部分转录本相同和/或b)与植物固有的ε-环化酶的至少部分启动子序列相同。
认为术语“ε-环化酶转录本”是指ε-环化酶基因的转录部分，其中除了编码ε-环化酶的序列之外，还含有诸如非编码序列，如UTRs。
认为“与植物固有的ε-环化酶的至少部分启动子序列相同”的RNA优选地是指与ε-环化酶启动子序列的至少部分理论转录本也就是说相应的RNA序列相同的RNA序列。
认为植物固有的ε-环化酶“部分”转录本或植物固有的ε-环化酶“部分”启动子序列是指转录本或启动子序列中从几个碱基对到多至全部序列的部分序列。由本领域技术人员通过常规实验能够容易地确定部分序列的最适长度。
通常，部分序列的长度为至少10个碱基且最多2kb，优选地为至少25个碱基且最多1.5kb，特别优选地为至少50个碱基并且最多600个碱基，非常特别优选地为至少100个碱基并且最多500个碱基，最优选地为至少200个碱基或至少300个碱基并且最多400个碱基。
优选地，以获得尽可能高的特异性而且其它酶(不期望其活性降低)的活性不降低的方式找出部分序列。因此对于ε-环化酶-dsRNA部分序列选择在其它活性中不存在的ε-环化酶部分转录本和/或ε-环化酶启动子序列中的部分序列是有利的。
因此，在特别优选的实施方案中，ε-环化酶-dsRNA含有与植物固有的部分ε-环化酶转录本相同的序列并含有植物固有的编码ε-环化酶核酸的5’末端或3’末端。特别地，转录本5’或3’的非翻译区适于产生选择性双链结构。
本发明进一步涉及双链RNA分子(dsRNA分子)，当将其导入植物(或其细胞、组织、器官或繁殖材料)时，引起ε-环化酶降低。
对于降低ε-环化酶(ε-环化酶-dsRNA)表达，双链RNA分子优选地包含a)含有至少一种基本上与“有意”RNA-ε-环化酶转录本的至少一部分相同的核糖核苷酸序列的“有意”RNA链，和b)基本上优选地完全与a)中的RNA“有意”链互补的“反义”RNA链。
对于用ε-环化酶-dsRNA转化植物，优选地使用被导入植物中并在植物中转录成ε-环化酶-dsRNA的核酸构建体。
因此，本发明还涉及能够转录成以下的核酸构建体a)含有至少一种基本上与“有意”RNA-ε-环化酶转录本的至少一部分相同的核糖核苷酸序列的“有意”RNA链，和b)基本上优选地完全与a)中的RNA“有意”链互补的“反义”RNA链。这些核酸构建体在下文中也称为表达盒或表达载体。
关于dsRNA分子，认为ε-环化酶核酸序列或相应的转录本优选地是指根据SEQ ID NO38或其部分的序列。
“基本上相同”意思是与ε-环化酶靶序列相比，dsRNA序列也可具有插入、缺失和单个的点突变，然而仍引起表达有效降低。优选地，抑制性dsRNA的“有意”链与ε-环化酶基因至少部分“有意”RNA转录本之间或“反义”链与ε-环化酶基因互补链之间的同源性为至少75％，优选地为至少80％，非常特别优选地为至少90％，最优选地为100％。
对于引起ε-环化酶表达有效降低，并非绝对必须dsRNA与ε-环化酶基因转录本之间存在100％同一性。于是，由于可能存在遗传突变、多态性或进化趋异，耐受序列偏离的方法是有利的。因此，例如，利用由一种有机体ε-环化酶序列起始产生的dsRNA抑制另一种有机体中ε-环化酶表达是可能的。对于该目的，dsRNA优选地含有ε-环化酶基因转录本相应于保守区的序列区域。通过序列比较能够容易地得到所述保守区。
此外，“基本上相同”的dsRNA也能够定义为能够与一部分ε-环化酶基因转录本杂交(如50℃或70℃在400mM NaCl、40mM PIPES pH 6.4、1mM EDTA中杂交12-16小时)的核酸序列。
“基本上互补”意思是指与“有意”RNA链的互补链相比较，“反义”RNA链也能够具有插入、缺失和单个的点突变。优选地，“反义”RNA链与“有意”RNA链的互补链之间的同源性为至少80％，优选地为至少90％，非常特别优选地为至少95％，最优选地为100％。
在另一个实施方案中，ε-环化酶-dsRNA包含a)含有至少一种基本上与ε-环化酶基因启动子区域“有意”RNA转录本的至少一部分相同的核糖核苷酸序列的“有意”RNA链，和b)基本上优选地完全与a)中的RNA“有意”链互补的“反义”RNA链。优选地用于转化植物的相应核酸构建体包含a)基本上与ε-环化酶基因启动子区域的至少一部分相同的“有意”DNA链，和b)基本上优选地完全与a)中的DNA“有意”链互补的“反义”DNA链。优选地，认为ε-环化酶启动子区域是指根据序列SEQ ID NO47或其部分序列。
具体而言对于万寿菊，为了产生降低ε-环化酶活性的ε-环化酶-dsRNA序列，特别优选地使用以下部分序列SEQ ID NO40ε-环化酶5’-末端区域的有意片段SEQ ID NO41ε-环化酶5’-末端区域的反义片段SEQ ID NO42ε-环化酶3’-末端区域的有意片段
SEQ ID NO43ε-环化酶3’-末端区域的反义片段SEQ ID NO47ε-环化酶启动子的有意片段SEQ ID NO48ε-环化酶启动子的反义片段dsRNA可由一条或多条多聚核糖核苷酸链组成。显然，为了实现相同的目的，也能将多种不同的dsRNA分子导入细胞或有机体中，其中每一dsRNA分子均含有一种上面定义的核糖核苷酸序列部分。
能够由两条互补的单独RNA链起始或优选地由一条自身互补的RNA链起始形成双链dsRNA结构。在这种情况下，“有意”RNA链和“反义”RNA链优选地以反向“重复”的形式彼此共价结合。
例如，如WO 99/53050中所述，dsRNA也可包含有发夹结构，通过以连接序列(“接头”；例如内含子)连接“有意”和“反义”链。自身互补的dsRNA结构是优选的，这是由于它们仅需要表达一条RNA序列并总含有等摩尔比率的互补RNA链。优选地，连接序列是内含子(例如来自马铃薯ST-LS1基因的内含子；Vancanneyt GF等(1990)Mol Gen Genet220(2)245-250)。
编码dsRNA的核酸序列可含有其它元件，例如转录终止信号或多聚腺苷酸化信号。
然而，如果dsRNA针对ε-环化酶启动子序列，优选地不含有转录终止信号或多聚腺苷酸化信号。这能够在细胞核中潴留dsRNA并阻止dsRNA在整株植物中分布(“扩散”)。
如果欲将dsRNA两条链一起导入一个细胞或植物体，可例如以下面的方式实施a)用含有两种表达盒的载体转化细胞或植物，b)使用两种载体共转化细胞或植物，一种载体含有具有“有意”链的表达盒，另一种载体含有具有“反义”链的表达盒。
c)两株不同的植物品系杂交，一株含有具有“有意”链的表达盒，另一株含有具有“反义”链的表达盒。
RNA双链的形成可在细胞外或在细胞内起始。
在体内或体外均能够合成dsRNA。因此，能够将编码dsRNA的DNA序列置于在至少一个遗传控制元件(例如启动子)控制下的表达盒。多聚腺苷酸化作用不是必需的，同样，起始翻译的元件也不是必须存在的。优选地，ε-环化酶dsRNA的表达盒存在于转化构建体或转化载体上。
在特别优选的实施方案中，由在花特异启动子的功能性控制下，特别优选地是在序列SEQ ID NO28所述的启动子或其功能等同部分控制下，自表达构建体起始表达dsRNA。
因此，优选地将编码ε-环化酶-dsRNA“反义”和/或“有意”链的表达盒或编码dsRNA自身互补链的表达盒插入到转化载体并使用下述方法将载体导入植物细胞中。对于本发明方法，稳定插入到基因组是有利的。
可将dsRNA以使每个细胞中至少能够有一个拷贝的量导入。根据需要较高的量(例如每个细胞至少5、10、100、500或1000个拷贝)能够引起更高效率的降低。
b)导入ε-环化酶的反义核糖核酸序列(ε-环化酶-反义RNA)通过“反义”技术减少某种蛋白质的方法已经多次描述于植物(Sheehy等(1988)Proc Natl Acad Sci USA 858805-8809；US 4,801,340；Mol JN等(1990)FEBS Lett 268(2)427-430)。反义核糖核酸分子与将被减少的编码ε-环化酶的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或结合。这会抑制ε-环化酶的转录和/或翻译。以常规方式通过形成稳定双链或者在为基因组DNA的情况下，通过以特异的相互作用将反义核酸分子结合于基因组DNA双链DNA螺旋的深沟中能够进行杂交。
按照Watson和Crick的碱基配对原则，利用编码该ε-环化酶的核酸序列，例如根据SEQ ID NO38的核酸序列，能够得到ε-环化酶-反义RNA。ε-环化酶-反义RNA可与ε-环化酶转录的全长mRNA互补、可局限于与编码区互补、或者仅由与mRNA的编码或非编码序列部分互补的寡核苷酸组成。例如，该寡核苷酸可与含有ε-环化酶翻译起始部分的区域互补。ε-环化酶-反义RNA长度可为例如5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸，但是也可能更长并含有至少100、200、500、1000、2000或5000个核苷酸。在本发明方法的上下文中，ε-环化酶-反义RNA优选地以重组方式表达于靶细胞中。
在特别优选的实施方案中，反义RNA由在花特异启动子功能性控制下的表达构建体起始表达，特别优选地是在SEQ ID NO28所述的启动子或其功能等同部分的控制下。
所述表达盒可以是转化构建体或转化载体的一部分，或者可通过共转化导入。
在更加优选的实施方案中，能够通过与ε-环化酶基因调控区(例如ε-环化酶启动子和/或增强子)互补并与DNA双螺旋形成三螺旋结构的核苷酸序列抑制ε-环化酶的表达，从而降低ε-环化酶基因的转录。已描述了相应的方法(Helene C(1991)Anticancer Drug Res 6(6)569-84；Helene C等(1992)Ann NY Acad Sci 66027-36；Maher LJ(1992)Bioassays 14(12)807-815)。
在另一个实施方案中，ε-环化酶-反义RNA可以是α-异头核酸。此类α-异头核酸分子与互补RNA形成特异双链杂交体，其中，与常规的β-核酸相反，其两条链方向平行(Gautier C等(1987)Nucleic Acids Res156625-6641)。
c)导入与核酶结合的ε-环化酶-反义RNA有利地，上述反义策略能够与核酶方法相结合。催化RNA分子或核酶能够被设计而适用于任意目的靶RNA并且在特异的位点断裂磷酸二酯主链，这会功能性失活靶RNA(Tanner NK(1999)FEMS Microbiol Rev23(3)257-275)。结果核酶自身不被修饰，但能够以相似的方式断裂其他靶RNA分子，这就赋予了其酶的特性。将核酶序列合并入“反义”RNA明确地赋予这些“反义”RNA这种酶样RNA切割特性，并因此增加了其失活靶RNA的效率。已经描述了相应的核酶“反义”RNA分子的产生和用途(尤其见Haseloff等(1988)Nature 334585-591)；Haselhoff和Gerlach(1988)Nature 334585-591；Steinecke P等(1992)EMBO J11(4)1525-1530；de Feyter R等(1996)Mol Gen Genet.250(3)329-338)。
以该种方式，核酶(例如“锤头状”核酶；Haselhoff和Gerlach(1988)Nature 334585-591)能够用于催化性切割将被减少的ε-环化酶mRNA，并且从而阻止其翻译。核酶技术能够提高反义策略的效率。表达用于减少某些蛋白质的核酶的方法描述于(EP 0 291 533、EP 0 321 201、EP 0 360 257)中。同样描述了植物细胞中的核酶表达(Steinecke P等(1992)EMBO J 11(4)1525-1530；de Feyter R等(1996)Mol Gen Genet.250(3)329-338)。例如，如“Steinecke P，核酶，Methods in Cell Biology 50，Galbraith等编辑，Academic Press，Inc.(1995)，449-460页”中所述，通过对核酶和靶RNA的二级结构计算并通过其相互作用能够确定适当的靶序列和核酶(Bayley CC等(1992)Plant Mol Biol.18(2)353-361；Lloyd AM和Davis RW等(1994)Mol Gen Genet.242(6)653-657)。例如，能够构建具有与欲抑制的ε-环化酶mRNA互补的区域的四膜虫属(Tetrahymena)L-19 IVS RNA衍生物(也见US 4,987,071和US 5,116,742)。另外，通过从不同核酶文库的筛选方法也能够确定此类核酶(Bartel D和Szostak JW(1993)Science 2611411-1418)。
d)导入ε-环化酶有意核糖核酸序列(ε-环化酶-有意RNA)以诱导共抑制以有意方向表达ε-环化酶核糖核酸序列(或其部分)能够导致相应ε-环化酶基因的共抑制。与内源ε-环化酶基因同源的有意RNA的表达能够减少或关闭其表达，已经描述了用于反义方法的相似方式(Jorgensen等(1996)Plant Mol Biol 31(5)957-973；Goring等(1991)Proc Natl Acad SciUSA 881770-1774；Smith等(1990)Mol Gen Genet 224447-481；Napoli等(1990)Plant Cell 2279-289；Van der Krol等(1990)Plant Cell 2291-99)。在本文中，所导入的构建体能够代表所要减少的全部或仅部分同源基因。可能不需要翻译。已描述了将该技术应用于植物(例如Napoli等(1990)Plant Cell 2279-289，US 5,034,323中)。
优选地，利用基本上与编码ε-环化酶的至少部分核酸序列相同的序列，例如根据SEQ ID NO38的核酸序列，实现共抑制。优选地，选择ε-环化酶-有意RNA以至于不能发生ε-环化酶或其部分的翻译。因此，例如，能够选择5’-非翻译区或3’-非翻译区，或者也能够删除或突变ATG起始密码子。
e)导入针对ε-环化酶基因、RNA或蛋白质的DNA-或蛋白质-结合因子利用特异DNA-结合因子，例如利用锌指转录因子型因子，也可能减少ε-环化酶表达。这些因子结合于内源靶基因基因组序列上，优选地结合于调控区，并引起表达降低。描述了产生相应因子的相关方法(Dreier B等(2001)J Biol Chem 276(31)29466-78；Dreier B等(2000)J Mol Biol303(4)489-502；Beerli RR等(2000)Proc Natl Acad Sci USA97(4)1495-1500；Beerli RR等(2000)J Biol Chem 275(42)32617-32627；Segal DJ和Barbas CF 3rd.(2000)Curr Opin Chem Biol4(1)34-39；KangJS和Kim JS(2000)J Biol Chem 275(12)8742-8748；Beerli RR等(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95(25)14628-14633；Kim JS等(1997)Proc NatlAcad Sci USA 94(8)3616-3620；Klug A(1999)J Mol Biol 293(2)215-218；Tsai SY等(1998)Adv Drug Deliv Rev 30(1-3)23-31；Mapp AK等(2000)Proc Natl Acad Sci USA 97(8)3930-3935；Sharrocks AD等(1997)Int JBiochem Cell Biol 29(12)1371-1387；Zhang L等(2000)J Biol Chem275(43)33850-33860)。
利用ε-环化酶基因任意目的片段能够选择这些因子。优选地，该部分在启动子区域内。然而，对于基因抑制，该部分也可以位于编码外显子或内含子区域内。
此外，抑制ε-环化酶自身的因子也能够导入细胞。这些蛋白质-结合因子可以是，例如适体(aptamer)(Famulok M和Mayer G(1999)Curr TopMicrobiol Immunol 243123-36)或抗体或抗体片段或单链抗体。已对这些因子的制备进行了描述(Owen M等(1992)Biotechnology(NY)10(7)790-794；Franken E等(1997)Curr Opin Biotechnol 8(4)411-416；Whitelam(1996)Trend Plant Sci 1268-272)。
f)导入引起ε-环化酶RNA降解的病毒核酸序列和表达构建体通过将病毒表达系统导入植物，诱导特异ε-环化酶RNA降解也能够实现ε-环化酶表达降低(Amplikon；Angell SM等(1999)Plant J20(3)357-362)。使用与所要减少的ε-环化酶转录本具有同源性的病毒载体核酸序列，将这些系统也称为“VIGS”(病毒诱导的基因沉默)导入植物。然后关闭转录，推断这通过针对病毒的植物防御机制介导。描述了相应的技术和方法(Ratcliff F等(2001)Plant J 25(2)237-45；Fagard M和Vaucheret H(2000)Plant Mol Biol 43(2-3)285-93；Anandalakshmi R等(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95(22)13079-84；Ruiz MT(1998)Plant Cell10(6)937-46)。
优选地，利用基本上与编码ε-环化酶的至少部分核酸序列相同的序列例如根据SEQ ID NO1的核酸序列实现VIGS-介导的减少。
g)导入产生ε-环化酶基因功能丧失或功能降低的构建体本领域的那些技术人员知道大量关于如何使基因组序列能够被特异性修饰的方法。具体而言，这些方法包括例如通过靶向重组产生敲除突变，例如产生终止密码子、读码框移位等(Hohn B和Puchta H(1999)Proc NatlAcad Sci USA 968321-8323)或者利用诸如序列特异的重组酶或核酶(见下)产生靶向缺失或序列反向。
通过将核酸序列(例如在本发明方法中欲被插入的核酸序列)靶向插入到编码ε-环化酶的序列中(例如通过分子间同源重组方法)也能够实现ε-环化酶数量、功能和/或活性的降低。在本实施方案的上下文中，优选地使用含有至少一部分ε-环化酶基因序列或相邻序列并因此能够在靶细胞中特异性地与这些序列重组的DNA构建体，从而缺失、添加或替代至少一个核苷酸以使ε-环化酶基因的功能性降低或完全去除的方式改变ε-环化酶基因。该改变也可针对ε-环化酶基因调控元件(例如启动子)，从而使编码序列保持不变，而表达(转录和/或翻译)停止或降低。在常规同源重组中，在所插入的序列的5’-和/或3’-端侧翼含有其它具有足够长度并与ε-环化酶基因相应序列(A和B)同源以便能够产生同源重组的核酸序列(A’或B’)。该长度通常在几百个碱基到几千个碱基范围之内(Thomas KR和Capecchi MR(1987)Cell 51503；Strepp等(1998)Proc Natl Acad Sci USA95(8)4368-4373)。对于同源重组，使用下面所述的方法用重组构建体转化植物细胞并基于所得到的失活ε-环化酶选择成功重组的克隆。
在另一个优选的实施方案中，通过与促进同源重组的方法相结合提高重组效率。已描述了此类方法，并包括例如表达RecA蛋白质，或者用PARP抑制剂处理。已经发现利用PARP抑制剂能够增加烟草植物中染色体内的同源重组(Puchta H等(1995)Plant J 7203-210)。通过使用这些抑制剂，在诱导序列特异的DNA双链断裂后重组构建体中同源重组率以及转基因序列缺失的效率能够进一步提高。能够使用多种PARP抑制剂。这些抑制剂优选地包括例如3-氨基苯甲酰胺、8-羟基-2-甲基喹唑啉-4-酮(NU1025)、1，11b-二氢-[2H]苯并吡喃-[4，3，2-de]异喹啉-3-酮(GPI 6150)、5-氨基异喹啉酮、3，4-二氢-5-[4-(1-哌啶基)丁氧基]-1-(2H)异喹啉酮，或描述于WO 00/26192、WO 00/29384、WO 00/32579、WO 00/64878、WO 00/68206、WO 00/67734、WO 01/23386和WO 01/23390中的物质。
其它适当的方法是将无意义突变导入内源标记蛋白质基因，例如通过将RNA/DNA寡核苷酸导入植物的方法(Zhu等(2000)Nat Biotechnol18(5)555-558)，或者通过诸如T-DNA诱变产生敲除突变(Koncz等，PlantMol.Biol.1992，20(5)963-976)。通过DNA-RNA杂合体也就是已知的“嵌合修复术(chimeraplasty)”也能够产生点突变(Cole-Strauss等(1999)NuclAcids Res 27(5)1323-1330；Kmiec(1999)Gene therapy American Scientist87(3)240-247)。
dsRNAi方法、通过有意RNA的共抑制和“VIGS”(“病毒诱导的基因沉默”)也称为“转录后基因沉默”(PTGS)或“转录基因沉默”(TGS)。由于对所要减少的标记蛋白质基因与转基因表达的有意或dsRNA核酸序列之间的同源性的需求低于诸如经典的反义方法，所以PTGS/TGS方法是特别有利的。因此，使用来自一个物种的标记蛋白质核酸序列也能够有效降低另一物种中同源标记蛋白质的表达而不需要对其中存在的标记蛋白质同源物进行分离和结构说明。这极大地降低了工作量。
在本发明方法特别优选的实施方案中，与野生型相比通过以下方法降低ε-环化酶活性a)将至少一种双链ε-环化酶核糖核酸序列或确保其表达的一个表达盒或多个表达盒导入植物和/或b)将至少一种ε-环化酶反义核糖核酸序列或确保其表达的表达盒导入植物。
在非常特别优选的实施方案中，与野生型相比通过将至少一种双链ε-环化酶核糖核酸序列或确保其表达的一个表达盒或多个表达盒导入植物降低ε-环化酶活性。
在优选的实施方案中，使用在其花中具有最低ε-环化酶表达率的经遗传修饰植物。
这优选地通过以花特异方式，特别优选地是以花叶特异方式降低ε-环化酶活性实现。
在上述特别优选的实施方案中，这是通过在花特异启动子控制下或者也是更加优选地在花叶特异启动子控制下转录ε-环化酶-dsRNA序列而实现的。
在另一个优选的实施方案中，所培养的植物与野生型相比还另外具有至少一种选自以下的活性升高HMG-CoA还原酶活性、(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶活性、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸-合酶活性、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶活性、异戊烯基二磷酸酯-Δ异构酶活性、牻牛儿基-二磷酸酯合酶活性、法呢基二磷酸酯合酶活性、牻牛儿基牻牛儿二磷酸酯合酶活性、八氢番茄红素合酶活性、八氢番茄红素去饱和酶活性、ζ-胡萝卜素去饱和酶活性、crtISO活性、FtsZ活性和MinD活性。
认为HMG-CoA还原酶活性意思是指HMG-CoA还原酶((3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶)的酶活性。
认为HMG-CoA还原酶意思是指具有将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶-A转化为甲羟戊酸这一酶活性的蛋白质。
因此，认为HMG-CoA还原酶活性意思是指在特定时间内由蛋白质HMG-CoA还原酶转化的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶-A的量，或形成的甲羟戊酸的量。
因此，具有与野生型相比提高的HMG-CoA还原酶活性，即与野生型相比在特定时间内由蛋白质HMG-CoA还原酶转化的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶-A的量或形成的甲羟戊酸的量增加。
优选地，HMG-CoA还原酶活性与野生型HMG-CoA还原酶活性相比较，提高至少5％，更加优选地提高至少20％，更加优选地提高至少50％，更加优选地提高至少100％，更加优选地提高至少300％，甚至更加优选地提高至少500％，尤其是提高至少600％。认为HMG-CoA还原酶活性意思是指HMG-CoA还原酶的酶活性。本发明经遗传修饰植物和野生型或参照植物中HMG-CoA还原酶活性优选地在以下条件下测定在研钵中加入液氮通过强力研磨匀浆冷冻植物材料并用比率从1∶1到1∶20的提取缓冲液进行抽提。所述比率取决于植物材料中可获得的酶活性，以使酶活性的测定和定量能够在线性计量范围内。一般，提取缓冲液可以含有50mM HEPES-KOH(pH 7.4)、10mM MgCl2、10mM KCl、1mMEDTA、1mM EGTA、0.1％(v/v)Triton X-100、2mM ε-氨基己酸、10％甘油、5mM KHCO3。提取之前，立即加入2mM DTT和0.5mM PMSF。
按照已公开的描述能够测定HMG-CoA还原酶活性(例如Schaller，Grausem，Benveniste，Chye，Tan，Song和Chua，Plant Physiol.109(1995)，761-770；Chappell，Wolf，Proulx，Cuellar和Saunders，Plant Physiol.109(1995)1337-1343)。植物组织能够在冷的缓冲液(100mM磷酸钾(pH 7.0)、4mM MgCl2、5mM DTT)中进行匀浆和抽提。将匀浆液在4℃10000g离心15分钟。随后将上清液再次以100000g离心45-60分钟。测定上清液中和微粒体级分沉淀物(重悬于100mM磷酸钾(pH 7.0)和50mM DTT之后)中HMG-CoA还原酶活性。将每份溶液和悬液(悬液中蛋白质含量相当于大约1-10μg)于30℃在含有3mM NADPH和20μM(14C)HMG-CoA(58μCi/μM)的100mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中，理想体积为26μl，孵育15-60分钟。加入5μl甲羟戊酸内酯(1mg/ml)和6N HCl终止反应。加入后，将混合物在室温孵育15分钟。通过加入125μl饱和磷酸钾溶液(pH 6.0)和300μl乙酸乙酯定量反应中所形成的(14C)甲羟戊酸。将混合物充分混合并离心。通过测量闪烁测定放射性。
(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶活性，也称为lytB或IspH，被认为意思是指(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶的酶活性。
认为(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶意思是指具有将(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯转化为异戊烯基二磷酸酯和二甲基烯丙基二磷酸酯的酶活性的蛋白质。
因此，认为(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶活性意思是指在特定时间内由蛋白质(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶转化的(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯的量，或形成的异戊烯基二磷酸酯和二甲基烯丙基二磷酸酯的量。
因此，当与野生型相比(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶活性提高时，与野生型相比在特定时间内由蛋白质(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶转化的(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯的量，或形成的异戊烯基二磷酸酯和二甲基烯丙基二磷酸酯的量增加。
优选地，(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶活性与野生型(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶活性相比至少增加5％，更加优选地为至少20％，更加优选地为至少50％，更加优选地为至少100％，更加优选地为至少300％，更加优选至少增加500％，尤其是至少600％。
本发明经遗传修饰植物和野生型或参照植物中(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶活性优选地在以下条件下进行测定在研钵中加入液氮通过强力研磨匀浆冷冻植物材料并用比率从1∶1到1∶20的提取缓冲液进行抽提。所述比率取决于植物材料中可获得的酶活性，以使酶活性的测定和定量能够在线性计量范围内。一般，提取缓冲液可以含有50mM HEPES-KOH(pH 7.4)、10mM MgCl2、10mM KCl、1mMEDTA、1mM EGTA、0.1％(v/v)Triton X-100、2mM ε-氨基己酸、10％甘油、5mM KHCO3。提取之前，立即加入2mM DTT和0.5mM PMSF。
通过免疫学检测能够测定(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶活性。特异抗体的产生已经由Rohdich及其同事所描述(Rohdich，Hecht，G_rtner，Adam，Krieger，Amslinger，Arigoni，Bacher和Eisenreich对非甲羟戊酸萜烯生物合成途径的研究IspH(LytB)蛋白的代谢作用，Natl.Acad.Natl.Sci.USA 99(2002)，1158-1163)。关于催化活性的测定，Altincicek及其同事(Altincicek，Duin，Reichenberg，Hedderich，Kollas，Hintz，Wagner，Wiesner，Beck和Jomaa在类异戊二烯生物合成中，LytB蛋白催化2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸酯途径的最后一步；FEBS Letters 532(2002)437-440)描述了一种体外系统跟踪(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原成异戊烯基二磷酸酯和二甲基烯丙基二磷酸酯。
认为1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性意思是指1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的酶活性。
认为1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶意思是指具有将羟乙基-ThPP和3-磷酸甘油醛转化为1-脱氧-D-木糖-5-磷酸的酶活性的蛋白质。
因此，认为1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性意思是指在特定时间内由蛋白质1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶转化的羟乙基-ThPP和/或3-磷酸甘油醛的量，或形成的1-脱氧-D-木糖-5-磷酸的量。
因此，当与野生型相比1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性提高时，与野生型相比在特定时间内由蛋白质1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶转化的羟乙基-ThPP和/或3-磷酸甘油醛的量，或形成的1-脱氧-D-木糖-5-磷酸的量增加。
优选地，1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性与野生型1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性相比较，提高至少5％，更加优选地提高至少20％，更加优选地提高至少50％，更加优选地提高至少100％，更加优选地提高至少300％，甚至更加优选地提高至少500％，尤其是提高至少600％。
在本发明的经遗传修饰植物和野生型或参照植物中，1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性优选地在以下条件下进行测定在研钵中加入液氮通过强力研磨匀浆冷冻植物材料并用比率从1∶1到1∶20的提取缓冲液进行抽提。所述比率取决于植物材料中可获得的酶活性，以使酶活性的测定和定量能够在线性计量范围内。一般，提取缓冲液可以含有50mM HEPES-KOH(pH 7.4)、10mM MgCl2、10mM KCl、1mMEDTA、1mM EGTA、0.1％(v/v)Triton X-100、2mM ε-氨基己酸、10％甘油、5mM KHCO3。提取之前，立即加入2mM DTT和0.5mM PMSF。
测定D-1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶活性(DXS)的反应混合物(50-200μl)含有100mM Tris-HCl(pH 8.0)、3mM MgCl2、3mM MnCl2、3mM ATP、1mM硫胺素二磷酸酯、0.1％吐温60、1mM氟化钾、30μM(2-14C)丙酮酸(0.5μCi)、0.6mM DL-3-磷酸甘油醛。将植物提取物于37℃在反应溶液中孵育1-2小时。随后，加热至80℃ 3分钟终止反应。以每分钟13000转离心5分钟之后，蒸发上清液，将剩余物重悬于50μl甲醇，应用于TLC板进行薄层层析(硅胶60，Merck，Darmstadt)并在正丙醇/乙酸乙酯/水(6∶1∶3；v/v/v)中进行分离。放射性标记的D-1-脱氧木酮糖-5-磷酸(或D-1-脱氧木酮糖)与(2-14C)丙酮酸分离。使用闪烁计数器进行定量。该方法已经描述于Harker和Bramley(FEBS Letters 448(1999)115-119)。另外，测定DXS合酶活性的荧光测定法已经由Querol及其同事进行了描述(Analytical Biochemistry 296(2001)101-105)。
认为1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶活性意思是指1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的酶活性。
认为1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶意思是指具有将1-脱氧-D-木糖-5-磷酸转化为β-胡萝卜素的酶活性的蛋白质。
因此，认为1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶活性意思是指在特定时间内由蛋白质1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶转化的1-脱氧-D-木糖-5-磷酸的量，或形成的异戊烯基二磷酸酯的量。
因此，当与野生型相比1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶活性提高时，与野生型相比在特定时间内由蛋白质1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶转化的1-脱氧-D-木糖-5-磷酸的量，或形成的异戊烯基二磷酸酯的量增加。
优选地，1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶活性与野生型1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶活性相比较，提高至少5％，更加优选地提高至少20％，更加优选地提高至少50％，更加优选地提高至少100％，更加优选地提高至少300％，甚至更加优选地提高至少500％，尤其是提高至少600％。
在本发明的经遗传修饰植物和野生型或参照植物中，1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶活性优选地在以下条件下进行测定在研钵中加入液氮通过强力研磨匀浆冷冻植物材料并用比率从1∶1到1∶20的提取缓冲液进行抽提。所述比率取决于植物材料中可获得的酶活性，以使酶活性的测定和定量能够在线性计量范围内。一般，提取缓冲液可以含有50mM HEPES-KOH(pH 7.4)、10mM MgCl2、10mM KCl、1mMEDTA、1mM EGTA、0.1％(v/v)Triton X-100、2mM ε-氨基己酸、10％甘油、5mM KHCO3。提取之前，立即加入2mM DTT和0.5mM PMSF。
D-1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)的活性在含有100mMTris-HCl(pH 7.5)、1mM MnCl2、0.3mM NADPH和0.3mM 1-脱氧-D-木酮糖-4-磷酸的缓冲液中进行测定，其中1-脱氧-D-木酮糖-4-磷酸能够酶学合成，例如(Kuzuyama，Takahashi，Watanabe和SetoTetrahedon letters39(1998)4509-4512)。加入植物提取物开始反应。反应体积一般为0.2到0.5ml；37℃孵育30-60分钟。孵育期间，在340nm处用光度计跟踪测定NADPH的氧化作用。
认为异戊烯基二磷酸酯Δ-异构酶活性意思是指异戊烯基-二磷酸酯Δ-异构酶的酶活性。
认为异戊烯基-二磷酸酯Δ-异构酶意思是指具有将异戊烯基二磷酸酯转化为二甲基烯丙基磷酸酯的酶活性的蛋白质。
因此，认为异戊烯基-二磷酸酯Δ-异构酶活性意思是指在特定时间内由异戊烯基-二磷酸酯Δ-异构酶转化的异戊烯基二磷酸酯的量或形成的二甲基烯丙基磷酸酯的量。
因此，当与野生型相比异戊烯基-二磷酸酯Δ-异构酶活性提高时，与野生型相比在特定时间内由蛋白质异戊烯基-二磷酸酯Δ-异构酶转化的异戊烯基二磷酸酯的量或形成的二甲基烯丙基磷酸酯的量增加。
优选地，异戊烯基-二磷酸酯Δ-异构酶活性与野生型异戊烯基-二磷酸酯Δ-异构酶活性相比较，提高至少5％，更加优选地提高至少20％，更加优选地提高至少50％，更加优选地提高至少100％，更加优选地提高至少300％，甚至更加优选地提高至少500％，尤其是提高至少600％。
在本发明的经遗传修饰植物和野生型或参照植物中，异戊烯基-二磷酸酯Δ-异构酶活性优选地在以下条件下进行测定在研钵中加入液氮通过强力研磨匀浆冷冻植物材料并用比率从1∶1到1∶20的提取缓冲液进行抽提。所述比率取决于植物材料中可获得的酶活性，以使酶活性的测定和定量能够在线性计量范围内。一般，提取缓冲液可以含有50mM HEPES-KOH(pH 7.4)、10mM MgCl2、10mM KCl、1mMEDTA、1mM EGTA、0.1％(v/v)Triton X-100、2mM ε-氨基己酸、10％甘油、5mM KHCO3。提取之前，立即加入2mM DTT和0.5mM PMSF。
按照由Fraser及其同事所公开的方法能够测定异戊烯基-二磷酸酯异构酶(IPP异构酶)活性(Fraser，R_mer，Shipton，Mills，Kiano，Misawa，Drake，Schuch和Bramley评估以果实特异性方式表达额外的八氢番茄红素合酶的转基因番茄植物；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(2002)，1092-1097，其基于Fraser，Pinto，Holloway和Bramley，Plant Journal 24(2000)，551-558)。对于酶测定，使用0.5μCi(1-14C)IPP(异戊烯基焦磷酸酯)(56mCi/mmol，Amersham plc)作为底物在含有1mM DTT、4mM MgCl2、6mM MnCl2、3mM ATP、0.1％吐温60、1mM氟化钾的0.4M Tris-HCl(pH 8.0)中体积为大约150-500μl进行孵育。将提取物与缓冲液混合(例如以1∶1的比例)并在28℃孵育至少5小时。随后，加入大约200μl甲醇并通过加入浓盐酸(终浓度为25％)在37℃孵育大约1小时进行酸水解。然后，使用石油醚(与10％二乙醚混合)进行两次重复抽提(每次500μl)。使用闪烁计数器测定每一上层相(hyperphase)中的放射性。使用5分钟的短期孵育能够测定特异酶活性，因为短的反应时间抑制反应副产物的形成(见Lützow和Beyer在黄水仙色质体中异戊烯基-二磷酸酯Δ-异构酶及其与八氢番茄红素合酶复合体的关系；Biochim.Biophys.Acta 959(1988)，118-126)。
认为牻牛儿基-二磷酸酯合酶活性意思是指牻牛儿基-二磷酸酯合酶的酶活性。
认为牻牛儿基-二磷酸酯合酶意思是指具有将异戊烯基二磷酸酯和二甲基烯丙基磷酸酯转化为牻牛儿基-二磷酸酯的酶活性的蛋白质。
因此，认为牻牛儿基-二磷酸酯合酶活性意思是指在特定时间内由蛋白质牻牛儿基-二磷酸酯合酶转化的异戊烯基二磷酸酯和/或二甲基烯丙基磷酸酯的量，或形成的牻牛儿基-二磷酸酯的量。
因此，当与野生型相比牻牛儿基-二磷酸酯合酶活性提高时，与野生型相比在特定时间内由蛋白质牻牛儿基-二磷酸酯合酶转化的异戊烯基二磷酸酯和/或二甲基烯丙基磷酸酯的量，或形成的牻牛儿基-二磷酸酯的量增加。
优选地，牻牛儿基-二磷酸酯合酶活性与野生型牻牛儿基-二磷酸酯合酶活性相比较，提高至少5％，更加优选地提高至少20％，更加优选地提高至少50％，更加优选地提高至少100％，更加优选地提高至少300％，甚至更加优选地提高至少500％，尤其是提高至少600％。
在本发明的经遗传修饰植物和野生型或参照植物中，牻牛儿基-二磷酸酯合酶活性优选地在以下条件下进行测定在研钵中加入液氮通过强力研磨匀浆冷冻植物材料并用比率从1∶1到1∶20的提取缓冲液进行抽提。所述比率取决于植物材料中可获得的酶活性，以使酶活性的测定和定量能够在线性计量范围内。一般，提取缓冲液可以含有50mM HEPES-KOH(pH 7.4)、10mM MgCl2、10mM KCl、1mMEDTA、1mM EGTA、0.1％(v/v)Triton X-100、2mM ε-氨基己酸、10％甘油、5mM KHCO3。提取之前，立即加入2mM DTT和0.5mM PMSF。
加入植物提取物之后能够测定在50mM Tris-HCl(pH 7.6)、10mMMgCl2、5mM MnCl2、2mM DTT、1mM ATP、0.2％吐温-20、5μM(14C)IPP和50μM DMAPP(二甲基烯丙基焦磷酸酯)中的牻牛儿基-二磷酸酯合酶(GPP合酶)的活性(按照Bouvier，Suire，d’Harlingue，Backhaus和Camara牻牛儿基-二磷酸酯合酶的分子克隆及在植物细胞中单萜合成的区室化，Plant Journal 24(2000)241-252)。37℃孵育，如2小时后，将反应产物去磷酸化(按照Koyama，Fuji和Ogura聚异戊二烯焦磷酸酯的酶促水解，Methods Enzymol.110(1985)，153-155)并用薄层层析法和放射性掺入测定法进行分析(Dogbo，Bardat，Quennemet和Camara质体萜类化合物的代谢通过苯乙基焦磷酸酯(phenethyl pyrophosphate)衍生物体外抑制八氢番茄红素合成，FEBS Letters 219(1987)211-215)。
认为法呢基二磷酸酯合酶活性意思是指法呢基二磷酸酯合酶的酶活性。
认为法呢基二磷酸酯合酶意思是指具有将牻牛儿基二磷酸酯和异戊烯基二磷酸酯转化为法呢基二磷酸酯的酶活性的蛋白质。
因此，法呢基二磷酸酯合酶活性是在特定时间内由蛋白质法呢基二磷酸酯合酶转化的牻牛儿基二磷酸酯和异戊烯基二磷酸酯的量，或形成的法呢基二磷酸酯的量。
因此，当与野生型相比法呢基二磷酸酯合酶活性提高时，与野生型相比在特定时间内由蛋白质法呢基二磷酸酯合酶转化的牻牛儿基二磷酸酯和异戊烯基二磷酸酯的量，或形成的法呢基二磷酸酯的量增加。
优选地，法呢基二磷酸酯合酶活性与野生型法呢基二磷酸酯合酶活性相比较，提高至少5％，更加优选地提高至少20％，更加优选地提高至少50％，更加优选地提高至少100％，更加优选地提高至少300％，甚至更加优选地提高至少500％，尤其是提高至少600％。
在本发明的经遗传修饰植物和野生型或参照植物中，法呢基二磷酸酯合酶活性优选地在以下条件下进行测定在研钵中加入液氮通过强力研磨匀浆冷冻植物材料并用比率从1∶1到1∶20的提取缓冲液进行抽提。所述比率取决于植物材料中可获得的酶活性，以使酶活性的测定和定量能够在线性计量范围内。一般，提取缓冲液可以含有50mM HEPES-KOH(pH 7.4)、10mM MgCl2、10mM KCl、1mMEDTA、1mM EGTA、0.1％(v/v)Triton X-100、2mM ε-氨基己酸、10％甘油、5mM KHCO3。提取之前，立即加入2mM DTT和0.5mM PMSF。
按照Joly和Edwards的方法能够测定焦磷酸法尼酯合酶(FPP合酶)的活性(Journal of Biological Chemistry 268(1993)，26983-26989)。据此，在10mM HEPES(pH 7.2)、1mM MgCl2、1mM二硫苏糖醇、20μM牻牛儿基焦磷酸酯和40μM(1-14C)异戊烯基焦磷酸酯(4Ci/mmol)缓冲液中测定酶活性。将反应混合物在37℃孵育；加入2.5N HCl(在含有19μg/ml法呢醇的70％乙醇中)终止反应。然后通过在37℃30分钟内进行酸水解水解反应产物。加入10％ NaOH中和混合物，并通过与己烷振荡进行抽提。利用闪烁计数器测定每份己烷相以测定放射性掺入。
另外，将植物提取物与放射性标记的IPP孵育之后，通过在苯/甲醇(9∶1)中薄层层析(Silica-Gel SE60，Merck)能够分离反应产物。洗脱放射性标记的产物并测定放射性(按照Gaffe，Bru，Causse，Vidal，Stamitti-Bert，Carde和Gallusci在果实早期发育期间高表达的一种番茄焦磷酸法尼酯基因LEFPS1；Plant Physiology 123(2000)1351-1362)。
认为牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶活性意思是指牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的酶活性。
认为牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶意思是指具有将法呢基二磷酸酯和异戊烯基二磷酸酯转化为牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯的酶活性的蛋白质。
因此，认为牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶活性意思是指在特定时间内由蛋白质牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶转化的法呢基二磷酸酯和/或异戊烯基二磷酸酯的量，或形成的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯的量。
因此，当与野生型相比牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶活性提高时，与野生型相比在特定时间内由蛋白质牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶转化的法呢基二磷酸酯和/或异戊烯基二磷酸酯的量，或形成的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯的量增加。
优选地，牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶活性与野生型活性相比较，提高至少5％，更加优选地提高至少20％，更加优选地提高至少50％，更加优选地提高至少100％，更加优选地提高至少300％，甚至更加优选地提高至少500％，尤其是提高至少600％。
在本发明的经遗传修饰植物和野生型或参照植物中，牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶活性优选地在以下条件下进行测定在研钵中加入液氮通过强力研磨匀浆冷冻植物材料并用比率从1∶1到1∶20的提取缓冲液进行抽提。所述比率取决于植物材料中可获得的酶活性，以使酶活性的测定和定量能够在线性计量范围内。一般，提取缓冲液可以含有50mM HEPES-KOH(pH 7.4)、10mM MgCl2、10mM KCl、1mMEDTA、1mM EGTA、0.1％(v/v)Triton X-100、2mM ε-氨基己酸、10％甘油、5mM KHCO3。提取之前，立即加入2mM DTT和0.5mM PMSF。
按照Dogbo和Camara所述的方法能够测定牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸酯合酶(GGPP合酶)的活性(Biochim.Biophys.Acta 920(1987)，140-148通过亲和层析自辣椒色质体纯化异戊烯基焦磷酸酯异构酶和牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸酯合酶)。因此，将植物提取物加入到总体积大约为200μl的缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 7.6)、2mM MgCl2、1mM MnCl2、2mM二硫苏糖醇、(1-14C)IPP(0.1μCi、10μM)、15μM DMAPP、GPP或FPP)中。在30℃孵育1-2小时(或更长)。加入0.5ml乙醇和0.1ml 6N HCl终止反应。37℃孵育10分钟之后，用6N NaOH中和反应混合物，与1ml水混合并与4ml乙醚振荡进行抽提。利用闪烁计数器测定一份乙醚相(如0.2ml)中的放射性。另外，酸水解之后，通过在乙醚中振荡可抽提放射性标记的异戊烯醇并通过HPLC(25cm Spherisorb ODS-1柱，5μm；用甲醇/水(90∶10；v/v)以1ml/分钟的流速洗脱)进行分离，并通过监测放射性定量(Wiedemann，Misawa和Sandmann来自嗜夏孢欧文氏菌(Erwiniauredovora)的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸酯合酶在大肠杆菌中表达后的纯化和酶学特性)。
认为八氢番茄红素合酶活性意思是指八氢番茄红素合酶的酶活性。
认为八氢番茄红素合酶意思是指具有将番茄红素末端线性残基转化为β-紫罗酮环的酶活性的蛋白质。
具体而言，认为八氢番茄红素合酶意思是指具有将牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯转化为八氢番茄红素的酶活性的蛋白质。
因此，认为八氢番茄红素合酶活性意思是指在特定时间内由蛋白质八氢番茄红素合酶转化的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯的量，或形成的八氢番茄红素的量。
因此，当与野生型相比八氢番茄红素合酶活性提高时，与野生型相比在特定时间内由蛋白质八氢番茄红素合酶转化的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯的量，或形成的八氢番茄红素的量增加。
优选地，认为八氢番茄红素合酶活性与野生型八氢番茄红素合酶活性相比较，提高至少5％，更加优选地提高至少20％，更加优选地提高至少50％，更加优选地提高至少100％，更加优选地提高至少300％，甚至更加优选地提高至少500％，尤其是提高至少600％。
在本发明的经遗传修饰植物和野生型或参照植物中，八氢番茄红素合酶活性优选地在以下条件下进行测定在研钵中加入液氮通过强力研磨匀浆冷冻植物材料并用比率从1∶1到1∶20的提取缓冲液进行抽提。所述比率取决于植物材料中可获得的酶活性，以使酶活性的测定和定量能够在线性计量范围内。一般，提取缓冲液可以含有50mM HEPES-KOH(pH 7.4)、10mM MgCl2、10mM KCl、1mMEDTA、1mM EGTA、0.1％(v/v)Triton X-100、2mM ε-氨基己酸、10％甘油、5mM KHCO3。提取之前，立即加入2mM DTT和0.5mM PMSF。
通过Fraser及其同事所公开的方法能够测定八氢番茄红素合酶(PSY)活性(Fraser，Romer，Shipton，Mills，Kiano，Misawa，Drake，Schuch和Bramley对转基因番茄植物以果实特异性方式表达额外的八氢番茄红素合酶的评估，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(2002)，1092-1097，其基于Fraser，Pinto，Holloway和Bramley，Plant Journal 24(2000)551-558)。对于酶测定法，以(3H)牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸酯(15mCi/mM，AmericanRadiolabeled Chemicals，St.Louis)作为底物在含有1mM DTT、4mMMgCl2、6mM MnCl2、3mM ATP、0.1％吐温60、1mM氟化钾的0.4MTris-HCl(pH 8.0)中进行。将植物提取物与缓冲液混合，例如将295μl缓冲液与提取物以总体积为500μl进行孵育。在28℃孵育至少5小时。然后，用氯仿两次(每次500μl)振荡抽提八氢番茄红素。在反应过程中，用甲醇/水(95∶5；v/v)在二氧化硅板上利用薄层层析法分离所形成的放射性标记的八氢番茄红素。在富碘环境下(通过加热几块碘晶体)在二氧化硅板上能够鉴定八氢番茄红素。以八氢番茄红素标准品作为参照。通过闪烁计数器测定法检测放射性标记产物的量。此外，利用装有放射性探测器的HPLC也能够定量八氢番茄红素(Fraser、Albrecht和Sandmann开发高效液相色谱体系以用于分离放射性标记的胡萝卜素和在特定酶促反应中形成的前体；J.Chromatogr.645(1993)265-272)。
认为八氢番茄红素去饱和酶活性意思是指八氢番茄红素去饱和酶的酶活性。
认为八氢番茄红素去饱和酶意思是指具有将八氢番茄红素转化为六氢番茄红素和/或将六氢番茄红素转化为ζ-胡萝卜素(zeta-胡萝卜素)的酶活性的蛋白质。
因此，认为八氢番茄红素去饱和酶活性意思是指在特定时间内由蛋白质八氢番茄红素去饱和酶转化的八氢番茄红素或六氢番茄红素的量或形成的六氢番茄红素或ζ-胡萝卜素的量。
因此，当与野生型相比八氢番茄红素去饱和酶活性提高时，与野生型相比在特定时间内由蛋白质八氢番茄红素去饱和酶转化的八氢番茄红素或六氢番茄红素的量或形成的六氢番茄红素或ζ-胡萝卜素的量增加。
优选地，认为八氢番茄红素去饱和酶活性与野生型八氢番茄红素去饱和酶活性相比较，提高至少5％，更加优选地提高至少20％，更加优选地提高至少50％，更加优选地提高至少100％，更加优选地提高至少300％，甚至更加优选地提高至少500％，尤其是提高至少600％。
在本发明的经遗传修饰植物和野生型或参照植物中，八氢番茄红素去饱和酶活性优选地在以下条件下进行测定在研钵中加入液氮通过强力研磨匀浆冷冻植物材料并用比率从1∶1到1∶20的提取缓冲液进行抽提。所述比率取决于植物材料中可获得的酶活性，以使酶活性的测定和定量能够在线性计量范围内。一般，提取缓冲液可以含有50mM HEPES-KOH(pH 7.4)、10mM MgCl2、10mM KCl、1mMEDTA、1mM EGTA、0.1％(v/v)Triton X-100、2mM ε-氨基己酸、10％甘油、5mM KHCO3。提取之前，立即加入2mM DTT和0.5mM PMSF。
通过将放射性标记的(14C)八氢番茄红素掺入不饱和胡萝卜素能够测定八氢番茄红素去饱和酶(PDS)的活性(如R_mer，Fraser，Kiano，Shipton，Misawa，Schuch和Bramley所报导评估转基因番茄植物中前维生素A含量；Nature Biotechnology 18(2000)666-669)。可如Fraser所述合成放射性标记的八氢番茄红素(Fraser，De la Rivas，Mackenzie，Bramley布拉克须霉(Phycomyces blakesleanus)CarB突变体它们在测定八氢番茄红素去饱和酶中的用途；Phytochemistry 30(1991)，3971-3976)。可与含有10mM MgCl2和1mM二硫苏糖醇的100mM MES缓冲液(pH 6.0)在1ml的总体积中孵育靶组织的质体膜。加入溶于丙酮中的(14C)八氢番茄红素(在每一情况下一次孵育大约100000裂变/分钟)，其中丙酮浓度不超过5％(v/v)。在暗处将混合物在28℃振荡孵育大约6-7小时。随后，用大约5ml石油醚(与10％乙醚混合)三次抽提色素并用HPLC法分离并定量。
另外，可如Fraser等所报导测定八氢番茄红素去饱和酶的活性(Fraser，Misawa，Linden，Yamano，Kobayashi和Sandmann在大肠杆菌中表达、纯化和再活化重组的嗜夏孢欧文氏菌八氢番茄红素去饱和酶，Journal ofBiological Chemistry 267(1992)，19891-19895)。
认为ζ-胡萝卜素去饱和酶活性意思是指ζ-胡萝卜素去饱和酶的酶活性。
认为ζ-胡萝卜素去饱和酶意思是指具有将ζ-胡萝卜素转化为四氢番茄红素和/或将四氢番茄红素转化为番茄红素的酶活性的蛋白质。
因此，认为ζ-胡萝卜素去饱和酶活性意思是指在特定时间内由蛋白质ζ-胡萝卜素去饱和酶转化的ζ-胡萝卜素或四氢番茄红素的量，或形成的四氢番茄红素或番茄红素的量。
因此，当与野生型相比ζ-胡萝卜素去饱和酶活性提高时，与野生型相比在特定时间内由蛋白质ζ-胡萝卜素去饱和酶转化的ζ-胡萝卜素或四氢番茄红素的量，或形成的四氢番茄红素或番茄红素的量增加。
优选地，认为ζ-胡萝卜素去饱和酶活性与野生型ζ-胡萝卜素去饱和酶活性相比较，提高至少5％，更加优选地提高至少20％，更加优选地提高至少50％，更加优选地提高至少100％，更加优选地提高至少300％，甚至更加优选地提高至少500％，尤其是提高至少600％。
在本发明的经遗传修饰植物和野生型或参照植物中，ζ-胡萝卜素去饱和酶活性优选地在以下条件下进行测定在研钵中加入液氮通过强力研磨匀浆冷冻植物材料并用比率从1∶1到1∶20的提取缓冲液进行抽提。所述比率取决于植物材料中可获得的酶活性，以使酶活性的测定和定量能够在线性计量范围内。一般，提取缓冲液可以含有50mM HEPES-KOH(pH 7.4)、10mM MgCl2、10mM KCl、1mMEDTA、1mM EGTA、0.1％(v/v)Triton X-100、2mM ε-氨基己酸、10％甘油、5mM KHCO3。提取之前，立即加入2mM DTT和0.5mM PMSF。
可在0.2M磷酸钾(pH 7.8，缓冲液体积大约1ml)中进行测定ζ-胡萝卜素去饱和酶(ZDS去饱和酶)的分析。Breitenbach及其同事公开了测定的分析法(Breitenbach，Kuntz，Takaichi和Sandmann表达并纯化的高等植物类型来自辣椒的ζ-胡萝卜素去饱和酶的催化特性；European Journal ofBiochemistry.265(1)376-383，1999年10月)。每种分析测定混合物含有3mg悬浮于0.4M磷酸钾缓冲液(pH 7.8)中的磷脂酰胆碱、5μg ζ-胡萝卜素或四氢番茄红素、0.02％丁基羟基甲苯、10μl癸基质体醌(1mM甲醇贮存液)和植物提取物。植物提取物的体积调整至ZDS去饱和酶活性存在的量以便可能在线性测量范围内进行定量。一般在黑暗处于约28℃时通过剧烈振荡(200转/分钟)孵育约17小时。通过加入4ml丙酮在50℃时振荡10分钟抽提类胡萝卜素。在该混合物中，类胡萝卜素转移至石油醚相(含有10％乙醚)。在氮气下，蒸发乙醚/石油醚相，将类胡萝卜素重新溶于20μl并利用HPLC法进行分离和定量。
认为crtlSO活性意思是指crtlSO蛋白的酶活性。
认为crtlSO蛋白意思是指具有将7，9，7’，9’-四-顺式-番茄红素转化为全反式-番茄红素的酶活性的蛋白质。
因此，认为crtlSO活性意思是指在特定时间内由蛋白质b-环化酶转化的7，9，7’，9’-四-顺式-番茄红素的量或形成的全反式-番茄红素的量。
因此，当与野生型相比crtlSO活性提高时，与野生型相比在特定时间内由crtlSO蛋白转化的7，9，7’，9’-四-顺式-番茄红素的量，或形成的全反式-番茄红素的量增加。
优选地，crtlSO活性与野生型crtlSO活性相比较，提高至少5％，更加优选地提高至少20％，更加优选地提高至少50％，更加优选地提高至少100％，更加优选地提高至少300％，甚至更加优选地提高至少500％，尤其是提高至少600％。
在本发明的经遗传修饰植物和野生型或参照植物中，crtlSO活性优选地在以下条件下进行测定在研钵中加入液氮通过强力研磨匀浆冷冻植物材料并用比率从1∶1到1∶20的提取缓冲液进行抽提。所述比率取决于植物材料中可获得的酶活性，以使酶活性的测定和定量能够在线性计量范围内。一般，提取缓冲液可以含有50mM HEPES-KOH(pH 7.4)、10mM MgCl2、10mM KCl、1mMEDTA、1mM EGTA、0.1％(v/v)Triton X-100、2mM ε-氨基己酸、10％甘油、5mM KHCO3。提取之前，立即加入2mM DTT和0.5mM PMSF。
认为FtsZ活性意思是指FtsZ蛋白的生理学活性。
认为FtsZ蛋白意思是指具有促进细胞分裂和质体分裂活性并且与微管蛋白质同源的蛋白质。
认为MinD活性意思是指MinD蛋白质的生理学活性。
认为MinD蛋白质意思是指在细胞分裂中具有多功能作用的蛋白质。它是一种膜相关ATP酶并且在细胞内可显示出从一极到另一极的振动运动。
而且，非甲羟戊酸途径的酶的活性增加能够导致目的酮式类胡萝卜素(ketocarotenoid)终产物的进一步增加。其实例是4-二磷酸胞苷(diphosphocytidyl)-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶和2-C-甲基-D-赤藓醇-2，4-环二磷酸酯合酶。通过修饰相应基因的基因表达，能够提高所述酶的活性。以标准方式通过抗体和相应印迹技术能够检测相应蛋白质的浓度改变。HMG-CoA还原酶活性和/或(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶活性和/或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性和/或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶活性和/或异戊烯基-二磷酸酯Δ-异构酶活性和/或牻牛儿基-二磷酸酯合酶活性和/或法呢基二磷酸酯合酶活性和/或牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶活性和/或八氢番茄红素合酶活性和/或八氢番茄红素去饱和酶活性和/或ζ-胡萝卜素去饱和酶活性和/或crtlSO活性和/或FtsZ活性和/或MinD活性可通过多种方式与野生型相比得到提高，例如通过在表达和蛋白质水平关闭限制性调控机制，或通过增加编码HMG-CoA还原酶的核酸和/或编码(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶的核酸和/或编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的核酸和/或编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的核酸和/或编码异戊烯基-二磷酸酯Δ-异构酶的核酸和/或编码牻牛儿基-二磷酸酯合酶的核酸和/或编码法呢基二磷酸酯合酶的核酸和/或编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸和/或编码八氢番茄红素合酶的核酸和/或编码八氢番茄红素去饱和酶的核酸和/或编码ζ-胡萝卜素去饱和酶的核酸和/或编码crtlSO蛋白的核酸和/或编码FtsZ蛋白的核酸和/或编码MinD蛋白质的核酸的基因表达。
也可通过多种方式使编码HMG-CoA还原酶的核酸和/或编码(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶的核酸和/或编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的核酸和/或编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的核酸和/或编码异戊烯基-二磷酸酯Δ-异构酶的核酸和/或编码牻牛儿基-二磷酸酯合酶的核酸和/或编码法呢基二磷酸酯合酶的核酸和/或编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸和/或编码八氢番茄红素合酶的核酸和/或编码八氢番茄红素去饱和酶的核酸和/或编码ζ-胡萝卜素去饱和酶的核酸和/或编码crtlSO蛋白的核酸和/或编码FtsZ蛋白的核酸和/或编码MinD蛋白质的核酸的基因表达与野生型相比得到提高，例如通过激活子诱导HMG-CoA还原酶基因和/或(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶基因和/或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶基因和/或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶基因和/或异戊烯基-二磷酸酯Δ-异构酶基因和/或牻牛儿基-二磷酸酯合酶基因和/或法呢基二磷酸酯合酶基因和/或牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶基因和/或八氢番茄红素合酶基因和/或八氢番茄红素去饱和酶基因和/或ζ-胡萝卜素去饱和酶基因和/或crtlSO基因和/或Fts基因和/或MinD基因，或者通过将一个或多个拷贝的HMG-CoA还原酶基因和/或(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶基因和/或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶基因和/或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶基因和/或异戊烯基-二磷酸酯Δ-异构酶基因和/或牻牛儿基-二磷酸酯合酶基因和/或法呢基二磷酸酯合酶基因和/或牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶基因和/或八氢番茄红素合酶基因和/或八氢番茄红素去饱和酶基因和/或ζ-胡萝卜素去饱和酶基因和/或crtlSO基因和/或Fts基因和/或MinD基因导入植物，也可通过将至少一个编码HMG-CoA还原酶的核酸和/或至少一个编码(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶的核酸和/或至少一个编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的核酸和/或至少一个编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的核酸和/或至少一个编码异戊烯基-二磷酸酯Δ-异构酶的核酸和/或至少一个编码牻牛儿基-二磷酸酯合酶的核酸和/或至少一个编码法呢基二磷酸酯合酶的核酸和/或至少一个编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸和/或至少一个编码八氢番茄红素合酶的核酸和/或至少一个编码八氢番茄红素去饱和酶的核酸和/或至少一个编码ζ-胡萝卜素去饱和酶的核酸和/或至少一个编码crtlSO蛋白的核酸和/或至少一个编码FtsZ蛋白的核酸和/或至少一个编码MinD蛋白质的核酸导入植物。
根据本发明也认为编码HMG-CoA还原酶和/或(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶和/或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶和/或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶和/或异戊烯基-二磷酸酯Δ-异构酶和/或牻牛儿基-二磷酸酯合酶和/或法呢基二磷酸酯合酶和/或牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶和/或八氢番茄红素合酶和/或八氢番茄红素去饱和酶和/或ζ-胡萝卜素去饱和酶和/或crtlSO蛋白和/或FtsZ蛋白和/或MinD蛋白质的核酸的基因表达提高意思是指操纵植物固有的、内源性HMG-CoA还原酶和/或(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶和/或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶和/或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶和/或异戊烯基-二磷酸酯Δ-异构酶和/或牻牛儿基-二磷酸酯合酶和/或法呢基二磷酸酯合酶和/或牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶和/或八氢番茄红素合酶和/或八氢番茄红素去饱和酶和/或ζ-胡萝卜素去饱和酶和/或crtlSO蛋白和/或FtsZ蛋白和/或MinD蛋白质的表达。
例如，这能够通过修饰相应的启动子DNA序列得以实现。例如通过DNA序列的缺失或插入能够实现此种引起基因表达率提高的修饰。
在优选的实施方案中，通过将至少一个编码HMG-CoA还原酶的核酸导入植物和/或通过将至少一个编码(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶的核酸导入植物和/或通过将至少一个编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的核酸导入植物和/或通过将至少一个编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的核酸导入植物和/或通过将至少一个编码异戊烯基-二磷酸酯Δ-异构酶的核酸导入植物和/或通过将至少一个编码牻牛儿基-二磷酸酯合酶的核酸导入植物和/或通过将至少一个编码法呢基二磷酸酯合酶的核酸导入植物和/或通过将至少一个编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸导入植物和/或通过将至少一个编码八氢番茄红素合酶的核酸导入植物和/或通过将至少一个编码八氢番茄红素去饱和酶的核酸导入植物和/或通过将至少一个编码ζ-胡萝卜素去饱和酶的核酸导入植物和/或通过将至少一个编码crtlSO蛋白的核酸导入植物和/或通过将至少一个编码FtsZ蛋白的核酸导入植物和/或通过将至少一个编码MinD蛋白质的核酸导入植物中，实现编码HMG-CoA还原酶的核酸基因表达的提高和/或编码(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶的核酸基因表达的提高和/或编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的核酸基因表达的提高和/或编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的核酸基因表达的提高和/或编码异戊烯基-二磷酸酯Δ-异构酶的核酸基因表达的提高和/或编码牻牛儿基-二磷酸酯合酶的核酸基因表达的提高和/或编码法呢基二磷酸酯合酶的核酸基因表达的提高和/或编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸基因表达的提高和/或编码八氢番茄红素合酶的核酸基因表达的提高和/或编码八氢番茄红素去饱和酶的核酸基因表达的提高和/或编码ζ-胡萝卜素去饱和酶的核酸基因表达的提高和/或编码crtlSO蛋白的核酸基因表达的提高和/或编码FtsZ蛋白的核酸基因表达的提高和/或编码MinD蛋白质的核酸基因表达的提高。
因此，基本上，能够使用任一HMG-CoA还原酶基因或(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶基因或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶基因或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶基因或异戊烯基-二磷酸酯Δ-异构酶基因或牻牛儿基-二磷酸酯合酶基因或法呢基二磷酸酯合酶基因或牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶基因或八氢番茄红素合酶基因或八氢番茄红素去饱和酶基因或ζ-胡萝卜素去饱和酶基因或crtlSO基因或FtsZ基因或MinD基因。
当宿主植物不能表达相应蛋白质，或不能被赋予表达相应蛋白质的能力时，在真核来源的含有内含子的基因组HMG-CoA还原酶序列或(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶序列或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶序列或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶序列或异戊烯基-二磷酸酯Δ-异构酶序列或牻牛儿基-二磷酸酯合酶序列或法呢基二磷酸酯合酶序列或牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶序列或八氢番茄红素合酶序列或八氢番茄红素去饱和酶序列或ζ-胡萝卜素去饱和酶序列或crtlSO序列或FtsZ序列或MinD序列中，优选地使用经预先加工了的核酸序列，如相应的cDNA。
因此，在该优选的实施方案中，与野生型相比，在本发明优选的转基因植物中含有至少一个额外的HMG-CoA还原酶基因和/或(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶基因和/或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶基因和/或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶基因和/或异戊烯基-二磷酸酯Δ-异构酶基因和/或牻牛儿基-二磷酸酯合酶基因和/或法呢基二磷酸酯合酶基因和/或牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶基因和/或八氢番茄红素合酶基因和/或八氢番茄红素去饱和酶基因和/或ζ-胡萝卜素去饱和酶基因和/或crtlSO基因和/或FtsZ基因和/或MinD基因。
在该优选的实施方案中，经遗传修饰植物具有，例如，至少一个编码HMG-CoA还原酶的外源核酸或至少两个编码HMG-CoA还原酶的内源核酸和/或至少一个编码(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶的外源核酸或至少两个编码(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶的内源核酸和/或至少一个编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的外源核酸或至少两个编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的内源核酸和/或至少一个编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的外源核酸或至少两个编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的内源核酸和/或至少一个编码异戊烯基-二磷酸酯Δ-异构酶的外源核酸或至少两个编码异戊烯基-二磷酸酯Δ-异构酶的内源核酸和/或至少一个编码牻牛儿基-二磷酸酯合酶的外源核酸或至少两个编码牻牛儿基-二磷酸酯合酶的内源核酸和/或至少一个编码法呢基二磷酸酯合酶的外源核酸或至少两个编码法呢基二磷酸酯合酶的内源核酸和/或至少一个编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的外源核酸或至少两个编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的内源核酸和/或至少一个编码八氢番茄红素合酶的外源核酸或至少两个编码八氢番茄红素合酶的内源核酸和/或至少一个编码八氢番茄红素去饱和酶的外源核酸或至少两个编码八氢番茄红素去饱和酶的内源核酸和/或至少一个编码ζ-胡萝卜素去饱和酶的外源核酸或至少两个编码ζ-胡萝卜素去饱和酶的内源核酸和/或至少一个编码crtlSO蛋白的外源核酸或至少两个编码crtlSO蛋白的内源核酸和/或至少一个编码FtsZ蛋白的外源核酸或至少两个编码FtsZ蛋白的内源核酸和/或至少一个编码MinD蛋白质的外源核酸或至少两个编码MinD蛋白质的内源核酸。
HMG-CoA还原酶基因的实例为登录号为NM 106299的来自拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)的编码HMG-CoA还原酶的核酸(核酸SEQ ID NO111，蛋白质SEQ ID NO112)，并且还包括来自其他有机体的具有以下登录号的其他HMG-CoA还原酶基因
P54961，P54870，P54868，P54869，O02734，P22791，P54873，P54871，P23228，P13704，P54872，Q01581，P17425，P54874，P54839，P14891，P34135，O64966，P29057，P48019，P48020，P12683，P43256，Q9XEL8，P34136，O64967，P29058，P48022，Q41437，P12684，Q00583，Q9XHL5，Q41438，Q9YAS4，O76819，O28538，Q9Y7D2，P54960，O51628，P48021，Q03163，P00347，P14773，Q12577，Q59468，P04035，O24594，P09610，Q58116，O26662，Q01237，Q01559，Q12649，O74164，O59469，P51639，Q10283，O08424，P20715，P13703，P13702，Q96UG4，Q8SQZ9，O15888，Q9TUM4，P93514，Q39628，P93081，P93080，Q944T9，Q40148，Q84MM0，Q84LS3，Q9Z9N4，Q9KLM0(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶基因的实例为来自拟南芥菜编码(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶的核酸(lytB/ISPH)，登录号AY168881，(核酸SEQ ID NO113，蛋白质SEQ ID NO114)，并且还包括来自其他有机体的具有以下登录号的其他(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶基因T04781，AF270978_1，NP_485028.1，NP_442089.1，NP_681832.1，ZP_00110421.1，ZP_00071594.1，ZP_00114706.1，ISPH_SYNY3，ZP_00114087.1，ZP_00104269.1，AF398145_1，AF398146_1，AAD55762.1，AF514843_1，NP_622970.1，NP_348471.1，NP_562001.1，NP_223698.1，NP_781941.1，ZP_00080042.1，NP_859669.1，NP_214191.1，ZP_00086191.1，ISPH_VIBCH，NP_230334.1，NP_742768.1，NP_302306.1，ISPH_MYCLE，NP_602581.1，ZP_00026966.1，NP_520563.1，NP_253247.1，NP_282047.1，ZP_00038210.1，ZP_00064913.1，CAA61555.1，ZP_00125365.1，ISPH_ACICA，EAA24703.1，ZP_00013067.1，ZP_00029164.1，NP_790656.1，NP_217899.1，NP_641592.1，NP_636532.1，NP_719076.1，NP_660497.1，NP_422155.1，NP_715446.1，ZP_00090692.1，NP_759496.1，ISPH_BURPS，ZP_00129657.1，NP_215626.1，NP_335584.1，ZP_00135016.1，NP_789585.1，NP_787770.1，NP_769647.1，ZP_00043336.1，NP_242248.1，ZP_00008555.1，NP_246603.1，ZP_00030951.1，NP_670994.1，NP_404120.1，NP_540376.1，NP_733653.1，NP_697503.1，NP_840730.1，NP_274828.1，NP_796916.1，ZP_00123390.1，NP_824386.1，NP_737689.1，ZP_00021222.1，NP_757521.1，NP_390395.1，ZP_00133322.1，CAD76178.1，NP_600249.1，NP_454660.1，NP_712601.1，NP_385018.1，NP_751989.11-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶基因的实例为来自食用番茄的编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的核酸，登录号#AF143812(核酸SEQ ID NO115，蛋白质SEQ ID NO116)，并且还包括来自其他有机体的具有以下登录号的其他1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶基因AF143812_1，DXS_CAPAN，CAD22530.1，AF182286_1，NP_193291.1，T52289，AAC49368.1，AAP14353.1，D71420，DXS_ORYSA，AF443590_1，BAB02345.1，CAA09804.2，NP_850620.1，CAD22155.2，AAM65798.1，NP_566686.1，CAD22531.1，AAC33513.1，CAC08458.1，AAG10432.1，T08140，AAP14354.1，AF428463_1，ZP_00010537.1，NP_769291.1，AAK59424.1，NP_107784.1，NP_697464.1，NP_540415.1，NP_196699.1，NP_384986.1，ZP_00096461.1，ZP_00013656.1，NP_353769.1，BAA83576.1，ZP_00005919.1，ZP_00006273.1，NP_420871.1，AAM48660.1，DXS_RHOCA，ZP_00045608.1，ZP_00031686.1，NP_841218.1，ZP_00022174.1，ZP_00086851.1，NP_742690.1，NP 520342.1，ZP_00082120.1，NP_790545.1，ZP_00125266.1，CAC17468.1，NP_252733.1，ZP_00092466.1，NP_439591.1，NP_414954.1，NP_752465.1，NP_622918.1，NP_286162.1，NP_836085.1，NP_706308.1，ZP_00081148.1，NP_797065.1，NP_213598.1，NP_245469.1，ZP_00075029.1，NP_455016.1，NP_230536.1，NP_459417.1，NP_274863.1，NP_283402.1，NP_759318.1，NP_406652.1，DXS_SYNLE，DXS_SYNP7，NP_440409.1，ZP_00067331.1，ZP_00122853.1，NP_717142.1，ZP_00104889.1，NP_243645.1，NP_681412.1，DXS_SYNEL，NP_637787.1，DXS_CHLTE，ZP_00129863.1，NP_661241.1，DXS_XANCP，NP_470738.1，NP_484643.1，ZP_00108360.1，NP_833890.1，NP_846629.1，NP_658213.1，NP_642879.1，ZP_00039479.1，ZP_00060584.1，ZP_00041364.1，ZP_00117779.1，NP_299528.11-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶基因的实例为来自拟南芥菜的编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的核酸，登录号#AF148852，(核酸SEQ ID NO137，蛋白质SEQ ID NO138)，并且还包括来自其他有机体的具有以下登录号的其他1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶基因AF148852，AY084775，AY054682，AY050802，AY045634，AY081453，AY091405，AY098952，AJ242588，AB009053，AY202991，NP_201085.1，T52570，AF331705_1，BAB16915.1，AF367205_1，AF250235_1，CAC03581.1，CAD22156.1，AF182287_1，DXR_MENPI，ZP_00071219.1，NP_488391.1，ZP_00111307.1，DXR_SYNLE，AAP56260.1，NP_681831.1，NP_442113.1，ZP_00115071.1，ZP_00105106.1，ZP_00113484.1，NP_833540.1，NP_657789.1，NP_661031.1，DXR_BACHD，NP_833080.1，NP_845693.1，NP_562610.1，NP_623020.1，NP_810915.1，NP_243287.1，ZP_00118743.1，NP_464842.1，NP_470690.1，ZP_00082201.1，NP_781898.1，ZP_00123667.1，NP_348420.1，NP_604221.1，ZP_00053349.1，ZP_00064941.1，NP_246927.1，NP_389537.1，ZP_00102576.1，NP_519531.1，AF124757_19，DXR_ZYMMO，NP_713472.1，NP_459225.1，NP_454827.1，ZP_00045738.1，NP_743754.1，DXR_PSEPK，ZP_00130352.1，NP_702530.1，NP_841744.1，NP_438967.1，AF514841_1，NP_706118.1，ZP_00125845.1，NP_404661.1，NP_285867.1，NP_240064.1，NP_414715.1，ZP_00094058.1，NP_791365.1，ZP_00012448.1，ZP_00015132.1，ZP_00091545.1，NP_629822.1，NP_771495.1，NP_798691.1，NP_231885.1，NP_252340.1，ZP_00022353.1，NP_355549.1，NP_420724.1，ZP_00085169.1，EAA17616.1，NP_273242.1，NP_219574.1，NP_387094.1，NP_296721.1，ZP_00004209.1，NP_823739.1，NP_282934.1，BAA77848.1，NP_660577.1，NP_760741.1，NP_641750.1，NP_636741.1，NP_829309.1，NP_298338.1，NP_444964.1，NP_717246.1，NP_224545.1，ZP_00038451.1，DXR_KITGR，NP_778563.1.
异戊烯基-二磷酸酯Δ-异构酶基因的实例为来自巴勒斯提纳侧金盏花克隆ApIPI28的编码异戊烯基-二磷酸酯Δ-异构酶的核酸(ipiAa1)，登录号#AF188060，由Cunningham，F.X.Jr.和Gantt，E.通过在大肠杆菌中的异源互补鉴定植物中编码异戊烯基-二磷酸酯异构酶的多基因家族，Plant Cell Physiol.41(1)，119-123(2000)公开(核酸SEQ ID NO117，蛋白质SEQ ID NO118)，并且还包括来自其他有机体的具有以下登录号的其他异戊烯基-二磷酸酯Δ-异构酶基因Q38929，O48964，Q39472，Q13907，O35586，P58044，O42641，O35760，Q10132，P15496，Q9YB30，Q8YNH4，Q42553，O27997，P50740，O51627，O48965，Q8KFR5，Q39471，Q39664，Q9RVE2，Q01335，Q9HHE4，Q9BXS1，Q9KWF6，Q9CIF5，Q88WB6，Q92BX2，Q8Y7A5，Q8TT35Q9KK75，Q8NN99，Q8XD58，Q8FE75，Q46822，Q9HP40，P72002，P26173，Q9Z5D3，Q8Z3X9，Q8ZM82，Q9X7Q6，O13504，Q9HFW8，Q8NJL9，Q9UUQ1，Q9NH02，Q9M6K9，Q9M6K5，Q9FXR6，O81691，Q9S7C4，Q8S3L8，Q9M592，Q9M6K3，Q9M6K7，Q9FV48，Q9LLB6，Q9AVJ1，Q9AVG8，Q9M6K6，Q9AVJ5，Q9M6K2，Q9AYS5，Q9M6K8，Q9AVG7，Q8S3L7，Q8W250，Q94IE1，Q9AVI8，Q9AYS6，Q9SAY0，Q9M6K4，Q8GVZ0，Q84RZ8，Q8KZ12，Q8KZ66，Q8FND7，Q88QC9，Q8BFZ6，BAC26382，CAD94476.
牻牛儿基-二磷酸酯合酶基因的实例为来自拟南芥菜的编码牻牛儿基-二磷酸酯合酶的核酸，登录号#Y17376，Bouvier，F.，Suire，C.，d’Harlingue，A.，Backhaus，R.A.和Camara，B.牻牛儿基-二磷酸酯合酶的分子克隆及在植物细胞中单萜合成的区室化，Plant J.24(2)，241-252(2000)(核酸SEQ ID NO119，蛋白质SEQ ID NO120)，并且还包括来自其他有机体的具有以下登录号的其他牻牛儿基-二磷酸酯合酶基因Q9FT89，Q8LKJ2，Q9FSW8，Q8LKJ3，Q9SBR3，Q9SBR4，Q9FET8，Q8LKJ1，Q84LG1，Q9JK86法呢基二磷酸酯合酶基因的实例为登录号#U80605的来自拟南芥菜的编码法呢基二磷酸酯合酶的核酸(FPS1)由Cunillera，N.，Arro，M.，Delourme，D.，Karst，F.，Boronat，A.和Ferrer，A.拟南芥菜包含两种差异表达的法呢基二磷酸酯合酶基因，J.Biol.Chem.271(13)，7774-7780(1996)公开，(核酸SEQ ID NO121，蛋白质SEQ ID NO122)，并且还包括来自其他有机体的具有以下登录号的其他法呢基二磷酸酯合酶基因P53799，P37268，Q02769，Q09152，P49351，O24241，Q43315，P49352，O24242，P49350，P08836，P14324，P49349，P08524，O66952，Q08291，P54383，Q45220，P57537，Q8K9A0，P22939，P45204，O66126，P55539，Q9SWH9，Q9AVI7，Q9FRX2，Q9AYS7，Q94IE8，Q9FXR9，Q9ZWF6，Q9FXR8，Q9AR37，O50009，Q94IE9，Q8RVK7，Q8RVQ7，O04882，Q93RA8，Q93RB0，Q93RB4，Q93RB5，Q93RB3，Q93RB1，Q93RB2，Q920E5.
牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶基因的实例为来自白芥(Sinapis alba)的编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸，登录号#X98795，由Bonk，M.，Hoffmann，B.，Von Lintig，J.，Schledz，M.，Al-Babili，S.，Hobeika，E.，Kleinig，H.和Beyer，P.体外四种类胡萝卜素生物合成酶的色质体输入揭示了在膜结合和寡聚组装前的不同命运，Eur.J.Biochem.247(3)，942-950(1997)公开(核酸SEQ ID NO123，蛋白质SEQ ID NO124)，并且还包括来自其他有机体的具有以下登录号的其他牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶基因P22873，P34802，P56966，P80042，Q42698，Q92236，O95749，Q9WTN0，Q50727，P24322，P39464，Q9FXR3，Q9AYN2，Q9FXR2，Q9AVG6，Q9FRW4，Q9SXZ5，Q9AVJ7，Q9AYN1，Q9AVJ4，Q9FXR7，Q8LSC5，Q9AVJ6，Q8LSC4，Q9AVJ3，Q9SSU0，Q9SXZ6，Q9SST9，Q9AVJ0，Q9AVI9，Q9FRW3，Q9FXR5，Q94IF0，Q9FRX1，Q9K567，Q93RA9，Q93QX8，CAD95619，EAA31459八氢番茄红素合酶基因的实例为来自噬夏孢欧文菌的编码八氢番茄红素合酶的核酸，登录号#D90087，由Misawa，N.，Nakagawa，M.，Kobayashi，K.，Yamano，S.，Izawa，Y.，Nakamura，K.和Harashima，K.通过对大肠杆菌中表达的基因产物进行功能分析阐述噬夏孢欧文菌的类胡萝卜素生物合成途径；J.Bacteriol.172(12)，6704-6712(1990)公开，(核酸SEQ ID NO125，蛋白质SEQ ID NO126)，并且还包括来自其他有机体的具有以下登录号的其他八氢番茄红素合酶基因CAB39693，BAC69364，AAF10440，CAA45350，BAA20384，AAM72615，BAC09112，CAA48922，P_001091，CAB84588，AAF41518，CAA48155，AAD38051，AAF33237，AAG10427，AAA34187，BAB73532，CAC19567，AAM62787，CAA55391，AAB65697，AAM45379，CAC27383，AAA32836，AAK07735，BAA84763，P_000205，AAB60314，P_001163，P_000718，AAB71428，AAA34153，AAK07734，CAA42969，CAD76176，CAA68575，P_000130，P_001142，CAA47625，CAA85775，BAC14416，CAA79957，BAC76563，P_000242，P_000551，AAL02001，AAK15621，CAB94795，AAA91951，P_000448八氢番茄红素去饱和酶基因的实例为来自噬夏孢欧文菌的编码八氢番茄红素去饱和酶的核酸，登录号#D90087，由Misawa，N.，Nakagawa，M.，Kobayashi，K.，Yamano，S.，Izawa，Y.，Nakamura，K.和Harashima，K.通过对大肠杆菌中表达的基因产物进行功能分析阐述噬夏孢欧文菌的类胡萝卜素生物合成途径；J.Bacteriol.172(12)，6704-6712(1990)公开，(核酸SEQ ID NO127，蛋白质SEQ IDNO128)，并且还包括来自其他有机体的具有以下登录号的其他八氢番茄红素去饱和酶基因AAL15300，A39597，CAA42573，AAK51545，BAB08179，CAA48195，BAB82461，AAK92625，CAA55392，AAG10426，AAD02489，AAO24235，AAC12846，AAA99519，AAL38046，CAA60479，CAA75094，ZP_001041，ZP_001163，CAA39004，CAA44452，ZP_001142，ZP_000718，BAB82462，AAM45380，CAB56040，ZP_001091，BAC09113，AAP79175，AAL80005，AAM72642，AAM72043，ZP_000745，ZP_001141，BAC07889，CAD55814，ZP_001041，CAD27442，CAE00192，ZP_001163，ZP_000197，BAA18400，AAG10425，ZP_001119，AAF13698，2121278A，AAB35386，AAD02462，BAB68552，CAC85667，AAK51557，CAA12062，AAG51402，AAM63349，AAF85796，BAB74081，AAA91161，CAB56041，AAC48983，AAG14399，CAB65434，BAB73487，ZP_001117，ZP_000448，CAB39695，CAD76175，BAC69363，BAA17934，ZP_000171，AAF65586，ZP_000748，BAC07074，ZP_001133，CAA64853，BAB74484，ZP_ 001156，AAF23289，AAG28703，AAP09348，AAM71569，BAB69140，ZP_000130，AAF41516，AAG18866，CAD95940，NP_656310，AAG10645，ZP_000276，ZP_000192，ZP_000186，AAM94364，EAA31371，ZP_000612，BAC75676，AAF65582ζ-胡萝卜素去饱和酶基因的实例为来自黄水仙的编码ζ-胡萝卜素去饱和酶的核酸，登录号#AJ224683，由Al-Babili，S.，Oelschlegel，J.和Beyer，P.来自黄水仙(PGR98-103)的编码β-胡萝卜素去饱和酶的cDNA(登录号AJ224683)，Plant Physiol.117，719-719(1998)公开(核酸SEQ ID NO129，蛋白质SEQ ID NO130)，并且还包括来自其他有机体的具有以下登录号的其他ζ-胡萝卜素去饱和酶基因Q9R6X4，Q38893，Q9SMJ3，Q9SE20，Q9ZTP4，O49901，P74306，Q9FV46，Q9RCT2，ZDS_NARPS，BAB68552.1，CAC85667.1，AF372617_1，ZDS_TARER，CAD55814.1，CAD27442.1，2121278A，ZDS_CAPAN，ZDS_LYCES，NP_187138.1，AAM63349.1，ZDS_ARATH，AAA91161.1，ZDS_MAIZE，AAG14399.1，NP_441720.1，NP_486422.1，ZP_00111920.1，CAB56041.1，ZP_00074512.1，ZP_00116357.1，NP_681127.1，ZP_00114185.1，ZP_00104126.1，CAB65434.1，NP_662300.1crtlSO基因的实例为来自食用番茄编码crtlSO的核酸；登录号#AF416727，由Isaacson，T.，Ronen，G.，Zamir，D.and Hirschberg，J.从番茄克隆桔红素(tangerine)揭示在植物中类胡萝卜素异构酶对于产生β-胡萝卜素和叶黄素是必需的；Plant Cell 14(2)，333-342(2002)公开(核酸SEQ ID NO131，蛋白质SEQ ID NO132)，并且还包括来自其他有机体的具有以下登录号的其他crtlSO基因AAM53952FtsZ基因的实例为来自万寿菊的编码FtsZ的核酸，登录号#AF251346，由Moehs，C.P.，Tian，L.，Osteryoung，K.W.和Dellapenna，D.在金盏花花瓣发育期间对类胡萝卜素生物合成基因表达的分析；Plant Mol.Biol.45(3)，281-293(2001)公开(核酸SEQ ID NO133，蛋白质SEQ ID NO134)，并且还包括来自其他有机体的具有以下登录号的其他FtsZ基因CAB89286.1，AF205858_1，NP_200339.1，CAB89287.1，CAB41987.1，AAA82068.1，T06774，AF383876_1，BAC57986.1，CAD22047.1，BAB91150.1，ZP_00072546.1，NP_440816.1，T51092，NP_683172.1，BAA85116.1，NP_487898.1，JC4289，BAA82871.1，NP_781763.1，BAC57987.1，ZP_00111461.1，T51088，NP_190843.1，ZP_00060035.1，NP_846285.1，AAL07180.1，NP_243424.1，NP_833626.1，AAN04561.1，AAN04557.1，CAD22048.1，T51089，NP_692394.1，NP_623237.1，NP_565839.1，T51090，CAA07676.1，NP_113397.1，T51087，CAC44257.1，E84778，ZP_00105267.1，BAA82091.1，ZP_00112790.1，BAA96782.1，NP_348319.1，NP_471472.1，ZP_00115870.1，NP_465556.1，NP_389412.1，BAA82090.1，NP_562681.1，AAM22891.1，NP_371710.1，NP_764416.1，CAB95028.1，FTSZ_STRGR，AF120117_1，NP_827300.1，JE0282，NP_626341.1，AAC45639.1，NP_785689.1，NP_336679.1，NP_738660.1，ZP_00057764.1，AAC32265.1，NP_814733.1，FTSZ_MYCKA，NP_216666.1，CAA75616.1，NP_301700.1，NP_601357.1，ZP_00046269.1，CAA70158.1，ZP_00037834.1，NP_268026.1，FTSZ_ENTHR，NP_787643.1，NP_346105.1，AAC32264.1，JC5548，AAC95440.1，NP_710793.1，NP_687509.1，NP_269594.1，AAC32266.1，NP_720988.1，NP_657875.1，ZP_00094865.1，ZP_00080499.1，ZP_00043589.1，JC7087，NP_660559.1，AAC46069.1，AF179611_14，AAC44223.1，NP_404201.1.
MinD基因的实例为来自万寿菊的编码MinD的核酸，登录号#AF251019，由Moehs，C.P.，Tian，L.，Osteryoung，K.W.和Dellapenna，D.在金盏花花瓣发育期间对类胡萝卜素生物合成基因表达的分析；Plant Mol.Biol.45(3)，281-293(2001)公开(核酸SEQ ID NO135，蛋白质SEQ ID NO136)，并且还包括来自其他有机体的具有以下登录号的其他MinD基因NP_197790.1，BAA90628.1，NP_038435.1，NP_045875.1，AAN33031.1，NP_050910.1，CAB53105.1，NP_050687.1，NP_682807.1，NP_487496.1，ZP_00111708.1，ZP_00071109.1，NP_442592.1，NP_603083.1，NP_782631.1，ZP_00097367.1，ZP_00104319.1，NP_294476.1，NP_622555.1，NP_563054.1，NP_347881.1，ZP_00113908.1，NP_834154.1，NP_658480.1，ZP_00059858.1，NP_470915.1，NP_243893.1，NP_465069.1，ZP_00116155.1，NP_390677.1，NP_692970.1，NP_298610.1，NP_207129.1，ZP_00038874.1，NP_778791.1，NP_223033.1，NP_641561.1，NP_636499.1，ZP_00088714.1，NP_213595.1，NP_743889.1，NP_231594.1，ZP_00085067.1，NP_797252.1，ZP_00136593.1，NP_251934.1，NP_405629.1，NP_759144.1，ZP_00102939.1，NP_793645.1，NP_699517.1，NP_460771.1，NP_860754.1，NP_456322.1，NP_718163.1，NP_229666.1，NP_357356.1，NP_541904.1，NP_287414.1，NP_660660.1，ZP_00128273.1，NP_103411.1，NP_785789.1，NP_715361.1，AF149810_1，NP_841854.1，NP_437893.1，ZP_00022726.1，EAA24844.1，ZP_00029547.1，NP_521484.1，NP_240148.1，NP_770852.1，AF345908_2，NP_777923.1，ZP_00048879.1，NP_579340.1，NP_143455.1，NP_126254.1，NP_142573.1，NP_613505.1，NP_127112.1，NP_712786.1，NP_578214.1，NP_069530.1，NP_247526.1，AAA85593.1，NP_212403.1，NP_782258.1，ZP_00058694.1，NP_247137.1，NP_219149.1，NP_276946.1，NP_614522.1，ZP_00019288.1，CAD78330.1在上述优选的实施方案中，作为HMG-CoA还原酶基因，优选使用的核酸为编码含有氨基酸序列SEQ ID NO112或通过对该序列进行氨基酸替代、插入或缺失所得序列的蛋白质，在氨基酸水平，后述蛋白质与序列SEQ ID NO112的同一性至少为30％，优选地为至少50％，更加优选地为至少70％，甚至更加优选地为至少90％，最优选地为至少95％，并且具有HMG-CoA还原酶的酶学特性。
如上所述，通过比较来自数据库的氨基酸序列或相应的反向翻译的核酸序列与SEQ ID NO112之间的同源性，可以容易地从诸如其基因组序列已知的多种有机体发现HMG-CoA还原酶和HMG-CoA还原酶基因的其它实例。
此外，如上所述，诸如由序列SEQ ID NO111起始通过杂交和PCR技术以本身已知的方式也可以容易地从其基因组序列未知的多种有机体发现HMG-CoA还原酶和HMG-CoA还原酶基因的其它实例。
在更加特别优选的实施方案中，为了增加HMG-CoA还原酶的活性，将这样的核酸导入有机体，所述核酸编码的蛋白质含有序列SEQ IDNO112的HMG-CoA还原酶的氨基酸序列。
例如，适当的核酸序列可按照遗传密码通过反向翻译多肽序列得到。
因此，优选地使用依照植物特异的密码子选择频繁使用的那些密码子。基于对相关有机体其它已知基因的计算机评估易于确定密码子选择。
在特别优选的实施方案中，将含有序列SEQ ID NO111的核酸导入有机体。
在上述优选的实施方案中，作为(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶基因，优选使用的核酸编码含有氨基酸序列SEQ ID NO114或通过对该序列进行氨基酸替代、插入或缺失所得序列的蛋白质，在氨基酸水平，后述蛋白质与序列SEQ ID NO114的同一性至少为30％，优选地为至少50％，更加优选地为至少70％，甚至更加优选地为至少90％，最优选地为至少95％，并且具有(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶的酶学特性。
如上所述，通过比较来自数据库的氨基酸序列或相应的反向翻译的核酸序列与SEQ ID NO114之间的同源性，可以容易地从诸如其基因组序列已知的多种有机体发现(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶和(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶基因的其它实例。
此外，如上所述，诸如由序列SEQ ID NO113起始通过杂交和PCR技术以本身已知的方式也可以容易地从其基因组序列未知的多种有机体发现(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶和(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶基因的其它实例。
在更加特别优选的实施方案中，为了增加(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶的活性，将这样的核酸导入有机体，所述核酸编码的蛋白质含有序列SEQ ID NO114的(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶的氨基酸序列例如，适当的核酸序列可按照遗传密码通过反向翻译多肽序列得到。
因此，优选地使用依照植物特异的密码子选择频繁使用的那些密码子。基于对相关有机体其它已知基因的计算机评估易于确定密码子选择。
在特别优选的实施方案中，将含有序列SEQ ID NO113的核酸导入有机体。
在上述优选的实施方案中，作为1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶基因，优选使用的核酸为编码含有氨基酸序列SEQ ID NO116或通过对该序列进行氨基酸替代、插入或缺失所得序列的蛋白质，在氨基酸水平，后述蛋白质与序列SEQ ID NO116的同一性至少为30％，优选地为至少50％，更加优选地为至少70％，甚至更加优选地为至少90％，最优选地为至少95％，并且具有1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的酶学特性。
如上所述，通过比较来自数据库的氨基酸序列或相应的反向翻译的核酸序列与SEQ ID NO116之间的同源性，可以容易地从诸如其基因组序列已知的多种有机体发现1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶和1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶基因的其它实例。
此外，如上所述，诸如由序列SEQ ID NO115起始通过杂交和PCR技术以本身已知的方式也可以容易地从其基因组序列未知的多种有机体发现1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶和1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶基因的其它实例。
在更加特别优选的实施方案中，为了增加1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的活性，将这样的核酸导入有机体，所述核酸编码的蛋白质含有序列SEQID NO116的1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的氨基酸序列。
例如，适当的核酸序列可按照遗传密码通过反向翻译多肽序列得到。
因此，优选地使用依照植物特异的密码子选择频繁使用的那些密码子。基于对相关有机体其它已知基因的计算机评估易于确定密码子选择。
在特别优选的实施方案中，将含有序列SEQ ID NO115的核酸导入有机体。
在上述优选的实施方案中，作为1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶基因，优选使用的核酸为编码含有氨基酸序列SEQ ID NO138或通过对该序列进行氨基酸替代、插入或缺失所得序列的蛋白质，在氨基酸水平，后述蛋白质与序列SEQ ID NO138的同一性至少为30％，优选地为至少50％，更加优选地为至少70％，甚至更加优选地为至少90％，最优选地为至少95％，并且具有1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的酶学特性。
如上所述，通过比较来自数据库的氨基酸序列或相应的反向翻译的核酸序列与SEQ ID NO138之间的同源性，可以容易地从诸如其基因组序列已知的多种有机体发现1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶和1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶基因的其它实例。
此外，如上所述，诸如由序列SEQ ID NO137起始通过杂交和PCR技术以本身已知的方式也可以容易地从其基因组序列未知的多种有机体发现1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶和1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶基因的其它实例。
在更加特别优选的实施方案中，为了增加1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的活性，将这样的核酸导入有机体，所述核酸编码的蛋白质含有序列SEQ ID NO138 1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的氨基酸序列。
例如，适当的核酸序列可按照遗传密码通过反向翻译多肽序列得到。
因此，优选地使用依照植物特异的密码子选择频繁使用的那些密码子。基于对相关有机体其它已知基因的计算机评估易于确定密码子选择。
在特别优选的实施方案中，将含有序列SEQ ID NO137的核酸导入有机体。
在上述优选的实施方案中，作为异戊烯基D-异构酶基因，优选使用的核酸编码含有氨基酸序列SEQ ID NO118或通过对该序列进行氨基酸替代、插入或缺失所得序列的蛋白质，在氨基酸水平，后述蛋白质与序列SEQID NO118的同一性至少为30％，优选地为至少50％，更加优选地为至少70％，甚至更加优选地为至少90％，最优选地为至少95％，并且具有异戊烯基D-异构酶的酶学特性。
如上所述，通过比较来自数据库的氨基酸序列或相应的反向翻译的核酸序列与SEQ ID NO118之间的同源性，可以容易地从诸如其基因组序列已知的多种有机体发现异戊烯基D-异构酶和异戊烯基D-异构酶基因的其它实例。
此外，如上所述，诸如由序列SEQ ID NO117起始通过杂交和PCR技术以本身已知的方式也可以容易地从其基因组序列未知的多种有机体发现异戊烯基D-异构酶和异戊烯基D-异构酶基因的其它实例。
在更加特别优选的实施方案中，为了增加异戊烯基D-异构酶的活性，将这样的核酸导入有机体，所述核酸编码的蛋白质含有序列SEQ IDNO118异戊烯基D-异构酶的氨基酸序列。
例如，适当的核酸序列可按照遗传密码通过反向翻译多肽序列得到。
因此，优选地使用依照植物特异的密码子选择频繁使用的那些密码子。基于对相关有机体其它已知基因的计算机评估易于确定密码子选择。
在特别优选的实施方案中，将含有序列SEQ ID NO117的核酸导入有机体。
在上述优选的实施方案中，作为牻牛儿基-二磷酸酯合酶基因，优选使用的核酸编码含有氨基酸序列SEQ ID NO120或通过对该序列进行氨基酸替代、插入或缺失所得序列的蛋白质，在氨基酸水平，后述蛋白质与序列SEQ ID NO120的同一性至少为30％，优选地为至少50％，更加优选地为至少70％，甚至更加优选地为至少90％，最优选地为至少95％，并且具有牻牛儿基-二磷酸酯合酶的酶学特性。
如上所述，通过比较来自数据库的氨基酸序列或相应的反向翻译的核酸序列与SEQ ID NO120之间的同源性，可以容易地从诸如其基因组序列已知的多种有机体发现牻牛儿基-二磷酸酯合酶和牻牛儿基-二磷酸酯合酶基因的其它实例。
此外，如上所述，诸如由序列SEQ ID NO119起始通过杂交和PCR技术以本身已知的方式也可以容易地从其基因组序列未知的多种有机体发现牻牛儿基-二磷酸酯合酶和牻牛儿基-二磷酸酯合酶基因的其它实例。
在更加特别优选的实施方案中，为了增加牻牛儿基-二磷酸酯合酶的活性，将这样的核酸导入有机体，所述核酸编码含有序列SEQ ID NO120牻牛儿基-二磷酸酯合酶的氨基酸序列的蛋白质。
例如，适当的核酸序列可按照遗传密码通过反向翻译多肽序列得到。
因此，优选地使用依照植物特异的密码子选择频繁使用的那些密码子。基于对相关有机体其它已知基因的计算机评估易于确定密码子选择。
在特别优选的实施方案中，将含有序列SEQ ID NO119的核酸导入有机体。
在上述优选的实施方案中，作为法呢基二磷酸酯合酶基因，优选使用的核酸编码含有氨基酸序列SEQ ID NO122或通过对该序列进行氨基酸替代、插入或缺失所得序列的蛋白质，在氨基酸水平，后述蛋白质与序列SEQ ID NO122的同一性至少为30％，优选地为至少50％，更加优选地为至少70％，甚至更加优选地为至少90％，最优选地为至少95％，并且具有法呢基二磷酸酯合酶的酶学特性。
如上所述，通过比较来自数据库的氨基酸序列或相应的反向翻译的核酸序列与SEQ ID NO122之间的同源性，可以容易地从诸如其基因组序列已知的多种有机体发现法呢基二磷酸酯合酶和法呢基二磷酸酯合酶基因的其它实例。
此外，如上所述，诸如由序列SEQ ID NO121起始通过杂交和PCR技术以本身已知的方式也可以容易地从其基因组序列未知的多种有机体发现法呢基二磷酸酯合酶和法呢基二磷酸酯合酶基因的其它实例。
在更加特别优选的实施方案中，为了增加法呢基二磷酸酯合酶的活性，将这样的核酸导入有机体，所述核酸编码含有序列SEQ ID NO122法呢基二磷酸酯合酶的氨基酸序列的蛋白质。
例如，适当的核酸序列可按照遗传密码通过反向翻译多肽序列得到。
因此，优选地使用依照植物特异的密码子选择频繁使用的那些密码子。基于对相关有机体其它已知基因的计算机评估易于确定密码子选择。
在特别优选的实施方案中，将含有序列SEQ ID NO121的核酸导入有机体。
在上述优选的实施方案中，作为牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶基因，优选使用的核酸编码含有氨基酸序列SEQ ID NO124或通过对该序列进行氨基酸替代、插入或缺失所得序列的蛋白质，在氨基酸水平，后述蛋白质与序列SEQ ID NO124的同一性至少为30％，优选地为至少50％，更加优选地为至少70％，甚至更加优选地为至少90％，最优选地为至少95％，并且具有牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的酶学特性。
如上所述，通过比较来自数据库的氨基酸序列或相应的反向翻译的核酸序列与SEQ ID NO124之间的同源性，可以容易地从诸如其基因组序列已知的多种有机体发现牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶和牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶基因的其它实例。
此外，如上所述，诸如由序列SEQ ID NO123起始通过杂交和PCR技术以本身已知的方式也可以容易地从其基因组序列未知的多种有机体发现牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶和牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶基因的其它实例。
在更加特别优选的实施方案中，为了增加牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合的活性，将这样的核酸导入有机体，所述核酸编码含有序列SEQ IDNO124牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合的氨基酸序列的蛋白质。
例如，适当的核酸序列可按照遗传密码通过反向翻译多肽序列得到。
因此，优选地使用依照植物特异的密码子选择频繁使用的那些密码子。基于对相关有机体其它已知基因的计算机评估易于确定密码子选择。
在特别优选的实施方案中，将含有序列SEQ ID NO123的核酸导入有机体。
在上述优选的实施方案中，作为八氢番茄红素合酶基因，优选使用的核酸编码含有氨基酸序列SEQ ID NO126或通过对该序列进行氨基酸替代、插入或缺失所得序列的蛋白质，在氨基酸水平，后述蛋白质与序列SEQID NO126的同一性至少为30％，优选地为至少50％，更加优选地为至少70％，甚至更加优选地为至少90％，最优选地为至少95％，并且具有八氢番茄红素合酶的酶学特性。
如上所述，通过比较来自数据库的氨基酸序列或相应的反向翻译的核酸序列与SEQ ID NO126之间的同源性，可以容易地从诸如其基因组序列已知的多种有机体发现八氢番茄红素合酶和八氢番茄红素合酶基因的其它实施例。
此外，如上所述，诸如由序列SEQ ID NO125起始通过杂交和PCR技术以本身已知的方式也可以容易地从其基因组序列未知的多种有机体发现八氢番茄红素合酶和八氢番茄红素合酶基因的其它实例。
在更加特别优选的实施方案中，为了增加八氢番茄红素合酶的活性，将这样的核酸导入有机体，所述核酸编码含有序列SEQ ID NO126八氢番茄红素合酶的氨基酸序列的蛋白质。
例如，适当的核酸序列可按照遗传密码通过反向翻译多肽序列得到。
因此，优选地使用依照植物特异的密码子选择频繁使用的那些密码子。基于对相关有机体其它已知基因的计算机评估易于确定密码子选择。
在特别优选的实施方案中，将含有序列SEQ ID NO125的核酸导入有机体。
在上述优选的实施方案中，作为八氢番茄红素去饱和酶基因，优选使用的核酸编码含有氨基酸序列SEQ ID NO128或通过对该序列进行氨基酸替代、插入或缺失所得序列的蛋白质，在氨基酸水平，后述蛋白质与序列SEQ ID NO128的同一性至少为30％，优选地为至少50％，更加优选地为至少70％，甚至更加优选地为至少90％，最优选地为至少95％，并且具有八氢番茄红素去饱和酶的酶学特性。
如上所述，通过比较来自数据库的氨基酸序列或相应的反向翻译的核酸序列与SEQ ID NO128之间的同源性，可以容易地从诸如其基因组序列已知的多种有机体发现八氢番茄红素去饱和酶和八氢番茄红素去饱和酶基因的其它实例。
此外，如上所述，诸如由序列SEQ ID NO127起始通过杂交和PCR技术以本身已知的方式也可以容易地从其基因组序列未知的多种有机体发现八氢番茄红素去饱和酶和八氢番茄红素去饱和酶基因的其它实例。
在更加特别优选的实施方案中，为了增加八氢番茄红素去饱和酶的活性，将这样的核酸导入有机体，所述核酸编码含有序列SEQ ID NO128八氢番茄红素去饱和酶的氨基酸序列的蛋白质。
例如，适当的核酸序列可按照遗传密码通过反向翻译多肽序列得到。
因此，优选地使用依照植物特异的密码子选择频繁使用的那些密码子。基于对相关有机体其它已知基因的计算机评估易于确定密码子选择。
在特别优选的实施方案中，将含有序列SEQ ID NO127的核酸导入有机体。
在上述优选的实施方案中，作为ζ-胡萝卜素去饱和酶基因，优选使用的核酸编码含有氨基酸序列SEQ ID NO130或通过对该序列进行氨基酸替代、插入或缺失所得序列的蛋白质，在氨基酸水平，后述蛋白质与序列SEQ ID NO130的同一性至少为30％，优选地为至少50％，更加优选地为至少70％，甚至更加优选地为至少90％，最优选地为至少95％，并且具有ζ-胡萝卜素去饱和酶的酶学特性。
如上所述，通过比较来自数据库的氨基酸序列或相应的反向翻译的核酸序列与SEQ ID NO130之间的同源性，可以容易地从诸如其基因组序列已知的多种有机体发现ζ-胡萝卜素去饱和酶和ζ-胡萝卜素去饱和酶基因的其它实例。
此外，如上所述，诸如由序列SEQ ID NO129起始通过杂交和PCR技术以本身已知的方式也可以容易地从其基因组序列未知的多种有机体发现ζ-胡萝卜素去饱和酶和ζ-胡萝卜素去饱和酶基因的其它实例。
在更加特别优选的实施方案中，为了增加ζ-胡萝卜素去饱和酶的活性，将这样的核酸导入有机体，所述核酸编码含有序列SEQ ID NO130ζ-胡萝卜素去饱和酶的氨基酸序列的蛋白质。
例如，适当的核酸序列可按照遗传密码通过反向翻译多肽序列得到。
因此，优选地使用依照植物特异的密码子选择频繁使用的那些密码子。基于对相关有机体其它已知基因的计算机评估易于确定密码子选择。
在特别优选的实施方案中，将含有序列SEQ ID NO129的核酸导入有机体。
在上述优选的实施方案中，作为Crtlso基因，优选使用的核酸编码含有氨基酸序列SEQ ID NO132或通过对该序列进行氨基酸替代、插入或缺失所得序列的蛋白质，在氨基酸水平，后述蛋白质与序列SEQ IDNO132的同一性至少为30％，优选地为至少50％，更加优选地为至少70％，甚至更加优选地为至少90％，最优选地为至少95％，并且具有Crtlso的酶学特性。
如上所述，通过比较来自数据库的氨基酸序列或相应反向翻译的核酸序列与SEQ ID NO132之间的同源性，可以容易地从诸如其基因组序列已知的多种有机体发现Crtlso和Crtlso基因的其它实例。
此外，如上所述，诸如由序列SEQ ID NO131起始通过杂交和PCR技术以本身已知的方式也可以容易地从其基因组序列未知的多种有机体发现Crtlso和Crtlso基因的其它实例。
在更加特别优选的实施方案中，为了增加Crtlso的活性，将这样的核酸导入有机体，所述核酸编码含有序列SEQ ID NO132 Crtlso的氨基酸序列的蛋白质。
例如，适当的核酸序列可按照遗传密码通过反向翻译多肽序列得到。
因此，优选地使用依照植物特异的密码子选择频繁使用的那些密码子。基于对相关有机体其它已知基因的计算机评估易于确定密码子选择。
在特别优选的实施方案中，将含有序列SEQ ID NO131的核酸导入有机体。
在上述优选的实施方案中，作为FtsZ基因，优选使用的核酸编码含有氨基酸序列SEQ ID NO134或通过对该序列进行氨基酸替代、插入或缺失所得序列的蛋白质，在氨基酸水平，后述蛋白质与序列SEQ ID NO134的同一性至少为30％，优选地为至少50％，更加优选地为至少70％，甚至更加优选地为至少90％，最优选地为至少95％，并且具有FtsZ的酶学特性。
如上所述，通过比较来自数据库的氨基酸序列或相应反向翻译的核酸序列与SEQ ID NO134之间的同源性，可以容易地从诸如其基因组序列已知的多种有机体发现FtsZ和FtsZ基因的其它实例。
此外，如上所述，诸如由序列SEQ ID NO133起始通过杂交和PCR技术以本身已知的方式也可以容易地从其基因组序列未知的多种有机体发现FtsZ和FtsZ基因的其它实例。
在更加特别优选的实施方案中，为了增加FtsZ的活性，将这样的核酸导入有机体，所述核酸编码含有序列SEQ ID NO134 FtsZ的氨基酸序列的蛋白质。
例如，适当的核酸序列可按照遗传密码通过反向翻译多肽序列得到。
因此，优选地使用依照植物特异的密码子选择频繁使用的那些密码子。基于对相关有机体其它已知基因的计算机评估易于确定密码子选择。
在特别优选的实施方案中，将含有序列SEQ ID NO133的核酸导入有机体。
在上述优选的实施方案中，作为MinD基因，优选使用的核编码含有氨基酸序列SEQ ID NO136或通过对该序列进行氨基酸替代、插入或缺失所得序列的蛋白质，在氨基酸水平，后述蛋白质与序列SEQ ID NO136的同一性至少为30％，优选地为至少50％，更加优选地为至少70％，甚至更加优选地为至少90％，最优选地为至少95％，并且具有MinD的酶学特性。
如上所述，通过比较来自数据库的氨基酸序列或相应反向翻译的核酸序列与SEQ ID NO136之间的同源性，可以容易地从诸如其基因组序列已知的多种有机体发现MinD和MinD基因的其它实例。
此外，如上所述，诸如由序列SEQ ID NO135起始通过杂交和PCR技术以本身已知的方式也可以容易地从其基因组序列未知的多种有机体发现MinD和MinD基因的其它实施例。
在更加特别优选的实施方案中，为了增加MinD的活性，将这样的核酸导入有机体，所述核酸编码含有序列SEQ ID NO136 MinD的氨基酸序列的蛋白质。
例如，适当的核酸序列可按照遗传密码通过反向翻译多肽序列得到。
因此，优选地使用依照植物特异的密码子选择频繁使用的那些密码子。基于对相关有机体其它已知基因的计算机评估易于确定密码子选择。
在特别优选的实施方案中，将含有序列SEQ ID NO135的核酸导入有机体。
此外，以本身已知的方式通过从核苷酸结构单元化学合成，例如通过双螺旋各个重叠互补核酸结构单元的片段缩合，能够制备所有上述的HMG-CoA还原酶基因、(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶基因、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶基因、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶基因、异戊烯基-二磷酸酯Δ-异构酶基因、牻牛儿基-二磷酸酯合酶基因、法呢酰-二磷酸酯合酶基因、牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶基因、八氢番茄红素合酶基因、八氢番茄红素去饱和酶基因、ζ-胡萝卜素去饱和酶基因、crtlSO基因、FtsZ基因或MinD基因。例如，以已知的方式通过亚磷酰胺法能够进行寡核苷酸的化学合成(Voet，Voet，第二版，Wiley Press New York，896-897页)。合成寡核苷酸的退火、利用DNA聚合酶的克列诺片段填补缺口、连接反应以及常规的克隆方法描述于Sambrook等(1989)，MolecularcloningA laboratory manual，冷泉港实验室出版社。
在方法更加优选的实施方案中，植物额外具有与野生型相比降低了的内源性β-羟化酶活性。
如上所述，认为降低了的活性优选地是指基于不同的细胞生物学机制部分或基本上完全抑制或阻断植物细胞、植物或其部分、组织、器官、细胞或种子中酶的功能。
例如，通过减少植物中蛋白质的量或mRNA的量，能够实现与野生型相比植物中的活性降低。因此，与野生型相比降低了的活性能够直接测定，或通过测定与野生型相比本发明植物中蛋白质的量或mRNA的量而测定。
活性的降低包括蛋白质数量降低至基本上完全缺乏该蛋白质(也就是说缺乏可检测到的相应活性或缺乏免疫学可检测到的相应蛋白质)。
认为内源性β-羟化酶活性意思是指内源的植物固有的β-羟化酶的酶活性。
认为内源性β-羟化酶意思是指如上所述内源的植物固有的羟化酶。例如如果万寿菊是进行遗传修饰的靶植物，认为内源性β-羟化酶是指万寿菊的β-羟化酶。
因此认为内源性β-羟化酶意思具体是指具有将β-胡萝卜素转化为玉米黄素这一酶活性的植物固有蛋白质。
因此，认为内源性β-羟化酶活性意思是指在特定时间内由蛋白质内源性β-羟化酶转化的β-胡萝卜素的量或形成的玉米黄素的量。
当与野生型相比内源性β-羟化酶活性降低时，与野生型相比在特定时间内由蛋白质内源性β-羟化酶转化的β-胡萝卜素的量或形成的玉米黄素的量减少。
优选地，内源性β-羟化酶活性降低至少5％，更加优选地为降低至少20％，更加优选地为降低至少50％，更加优选地为降低100％。特别优选地，内源性β-羟化酶活性完全关闭。
令人惊奇地发现在通过α-胡萝卜素途径大量产生类胡萝卜素例如叶黄素的植物例如万寿菊属植物中，降低内源性β-羟化酶活性并且根据需要增加异源羟化酶活性是有利的。特别优选地，使用的羟化酶或其功能等同物来自通过β-胡萝卜素途径产生大量类胡萝卜素的植物，例如为上述来自番茄的β-羟化酶(核酸SEQ ID No.107，蛋白质SEQ ID No.108)。
如上所述以与测定羟化酶活性相似的方式测定内源性β-羟化酶活性。
优选地，通过至少一种以下方法降低植物中内源性β-羟化酶活性a)导入至少一种双链内源性β-羟化酶核糖核酸序列，下文中也称为内源性β-羟化酶-dsRNA，或导入确保其表达的一个表达盒或多个表达盒。
包括其中内源性β-羟化酶-dsRNA针对内源性β-羟化酶基因(也就是指诸如启动子序列的基因组DNA序列)或内源性β-羟化酶转录本(也就是指mRNA序列)的那些方法，b)导入至少一种内源性β-羟化酶反义核糖核酸序列，下文中也称为内源性β-羟化酶-反义RNA，或导入确保其表达的表达盒。包括其中内源性β-羟化酶-反义RNA针对内源性β-羟化酶基因(也就是指基因组DNA序列)或内源性β-羟化酶基因转录本(也就是指RNA序列)的那些方法。也包括α-异头核酸序列。
c)导入至少一种与核酶相结合的内源性β-羟化酶-反义RNA或确保其表达的表达盒。
d)导入至少一种内源性β-羟化酶有意核糖核酸序列，下文也称为内源性β-羟化酶-有意RNA以诱导共抑制，或导入确保其表达的表达盒e)导入至少一种针对内源性β-羟化酶基因、β-羟化酶RNA或β-羟化酶蛋白质的DNA-或蛋白质-结合因子或确保其表达的表达盒f)导入至少一种病毒核酸序列或确保其表达的表达盒，引起内源性β-羟化酶RNA的降解g)导入至少一个构建体以在内源性β-羟化酶基因中产生功能丧失，例如产生终止密码子或读码框内的移位，例如通过在内源性β-羟化酶基因中产生插入、缺失、反向或突变而实施。优选地，通过同源重组而靶向插入所述内源性β-羟化酶基因或导入针对内源性β-羟化酶基因序列的序列特异性核酸酶的方法能够产生敲除突变。
本领域技术人员已知其他方法也能够用于本发明中以降低内源性β-羟化酶或其活性或功能。例如导入内源性β-羟化酶的显性失活变体或确保其表达的表达盒也可以是有利的。每种不同的方法均能够引起内源性β-羟化酶蛋白质的量、mRNA的量和/或活性降低。也可以考虑组合使用这些方法。其他方法对于本领域技术人员也是已知的并可包括抑制或阻止内源性β-羟化酶加工、玉米黄素环氧酶和/或内源性β-羟化酶或其mRNA的转运、抑制核糖体附着、抑制RNA剪接、诱导内源性β-羟化酶-RNA-降解酶和/或抑制翻译的延伸或终止。
在下文中可以通过示例性的实施方案描述每个优选的方法a)导入双链内源性β-羟化酶核糖核酸序列(内源性β-羟化酶-dsRNA)上面已经深入描述了用于降低ε-环化酶活性的以双链RNA方式进行基因调控的方法。以相似的方式，可以实施该方法以降低内源性β-羟化酶活性。
认为双链内源性β-羟化酶核糖核酸序列或内源性β-羟化酶-dsRNA优选地是指具有含双链结构的区域并且在该区域中含有以下核酸序列的RNA分子
a)与植物固有的内源性β-羟化酶转录本的至少一部分相同和/或b)与植物固有的内源性β-羟化酶启动子序列的至少一部分相同。
在本发明的方法中，为了降低内源性β-羟化酶活性，优选地将RNA导入植物，其中所述RNA含有具双链结构区域并且在该区域中含有以下核酸序列a)与植物固有的内源性β-羟化酶转录本的至少一部分相同和/或b)与植物固有的内源性β-羟化酶启动子序列的至少一部分相同。
认为术语“内源性β-羟化酶转录本”意识是指内源性β-羟化酶基因的转录部分，其中除了编码内源性β-羟化酶的序列，还包括例如非编码序列如UTR。
认为“与植物固有的内源性β-羟化酶启动子序列的至少一部分相同”的RNA优选地是指RNA序列与内源性β-羟化酶启动子序列的理论转录本也就是指其相应的RNA序列至少部分相同的事实。
认为植物固有的内源性β-羟化酶转录本或植物固有的内源性β-羟化酶启动子序列的“一部分”意思是指转录本或启动子序列中从几个碱基对到多至全部序列的部分序列。由本领域技术人员通过常规试验能够容易地决定部分序列的最适长度。
通常，部分序列的长度为至少10个碱基且最多2kb，优选地为至少25个碱基且最多1.5kb，特别优选地为至少50个碱基且最多600个碱基，非常特别优选地为至少100个碱基且最多500个碱基，最优选地为至少200个碱基或至少300个碱基且最多400个碱基。
优选地，以获得尽可能高的特异性并且其他酶的活性(不期望其活性降低)不降低的方式找出部分序列。因此对于内源性β-羟化酶-dsRNA的部分序列，选择在其它活性中不存在的部分内源性β-羟化酶转录本和/或内源性β-羟化酶启动子序列的部分序列是有利的。
因此，在特别优选的实施方案中，内源性β-羟化酶-dsRNA含有的序列与植物固有的内源性β-羟化酶转录本的一部分相同并且含有植物固有的编码内源性β-羟化酶的核酸的5’末端或3’末端。特别地，转录本5’或3’的非翻译区适于产生选择性双链结构。
本发明进一步涉及双链RNA分子(dsRNA分子)，当将其导入植物(或其细胞、组织、器官或繁殖材料)时，引起内源性β-羟化酶降低。
本发明进一步涉及降低内源性β-羟化酶表达的双链RNA分子(内源性β-羟化酶-dsRNA)，该双链RNA分子优选地包含a)含有至少一种基本上与“有意”RNA-内源性β-羟化酶转录本的至少一部分相同的核糖核苷酸序列的“有意”RNA链，和b)基本上优选地完全与a)中的RNA“有意”链互补的“反义”RNA链。
为了用内源性β-羟化酶-dsRNA转化植物，优选地使用了将其导入植物并在植物中转录成内源性β-羟化酶-dsRNA的核酸构建体。
此外本发明还涉及能够转录成以下的核酸构建体a)含有至少一种基本上与“有意”RNA-内源性β-羟化酶转录本的至少一部分相同的核糖核苷酸序列的“有意”RNA链，和b)基本上优选地完全与a)中的RNA有意链互补的“反义”RNA链。
这些核酸构建体在下文中也称为表达盒或表达载体。
关于dsRNA分子，认为内源性β-羟化酶核酸序列或其相应的转录本优选地是指根据SEQ ID NO139或其部分的序列。
“基本上相同”意思是指与内源性β-羟化酶靶序列相比dsRNA序列也可具有插入、缺失和单个的点突变从而引起表达的有效降低。优选地，抑制性dsRNA的“有意”链与内源性β-羟化酶基因至少部分“有意”RNA转录本之间或“反义”链与内源性β-羟化酶基因互补链之间的同源性至少为75％，优选地为至少80％，非常特别优选地为至少90％，最优选地为100％。
对于引起内源性β-羟化酶表达有效降低，dsRNA和内源性β-羟化酶基因转录本之间存在100％序列同一性并不是绝对必须的。因此，耐受由于遗传突变、多态性或进化趋异而可能存在的序列偏离的方法是有利的。例如使用来自一种有机体内源性β-羟化酶序列的dsRNA抑制另一种有机体中内源性β-羟化酶表达是可能的。为了该目的，dsRNA优选地含有相应于保守区的内源性β-羟化酶基因转录本的序列区域。能够通过序列比对快速得到所述保守区。
另外，“基本上相同”的dsRNA也能够定义为能够与一部分内源性β-羟化酶基因转录本杂交(例如在400mM NaCl、40mM PIPES pH 6.4、1mM EDTA中50℃或70℃杂交12-16小时)的核酸序列。
“基本上互补”意思是指与“有意”RNA链的互补链相比较，“反义”RNA链也可具有插入、缺失以及单个的点突变。优选地，“反义”RNA链与“有意”RNA链的互补链之间的同源性至少为80％，优选地为至少90％，非常特别优选地为至少95％，最优选地为100％。
在另一个实施方案中，内源性β-羟化酶-dsRNA包含a)含有至少一种基本上与内源性β-羟化酶基因启动子区域“有意”RNA转录本的至少部分相同的核糖核苷酸序列的“有意”RNA链，和b)基本上优选地完全与a)中的RNA“有意”链互补的“反义”RNA链。
优选地用于转化植物的相应核酸构建体包含a)基本上与内源性β-羟化酶基因启动子区域的至少一部分相同的“有意”DNA链，和b)基本上优选地完全与a)中的DNA“有意”链互补的“反义”DNA链。
为了产生用于降低内源性β-羟化酶活性的内源性β-羟化酶序列，特别是对于万寿菊，特别优选地使用以下部分序列SEQ ID NO141内源性β-羟化酶5’末端区域的有意片段SEQ ID NO142内源性β-羟化酶5’末端区域的反义片段dsRNA可由一条或多条多聚核糖核苷酸链组成。当然，为了实现相同的目的，也能将多种不同的dsRNA分子导入细胞或有机体，它们中的每一种均含有上面定义的核糖核苷酸序列部分之一。
由两条互补的单独RNA链或优选地由单一一条自身互补的RNA链起始能够形成双链dsRNA结构。在这种情况下，“有意”RNA链和“反义”RNA链优选地以反向“重复”的形式彼此共价结合。
例如，如WO 99/53050中所述dsRNA也能够含有发夹结构，通过以连接序列(“接头”；例如内含子)连接“有意”和“反义”链。自身互补的dsRNA结构是优选的，这是由于它们仅需要表达一条RNA序列并且总含有等摩尔比率的互补RNA链。优选地，连接序列是内含子(例如来自马铃薯ST-LS1基因的内含子；Vancanneyt GF等(1990)Mol Gen Genet220(2)245-250)。
编码dsRNA的核酸序列可含有其它元件，例如转录终止信号或多聚腺苷酸化信号。
降低内源性β-羟化酶活性的其它优选实施方案类似于上述用于降低ε-环化酶活性的优选实施方案，只是其中用内源性β-羟化酶代替了ε-环化酶。
在本发明方法中，特别优选地使用具有组合了以下遗传修饰的经遗传修饰植物与野生型相比，在花叶中具有提高了的或诱导的酮酶活性并且具有提高了的羟化酶活性的经遗传修饰植物，与野生型相比，在花叶中具有提高了的或诱导的酮酶活性并且具有提高了的β-环化酶活性的经遗传修饰植物，与野生型相比，在花叶中具有提高了的或诱导的酮酶活性并且具有降低了的ε-环化酶活性的经遗传修饰植物，与野生型相比，在花叶中具有提高了的或诱导的酮酶活性并且具有提高了的羟化酶活性和提高了的β-环化酶活性的经遗传修饰植物，与野生型相比，在花叶中具有提高了的或诱导的酮酶活性并且具有提高了的羟化酶活性和降低了的ε-环化酶活性的经遗传修饰植物，与野生型相比，在花叶中具有提高了的或诱导的酮酶活性并且具有提高了的β-环化酶活性和降低了的ε-环化酶活性的经遗传修饰植物，以及与野生型相比，在花叶中具有提高了的或诱导的酮酶活性并且具有提高了的羟化酶活性、提高了的β-环化酶活性和降低了的ε-环化酶活性的经遗传修饰植物，与野生型相比，在花叶中具有提高了的或诱导的酮酶活性、降低了的ε-环化酶活性、提高了的β-环化酶活性的经遗传修饰植物，
与野生型相比，在花叶中具有提高了的或诱导的酮酶活性、降低了的ε-环化酶活性和降低了的内源性β-羟化酶活性的经遗传修饰植物，与野生型相比，在花叶中具有提高了的或诱导的酮酶活性、降低了的ε-环化酶活性和提高了的羟化酶活性的经遗传修饰植物，与野生型相比，在花叶中具有提高了的或诱导的酮酶活性、提高了的β-环化酶活性和提高了的羟化酶活性的经遗传修饰植物，与野生型相比，在花叶中具有提高了的或诱导的酮酶活性、提高了的β-环化酶活性和降低了的内源性β-羟化酶活性的经遗传修饰植物，与野生型相比，在花叶中具有提高了的或诱导的酮酶活性和提高了的β-环化酶活性的经遗传修饰植物，与野生型相比，在花叶中具有提高了的或诱导的酮酶活性、降低了的ε-环化酶活性和至少一种其它提高了的活性选自HMG-CoA还原酶活性、(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶活性、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶活性、异戊烯基-二磷酸酯Δ-异构酶活性、牻牛儿基-二磷酸酯合酶活性、法呢酰-二磷酸酯合酶活性、牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶活性、八氢番茄红素合酶活性、八氢番茄红素去饱和酶活性、ζ-胡萝卜素去饱和酶活性、crtlSO活性、FtsZ活性或MinD活性的经遗传修饰植物，与野生型相比，在花叶中具有提高了的或诱导的酮酶活性、降低了的ε-环化酶活性、提高了的β-环化酶活性和提高了的羟化酶活性的经遗传修饰植物，与野生型相比，在花叶中具有提高了的或诱导的酮酶活性、降低了的ε-环化酶活性、提高了的β-环化酶活性和降低了的内源性β-羟化酶活性的经遗传修饰植物，与野生型相比，在花叶中具有提高了的或诱导的酮酶活性、降低了的ε-环化酶活性和提高了的β-环化酶活性的经遗传修饰植物，与野生型相比，在花叶中具有提高了的或诱导的酮酶活性、降低了的ε-环化酶活性和提高了的羟化酶活性的经遗传修饰植物，
与野生型相比，在花叶中具有提高了的或诱导的酮酶活性、降低了的ε-环化酶活性和降低了的内源性β-羟化酶活性的经遗传修饰植物，与野生型相比，在花叶中具有提高了的或诱导的酮酶活性、降低了的ε-环化酶活性、提高了的羟化酶活性和降低了的内源性β-羟化酶活性的经遗传修饰植物，与野生型相比，在花叶中具有提高了的或诱导的酮酶活性、提高了的β-环化酶活性、提高了的羟化酶活性和降低了的内源性β-羟化酶活性的经遗传修饰植物，与野生型相比，在花叶中具有提高了的或诱导的酮酶活性、降低了的ε-环化酶活性、提高了的β-环化酶活性和至少一种其它提高了的活性选自HMG-CoA还原酶活性、(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶活性、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶活性、异戊烯基-二磷酸酯D-异构酶活性、牻牛儿基-二磷酸酯合酶活性、法呢酰-二磷酸酯合酶活性、牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶活性、八氢番茄红素合酶活性、八氢番茄红素去饱和酶活性、ζ-胡萝卜素去饱和酶活性、crtlSO活性、FtsZ活性或MinD活性的经遗传修饰植物，与野生型相比，在花叶中具有提高了的或诱导的酮酶活性、降低了的ε-环化酶活性、提高了的β-环化酶活性、提高了的羟化酶活性和降低了的内源性β-羟化酶活性的经遗传修饰植物，与野生型相比，在花叶中具有提高了的或诱导的酮酶活性、降低了的ε-环化酶活性、提高了的β-环化酶活性和提高了的羟化酶活性的经遗传修饰植物，与野生型相比，在花叶中具有提高了的或诱导的酮酶活性、降低了的ε-环化酶活性、提高了的β-环化酶活性和降低了的内源性β-羟化酶活性的经遗传修饰植物，与野生型相比，在花叶中具有提高了的或诱导的酮酶活性、降低了的ε-环化酶活性、提高了的羟化酶活性和至少一种其它提高了的活性选自HMG-CoA还原酶活性、(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶活性、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶活性、异戊烯基-二磷酸酯D-异构酶活性、拢牛儿基-二磷酸酯合酶活性、法呢酰-二磷酸酯合酶活性、牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶活性、八氢番茄红素合酶活性、八氢番茄红素去饱和酶活性、ζ-胡萝卜素去饱和酶活性、crtlSO活性、FtsZ活性或MinD活性的经遗传修饰植物，与野生型相比，在花叶中具有提高了的或诱导的酮酶活性、降低了的ε-环化酶活性、降低了的内源性β-羟化酶活性和至少一种其它提高了的活性选自HMG-CoA还原酶活性、(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶活性、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶活性、异戊烯基-二磷酸酯D-异构酶活性、牻牛儿基-二磷酸酯合酶活性、法呢酰-二磷酸酯合酶活性、牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶活性、八氢番茄红素合酶活性、八氢番茄红素去饱和酶活性、ζ-胡萝卜素去饱和酶活性、crtlSO活性、FtsZ活性或MinD活性的经遗传修饰植物，与野生型相比，在花叶中具有提高了的或诱导的酮酶活性、提高了的β-环化酶活性、提高了的羟化酶活性和至少一种其它提高了的活性选自HMG-CoA还原酶活性、(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶活性、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶活性、异戊烯基-二磷酸酯Δ-异构酶活性、牻牛儿基-二磷酸酯合酶活性、法呢酰-二磷酸酯合酶活性、牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶活性、八氢番茄红素合酶活性、八氢番茄红素去饱和酶活性、ζ-胡萝卜素去饱和酶活性、crtlSO活性、FtsZ活性或MinD活性的经遗传修饰植物，与野生型相比，在花叶中具有提高了的或诱导的酮酶活性、提高了的β-环化酶活性、降低了的内源性β-羟化酶活性和至少一种其它提高了的活性选自HMG-CoA还原酶活性、(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶活性、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶活性、异戊烯基-二磷酸酯D-异构酶活性、牻牛儿基-二磷酸酯合酶活性、法呢酰-二磷酸酯合酶活性、牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶活性、八氢番茄红素合酶活性、八氢番茄红素去饱和酶活性、ζ-胡萝卜素去饱和酶活性、crtlSO活性、FtsZ活性或MinD活性的经遗传修饰植物，与野生型相比，在花叶中具有提高了的或诱导的酮酶活性、降低了的ε-环化酶活性、提高了的β-环化酶活性和提高了的羟化酶活性和降低了的β-羟化酶活性的经遗传修饰植物，与野生型相比，在花叶中具有提高了的或诱导的酮酶活性、降低了的ε-环化酶活性、提高了的β-环化酶活性、提高了的羟化酶活性和至少一种其它提高了的活性选自HMG-CoA还原酶活性、(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶活性、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶活性、异戊烯基-二磷酸酯D-异构酶活性、牻牛儿基-二磷酸酯合酶活性、法呢酰-二磷酸酯合酶活性、牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶活性、八氢番茄红素合酶活性、八氢番茄红素去饱和酶活性、ζ-胡萝卜素去饱和酶活性、crtlSO活性、FtsZ活性或MinD活性的经遗传修饰植物，与野生型相比，在花叶中具有提高了的或诱导的酮酶活性、降低了的ε-环化酶活性、提高了的β-环化酶活性、降低了的内源性β-羟化酶活性和至少一种其它提高了的活性选自HMG-CoA还原酶活性、(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶活性、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性、1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶活性、异戊烯基-二磷酸酯D-异构酶活性、牻牛儿基-二磷酸酯合酶活性、法呢酰-二磷酸酯合酶活性、牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶活性、八氢番茄红素合酶活性、八氢番茄红素去饱和酶活性、ζ-胡萝卜素去饱和酶活性、crtlSO活性、FtsZ活性或MinD活性的经遗传修饰植物。
尤其优选与野生型相比，在花叶中具有提高了的或诱导的酮酶活性、提高了的β-环化酶活性和提高了的羟化酶活性的经遗传修饰植物，通过导入这样的核酸诱导提高的酮酶活性，所述核酸编码的蛋白质包含氨基酸序列SEQ ID NO2或通过对该序列进行氨基酸替代、插入或缺失而得到的序列，后述序列在氨基酸水平上与序列SEQ ID NO2具有至少20％的同一性且具有酮酶的酶学特性。
通过导入这样的核酸诱导提高的β-环化酶活性，所述核酸编码的β-环化酶包含氨基酸序列SEQ ID NO110或通过对该序列进行氨基酸替代、插入或缺失而得到的序列，后述序列在氨基酸水平上与序列SEQ ID NO110具有至少20％的同一性。
通过导入这样的核酸诱导提高的羟化酶活性，所述核酸编码的羟化酶包含氨基酸序列SEQ ID NO108或通过对该序列进行氨基酸替代、插入或缺失而得到的序列，后述序列在氨基酸水平上与序列SEQ ID NO108具有至少20％的同一性。
尤其优选与野生型相比，在花叶中具有提高了的或诱导的酮酶活性、降低了的ε-环化酶活性、提高了的β-环化酶活性、提高了的羟化酶活性和降低了的内源性β-羟化酶活性的经遗传修饰植物，通过导入这样的核酸诱导提高的酮酶活性，所述核酸编码的蛋白质包含氨基酸序列SEQ ID NO2或通过对该序列进行氨基酸替代、插入或缺失而得到的序列，后述序列在氨基酸水平上与序列SEQ ID NO2具有至少20％的同一性且具有酮酶的酶学特性。
通过导入这样的核酸诱导提高的β-环化酶活性，所述核酸编码的β-环化酶包含氨基酸序列SEQ ID NO110或通过对该序列进行氨基酸替代、插入或缺失而得到的序列，后述序列在氨基酸水平上与序列SEQ ID NO110具有至少20％的同一性。
通过导入这样的核酸诱导提高的羟化酶活性，所述核酸编码的羟化酶包含氨基酸序列SEQ ID NO108或通过对该序列进行氨基酸替代、插入或缺失而得到的序列，后述序列在氨基酸水平上与序列SEQ ID NO108具有至少20％的同一性。并且根据上述优选的实施方案诱导降低了的ε-环化酶活性和降低了的内源性β-羟化酶活性。
如下文中所述，例如通过导入单独的核酸构建体(表达盒)或通过导入含有多至二、三或四个所述活性的多重构建体，能够产生万寿菊属的这些经遗传修饰植物。
在下文中，通过举例方式描述在花叶中具有提高了的或诱导的酮酶活性的经遗传修饰植物的产生。以类似方式利用编码羟化酶或β-环化酶的核酸序列或编码HMG-CoA还原酶的核酸和/或编码(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶的核酸和/或编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶的核酸和/或编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶的核酸和/或编码异戊烯基-二磷酸酯D-异构酶的核酸和/或编码牻牛儿基-二磷酸酯合酶的核酸和/或编码法呢酰-二磷酸酯合酶的核酸和/或编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶的核酸和/或编码八氢番茄红素合酶的核酸和/或编码八氢番茄红素去饱和酶的核酸和/或编码ζ-胡萝卜素去饱和酶的核酸和/或编码crtlSO蛋白的核酸和/或编码FtsZ蛋白的核酸和/或编码MinD蛋白质的核酸代替编码酮酶的核酸序列，能够实现其它活性的提高，例如羟化酶活性和/或β-环化酶活性和/或HMG-CoA还原酶活性和/或(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸酯还原酶活性和/或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶活性和/或1-脱氧-D-木糖-5-磷酸还原异构酶活性和/或异戊烯基-二磷酸酯D-异构酶活性和/或牻牛儿基-二磷酸酯合酶活性和/或法呢酰-二磷酸酯合酶活性和/或牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯合酶活性和/或八氢番茄红素合酶活性和/或八氢番茄红素去饱和酶活性和/或ζ-胡萝卜素去饱和酶活性和/或crtlSO活性和/或FtsZ活性和/或MinD活性。以类似方式使用ε-环化酶反义核酸序列或ε-环化酶反向重复核酸序列或使用内源性β-羟化酶反义核酸序列或内源性β-羟化酶反向重复核酸序列代替编码酮酶的核酸序列，能够实现其它酶活性例如ε-环化酶活性或内源性β-羟化酶活性的降低。在进行组合遗传修饰的情况下，可分别地实施转化或通过多种构建体实施转化。
优选地，通过使用含有上述编码酮酶并功能性连接于一个或多个确保在植物中转录和翻译的调控信号上的核酸的核酸构建体进行起始植物的转化，产生万寿菊属转基因植物。
其中编码核酸序列功能性连接于一个或多个确保在植物中转录和翻译的调控信号上的这些核酸构建体在下文中也称为表达盒。
优选地，调控信号含有一个或多个确保在植物中转录和翻译的启动子。
表达盒含有调控信号，也就是说控制宿主细胞中编码序列表达的调节性核酸序列。根据优选的实施方案，表达盒包含上游(也就是说在编码序列5’末端)、启动子、下游(也就是说在3’末端)、多聚腺苷酸化信号以及根据需要还包含其它可操作连接于至少一个上述基因的编码序列的调控元件。可操作连接意思是指启动子、编码序列、终止子以及根据需要其它调控元件以每个调控元件都能够在编码序列表达中以适当方式履行其功能的方式顺序排列。
在下文中，以举例的方式描述了用于万寿菊属植物的优选核酸构建体、表达盒和载体以及用于产生万寿菊属转基因植物的方法，还有万寿菊属转基因植物自身。
优选用于可操作连接的序列是(但并不限于)确保在质外体、液泡、质体、线粒体、内质网(ER)、细胞核、油体或其它区室中亚细胞定位的靶向性序列和诸如来自烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus)5’前导序列的翻译增强子(Gallie等，Nucl.Acids Res.15(1987)，8693-8711)。
原则上，能够控制外源基因在植物中表达的任意启动子都适于作为表达盒的启动子。
“组成型”启动子是指那些在多数优选地在所有组织非常长的植物发育期优选地在植物发育的全部时间点确保表达的启动子。
特别优选使用植物启动子或源于植物病毒的启动子。具体而言，CaMV花椰菜花叶病毒(CaMV cauliflower mosaic virus)35S转录本的启动子是优选的(Franck等(1980)Cell 21285-294；Odell等(1985)Nature313810-812；Shewmaker等(1985)Virology 140281-288；Gardner等(1986)Plant Mol Biol 6221-228)或19S CaMV启动子(US 5,352,605；WO 84/02913；Benfey等(1989)EMBO J 82195-2202)。
其它合适的组成型启动子是pds启动子(Pecker等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci USA 894962-4966)或“核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基(SSU)”启动子(US 4,962,028)、豆球蛋白B启动子(GenBank登录号X03677)、来自农杆菌属的胭脂碱合酶启动子、TR双启动子、来自农杆菌属的OCS(章鱼碱合酶)启动子、泛素启动子(HoltorfS等(1995)PlantMol Biol 29637-649)、泛素1启动子(Christensen等(1992)Plant Mol Biol18675-689；Bruce等(1989)Proc Natl Acad Sci USA 869692-9696)、Smas启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(US 5,683,439)、液泡ATP酶亚基启动子或来自小麦的富含脯氨酸的蛋白质的启动子(WO 91/13991)、Pnit启动子(Y07648.L，Hillebrand等(1998)，Plant.Mol.Biol.36，89-99，Hillebrand等(1996)，Gene，170，197-200)以及其它本领域技术人员已知的在植物中组成型表达的基因的启动子。
表达盒也可包含化学可诱导型的启动子(综述文章Gatz等(1997)Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 4889-108)，通过化学可诱导的启动子能够在特定时间点控制植物中酮酶基因的表达。同样能够使用此类启动子，例如PRP1启动子(Ward等(1993)Plant Mol Biol 22361-366)、水杨酸-可诱导的启动子(WO 95/19443)、苯磺酰胺-可诱导的启动子(EP 0 388 186)、四环素-可诱导的启动子(Gatz等(1992)Plant J 2397-404)、脱落酸-可诱导的启动子(EP 0 335 528)和乙醇-或环己酮-可诱导的启动子(WO 93/21334)。
而且，由生物或非生物胁迫诱导的启动子也是优选的，例如PRP1基因的病原体-可诱导的启动子(Ward等(1993)Plant Mol Biol 22361-366)、来自番茄的热-可诱导的hsp70或hsp80启动子(US 5,187,267)、来自马铃薯的冷-可诱导的α-淀粉酶启动子(WO 96/12814)、光-可诱导的PPDK启动子或创伤-可诱导的pinII启动子(EP 375091)。
病原体-可诱导的启动子包括作为病原体攻击的结果而诱导的基因的启动子，所述基因例如PR蛋白、SAR蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、壳多糖酶等的基因(例如Redolfi等(1983)Neth J Plant Pathol 89245-254；Uknes等(1992)The Plant Cell 4645-656；Van Loon(1985)Plant Mol Viral4111-116；Marineau等(1987)Plant Mol Biol 9335-342；Matton等(1987)Molecular Plant-Microbe Interactions 2325-342；Somssich等(1986)ProcNatl Acad Sci USA 832427-2430；Somssich等(1988)Mol Gen Genetics293-98；Chen等(1996)Plant J 10955-966；Zhang和Sing(1994)ProcNatl Acad Sci USA 912507-2511；Warner等(1993)Plant J 3191-201；Siebertz等(1989)Plant Cell 1961-968(1989)。
还包括一些基因的创伤-可诱导的启动子，所述基因如pinII基因(Ryan(1990)Ann Rev Phytopath 28425-449；Duan等(1996)Nat Biotech14494-498)、wun1和wun2基因(US 5,428,148)、win1和win2基因(Stanford等(1989)Mol Gen Genet 215200-208)、系统素(McGurl等(1992)Science2251570-1573)、WIP1基因(Rohmeier等(1993)Plant Mol Biol 22783-792；Ekelkamp等(1993)FEBS Letters 32373-76)、MPI基因(Corderok等(1994)The Plant J 6(2)141-150)等等。
其它合适的启动子为例如果实成熟特异启动子，如来自番茄的果实成熟特异启动子(WO 94/21794，EP 409 625)。当然，由于不同的组织以发育依赖方式形成，发育依赖启动子也包括部分组织特异启动子。
此外，特别优选确保在组织或植物部分中进行例如酮式类胡萝卜素生物合成或其前体发生表达的那些启动子。例如优选的是具有花药、子房、花瓣、萼片、花、叶、茎和根特异性的启动子和它们的组合。
块茎-、贮藏根-或根-特异启动子是，例如，来自马铃薯的patatin启动子类I(B33)或组织蛋白酶D抑制剂的启动子。
叶特异启动子为例如来自马铃薯的细胞溶质FBP酶的启动子(WO 97/05900)、来自马铃薯的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶)的SSU启动子(小亚基)或ST-LSI启动子(Stockhaus等(1989)EMBO J 82445-2451)。
花特异启动子为例如来自拟南芥菜的八氢番茄红素合酶启动子(WO 92/16635)或P-rr基因启动子(WO 98/22593)或AP3启动子(见实施例1)。
花药特异启动子为例如5126启动子(US 5,689,049，US 5,689,051)、glob-l启动子或g-玉米醇溶蛋白启动子。
其他适于在植物中表达的启动子描述于Rogers等(1987)Meth inEnzymol 153253-277；Schardl等(1987)Gene 611-11以及Berger等(1989)Proc Natl Acad Sci USA8402-8406)。
所有本申请中所述的启动子通常使得在本发明植物的花叶中表达酮酶成为可能。
本发明方法中特别优选的是组成型花特异且尤其是花叶特异的启动子。
根据常规的重组和克隆技术，例如描述于T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)、T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)以及Ausubel，F.M.等，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience(1987)中的重组和克隆技术，优选地通过融合适当的启动子及上述编码酮酶的核酸并优选地在启动子和该核酸序列之间插入编码质体特异性转运肽的核酸以及多聚腺苷酸化信号产生表达盒。
优选地插入并编码质体转运肽的核酸确保定位于质体，并且特别是定位于色质体。
也可使用其核酸序列编码酮酶融合蛋白质的表达盒，一部分融合蛋白质作为控制多肽转位的转运肽。对于色质体特异的转运肽是优选的，当酮酶转位进入色质体后特异转运肽从酮酶部分酶切下来。
特别优选的转运肽为来自烟草质体转酮醇酶的转运肽或其它转运肽(例如核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(rbcS)小亚基或铁氧还蛋白NADP氧化还原酶以及异戊烯焦磷酸异构酶-2或其功能等同物的转运肽)。
来自烟草质体转酮醇酶的质体转运肽的三个盒的核酸序列是特别优选的，它们作为KpnI/BamHI片段在NcoI酶切位点具有ATG密码子的三个读码框pTP09KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTC
TCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGGGATCC_BamHIpTP10KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGCTGGATCC_BamHIpTP11KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGGGGATCC_BamHI质体转运肽的其它实例是来自拟南芥菜质体的异戊烯焦磷酸异构酶-2(IPP-2)的转运肽和来自豌豆核酮糖二磷酸羧化酶小亚基(rbcS)的转运肽(Guerineau，F，Woolston，S，Brooks，L，Muuineaux，P(1988)，用于将外源蛋白靶向色质体的表达盒，Nucl.Acids Res.1611380)。
本发明的核酸可合成制备或天然产生或者可含有合成和天然核酸成分的混合物，并且也可由多种有机体的多种异源基因部分组成。
如上所述，具有被万寿菊属植物所优选密码子的合成核苷酸序列是优选的。从在绝大多数目的植物物种中具有最高表达蛋白质频率的密码子能够确定植物优选的这些密码子。
在表达盒的制备中，能够操作多种DNA片段而获得以正确方向方便阅读并置于正确读码框中的核苷酸序列。对于DNA片段的彼此连接，可将接头或连接子添加到片段上。
方便地，能够以转录方向将含有一个或多个限制性酶切位点的接头或多接头提供于启动子和终止子区域以插入所述序列。通常，接头有从1到10，通常从1到8，优选地从2到6个限制性酶切位点。通常，在调控区域内，接头大小少于100bp，通常少于60bp，但至少为5bp。对于宿主植物，启动子可以是天然的或同源的也可以是外来的或异源的。表达盒5’-3’转录方向优选地含有启动子、编码核酸序列或核酸构建体以及转录终止区域。多种终止区域可以根据需要进行彼此替换。
终止子的实例为35S终止子(Guerineau等(1988)Nucl Acids Res.1611380)、nos终止子(Depicker A，Stachel S，Dhaese P，Zambryski P，Goodman HM.，胭脂碱合酶转录图谱和DNA序列，J Mol Appl Genet.1982；1(6)561-73)或ocs终止子(Gielen，J，de Beuckeleer，M，Seurinck，J，Debroek，H，de Greve，H，Lemmers，M，van Montagu，M，Schell，J(1984)，根癌农杆菌质粒pTiAch5的TL-DNA全序，EMBO J.3835-846)。
此外，能够使用提供相匹配的限制性酶切位点或去除多余DNA或限制性酶切位点的操作。在进行插入、缺失或替代例如转换和颠换时可以使用体外诱变、“引物修复”、限制性酶切或连接。
运用适当的操作，例如限制性酶切、“消化”或补平突出端形成钝末端，能够获得用于连接的片段的互补末端。
优选的多聚腺苷酸化信号是植物多聚腺苷酸化信号，优选地是基本上对应于来自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的T-DNA多聚腺苷酸化信号，尤其是Ti质粒pTiACH5(Gielen等，EMBO J.3(1984)，835ff)T-DNA基因3(章鱼碱合酶)的多聚腺苷酸化信号或其功能等同物。
将外源基因转移至植物基因组称为转化。
因此，能够利用本身已知的方法转化并从瞬时或稳定转化的植物组织或植物细胞再生植物。
用于转化植物的适宜方法是通过聚乙二醇诱导DNA摄入进行原生质体转化、使用基因枪的生物弹射击(biolistic)法(也称为粒子轰击法)、电穿孔法、在含DNA溶液中孵育干燥胚法、微注射和上述通过农杆菌介导的基因转移。所述方法描述于例如Transgenic Plants，1卷，Engineeringand Utilization(S.D.Kung和R.Wu Academic Press(1993)出版)中的B.Jenes等，基因转移技术，128-143，以及描述于Potrykus，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)，205-225)。
优选地，将欲表达的构建体克隆入适于转化根癌农杆菌的载体中，例如pBin19(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1984)，8711)或特别优选地为pSUN2、pSUN3、pSUN4或pSUN5(WO 02/00900)。
通过表达质粒转化的农杆菌能够以已知的方式用于转化植物，例如通过在转化农杆菌溶液中浸浴创伤叶或叶片块并且然后在适当的培养基中培养它们。
对于优选地产生经遗传修饰植物在下文中也称为转基因植物，将表达酮酶的融合表达盒克隆入适于转化入根癌农杆菌的载体例如pBin19或特别是pSUN2。然后以已知的方式将用此种载体转化的农杆菌用于转化植物，特别是通过在转化农杆菌溶液中浸浴创伤叶或叶片块并且然后在适当的培养基中培养它们得到培养植物。
通过农杆菌进行植物转化尤其公开于Transgenic Plants，Vol.1，Engineering and Utilization(S.D.Kung和R.Wu，Academic Press，1993出版)一书中F.F.White，高等植物中用于基因转移的载体；15-38页。以已知的方式，从创伤的叶或叶片块的转化细胞能够再生出含有整合入表达盒并表达编码酮酶的核酸的基因的转基因植物。
对于用具有编码酮酶的核酸转化万寿菊属宿主植物的转化，将其表达盒整合插入重组载体，所述载体DNA包含额外的功能性调控信号，例如用于复制或整合的序列。适当的载体尤其描述于“Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology”(CRC Press)，6/7章，71-119页(1993)。
使用上面引用的重组和克隆技术，能够将表达盒克隆入适当的载体以允许它们的扩增，例如在大肠杆菌(E.coli.)中扩增。适当的克隆载体尤其是pJIT117(Guerineau等(1988)Nucl.Acids Res.1611380)、pBR332、pUC系列、M13mp系列和pACYC184。特别适当的载体是不仅能够在大肠杆菌中也能够在农杆菌中复制的双元载体。
根据对启动子的选择，可在花叶中组成型地或优选地为特异性地进行表达。
与野生型相比，本发明万寿菊属经遗传修饰植物含有一定量的虾青素，尤其是在花瓣中。
如上所述，本发明涉及含虾青素的万寿菊属植物或其部分的用途或涉及含虾青素的万寿菊属植物或其部分的含虾青素提取物的用途，用于经口施用于动物。
在优选的实施方案中，含虾青素的万寿菊属植物或其部分或者含虾青素的万寿菊属植物或其部分的含虾青素提取物用于使动物和相应的动物产品着色。
认为含虾青素植物或植物部分的含虾青素提取物优选地是指含有已经通过至少一种适当的溶剂从含虾青素植物或植物部分抽提产生的含虾青素的溶液。根据所使用的溶剂和所使用的化学和物理纯化方法，虾青素能够以任意预期的纯度存在于抽提物中。抽提之前适当地制备含虾青素植物或植物部分是有利的，例如干燥植物或植物部分并将其粉碎，其顺序是任选的。
通过有机溶剂例如丙酮、己烷、二氯甲烷、甲基叔丁基醚，或通过溶剂混合物如乙醇/己烷或丙酮/己烷，能够从含虾青素的植物或植物部分抽提虾青素，根据需要含虾青素的植物或植物部分已经事先干燥和/或粉碎。通过溶剂不同的混合比例，由于具有不同的极性，提取效率可不同。通过此种抽提，可以以高浓度富集虾青素。
然后通过振荡和层析分离混合物提取虾青素能够进一步提高虾青素的纯度。虾青素通常作为单-和二酯混合物存在，通常以软脂酸酯存在。
根据本发明认为“着色”优选地是指与非着色动物相比，着色动物或动物产品的至少一部分颜色加强或产生颜色。含虾青素色素通常着色并起始或加强粉红色至粉红色-红色。
能够通过本发明经口施用而着色的优选动物是选自鱼类、甲壳动物或鸟类的动物，尤其是鸡形目(galliformes)和Anatridae。
优选的鱼类是鲑类(salmonid)，尤其是鲑鱼或鳟鱼。
优选的甲壳动物是虾和蟹。
优选的鸡形目是鸡、鸭或鹅。
优选的Anatridae是红鹳(flamingo)。
依赖于着色动物，优选地，认为着色动物产品尤其是指鲑鱼或鳟鱼的肉，鸡、鸭或鹅的皮肤，鸡、鸭、鹅或红鹳的羽毛，以及鸡、鸭或鹅的卵或卵黄。
通过直接或通过经口施用已经预先将含虾青素的万寿菊属植物或植物部分或者含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物混合于其中的动物饲料制品，能够实现将含虾青素的万寿菊属植物或植物部分或者含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物经口施用于动物。
在优选的实施方案中，将含虾青素的万寿菊属植物或植物部分或者含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物混合于动物饲料制品并且将动物饲料制品经口施用于动物。
在混合于动物饲料制品之前，将含虾青素的万寿菊属植物或植物部分或者含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物加工成一种能够混合于相应动物饲料制品并优选地在各自的使用领域中产生高稳定性和高生物利用度虾青素的形式是有利的。
根据对其进行经口施用的动物并且也根据动物饲料制品，因此多种加工步骤对其目的可以是有利的。
对于含虾青素的万寿菊属植物或植物部分，在该实施方案中，干燥和/或粉碎含虾青素的植物或植物部分尤其是头状花序或花瓣是有利的。特别优选地，含虾青素的万寿菊属植物或植物部分是以粉末形式存在的。
然而每个实施方案所准备的含虾青素万寿菊属植物或植物部分，无论加工或不加工，均能够以本身已知的方式混合于动物饲料制品。
对于含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物，在该实施方案中，多种加工步骤都是有利的。
如果仍然存在的溶剂对于相应的动物是生理学上无害的时，含虾青素提取物能够直接混合于动物饲料制品。
蒸发掉仍然存在的溶剂之后，提取物能够以含虾青素粉末或油的形式使用。
例如，所得到的含虾青素粉末或油能够掺入鱼油，应用于粉末载体物质例如小麦面粉或擦碎的万寿菊花瓣，或者包括于藻酸盐、明胶或脂类中。
因此含虾青素提取物或加工后的提取物优选地是液体或粉末形式。
然而每个实施方案所准备的含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物，无论加工或不加工，均能够以本身已知的方式混合于动物饲料制品。
因此本发明还涉及包含含虾青素的万寿菊属植物或植物部分或含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物的动物饲料制品。
本发明进一步涉及通过将含虾青素的万寿菊属植物或植物部分或含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物与传统动物饲料组合产生动物饲料制品的方法。
方法优选的实施方案包括在与动物饲料组合之前，将含虾青素的万寿菊属植物或植物部分或含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物加工成一种能够与动物饲料组合的形式。
例如，对于鱼类，鱼类饲料制品可包含其它常见鱼类饲料成分，例如鱼粉和/或其它蛋白质、油(例如鱼油)、谷类、维生素、矿物质、防腐剂以及根据需要还含有常规量的药物。
例如，用于鳟鱼的一般鱼类饲料制品由以下成分组成
例如，用于鲑鱼的一般鱼类饲料制品由以下成分组成
在一个实施方案中，含虾青素的万寿菊属植物或植物部分或含虾青素提取物优选地以干燥并粉碎的粉末形式混合于动物饲料制品。
关于鱼类饲料，所得到的含有含虾青素的万寿菊属植物或植物部分或含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物的动物饲料制品可以例如以本身已知的方式被颗粒化或特别有利地被挤压。
在优选的实施方案中，含虾青素提取物混合于动物饲料制品，优选地以液体形式混合。这是有利的，特别是在生产挤压的鱼类饲料制品时。挤压过程对于敏感物质例如虾青素造成挤压压力，这可能导致虾青素损失。挤压压力主要是机械力(揉捏、剪切、压迫等)的作用，但也包括由加入水和蒸气引起的水热压力，并且也可以观察到氧化压力。
为了避免作为上述挤压过程的结果产生的虾青素损失，在挤压或干燥过程之后在真空条件下可以通过PPA(制粒后应用)技术应用液体含虾青素提取物。
在更加优选的实施方案中，含虾青素的万寿菊属植物或植物部分或含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物经口直接施用于动物。
在施用之前，将含虾青素的万寿菊属植物或植物部分或含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物加工成一种能够直接经口施用于动物并优选地在各自的使用领域中产生高稳定性和高生物利用度虾青素的形式是有利的。
取决于对其进行经口施用的动物，并且也取决于动物饲料制品，因此多种加工步骤均可以是有利的。
对于含虾青素的万寿菊属植物或植物部分，在该实施方案中干燥和/或粉碎含虾青素的植物或植物部分尤其是头状花序或花瓣是有利的。特别优选地，含虾青素的万寿菊属植物或植物部分是以粉末形式存在的。
然而每个实施方案所准备的含虾青素的万寿菊属植物或植物部分，无论加工或不加工，均能够以本身已知的方式经口施用于动物。
对于含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物，在该实施方案中，多种加工步骤都是有利的。
如果仍然存在的溶剂对于相应的动物是生理学上无害的，含虾青素提取物能够直接经口施用于动物。
蒸发掉仍然存在的溶剂之后，提取物能够以含虾青素粉末或油的形式被施用。
例如，所得到的含虾青素粉末或油能够掺入鱼油，能够应用于粉末载体物质例如小麦粉或擦碎的万寿菊花瓣，或者包括于藻酸盐、明胶或脂类中。
因此含虾青素提取物或加工后提取物优选地是液体或粉末形式。
然而每个实施方案所准备的含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物，无论加工或不加工，均能够以本身已知的方式经口施用于动物。
因此本发明还涉及含有含虾青素的万寿菊属植物或植物部分或含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物的着色剂，在这种情况下含虾青素的万寿菊属植物或植物部分或含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物根据需要能够如上述被加工。
在优选的实施方案中，着色剂含有含虾青素的万寿菊属植物或植物部分或含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物，在这种情况下含虾青素的万寿菊属植物或植物部分或含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物根据需要能够如上述被加工。
在特别优选的着色剂中，所使用的植物部分是头状花序或花瓣。
本发明进一步涉及通过将含虾青素的万寿菊属植物或植物部分或含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物经口施用于动物进行动物或动物产品着色的方法。
本发明进一步涉及通过将含虾青素的万寿菊属植物或植物部分或含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物经口施用于动物产生着色的动物或动物产品的方法。
本发明进一步涉及含虾青素的万寿菊属植物或植物部分或含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物作为动物饲料或动物饲料添加剂的用途。
含有含虾青素的万寿菊属植物或植物部分或含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物的着色剂或含有这些着色剂的动物饲料也具有色素虾青素高储存稳定性和高生物利用度的优点。
现在将通过以下实施例描述本发明，但不限于此实施例I产生含虾青素的万寿菊属经遗传修饰植物常规实验条件重组DNA的序列分析通过Sanger法(Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74(1977)，5463-5467)使用来自Licor的激光荧光DNA-测序仪(通过MWG Biotech分布，Ebersbach)对重组DNA分子进行测序。
实施例I.1扩增编码来自雨生红球藻Flotow em.Wille的酮酶的全长一级序列的cDNA通过PCR方法从雨生红球藻(G_ttingen大学藻类培养物保藏中心的192.80株)悬浮培养物扩增来自雨生红球藻编码酮酶的cDNA。
对于从已经室温在红球藻培养基中(1.2g/l醋酸钠、2g/l酵母抽取物、0.2g/l MgCl2·6H2O、0.02CaCl2·2H2O；pH 6.8；高压灭菌后，加入400mg/lL-天冬酰胺、10mg/l FeSO4·H2O)间接日光生长2周的雨生红球藻(192.80株)悬浮培养物中制备总RNA，步骤为收获细胞，冰冻于液氮中并在研钵中研磨。然后将100mg冰冻粉碎的藻类细胞转移至反应容器中并加入0.8ml Trizol缓冲液(LifeTechnologies)中。用0.2ml氯仿抽提悬浮液。12000g离心15分钟后，取出含水上清并将其转移至新的反应容器中并用一倍体积的乙醇进行抽提。用一倍体积的异丙醇沉淀RNA，用75％乙醇洗涤并将沉淀物溶于DEPC水(室温将含1/1000体积焦碳酸二乙酯的水孵育过夜，然后高压灭菌)中。通过分光光度法测定RNA浓度。
对于cDNA合成，将2.5μg总RNA 60℃变性10分钟，冰上冷却2分钟并利用cDNA试剂盒(Ready-to-go-you-prime-beads，Pharmacia Biotech)按照制造商的说明，使用反义-特异引物(PR1 SEQ ID NO29)将其转录成cDNA。
使用一条有意-特异引物(PR2 SEQ ID NO30)和一条反义-特异引物(PR1 SEQ ID NO29)，通过聚合酶链式反应(PCR)从雨生红球藻扩增来自雨生红球藻(192.80株)编码酮酶的核酸。
PCR条件如下在含有以下成分的50ml反应混合物中PCR扩增编码由全长一级序列组成的酮酶蛋白质的cDNA-4ml雨生红球藻cDNA(如上述制备)-0.25mM dNTPs
-0.2mM PR1(SEQ ID NO29)-0.2mM PR2(SEQ ID NO30)-5ml 10×PCR缓冲液(TAKARA)-0.25ml R Taq聚合酶(TAKARA)-25.8ml蒸馏水。
PCR在以下循环条件下进行1×94℃ 2分钟35×94℃ 1分钟53℃ 2分钟72℃ 3分钟1×72℃ 10分钟使用SEQ ID NO29和SEQ ID NO30的PCR扩增产生编码全长一级序列蛋白质的1155bp片段(SEQ ID NO22)。使用标准方法，将扩增子克隆入PCR克隆载体pGEM-Teasy(Promega)并得到克隆pGKETO2。
对含有T7和SP6引物的克隆pGKETO2的测序分析证实该序列仅与所公开的序列X86782有三个密码子73、114和119不同，其中每个密码子中有一个碱基不同。在不同的扩增实验中也产生了这些核苷酸替代并因此代表了在所使用的雨生红球藻192.80株的核苷酸序列(

图1和2，序列比较)。
因此该克隆用于克隆入表达载体pJIT117(Guerineau等，1988，Nucl.Acids Res.1611380)。通过从pGEM-Teasy分离1027bp SpHI片段并将其连接入经SpHI酶切的载体pJIT117进行克隆。以正确方向含有雨生红球藻酮酶及其N端与rbcs转运肽翻译融合的克隆称为pJKETO2。
实施例I.2扩增编码来自雨生红球藻Flotow em.Wille的N末端缩短14个氨基酸的酮酶的cDNA利用PCR法从雨生红球藻悬浮培养物(G_ttingen大学藻类培养物保藏中心的192.80株)扩增编码雨生红球藻(192.80株)N末端缩短14个氨基酸的酮酶的cDNA。
如实施例1所述，从雨生红球藻(192.80株)悬浮培养物制备总RNA。
如实施例1所述进行cDNA合成。
利用聚合酶链式反应(PCR)使用一条有意特异引物(PR3 SEQ IDNO31)和一条反义特异引物(PR1 SEQ ID NO29)从雨生红球藻扩增编码来自雨生红球藻(192.80株)的N末端缩短14个氨基酸的酮酶的核酸。
PCR条件如下在含有以下成分的50ml反应混合物中PCR扩增编码N末端缩短14个氨基酸的酮酶蛋白质的cDNA-4ml雨生红球藻cDNA(如上述制备)-0.25mM dNTPs-0.2mM PR1(SEQ ID NO29)-0.2mM PR3(SEQ ID NO31)-5ml 10×PCR缓冲液(TAKARA)-0.25ml R Taq聚合酶(TAKARA)-25.8ml蒸馏水。
PCR在以下循环条件下进行1×94℃ 2分钟35×94℃1分钟53℃2分钟72℃3分钟1×72℃ 10分钟使用SEQ ID NO29和SEQ ID NO31的PCR扩增反应产生编码N-末端氨基酸(位置2-16)由单一氨基酸(亮氨酸)替换的酮酶蛋白质的1111bp片段。
使用标准方法，将扩增子克隆入PCR克隆载体pGEM-Teasy(Promega)。使用引物T7和SP6进行序列测定证实该序列与序列SEQ IDNO22相同，不同之处在于扩增子SEQ ID NO24中SEQ ID NO22的5’区域(位置1-53)被不同的九碱基序列所代替。因此该克隆用于克隆入表达载体pJIT117(Guerineau等1988，Nucl.Acids Res.1611380)。
通过从pGEM-Teasy分离985bp SpHI片段并将其连接入经SpHI酶切的载体pJIT117进行克隆。以正确方向含有N末端缩短14个氨基酸的雨生红球藻酮酶及其N-末端与rbcs转运肽融合翻译的克隆称为pJKETO3。
实施例I.3扩增编码来自雨生红球藻Flotow em.Wille(G_ttingen大学藻类培养物保藏中心192.80株)含有全部一级序列的酮酶并融合有C-末端myc-标签的cDNA通过PCR法利用质粒pGKETO2(如实施例1中所述)和引物PR15(SEQ ID NO32)制备编码来自雨生红球藻(192.80株)含有全部一级序列的酮酶并融合有C-末端myc-标签的cDNA。引物PR15包括反义特异3’区域(核苷酸40-59)和编码myc-标签的5’区域(核苷酸1-39)。
在含有以下成分的11.5ml反应混合物中进行pGKETO2和PR15的变性(95℃ 5分钟)和退火(在室温缓慢冷却至40℃)-1mg pGKETO2质粒DNA-0.1mg PR15(SEQ ID NO32)在含有以下成分的20ml反应混合物中补平3’末端(30℃ 30分钟)-11.5ml pGKETO2/PR15退火反应液(如上所述产生)-50mM dNTPs-2ml 1×克列诺缓冲液-2U克列诺酶通过聚合酶链式反应(PCR)使用一条有意特异引物(PR2 SEQ IDNO30)和一条反义特异引物(PR15 SEQ ID NO32)从雨生红球藻扩增编码来自雨生红球藻(192.80株)含有全部一级序列的酮酶并融合有C末端myc-标签的核酸。
PCR条件如下在含有以下成分的50ml反应混合液中PCR扩增编码具有融合C末端myc-标签的酮酶蛋白质的cDNA-1ml退火反应液(如上所述产生)-0.25mM dNTPs-0.2mM PR15(SEQ ID NO32)-0.2mM PR2(SEQ ID NO30)-5ml 10×PCR缓冲液(TAKARA)-0.25ml R Taq聚合酶(TAKARA)-28.8ml蒸馏水。
在以下循环条件进行PCR1×94℃ 2分钟35×94℃1分钟53℃1分钟72℃1分钟1×72℃ 10分钟使用SEQ ID NO32和SEQ ID NO30 PCR扩增产生了编码含有来自雨生红球藻酮酶全部一级序列并在N末端与rbcS转运肽融合且在C末端与myc-标签融合的双重翻译融合蛋白质的1032bp片段。
使用标准方法，将扩增子克隆入PCR克隆载体pGEM-Teasy(Promega)。使用引物T7和SP6进行序列测定证实该序列与序列SEQ IDNO22相同，不同之处为在扩增子SEQ ID NO26中SEQ ID NO22的3’区域(位置993-1155)被不同的39bp序列所代替。因此该克隆用于克隆入表达载体pJIT117(Guerineau等1988，Nucl.Acids Res.1611380)。
通过从pGEM-Teasy分离1038bp EcoRI-SpHI片段并将其连接入经EcoRI-SpHI酶切的载体pJIT117进行克隆。连接导致在rbcS转运肽序列的C末端和酮酶序列的N末端之间产生翻译融合。含有以正确方向在C末端融合myc-标签并在N末端与rbcS转运肽翻译融合的雨生红球藻酮酶的克隆称为pJKETO4。
实施例I.4扩增编码来自念珠藻(Nostoc sp.)PCC 7120的酮酶全部一级序列的DNA通过PCR从念珠藻PCC 7120(“巴斯德蓝细菌培养物保藏中心(Pasteur Culture Collection of Cyanobacterium”)的菌株)扩增编码来自念珠藻PCC 7120酮酶的DNA。
为了从已经在25℃于BG 11培养基(1.5g/l NaNO3，0.04g/lK2PO4·3H2O，0.075g/l MgSO4·H2O，0.036g/l CaCl2·2H2O，0.006g/l柠檬酸，0.006g/l柠檬酸铁铵，0.001g/l EDTA二钠镁，0.04g/l Na2CO3，1ml微量金属混合物A5+Co(2.86g/l H3BO3，1.81g/l MnCl2·4H2O，0.222g/lZnSO4·7H2O，0.39g/l NaMoO4·2H2O，0.079g/l CuSO4·5H2O，0.0494g/lCo(NO3)2·6H2O)中持续光照且持续振荡(150转/分钟)生长一周的念珠藻PCC 7120悬浮培养物中制备基因组DNA，通过离心收获细胞，冰冻于液氮并在研钵中粉碎。
从念珠藻PCC 7120分离DNA的步骤通过在8000转/分钟离心10分钟，从10ml液体培养物中沉淀出细菌细胞。然后使用研钵在液氮中挤压并研磨细菌细胞。将细胞物质重悬于1ml 10mM Tris HCl(pH 7.5)并转移至Eppendorf反应容器(2ml体积)中。加入100μl蛋白酶K(浓度20 mg/ml)，将细胞悬液在37℃孵育3小时。然后用500μl酚抽提悬浮液。13000转/分钟离心5分钟后，将上层的水相转移至一个新的2ml Eppendorf反应管中。重复酚抽提3次。加入1/10体积的3 M醋酸钠(pH 5.2)和0.6体积的异丙醇沉淀DNA，然后用70％乙醇洗涤。室温干燥DNA沉淀，然后加入25μl水在65℃加热溶解。
通过聚合酶链式反应(PCR)，使用一条有意特异引物(NOSTF，SEQID No.87)和一条反义特异引物(NOSTG，SEQ ID NO.88)从念珠藻PCC7120扩增编码来自念珠藻PCC 7120的酮酶的核酸。
PCR条件如下在含有以下成分的50μl反应混合液中PCR扩增编码含有全部一级序列的酮酶蛋白质的DNA-1μl念珠藻PCC 7120 DNA(如上所述制备)-0.25mM dNTPs-0.2mM NOSTF(SEQ ID No.87)-0.2mM NOSTG(SEQ ID No.88)-5μl 10×PCR缓冲液(TAKARA)-0.25μl R Taq聚合酶(TAKARA)-25.8μl蒸馏水。
在以下循环条件下进行PCR1×94℃2分钟35×94℃ 1分钟55℃ 1分钟72℃ 3分钟1×72℃10分钟使用SEQ ID NO87和SEQ ID NO88 PCR扩增产生了编码含有蛋白质全部一级序列的805bp片段(SEQ ID NO89)。使用标准方法，将扩增子克隆入PCR克隆载体pGEM-T(Promega)并得到克隆pNOSTF-G。
使用M13F和M13R引物针对克隆pNOSTF-G进行测序证实该序列与数据库录入号AP003592的DNA序列相同。在不同的扩增实验中也产生了该核苷酸序列，因此其代表了所使用的念珠藻PCC 7120中的核苷酸序列。
因此克隆pNOSTF-G用于克隆入表达载体pJIT117(Guerineau等1988，Nucl.Acids Res.1611380)。通过从pGEM-T分离1027bp SpHI片段并将其连接入经SpHI酶切的载体pJIT117进行克隆。以正确方向含有念珠藻属酮酶并在其N末端与rbcS转运肽翻译融合的克隆称为pJNOST。
实施例I.5产生用于在万寿菊中组成型表达雨生红球藻酮酶的表达载体。
来自雨生红球藻的酮酶在CaMV的组成型启动子d35S控制下于万寿菊中表达(Franck等1980，Cell 21285-294)。使用来自豌豆的转运肽rbcS进行表达(Anderson等1986，Biochem J.240709-715)。
通过双元载体pSUN5(WO 02/00900)产生用于在万寿菊中进行农杆菌介导的来自雨生红球藻酮酶的转化的表达盒。
为了产生万寿菊表达载体pS5KETO2，将来自pJKETO2的2.8KbSacI-XhoI片段与经SacI-XhoI酶切的载体pSUN5连接(图3，构建体图)。在图3中，片段d35s含有重复的35S启动子(747bp)、片段rbcS为来自豌豆的rbcS转运肽(204bp)、片段KETO2编码雨生红球藻酮酶的全部一级序列(1027bp)、片段term为CaMV多聚腺苷酸化信号(761bp)。
实施例I.5A产生用于在万寿菊中花特异表达雨生红球藻酮酶的表达载体使用来自豌豆的转运肽rbcS在万寿菊中表达来自雨生红球藻的酮酶(Anderson等1986，Biochem J.240709-715)。在拟南芥菜花特异启动子(AL132971核苷酸区域9298-10 200；Hill等(1998)Development 1251711-1721)修饰形式AP3P的控制下进行表达。
通过PCR利用基因组DNA(通过标准方法从拟南芥菜分离)以及引物PR7(SEQ ID NO33)和PR10(SEQ ID NO36)产生含有拟南芥菜AP3启动子区域-902-+15的DNA片段。
PCR条件如下在含有以下成分的50ml反应混合液中PCR扩增含有AP3启动子片段(-902-+15)的DNA-100ng拟南芥菜基因组DNA-0.25mM dNTPs-0.2mM PR7(SEQ ID NO33)
-0.2mM PR10(SEQ ID NO36)-5ml 10×PCR缓冲液(Stratagene)-0.25ml Pfu聚合酶(Stratagene)-28.8ml蒸馏水。
PCR按以下循环条件进行1×94℃2分钟35×94℃ 1分钟50℃1分钟72℃1分钟1×72℃10分钟使用标准方法将922bp扩增子克隆入PCR克隆载体pCR 2.1(Invitrogen)，并得到质粒pTAP3。
对克隆pTAP3的序列测定证实其序列与所公开的AP3序列(AL132971，核苷酸区域9298-10200)仅存在一个插入(序列AL132971的9765位插入G)和一个碱基替换(序列AL132971的9726位的A替换为G)的不同。在不同的扩增实验中也出现了这些核苷酸的不同，因此该序列代表了所用拟南芥菜植物中实际的核苷酸序列。
通过重组PCR方法利用质粒pTAP3产生修饰形式的AP3P。使用引物PR7(SEQ ID NO33)和PR9(SEQ ID NO35)扩增区域10200-9771(扩增子A7/9)，使用PR8(SEQ ID NO34)和PR10(SEQ ID NO36)扩增区域9526-9285(扩增子A8/10)。
PCR条件如下在50ml反应混合物中PCR扩增含有AP3启动子区域10200-9771和区域9526-9285的DNA片段，其中成分如下-100ng AP3扩增子(如上所述)-0.25mM dNTP-0.2mM有意引物(PR7 SEQ ID NO33或PR8 SEQ ID NO34)-0.2mM反义引物(PR9 SEQ ID NO35或PR10 SEQ ID NO36)
-5ml 10×PCR缓冲液(Stratagene)-0.25ml Pfu Taq聚合酶(Stratagene)-28.8ml蒸馏水。
PCR按以下循环条件进行1×94℃2分钟35×94℃ 1分钟50℃ 1分钟72℃ 1分钟1×72℃10分钟重组PCR反应包括对25个核苷酸序列重叠的扩增子A7/9和A8/10进行退火，形成双链以及随后的扩增。这产生AP3启动子的修饰形式AP3P，其中9670-9526位缺失。在含有以下成分的17.6ml反应混合物中进行两个扩增子A7/9和A8/10的变性(95℃ 5分钟)和退火(室温缓慢冷却至40℃)-0.5mg A7/9扩增子-0.25mg A8/10扩增子在含有以下成分的20ml反应混合物中补平(30℃ 30分钟)3’末端-17.6ml gA7/9和A8/10退火反应液(如上所述产生)-50mM dNTP-2ml 1×克列诺缓冲液-2U克列诺酶通过PCR方法使用一条有意特异引物(PR7 SEQ ID NO33)和一条反义特异引物(PR10 SEQ ID NO36)扩增编码启动子经修饰形式AP3P的核酸。
PCR条件如下在含有以下成分的50ml反应混合物中PCR扩增AP3P片段-1ml退火反应液(如上所述产生)-0.25mM dNTP
-0.2mM PR7(SEQ ID NO33)-0.2mM PR10(SEQ ID NO36)-5ml 10×PCR缓冲液(Stratagene)-0.25ml Pfu Taq聚合酶(Stratagene)-28.8ml蒸馏水。
PCR按以下循环条件进行1×94℃2分钟35×94℃ 1分钟50℃ 1分钟72℃ 1分钟1×72℃10分钟使用SEQ ID NO33和SEQ ID NO36进行的PCR扩增产生编码启动子经修饰形式AP3P的778bp片段。将扩增子克隆入克隆载体pCR2.1(Invitrogen)。使用引物T7和M13的序列测定证实其序列与序列AL132971内部区域9285-9526已经缺失的区域10200-9298相同。因此该克隆用于克隆入表达载体pJIT117(Guerineau等1988，Nucl.Acids Res.1611380)。
通过从pTAP3P分离771bp SacI-HindIII片段并将其连接入经SacI-HindIII-酶切的载体pJIT117进行克隆。含有启动子AP3P而不是原来启动子d35S的克隆称为pJAP3P。
为了产生表达盒pJAP3PKETO2，将1027bp SpHI片段KETO2克隆入经SpHI-酶切的载体pJAP3P中。含有正确方向的片段KETO2且其N-末端与rbcS转运肽融合的克隆称为pJAP3PKETO2。
为了产生表达盒pJAP3PKETO4，将1032bp SpHI-EcoRI片段KETO4(描述于实施例3)克隆入经SpHI-EcoRI-酶切的载体pJAP3P中。含有正确方向的片段KETO4且其N-末端与rbcS转运肽融合的克隆称为pJAP3PKETO4。
使用双元载体pSUN5(WO 02/00900)制备用于在万寿菊中进行农杆菌介导的雨生红球藻受AP3P-控制酮酶的转化的表达载体。
为了产生表达载体pS5AP3PKETO2，将来自pJAP3PKETO2的2.8KB bp SacI-XhoI片段连接入经SacI-XhoI-酶切的载体pSUN5(图4，构建体图)。在图4中，片段AP3P含有经修饰的AP3P启动子(771bp)，片段rbcS含有豌豆的rbcS转运肽(204bp)，片段KETO2(1027bp)含有编码雨生红球藻酮酶的全部一级序列，片段term(761bp)含有CaMV多聚腺苷酸化信号。
实施例I.5.B产生用于在万寿菊中组成型表达念球藻PCC 7120酮酶的表达载体万寿菊中念珠藻属酮酶在拟南芥菜组成型启动子FNR(铁氧还蛋白-NADPH氧化还原酶)控制下表达。使用豌豆转运肽rbcS进行表达(Anderson等1986，Biochem J.240709-715)。
通过PCR方法利用基因组DNA(使用标准方法从拟南芥菜分离)以及引物FNR-1(SEQ ID No.90)和FNR-2(SEQ ID No.91)产生含有拟南芥菜FNR启动子区域-635--1的DNA片段。
PCR条件如下在含有以下成分的50μl反应混合物中PCR扩增含有FNR启动子片段FNR1-2(-635--1)的DNA-100ng拟南芥菜基因组DNA-0.25mM dNTP-0.2mM FNR-1(SEQ ID No.90)-0.2mM FNR-2(SEQ ID No.91)-5μl 10×PCR缓冲液(Stratagene)-0.25μl Pfu聚合酶(Stratagene)-28.8μl蒸馏水。
PCR按照以下循环条件进行1 ×94℃2分钟35×94℃1分钟
50℃1分钟72℃1分钟1×72℃ 10分钟通过标准方法将653bp扩增子克隆入PCR克隆载体pCR 2.1(Invitrogen)并得到质粒pFNR。
对克隆pFNR进行序列测定证实其序列与拟南芥菜第5号染色体从70127-69493位序列部分一致(数据库进入号AB011474)。该基因起始于碱基对69492且称为“铁氧还蛋白-NADP+还原酶”。
该克隆称为pFNR并用于克隆入表达载体pJIT117(Guerineau等1988，Nucl.Acids Res.1611380)。
通过从pFNR分离635bp SacI-HindIII片段并将其连接入经SacI-HindIII-酶切的载体pJIT117进行克隆。含有启动子FNR而不是原来启动子d35S的克隆称为pJITFNR。
为了产生表达盒pJFNRNOST，将805bp SpHI片段NOSTF-G(描述于实施例1)克隆入经SpHI-酶切的载体pJITFNR。含有正确方向的片段NOSTF-G且其N-末端与rbcS转运肽融合的克隆称为pJFNRNOST。
使用双元载体pSUN5(WO 02/00900)产生用于在万寿菊中进行农杆菌介导的具有念珠藻属酮酶的表达载体转化的表达盒。
为了产生万寿菊表达载体pS5FNRNOST，将pJFNRNOST的2.4KbSacI-XhoI片段(部分SacI水解)连接入经SacI-XhoI-酶切的载体pSUN5(图5，构建体图)。在图5中，片段FNR启动子含有重复的FNR启动子(655bp)，片段rbcS转运肽含有豌豆rbcS转运肽(204bp)，片段Nost酮酶(799bp)含有编码念珠藻属酮酶的全部一级序列，片段35S Term(761bp)含有CaMV多聚腺苷酸化信号。
实施例I.5C产生用于在万寿菊中进行花特异表达念珠藻PCC 7120酮酶的表达载体使用豌豆转运肽rbcS在万寿菊中表达念珠藻属酮酶(Anderson等1986，Biochem J.240709-715)。表达在拟南芥菜花特异启动子AP3(AL132971核苷酸区域9298-10200；Hill等(1998)Development 1251711-1721)的经修饰形式AP3P控制下进行。
通过PCR利用基因组DNA(使用标准方法从拟南芥菜分离)以及引物AP3-1(SEQ ID No.93)和AP3-2(SEQ ID No.94)产生含有拟南芥菜AP3启动子区域-902-+15的DNA片段。
PCR条件如下在含有以下成分的50μl反应混合物中PCR扩增含有AP3启动子片段(-902-+15)的DNA-100ng拟南芥菜基因组DNA-0.25mM dNTP-0.2mM AP3-1(SEQ ID No.93)-0.2mM AP3-2(SEQ ID No.94)-5μl 10×PCR缓冲液(Stratagene)-0.25μl Pfu聚合酶(Stratagene)-28.8μl蒸馏水。
PCR按照以下循环条件进行1×94℃ 2分钟35×94℃1分钟50℃1分钟72℃1分钟1×72℃ 10分钟使用标准方法将929bp扩增子克隆入PCR克隆载体pCR 2.1(Invitrogen)并得到质粒pAP3。
对克隆pAP3进行序列测定证实该序列与所公开的AP3序列(AL132971，核苷酸区域9298-10200)仅存在一个插入(序列AL132971的9765位插入一个G)和一个碱基替换(序列AL132971的9726位的A替换为G)的不同。在不同的扩增实验中也产生了这些核苷酸不同，因此该序列代表了所使用的拟南芥菜植物中实际的核苷酸序列。
通过重组PCR方法利用质粒pAP3产生修饰形式AP3P。使用引物AP3-1(SEQ ID No.93)和AP3-4(SEQ ID No.96)扩增区域10200-9771(扩增子A1/4)，使用AP3-3(SEQ ID No.95)和AP3-2(SEQ ID No.94)扩增区域9526-9285(扩增子A2/3)。
PCR条件如下在含有以下成分的50μl反应混合物中PCR扩增含有AP3启动子区域10200-9771和区域9526-9285的DNA片段-100ng AP3扩增子(如上所述)-0.25mM dNTPs-0.2mM有意引物(AP3-1 SEQ ID No.93或AP3-3 SEQ ID No.95)-0.2mM反义引物(AP3-4 SEQ ID No.96或AP3-2 SEQ ID No.94)-5μl 10×PCR缓冲液(Stratagene)-0.25μl Pfu Taq聚合酶(Stratagene)-28.8μl蒸馏水。
PCR按照以下循环条件进行1×94℃ 2分钟35×94℃1分钟50℃1分钟72℃1分钟1×72℃ 10分钟重组PCR包括退火存在25个核苷酸序列重叠的扩增子A1/4和A2/3，形成双链以及随后的扩增。这产生AP3启动子的经修饰形式AP3P，其中9670-9526位缺失。在含有以下成分的17.6μl反应混合物中进行两个扩增子A1/4和A2/3的变性(95℃5分钟)和退火(室温缓慢冷却至40℃)-0.5μg A1/4扩增子-0.25μg A2/3扩增子在含有以下成分的20μl反应混合物中补平(30℃ 30分钟)3’末端
-17.6μl A1/4和A2/3退火反应液(如上所述产生)-50μM dNTPs-2μl 1×克列诺缓冲液-2U克列诺酶通过PCR方法使用一条有意特异引物(AP3-1 SEQ ID No.93)和一条反义特异引物(AP3-2 SEQ ID No.94)扩增编码启动子经修饰形式AP3P的核酸。
PCR条件如下在含有以下成分的50μl反应混合物中PCR扩增AP3P片段-1μ1退火反应液(如上所述产生)-0.25mM dNTPs-0.2mM AP3-1(SEQ ID No.93)-0.2mM AP3-2(SEQ ID No.94)-5μl 10×PCR缓冲液(Stratagene)-0.25μl Pfu Taq聚合酶(Stratagene)-28.8μl蒸馏水。
PCR按照以下循环条件进行1×94℃ 2分钟35×94℃1分钟50℃1分钟72℃1分钟1×72℃ 10分钟使用SEQ ID No.93(AP3-1)和SEQ ID No.94(AP3-2)进行PCR扩增产生编码启动子经修饰形式AP3P的783bp片段。将扩增子克隆入克隆载体pCR2.1(Invitrogen)并得到质粒pAP3P。使用引物T7和M13进行序列测定证实该序列与序列AL132971内部区域9285-9526已经缺失的区域10200-9298相同。因此该克隆用于克隆入表达载体pJIT117(Guerineau等1988，Nucl. Acids Res.1611380)。
通过从pAP3P分离783bp SacI-HindIII片段并将其连接入经SacI-HindIII-酶切的载体pJIT117进行克隆。含有启动子AP3P而不是原来启动子d35S的克隆称为pJITAP3P。为了产生表达盒pJAP3NOST，将805bp SpHI片段NOSTF-G(描述于实施例1)克隆入经SpHI-酶切的载体pJITAP3P。含有正确方向的片段NOSTF-G且其N-末端与rbcS转运肽融合的克隆称为pJAP3PNOST。
使用双元载体pSUN5(WO 02/00900)产生用于在万寿菊中进行农杆菌介导的AP3P控制的念珠藻属酮酶转化的表达盒。
为了产生表达载体pS5AP3PNOST，将pS5AP3PNOST的2.6KbSacI-XhoI片段(部分SacI水解)连接入经SacI-XhoI-酶切的载体pSUN5(图6，构建体图)。在图6中，片段AP3P含有经修饰的AP3P启动子(783bp)，片段rbcS含有豌豆rbcS转运肽(207bp)，片段NOSTF-G(792bp)含有编码念珠藻属酮酶的全部一级序列，片段term(795bp)含有CaMV多聚腺苷酸化信号。
实施例I.6转基因万寿菊植物的产生将万寿菊种子灭菌并放置于发芽培养基(MS培养基；Murashige和Skoog，Physiol.Plant.15(1962)，473-497)pH 5.8，2％蔗糖)。发芽在温度/光照/时间间隔为18-28℃/20-200mE/3-16周进行，优选地为21℃，20-70mE，培养4-8周。
到那时收获所有已经体外发育的植物叶子并横向切割至中脉。在制备过程中将所产生的大小为10-60mm2的叶外植体室温保存于液体MS培养基最长2小时。
任选的根癌农杆菌菌株但优选地为超强毒株例如具有携带选择标记基因(优选的为bar或pat)以及一个或多个特性或报告基因的相应双元质粒(例如pS5KETO2和pS5AP3PKETO2)的EHA105生长过夜并用于与叶材料共培养。细菌菌株的生长如下进行将相应菌株的单一克隆接种于含有25mg/l卡那霉素的YEB(0.1％酵母提取物，0.5％牛肉膏，0.5％蛋白胨，0.5％蔗糖，0.5％硫酸镁·7H2O)中并在28℃培养16-20小时。然后通过在6000g离心10分钟收获细菌悬液并以每OD600大约0.1-0.8的浓度重悬于液体MS培养基中。该悬液用于与叶材料共培养。
共培养之前，立即用细菌悬液代替保存叶的MS培养基。轻轻振荡室温将叶孵育于农杆菌悬液中30分钟。然后将感染的外植体放置于琼脂固化(如0.8％植物琼脂(Duchefa，NL))的含生长调节剂例如3mg/l苄氨基嘌呤(BAP)和1mg/l吲哚乙酸(IAA)的MS培养基上。叶在培养基上的定位不是重要的。将外植体培养1-8天，但优选地为6天，可使用以下条件光强度30-80mmol/m2x秒，温度22-24℃，光/暗更换为16/8小时。然后，将共培养的外植体转移至新鲜的MS培养基，优选地为含有相同生长调节剂的新鲜MS培养基，该第二培养基额外含有抑制细菌生长的抗生素。浓度为200-500mg/l的替门汀(Timentin)特别适于该目的。作为第二选择成分，使用的是用于筛选成功转化的成分。用浓度为1-5mg/l的膦丝菌素选择是非常有效的，但根据本方法也可以考虑使用其它选择成分。
对每一情况培养一到三周后，将外植体转移至新鲜培养基中直到胚芽和小芽形成，然后将它们转移至含有替门汀和PPT或者其他含有调节剂的成分也就是指诸如0.5mg/l吲哚丁酸(IBA)和0.5mg/l赤霉酸GA3的相同基础培养基中以生根。可以将生根的枝条转移至温室。
除了上述方法，以下有利的改变也是可能的·用细菌感染外植体之前，可以将它们在上述的培养基中预孵育1-12天，优选地为3-4天，以用于共培养。然后，如上所述进行感染、共培养和选择性再生。
·用于再生的pH(通常为5.8)可以降低至pH 5.2。这提高了对农杆菌属生长的控制。
·在再生培养基中加入AgNO3(3-10mg/l)改善了培养状态，包括再生本身。
·降低酚形成及为本领域技术人员熟知的成分例如柠檬酸、抗坏血酸、PVP和许多其它成分，对培养具有有益作用。
·对于全部方法，也可以使用液体培养基。培养物也可以在被放置于液体培养基中的商业可得的常规支持物上孵育。
根据上述转化方法，使用如下表达构建体得到以下品系例如，使用pS5KETO2得到如下品系cs18-1和cs18-2，例如使用pS5AP3PKETO2得到如下品系cs19-1，cs19-2和cs19-3。例如，使用pS5FNRNOST得到如下品系ms 103-1，ms103-2，ms103-3，例如，使用pS5AP3NOST得到如下品系ms 104-1，ms104-2，ms104-3。
实施例I.8转基因植物花的特征实施例I.8.1转基因植物花叶中类胡萝卜素酯类的分离总体工作说明用研钵在液氮中研磨转基因植物的花叶并用100％丙酮抽提(3次，每次500ml)花瓣粉末(大约40mg)。蒸发溶剂并将类胡萝卜素重悬于100-200ml石油醚/丙酮(5∶1，v/v)。
根据它们的疏水性，以浓缩的形式通过在有机流动相(石油醚/丙酮；5∶1)中于二氧化硅60 F254板(Merck)上通过薄层层析法(TLC)分离类胡萝卜素。在TLC上刮下黄色(叶黄素酯)、红色(酮式类胡萝卜素酯)和橙色(叶黄素酯和酮式类胡萝卜素酯的混合物)条带。
用500ml丙酮三次洗脱二氧化硅结合的类胡萝卜素，蒸发溶剂并通过HPLC方法分离类胡萝卜素并鉴定。
通过C30反相柱，能够区分类胡萝卜素单酯和二酯。HPLC工作条件实际上与所公开的方法相同(Frazer等(2000)，Plant Journal 24(4)551-558)。基于UV-VIS光谱能够鉴定类胡萝卜素。
实施例I.9
类胡萝卜素酯的酶水解和类胡萝卜素的鉴定总体工作说明用100％丙酮抽提(用500ml抽提3次，每次振荡大约15分钟)在研钵中研磨的花瓣材料(50-100mg鲜重)。蒸发溶剂，然后将类胡萝卜素溶于400ml丙酮(475nm吸收在0.75-1.25之间)并在超声浴中处理5分钟。将类胡萝卜素提取物与300ml 50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)混合并在37℃孵育5-10分钟。之后，加入100-200ml胆固醇酯酶(贮液假单孢菌(Pseudomonas spec.)的6.8单位/ml胆固醇酯酶)。8-12小时之后，再加入100-200ml酶；在24小时内在37℃孵育水解酯类。在加入0.35gNa2SO4·10H2O和500ml石油醚后，将混合物充分混合并离心(3分钟；4500g)。取出石油醚相并再一次与0.35g Na2SO4·10H2O(无水的)混合。10000g离心1分钟。蒸发石油醚并将游离类胡萝卜素溶于100-120ml丙酮。使用HPLC和C30反相柱方法，基于保留时间和UV-VIS光谱能够鉴定游离类胡萝卜素。
实施例I.10产生用于在万寿菊中花特异表达ε-环化酶ds RNA的反向重复表达盒的克隆载体在万寿菊中于拟南芥菜花特异启动子AP3(AL132971核苷酸区域9298-10200；Hill等(1998)Development 1251711-1721)的经修饰形式AP3P控制下表达由ε-环化酶片段组成的反向重复转录本。
在每一情况下，反向重复转录本含有通过功能性内含子即马铃薯ST-LH1基因PIV2内含子彼此连接的一个正向片段(有意片段)和一个反向的相同序列片段(反义片段)(Vancanneyt G.等(1990)Mol Gen Genet220245-50)。
通过PCR方法，利用基因组DNA(通过标准方法从拟南芥菜分离)以及引物PR7(SEQ ID NO49)和PR10(SEQ ID NO52)产生编码拟南芥菜AP3启动子(-902-+15)的cDNA。
PCR条件如下在含有以下成分的50ml反应混合物中PCR扩增编码AP3启动子片段(-902-+15)的DNA-1ml拟南芥菜基因组DNA(如上所述产生的1∶100稀释液)-0.25mM dNTP-0.2mM PR7(SEQ ID NO49)-0.2mM PR10(SEQ ID NO52)-5ml 10×PCR缓冲液(Stratagene)-0.25ml Pfu聚合酶(Stratagene)-28.8ml蒸馏水。
PCR按照以下循环条件进行1×94℃ 2分钟35×94℃1分钟50℃1分钟72℃1分钟1×72℃ 10分钟使用标准方法将922bp扩增子克隆入PCR克隆载体pCR 2.1(Invitrogen)并得到质粒pTAP3。对克隆pTAP3进行序列测定证实该序列与所公开的AP3序列(AL132971，核苷酸区域9298-10200)仅存在一个插入(序列AL132971的9765位插入一个G)和一个碱基替代(序列AL132971的9726的A替换为G)不同(33位G替换为T，55位G替换为T)。在不同的扩增实验中也产生了这些核苷酸的不同，因此代表了所使用的拟南芥菜中的核苷酸序列。
通过重组PCR方法利用质粒pTAP3产生修饰形式AP3P。使用引物PR7(SEQ ID NO49)和引物PR9(SEQ ID NO51)扩增10200-9771区域(扩增子A7/9)，使用PR8(SEQ ID NO50)和PR10(SEQ ID NO52)扩增9526-9285区域(扩增子A8/10)。
PCR条件如下
在含有以下成分的50ml反应混合物中PCR扩增编码AP3启动子10200-9771区域和9526-9285区域的DNA片段-100ng AP3扩增子(如上所述)-0.25mM dNTPs-0.2mM PR7(SEQ ID NO49)或PR8(SEQ ID NO50)-0.2mM PR9(SEQ ID NO51)或PR10(SEQ ID NO52)-5ml 10×PCR缓冲液(Stratagene)-0.25ml Pfu Taq聚合酶(Stratagene)-28.8ml蒸馏水。
PCR按照以下循环条件进行1×94℃ 2分钟35×94℃1分钟50℃2分钟72℃3分钟1×72℃10分钟重组PCR方法包括对具有25个核苷酸序列重叠的扩增子A7/9和A8/10的退火，形成双链和随后的扩增。这产生了AP3启动子的修饰形式AP3P，其中9670-9526位被缺失。在含有以下成分的17.6ml反应混合物中，进行两个扩增子A7/9和A8/10的变性(95℃ 5分钟)和退火(室温缓慢冷却至40℃)-0.5mg A7/9-0.25mg A8/10在含有以下成分的20ml反应混合物中补平(30℃ 30分钟)3’末端-17.6ml A7/9和A8/10退火反应液(如上所述产生)-50mM dNTPs-2ml 1×克列诺缓冲液-2U克列诺酶通过PCR方法使用一条有意特异引物(PR7 SEQ ID NO49)和一条反义特异引物(PR10 SEQ ID NO52)扩增编码启动子经修饰形式AP3P的核酸。
PCR条件如下在含有以下成分的50ml反应混合物中PCR扩增AP3P片段-1ml退火反应液(如上所述产生)-0.25mM dNTPs-0.2mM PR7(SEQ ID NO49)-0.2mM PR10(SEQ ID NO52)-5ml 10×PCR缓冲液(Stratagene)-0.25ml Pfu Taq聚合酶(Stratagene)-28.8ml蒸馏水。
PCR按照以下循环条件进行1×94℃ 2分钟35×94℃1分钟50℃1分钟72℃1分钟1×72 ℃10分钟使用PR7，SEQ ID NO49和PR10 SEQ ID NO52进行的PCR扩增产生编码启动子经修饰形式AP3P的778bp片段。将扩增子克隆入克隆载体pCR2.1(Invitrogen)。使用引物T7和M13的序列测定证实该序列与序列AL132971内部区域9285-9526已经缺失的10200-9298区域相同。因此该克隆用于克隆入表达载体pJIT117(Guerineau等1988，Nucl.Acids Res.1611380)。
通过从pTAP3P分离771bp SacI-HindIII片段并将其连接入经SacI-HindIII-酶切的载体pJIT117进行克隆。含有启动子AP3P而非原来启动子d35S的克隆称为pJAP3P。
通过PCR方法利用质粒DNA p35SGUS INT(Vancanneyt G等(1990)Mol Gen Genet 220245-50)以及引物PR40(Seq ID NO54)和PR41(SeqID NO55)扩增含有基因ST-LS1内含子PIV2的DNA片段。
PCR条件如下在含有以下成分的50ml反应混合物中PCR扩增基因ST-LS1内含子PIV2序列-1ml p35SGUS INT-0.25mM dNTPs-0.2mM PR40(SEQ ID NO54)-0.2mM PR41(SEQ ID NO55)-5ml 10×PCR缓冲液(TAKARA)-0.25ml R Taq聚合酶(TAKARA)-28.8ml蒸馏水。
PCR按照以下循环条件进行1×94℃ 2分钟35×94℃1分钟53℃1分钟72℃1分钟1×72℃ 10分钟使用PR40和PR41进行的PCR扩增反应产生206bp片段。使用标准方法，将扩增子克隆入PCR克隆载体pBluntII(Invitrogen)并得到克隆pBluntII-40-41。使用引物SP6对该克隆进行序列测定证实该序列与来自载体p35SGUS INT的相应序列相同。
因此该克隆用于克隆入载体pJAP3P(如上所述)。
通过从pBluntII-40-41分离206bp SaH-BamHI片段并将其连接入经SalI-BamHI-酶切的载体pJAP3P进行克隆。含有正确方向ST-LS1基因PIV2内含子并连接于rbcs转运肽3’末端的克隆称为pJAI1并且该克隆适于产生用于花特异表达反向重复转录本的表达盒。
在图7中，片段4P3P含有经修饰的AP3P启动子(771bp)、片段rbcs含有豌豆rbcS转运肽(204bp)、片段intron含有马铃薯ST-LS1基因PIV2内含子、且片段term(761bp)含有CaMV多聚腺苷酸化信号。
实施例I.11产生用于在万寿菊中花特异表达ε-环化酶dsRNA的反向重复表达盒(针对ε-环化酶cDNA的5’区域)通过聚合酶链式反应(PCR)方法利用一条有意特异引物(PR42 SEQ IDNO56)和一条反义特异引物(PR43 SEQ ID NO57)从万寿菊cDNA扩增含有ε-环化酶cDNA(Genbank登录号AF251016)5’-末端435bp区域的核酸。万寿菊ε-环化酶cDNA 5’-末端435 bp区域包括138bp 5’-非翻译序列(5’UTR)和297bp相应的N端编码区。
为了制备万寿菊花的总RNA，将100mg冰冻粉碎的花转移至反应容器并溶于0.8ml Trizol缓冲液(LifeTechnologies)。用0.2ml氯仿抽提悬液。12000g离心15分钟后，取出水相并将其转移至新的反应管并用一倍体积的乙醇提取。用一倍体积的异丙醇沉淀RNA，用75％乙醇洗涤并将沉淀溶于DEPC水(室温用1/1000体积的焦碳酸二乙酯过夜孵育，然后高压灭菌)。通过分光光度法测定RNA浓度。对于cDNA合成，将2.5μg总RNA在60℃变性10分钟，冰上冷却2分钟并利用cDNA试剂盒(Ready-to-go-you-prime-beads，Pharmacia Biotech)按照制造商的使用说明，使用反义特异引物(PR17 SEQ ID NO53)将其转录成cDNA。
随后的PCR反应条件如下在含有以下成分的50ml反应混合物中PCR扩增含有ε-环化酶5’-末端435bp区域的PR42-PR43 DNA片段-1ml cDNA(如上所述产生)-0.25mM dNTPs-0.2mM PR42(SEQ ID NO56)-0.2mM PR43(SEQ ID NO57)-5ml 10×PCR缓冲液(TAKARA)-0.25ml R Taq聚合酶(TAKARA)
-28.8ml蒸馏水。.
在含有以下成分的50ml反应混合物中PCR扩增含有ε-环化酶5’-末端435bp区域的PR44-PR45 DNA片段-1ml cDNA(如上所述产生)-0.25mM dNTPs-0.2mM PR44(SEQ ID NO58)-0.2mM PR45(SEQ ID NO59)-5ml 10×PCR缓冲液(TAKARA)-0.25ml R Taq聚合酶(TAKARA)-28.8ml蒸馏水。
PCR按照以下循环条件进行1×94℃ 2分钟35×94℃1分钟58℃1分钟72℃1分钟1×72℃ 10分钟使用引物PR42和PR43进行的PCR扩增反应产生443bp片段，并且使用引物PR44和PR45的PCR扩增反应产生444bp片段。
使用标准方法将两个扩增子PR42-PR43(HindIII-SalI有意)片段和PR44-PR45(EcoRI-BamHI反义)片段克隆入PCR克隆载体pCR-BluntII(Invitrogen)。使用引物SP6进行序列测定证实在每一情况下其序列与所公开的序列AF251016(SEQ ID NO38)相同，除了所导入的限制性酶切位点不同之外。因此该克隆用于在克隆载体pJAI1中产生反向重复构建体(见实施例I.10)。
通过从克隆载体pCR-BluntII(Invitrogen)分离444bp PR44-PR45BamHI-EcoRI片段并将其连接入经BamHI-EcoRI-酶切的载体pJAI1进行第一次克隆步骤。含有反义方向ε-环化酶5’-末端区域的克隆称为pJAI2。连接产生ε-环化酶5’-末端区域反义片段和CaMV多聚腺苷酸化信号之间的转录融合。
通过从克隆载体pCR-BluntII(Invitrogen)分离443bp PR42-PR43HindIII-SalI片段并将其连接入经HindIII-SalI-酶切的载体pJAI2进行第二次克隆步骤。含有有意方向435bpε-环化酶cDNA 5’-末端区域的克隆称为pJAI3。连接产生AP3P和ε-环化酶5’-末端区域有意片段之间的转录融合。
为了产生在CHRC启动子控制下的反向重复表达盒，利用矮牵牛(petunia)基因组DNA(按照标准方法产生)以及引物PRCHRC5(SEQID NO76)和PRCHRC3(SEQ ID NO77)扩增CHRC启动子片段。将扩增子克隆入克隆载体pCR2.1(Invitrogen)。使用引物M13和T7对所得克隆pCR2.1-CHRC进行序列测定证实该序列与序列AF099501相同。因此该克隆用于克隆入表达载体pJAI3。
通过从pCR2.1-CHRC分离1537bp SacI-HindIII片段并将其连接入经SacI-HindIII-酶切的载体pJAI3进行克隆。含有启动子CHRC而非原来启动子AP3P的克隆称为pJCI3。
利用双元载体pSUN5(WO02/00900)产生用于在万寿菊中进行农杆菌介导的在AP3P-或CHRC-控制下的反向重复转录本的转化的表达载体。
为了产生表达载体pS5AI3，将来自pJAI3的2622bp SacI-XhoI片段连接入经SacI-XhoI-酶切的载体pSUN5(图8，构建体图)。
在图8中，片段AP3P含有经修饰的AP3P启动子(771bp)，片段5sense含有有意方向的万寿菊ε-环化酶5’区域(435bp)，片段intron含有马铃薯ST-LS1基因PIV2内含子，片段5anti含有反义方向的万寿菊ε-环化酶5’区域(435bp)，且片段term(761bp)含有CaMV多聚腺苷酸化信号。
为了产生表达载体pS5CI3，将来自pJCI3的3394bp SacI-XhoI片段连接入经SacI-XhoI-酶切的载体pSUN5(图9，构建体图)。
在图9中，片段CHRC含有启动子(1537bp)，片段5sense含有有意方向的万寿菊ε-环化酶5’区域(435bp)，片段intron含有马铃薯ST-LS1基因PIV2内含子，片段5anti含有反义方向的万寿菊ε-环化酶5’区域(435bp)，且片段term(761bp)含有CaMV多聚腺苷酸化信号。
实施例I.12产生用于在万寿菊中花特异表达ε-环化酶dsRNA的反向重复表达盒(针对ε-环化酶cDNA的3’区域)通过聚合酶链式反应(PCR)方法，使用一条有意特异引物(PR46SEQ ID NO60)和一条反义特异引物(PR47 SEQ ID NO61)从万寿菊扩增含有ε-环化酶cDNA(Genbank登录号AF251016)3’-末端区域(384bp)核酸。万寿菊ε-环化酶cDNA3’-末端区域(384bp)由140bp3’-非翻译序列(3’UTR)和244bp相应于C末端的编码区域组成。
如实施例I.11所述从万寿菊花制备总RNA。
如实施例I.11所述，使用反义特异引物PR17(SEQ ID NO53)合成cDNA。
随后的PCR反应条件如下在含有以下成分的50ml反应混合物中PCR扩增含有ε-环化酶3’-末端384bp区域的PR46-PR47 DNA片段-1ml cDNA(如上所述产生)-0.25mM dNTPs-0.2mM PR46(SEQ ID NO60)-0.2mM PR47(SEQ ID NO61)-5ml 10×PCR缓冲液(TAKARA)-0.25ml R Taq聚合酶(TAKARA)-28.8ml蒸馏水。
在含有以下成分的50ml反应混合物中PCR扩增含有ε-环化酶3’-末端384bp区域的PR48-PR49 DNA片段-1ml cDNA(如上所述产生)-0.25mM dNTPs-0.2mM PR48(SEQ ID NO62)
-0.2mM PR49(SEQ ID NO63)-5ml 10×PCR缓冲液(TAKARA)-0.25ml R Taq聚合酶(TAKARA)-28.8ml蒸馏水。
PCR反应按照以下循环条件进行1×94℃2分钟35×94℃ 1分钟58℃ 1分钟72℃ 1分钟1×72℃10分钟使用SEQ ID NO60和SEQ ID NO61的PCR扩增反应产生392bp的片段，使用SEQ ID NO62和SEQ ID NO63的PCR扩增反应产生396bp的片段。
使用标准方法将两个扩增子，PR46-PR47片段和PR48-PR49片段，克隆入PCR克隆载体pCR-BluntII(Invitrogen)。使用引物SP6进行序列测定证实在每一情况下其序列与所公开的序列AF251016(SEQ ID NO38)相同，除了所导入的限制性酶切位点不同以外。因此所述克隆用于产生克隆载体pJAI1中的反向重复构建体(见实施例I.10)。
通过从克隆载体pCR-BluntII(Invitrogen)分离396bp PR48-PR49BamHI-EcoRI片段并将其连接入经BamHI-EcoRI-酶切的载体pJAI1进行第一克隆步骤。含有反义方向的ε-环化酶3’-末端区域的克隆称为pJAI4。连接产生了ε-环化酶3’-末端区域的反义片段和CaMV多聚腺苷酸化信号之间的转录融合。
通过从克隆载体pCR-BluntII(Invitrogen)分离392bp PR46-PR47HindIII-SalI片段并将其连接入经HindIII-SalI-酶切的载体pJAI4进行第二克隆步骤。含有有意方向的ε-环化酶392bp 3’-末端区域的克隆称为pJAI5。连接产生了AP3P和ε-环化酶3’-末端区域有意片段之间的转录融合。
使用双元载体pSUN5(WO02/00900)产生用于在万寿菊中进行农杆菌介导的在AP3P-控制下的反向重复转录本转化的表达载体。为了产生表达载体pS5AI5，将来自pJAI5的2523bp SacI-XhoI片段连接入经SacI-XhoI酶切的载体pSUN5(图10，构建体图)。
在图10中，片段AP3P含有修饰的AP3P启动子(771bp)，片段3sense含有有意方向的万寿菊ε-环化酶3’区域(435bp)，片段intron含有马铃薯ST-LS1基因IV2内含子，片段3anti含有反义方向的万寿菊ε-环化酶3’区域(435bp)，且片段term(761bp)含有CaMV多聚腺苷酸化信号。
实施例I.13ε-环化酶启动子的克隆使用基因组DNA(通过标准方法从万寿菊Orangenprinz品系分离)通过两个独立的克隆策略反向PCR(采用Long等Proc.Natl.Acad.SciUSA 9010370)和TAIL-PCR(Liu Y-G.等(1995)Plant J.8457-463)分离ε-环化酶启动子的199bp片段和312bp片段。
对于反向PCR方法在含有EcoRV和RsaI的25μl反应混合液中消化2μg基因组DNA，然后稀释至300μl并使用3U连接酶16℃重新连接过夜。使用引物PR50(SEQ ID NO64)和PR51(SEQ ID NO65)，通过PCR扩增反应，产生了在每一情况下以有意方向含有354bp ε-环化酶cDNA(Genbank登录号AF251016)的片段，将该片段与300bp ε-环化酶启动子和70bp的ε-环化酶cDNA的5’-末端区域连接(见图11)。
PCR反应条件如下在含有以下成分的50ml反应混合液中PCR扩增含有ε-环化酶312bp启动子片段的PR50-PR51 DNA片段-1ml连接混合物(如上所述产生)-0.25mM dNTPs-0.2mM PR50(SEQ ID NO64)-0.2mM PR51(SEQ ID NO65)
-5ml 10×PCR缓冲液(TAKARA)-0.25ml R Taq聚合酶(TAKARA)-28.8ml蒸馏水。
PCR反应按照以下循环条件进行1×94℃2分钟35×94℃ 1分钟53℃1分钟72℃1分钟1×72℃10分钟使用引物PR50和PR51的PCR扩增反应产生734bp片段，其中尤其含有ε-环化酶312bp启动子片段(图11)。
使用标准方法将扩增子克隆入PCR克隆载体pCR2.1(Invitrogen)，使用引物M13和T7进行序列测定得到序列SEQ ID NO45。在不同的扩增实验中也产生了该序列，因此该序列代表了所使用的万寿菊品系Orangenprinz中的核苷酸序列。
对于TAIL-PCR方法，在每一情况下使用不同的基因特异引物(巢式引物)进行三个连续的PCR反应。
在含有以下成分的20m1反应混合液中进行TAIL1-PCR反应-1ng基因组DNA(如上所述产生)-0.2mM每种dNTP-0.2mM PR60(SEQ ID NO66)-0.2mM AD1(SEQ ID NO69)-2ml 10×PCR缓冲液(TAKARA)-0.5U R Taq聚合酶(TAKARA)-用蒸馏水补至20ml。
-AD1是序列(a/c/g/t)tcga(g/c)t(a/t)t(g/c)g(a/t)gtt引物的第一混合物。
PCR反应TAIL1在以下循环条件下进行1×93℃1分钟，95℃1分钟
5×94℃30秒，62℃1分钟，72℃2.5分钟1×94℃30秒，25℃3分钟，在3分钟内升至72℃，72℃2.5分钟15×94℃10秒，68℃1分钟，72℃2.5分钟；94℃10秒，68℃1分钟，72℃2.5分钟；94℃10秒，29℃1分钟，72℃2.5分钟1×72℃5分钟在含有以下成分的21ml反应混合物中进行TAIL2-PCR-1ml TAIL1反应混合物(如上所述产生)的1∶50稀释液-0.8mM dNTP-0.2mM PR61(SEQ ID NO67)-0.2mM AD1(SEQ ID NO69)-2ml 10×PCR缓冲液(TAKARA)-0.5U R Taq聚合酶(TAKARA)-用蒸馏水补至21ml。
PCR反应TAIL2在以下循环条件下进行12×94℃10秒，64℃1分钟，72℃2.5分钟；94℃10秒，64℃1分钟，72℃2.5分钟；94℃10秒，29℃1分钟，72℃2.5分钟1×72℃5分钟在含有以下成分的100ml反应混合物中进行TAIL3-PCR反应-1ml TAIL2反应混合物(如上所述产生)的1∶10稀释液-0.8mM dNTP-0.2mM PR63(SEQ ID NO68)-0.2mM AD1(SEQ ID NO69)-10ml 10×PCR缓冲液(TAKARA)-0.5U R Taq聚合酶(TAKARA)-用蒸馏水补至100ml。
PCR反应TAIL3在以下循环条件下进行20×94℃15秒，29℃30秒，72℃2分钟1×72℃5分钟使用引物PR63和AD1的PCR扩增反应产生280bp片段，其中尤其含有ε-环化酶199bp启动子片段(图12)。
使用标准方法将扩增子克隆入PCR克隆载体pCR2.1(Invitrogen)。使用引物M13和T7进行序列测定得到序列SEQ ID NO46。该序列与通过IPCR策略分离的序列SEQ ID NO45相同，因此代表了所使用的万寿菊品系Orangenprinz中的核苷酸序列。
含有通过IPCR策略分离的ε-环化酶启动子312bp片段(SEQ IDNO45)的pCR2.1克隆称为pTA-ecycP并用于产生IR构建体。
实施例I.14产生用于在万寿菊中花特异表达ε-环化酶dsRNA的反向重复表达盒(针对ε-环化酶cDNA启动子区域)由ε-环化酶启动子片段组成的反向重复转录本在万寿菊中的表达在拟南芥菜花特异启动子AP3的修饰形式AP3P的控制下(见实施例I.10)或在花特异启动子CHRC(Genbank登录号AF099501)的控制下进行。在每一情况下反向重复转录本含有通过功能内含子连接在一起的一个正确方向的ε-环化酶启动子片段(有意片段)和一个序列相同的反向ε-环化酶启动子片段(反义片段)(见实施例I.10)。
通过PCR方法使用质粒DNA(克隆pTA-ecycP，见实施例I.13)和引物PR124(SEQ ID NO70)与PR126(SEQ ID NO72)以及引物PR125(SEQ ID NO71)与PR127(SEQ ID NO73)产生启动子片段。
PCR反应条件如下在含有以下成分的50ml反应混合物中PCR扩增含有ε-环化酶启动子片段的PR124-PR126 DNA片段-1ml cDNA(如上所述产生)
-0.25mM dNTPs-0.2mM PR124(SEQ ID NO70)-0.2mM PR126(SEQ ID NO72)-5ml 10×PCR缓冲液(TAKARA)-0.25ml R Taq聚合酶(TAKARA)-28.8ml蒸馏水。
在含有以下成分的50ml反应混合物中PCR扩增含有ε-环化酶312bp启动子片段的PR125-PR127 DNA片段-1ml cDNA(如上所述产生)-0.25mM dNTPs-0.2mM PR125(SEQ ID NO71)-0.2mM PR127(SEQ ID NO73)-5ml 10×PCR缓冲液(TAKARA)-0.25ml R Taq聚合酶(TAKARA)-28.8ml蒸馏水。
在以下循环条件下进行PCR反应1×94℃ 2分钟35×94℃1分钟53℃1分钟72℃1分钟1×72℃10分钟使用引物PR124和PR126的PCR扩增反应产生358bp片段，使用引物PR125和PR127的PCR扩增反应产生361bp片段。
使用标准方法将两个扩增子，PR124-PR126(HindIII-SalI有意)片段和PR125-PR127(EcoRI-BamHI反义)片段，克隆入PCR克隆载体pCR-BluntII(Invitrogen)。使用引物SP6进行序列测定证实在每一情况下其序列除了所导入的限制性酶切位点之外与SEQ ID NO45相同。因此该克隆用于产生克隆载体pJAI1中的反向重复构建体(见实施例I.10)。
通过从克隆载体pCR-BluntII(Invitrogen)分离358bp PR124-PR126HindIII-SalI片段并将其连接入经BamHI-EcoRI酶切的载体pJAI1进行第一次克隆步骤。含有有意方向ε-环化酶启动子片段的克隆称为cs43。连接反应在AP3P启动子和内含子之间导入ε-环化酶启动子有意片段。
通过从克隆载体pCR-BluntII(Invitrogen)分离361bp PR125-PR127BamHI-EcoRI片段并将其连接入经BamHI-EcoRI-酶切的载体cs43进行第二次克隆步骤。含有反义方向ε-环化酶启动子片段的克隆称为cs44。连接反应在内含子和ε-环化酶启动子反义片段之间形成转录融合。
为了产生在CHRC启动子控制下的反向重复表达盒，使用矮牵牛基因组DNA(按照标准方法产生)以及引物PRCHRC3’(SEQ ID NO77)和PRCHRC5’(SEQ ID NO76)扩增CHRC启动子片段。将扩增子克隆入克隆载体pCR2.1(Invitrogen)。使用引物M13和T7对所得克隆pCR2.1-CHRC进行序列测定证实该序列与序列AF099501相同。因此该克隆用于克隆入表达载体cs44。
通过从pCR2.1-CHRC分离1537bp SacI-HindIII片段并将其连接入经SacI-HindIII酶切的载体cs44进行克隆。含有启动子CHRC而非原来启动子AP3P的克隆称为cs45。
为了产生在两个启动子CHRC启动子和AP3P启动子控制下的反向重复表达盒，将AP3P启动子以反义方向克隆入cs45的ε-环化酶反义片段的3’末端。使用引物PR128和PR129扩增来自pJAI1的AP3P启动子片段。将扩增子克隆入克隆载体pCR2.1(Invitrogen)。使用引物M13和T7进行序列测定证实该序列与序列SEQ ID NO28(AL132971)相同。该克隆pCR2.1-AP3PSX用于产生在两个启动子控制下的反向重复表达盒。
通过从pCR2.1-AP3PSX分离771bp SalI-XhoI片段并将其连接入经XhoI-酶切的载体cs45进行克隆。在反向重复序列3’侧含有反义方向启动子AP3P的克隆称为cs46。
使用双元载体pSUN5(WO 02/00900)产生用于在万寿菊中进行农杆菌介导的在AP3P-控制下的反向重复转录本转化的表达载体。
为了产生表达载体pS5AI7，将来自cs44的1685bp SacI-XhoI片段连接入经SacI-XhoI-酶切的载体pSUN5(图13，构建体图)。在图13中，片段AP3P含有修饰的AP3P启动子(771bp)，片段P-sense含有有意方向的ε-环化酶312bp启动子片段，片段intron含有马铃薯ST-LS1基因IV2内含子，且片段P-anti含有反义方向的ε-环化酶312bp启动子片段。
为了产生表达载体pS5CI7，将来自cs45的2445bp SacI-XhoI片段连接入经SacI-XhoI-酶切的载体pSUN5(图14，构建体图)。
在图14中，片段CHRC含有CHRC启动子(1537bp)，片段P-sense含有有意方向的ε-环化酶312bp启动子片段，片段intron含有马铃薯ST-LS1基因IV2内含子，且片段P-anti含有反义方向的ε-环化酶312bp启动子片段。
为了产生表达载体pS5CAI7，将来自cs46的3219bp SacI-XhoI片段连接入经SacI-XhoI-酶切的载体pSUN5(图15，构建体图)。
在图15中，片段CHRC含有CHRC启动子(1537bp)，片段P-sense含有有意方向的ε-环化酶312bp启动子片段，片段intron含有马铃薯ST-LS1基因IV2内含子，片段P-anti含有反义方向的ε-环化酶312bp启动子片段，且片段AP3P含有反义方向771bp AP3P启动子片段。
实施例I.15具有降低了的ε-环化酶活性的转基因万寿菊植物的产生将万寿菊种子灭菌并将其放置于发芽培养基上(MS培养基；Murashige和Skoog，Physiol.Plant.15(1962)，473-497)pH 5.8，2％蔗糖)。发芽发生于温度/光照/时间间隔为18-28℃/20-200mE/3-16周条件下，优选地为21℃，20-70mE，4-8周。
到那时收获已经在体外发育的植物的所有叶子并横向切割至中脉。在制备过程中，将所得到的大小为10-60mm2的叶外植体贮存于液体MS培养基中室温最长2小时。
使用双元载体pS5AI3转化根癌农杆菌菌株EHA105。转化的根癌农杆菌菌株EHA105在以下条件下生长过夜将单一克隆接种于含有25mg/l卡那霉素的YEB(0.1％酵母提取物，0.5％牛肉膏，0.5％蛋白胨，0.5％蔗糖，0.5％硫酸镁·7H2O)中并在28℃培养16-20小时。然后通过在6000g离心10分钟收获细菌悬液并以OD600大约0.1-0.8的浓度重悬于液体MS培养基中。该悬浮液用于与叶材料共培养。
共培养之前，立即用细菌悬液代替保存有叶的MS培养基。轻轻振荡下室温将叶孵育于转化农杆菌悬液中30分钟。然后将感染的外植体放置于琼脂固化(如0.8％植物琼脂(Duchefa，NL))的含生长调节剂例如3mg/l苄氨基嘌呤(BAP)和1mg/l吲哚乙酸(IAA)的MS培养基上。叶在培养基上的定位不是重要的。将外植体培养1-8天，但优选地为6天，可使用以下条件光强度30-80mmol/m2x秒，温度22-24℃，光/暗更换为16/8小时。然后，将共培养的外植体转移至新鲜MS培养基，优选地为含有相同生长调节剂的新鲜MS培养基，该第二培养基额外含有抑制细菌生长的抗生素。浓度为200-500mg/l的替门汀特别适于该目的。作为第二选择成分，可使用的是用于筛选成功转化的成分。浓度为1-5mg/l的膦丝菌素选择非常有效，但根据本方法也可以考虑使用其它选择成分。
在每一情况下培养一到三周后，将外植体转移至新鲜培养基中直到胚芽和小芽形成，然后将它们转移至含有替门汀和PPT或者其他含有调节剂的成分也就是指诸如0.5mg/l吲哚丁酸(IBA)和0.5mg/l赤霉酸GA3的相同基础培养基中以生根。可以将生根的芽转移至温室。
除了上述方法，以下有利的改变也是可能的·用细菌感染外植体之前，为了共培养可以将外植体在上述的培养基中预孵育1-12天，优选地为3-4天。然后，如上所述进行感染、共培养和选择性再生。
·用于再生的pH(通常为5.8)可以降低至pH 5.2。这提高了对农杆菌属生长的控制。
·在再生培养基中加入AgNO3(3-10mg/l)改善了培养状态，包括再生本身。
·降低酚形成并且为本领域技术人员熟知的成分例如柠檬酸、抗坏血酸、PVP和许多其它成分，对培养具有有益作用。
·对于全部方法，也可以使用液体培养基。培养物也可以在被放置于液体培养基中的商业可得的常规支持物上孵育。
根据上述转化方法，使用表达构建体pS5AI3，得到以下品系CS30-1，CS30-3和CS30-4实施例I.16具有降低了的ε-环化酶活性的转基因万寿菊植物的特性用研钵在液氮中研磨来自实施例I.15的转基因万寿菊植物花材料，并用100％丙酮抽提(三次，每次500ml)粉末(大约250-500mg)。蒸发溶剂并将类胡萝卜素重悬于100ml丙酮。
使用C30反相柱方法，定量不同的类胡萝卜素。HPLC工作条件实际上与所公开的方法(Frazer等(2000)，Plant Journal 24(4)551-558)相同。基于UV-VIS光谱能够鉴定类胡萝卜素。
表2显示了按照上述实施例产生的转基因万寿菊植物和对照万寿菊植物的万寿菊花瓣中类胡萝卜素谱。所有类胡萝卜素的量以[μg/g]鲜重给出，在括弧中给出与对照植物相比的百分比改变。
与非遗传修饰的对照植物相比，具有降低了的ε-环化酶活性的经遗传修饰植物具有显著增加的“β-胡萝卜素途径”的类胡萝卜素含量，例如显著增加了的β-胡萝卜素和玉米黄素含量，以及显著降低了的“α-胡萝卜素途径”的类胡萝卜素含量，例如显著降低了的叶黄素含量。
表2
实施例II含虾青素的万寿菊属植物部分的产生分离出按照实施例I.6产生的含虾青素万寿菊属植物的头状花序或花瓣并干燥。然后将干燥的头状花序或花瓣通过粉碎转化成粉末形式。
实施例III含虾青素提取物的产生和进一步纯化在匀浆器中用过量(一份植物材料大约10份溶剂)溶剂(例如丙酮、己烷、二氯甲烷、甲基叔丁基醚、四氢呋喃、乙醇、庚烷、环庚烷或石油醚，但并不仅限于这些)或用溶剂混合物(例如丙酮/己烷、乙醇/己烷(50∶50，v/v)或丙酮/甲醇(7∶3，v/v))匀浆按照实施例I.6产生的万寿菊的干燥花叶或干燥头状花序，并振荡下在黑暗和冷处抽提。可以将残余物用所使用的溶剂/溶剂混合物重复抽提多达三次。使用蒸发器蒸发所收集的有机溶剂或溶剂混合物直到得到减少了的浓缩物。另外，可以用己烷进一步抽提材料。蒸发(也在黑暗和冷处)所使用的己烷。
将以该种方式产生的浓缩物溶于己烷并利用柱层析法使用二氧化硅材料进行层析。将其中一份二氧化硅材料与1-2份类胡萝卜素溶液混合并装于柱中。在黑暗和冷处用己烷充分洗涤柱。丢弃该洗脱物。用己烷和乙醇混合物(己烷中有2-5％乙醇)洗脱酮式类胡萝卜素特别是虾青素，直到洗脱出橙红色级分。收集橙红色洗脱物直到颜色改变。橙红色洗脱物含有单酯和二酯虾青素混合物。
实施例IV挤压型鳟鱼饲料的产生，所述饲料包含含有虾青素的万寿菊属植物或植物部分或含有虾青素万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物在双螺旋挤压器中挤压以下成分。
挤压之前，作为组分加入按照诸如实施例II产生的经粉碎加工的含虾青素的万寿菊属植物或植物部分或含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物。
挤压之后，将含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物或经加工提取物以液体形式，例如按照实施例III产生，喷雾于挤压物上(通过PPA方法应用)。
虾青素活性成分的剂量为每kg饲料中含10、20和40mg虾青素。
完成挤压过程之后，将挤压物干燥并冷却。
实施例V
将含虾青素的万寿菊属植物或植物部分或含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物以标准鳟鱼饲喂形式经口施用于鳟鱼-生物利用度检测按照实施例IV产生的含有本发明虾青素色素的鳟鱼饲料并经口施用于鳟鱼(平均活体质量180g)。测试3个浓度每kg饲料10、20和40mg来自本发明虾青素色素的虾青素。
如下文中所述养殖鳟鱼●给予鳟鱼标准的14天适应期。
●在饲养试验期间，在每个体积80升水的恒水流塑料缸中养殖10尾鳟鱼。水温为15℃。水经过生物学净化并且每天将至少总体积10％的水替换为新鲜水。
●照明期为每天12小时以避免动物的过早性成熟。
●对每一处理，池的数量为3。这等于每个剂量水平30尾鳟鱼。
●饲料贮存于-20℃以避免虾青素损失。融化部分饲料(每周)并施用。
●实验期为8周。
如下文中所述进行鳟鱼喂饲●所施用的实验饲料是按照实施例IV产生的另外进行了油包衣的挤压型鳟鱼饲料。
●在适应期期间，施用按照实施例IV产生的无虾青素的挤压型油包衣无虾青素标准鳟鱼饲料。
●作为阴性对照，整个实验期间施用按照实施例IV产生的无虾青素的挤压型油包衣无虾青素标准鳟鱼饲料。
●每天2×用手进行喂食直到动物吃饱。
本发明虾青素着色不仅影响鱼的行为参数，例如饲料摄取、饲料利用和体重增加，而且还影响所研究的着色的生物效率。
对每尾鱼的平均饲料消耗、饲料转化和体重增加进行统计学评价。
通过反射分光光度计测定法(Minolta a值＝鱼片切口处的红色值)并通过测定与阴性对照相比每一情况下鱼片中的虾青素含量(mg/kg)测定鱼的着色。
代表色调中的红色部分的Minolta a值以剂量依赖方式随功能梯的降低而增加。反映黄色部分的Minolta b值在阴性范围或零附近。这表明鳟鱼鱼片中的红色调依赖于所消耗的虾青素的量。
实验期间，对于所观察的行为参数，在处理组之间或处理组内(含虾青素的粉末、液体形式含虾青素的提取物、合成虾青素、阴性对照)没有观察到统计上有意义的差别。
发现含虾青素的万寿菊属植物或植物部分或含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物在使以鲑类为代表的鳟鱼着色中是生物可利用的并且对鳟鱼生物学行为不导致负面影响。
序列表<110>太阳基因两合公司<120>含虾青素的万寿菊属植物或植物部分作为饲料的用途<130>PF 54148<160>142<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>1771<212>DNA<213>雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)<220>
<221>CDS<222>(166)..(1155)<223>
<400>1ggcacgagct tgcacgcaag tcagcgcgcg caagtcaaca cctgccggtc cacagcctca 60aataataaag agctcaagcg tttgtgcgcc tcgacgtggc cagtctgcac tgccttgaac 120
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85 90 95Gln Leu His Trp Leu Pro Val Ser Asp Ala Thr Ala Gln Leu Val Ser100 105 110Gly Thr Ser Ser Leu Leu Asp Ile Val Val Val Phe Phe Val Leu Glu115 120 125Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe Ile Thr Thr His Asp Ala Met His Gly130 135 140Thr Ile Ala Met Arg Asn Arg Gln Leu Asn Asp Phe Leu Gly Arg Val145 150 155 160Cys Ile Ser Leu Tyr Ala Trp Phe Asp Tyr Asn Met Leu His Arg Lys165 170 175His Trp Glu His His Asn His Thr Gly Glu Val Gly Lys Asp Pro Asp180 185 190Phe His Arg Gly Asn Pro Gly Ile Val Pro Trp Phe Ala Ser Phe Met195 200 205Ser Ser Tyr Met Ser Met Trp Gln Phe Ala Arg Leu Ala Trp Trp Thr210 215 220Val Val Met Gln Leu Leu Gly Ala Pro Met Ala Asn Leu Leu Val Phe225 230 235 240Met Ala Ala Ala Pro Ile Leu Ser Ala Phe Arg Leu Phe Tyr Phe Gly245 250 255Thr Tyr Met Pro His Lys Pro Glu Pro Gly Ala Ala Ser Gly Ser Ser260 265 270Pro Ala Val Met Asn Trp Trp Lys Ser Arg Thr Ser Gln Ala Ser Asp
275 280 285Leu Val Ser Phe Leu Thr Cys Tyr His Phe Asp Leu His Trp Glu His290 295 300His Arg Trp Pro Phe Ala Pro Trp Trp Glu Leu Pro Asn Cys Arg Arg305 310 315 320Leu Ser Gly Arg Gly Leu Val Pro Ala325<210>3<211>1662<212>DNA<213>雨生红球藻<220>
<221>CDS<222>(168)..(1130)<223>
<400>3cggggcaact caagaaattc aacagctgca agcgcgcccc agcctcacag cgccaagtga 60gctatcgacg tggttgtgag cgctcgacgt ggtccactga cgggcctgtg agcctctgcg 120ctccgtcctc tgccaaatct cgcgtcgggg cctgcctaag tcgaaga atg cac gtc 176Met His Val1gca tcg gca cta atg gtc gag cag aaa ggc agt gag gca gct gct tcc 224Ala Ser Ala Leu Met Val Glu Gln Lys Gly Ser Glu Ala Ala Ala Ser5 10 15
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<210>4<211>320<212>PRT<213>雨生红球藻<400>4Met His Val Ala Ser Ala Leu Met Val Glu Gln Lys Gly Ser Glu Ala1 5 10 15Ala Ala Ser Ser Pro Asp Val Leu Arg Ala Trp Ala Thr Gln Tyr His20 25 30Met Pro Ser Glu Ser Ser Asp Ala Ala Arg Pro Ala Leu Lys His Ala35 40 45Tyr Lys Pro Pro Ala Ser Asp Ala Lys Gly Ile Thr Met Ala Leu Thr50 55 60Ile Ile Gly Thr Trp Thr Ala Val Phe Leu His Ala Ile Phe Gln Ile65 70 75 80Arg Leu Pro Thr Ser Met Asp Gln Leu His Trp Leu Pro Val Ser Glu85 90 95Ala Thr Ala Gln Leu Leu Gly Gly Ser Ser Ser Leu Leu His Ile Ala100 105 110Ala Val Phe Ile Val Leu Glu Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe Ile Thr115 120 125Thr His Asp Ala Met His Gly Thr Ile Ala Leu Arg His Arg Gln Leu130 135 140
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<211>729<212>DNA<213>橙黄农杆菌(Agrobacterium aurantiacum)<220>
<221>CDS<222>(1)..(729)<223>
<400>5atg agc gca cat gcc ctg ccc aag gca gat ctg acc gcc acc agc ctg48Met Ser Ala His Ala Leu Pro Lys Ala Asp Leu Thr Ala Thr Ser Leu1 5 10 15atc gtc tcg ggc ggc atc atc gcc gct tgg ctg gcc ctg cat gtg cat96Ile Val Ser Gly Gly Ile Ile Ala Ala Trp Leu Ala Leu His Val His20 25 30gcg ctg tgg ttt ctg gac gca gcg gcg cat ccc atc ctg gcg atc gca 144Ala Leu Trp Phe Leu Asp Ala Ala Ala His Pro Ile Leu Ala Ile Ala35 40 45aat ttc ctg ggg ctg acc tgg ctg tcg gtc gga ttg ttc atc atc gcg 192Asn Phe Leu Gly Leu Thr Trp Leu Ser Val Gly Leu Phe Ile Ile Ala50 55 60cat gac gcg atg cac ggg tcg gtg gtg ccg ggg cgt ccg cgc gcc aat 240His Asp Ala Met His Gly Ser Val Val Pro Gly Arg Pro Arg Ala Asn65 70 75 80gcg gcg atg ggc cag crt gtc ctg tgg ctg tat gcc gga ttt tcg tgg 288Ala Ala Met Gly Gln Leu Val Leu Trp Leu Tyr Ala Gly Phe Ser Trp85 90 95cgc aag atg atc gtc aag cac atg gcc cat cac cgc cat gcc gga acc 336Arg Lys Met Ile Val Lys His Met Ala His His Arg His Ala Gly Thr100 105 110
gac gac gac ccc gat ttc gac cat ggc ggc ccg gtc cgc tgg tac gcc 384Asp Asp Asp Pro Asp Phe Asp His Gly Gly Pro Val Arg Trp Tyr Ala115 120 125cgc ttc atc ggc acc tat ttc ggc tgg cgc gag ggg ctg ctg ctg ccc 432Arg Phe Ile Gly Thr Tyr Phe Gly Trp Arg Glu Gly Leu Leu Leu Pro130 135 140gtc atc gtg acg gtc tat gcg ctg atc ctt ggg gat cgc tgg atg tac 480Val Ile Val Thr Val Tyr Ala Leu Ile Leu Gly Asp Arg Trp Met Tyr145 150 155 160gtg gtc ttc tgg ccg ctg ccg tcg atc ctg gcg tcg atc cag ctg ttc 528Val Val Phe Trp Pro Leu Pro Ser Ile Leu Ala Ser Ile Gln Leu Phe165 170 175gtg ttc ggc acc tgg ctg ccg cac cgc ccc ggc cac gac gcg ttc ccg 576Val Phe Gly Thr Trp Leu Pro His Arg Pro Gly His Asp Ala Phe Pro180 185 190gac cgc cac aat gcg cgg tcg tcg cgg atc agc gac ccc gtg tcg ctg 624Asp Arg His Asn Ala Arg Ser Ser Arg Ile Ser Asp Pro Val Ser Leu195 200 205ctg acc tgc ttt cac ttt ggc ggt tat cat cac gaa cac cac ctg cac 672Leu Thr Cys Phe His Phe Gly Gly Tyr His His Glu His His Leu His210 215 220ccg acg gtg ccg tgg tgg cgc ctg ccc agc acc cgc acc aag ggg gac 720Pro Thr Val Pro Trp Trp Arg Leu Pro Ser Thr Arg Thr Lys Gly Asp225 230 235 240acc gca tga 729Thr Ala<210>6<211>242<212>PRT<213>橙黄农杆菌
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Asp Arg His Asn Ala Arg Ser Ser Arg Ile Ser Asp Pro Val Ser Leu195 200 205Leu Thr Cys Phe His Phe Gly Gly Tyr His His Glu His His Leu His210 215 220Pro Thr Val Pro Trp Trp Arg Leu Pro Ser Thr Arg Thr Lys Gly Asp225 230 235 240Thr Ala<210>7<211>1631<212>DNA<213>产碱菌(Alcaligenes sp.)<220>
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10 15 20ctg ctg tgc tgg ctg gtc ctg cac gcc ttt acg cta tgg ttg cta gat 212Leu Leu Cys Trp Leu Val Leu His Ala Phe Thr Leu Trp Leu Leu Asp25 30 35gcg gcc gcg cat ccg ctg ctt gcc gtg ctg tgc ctg gct ggg ctg acc 260Ala Ala Ala His Pro Leu Leu Ala Val Leu Cys Leu Ala Gly Leu Thr40 45 50tgg ctg tcg gtc ggg ctg ttc atc atc gcg cat gac gca atg cac ggg 308Trp Leu Ser Val Gly Leu Phe Ile Ile Ala His Asp Ala Met His Gly55 60 65 70tcc gtg gtg ccg ggg cgg ccg cgc gcc aat gcg gcg atc ggg caa ctg 356Ser Val Val Pro Gly Arg Pro Arg Ala Asn Ala Ala Ile Gly Gln Leu75 80 85gcg ctg tgg ctc tat gcg ggg ttc tcg tgg ccc aag ctg atc gcc aag 404Ala Leu Trp Leu Tyr Ala Gly Phe Ser Trp Pro Lys Leu Ile Ala Lys90 95 100cac atg acg cat cac cgg cac gcc ggc acc gac aac gat ccc gat ttc 452His Met Thr His His Arg His Ala Gly Thr Asp Asn Asp Pro Asp Phe105 110 115ggt cac gga ggg ccc gtg cgc tgg tac ggc agc ttc gtc tcc acc tat 500Gly His Gly Gly Pro Val Arg Trp Tyr Gly Ser Phe Val Ser Thr Tyr120 125 130ttc ggc tgg cga gag gga ctg ctg cta ccg gtg atc gtc acc acc tat 548Phe Gly Trp Arg Glu Gly Leu Leu Leu Pro Val Ile Val Thr Thr Tyr135 140 145 150gcg ctg atc ctg ggc gat cgc tgg atg tat gtc atc ttc tgg ccg gtc 596Ala Leu Ile Leu Gly Asp Arg Trp Met Tyr Val Ile Phe Trp Pro Val155 160 165ccg gcc gtt ctg gcg tcg atc cag att ttc gtc ttc gga act tgg ctg 644Pro Ala Val Leu Ala Ser Ile Gln Ile Phe Val Phe Gly Thr Trp Leu170 175 180ccc cac cgc ccg gga cat gac gat ttt ccc gac cgg cac aac gcg agg 692Pro His Arg Pro Gly His Asp Asp Phe Pro Asp Arg His Asn Ala Arg185 190 195tcg acc ggc atc ggc gac ccg ttg tca cta ctg acc tgc ttc cat ttc 740Ser Thr Gly Ile Gly Asp Pro Leu Ser Leu Leu Thr Cys Phe His Phe
200 205 210ggc ggc tat cac cac gaa cat cac ctg cat ccg cat gtg ccg tgg tgg 788Gly Gly Tyr His His Glu His His Leu His Pro His Val Pro Trp Trp215 220 225 230cgc ctg cct cgt aca cgc aag acc gga ggc cgc gca tga cgcaattcct837Arg Leu Pro Arg Thr Arg Lys Thr Gly Gly Arg Ala235 240cattgtcgtg gcgacagtcc tcgtgatgga gctgaccgcc tattccgtcc accgctggat 897tatgcacggc cccctaggct ggggctggca caagtcccat cacgaagagc acgaccacgc 957gttggagaag aacgacotct acggcgtcgt cttcgcggtg ctggcgacga tcctcttcac1017cgtgggcgcc tattggtggc cggtgctgtg gtggatcgcc ctgggcatga cggtctatgg1077gttgatctat ttcatcctgc acgacgggct tgtgcatcaa cgctggccgt ttcggtatat1137tccgcggcgg ggctatttcc gcaggctcta ccaagctcat cgcctgcacc acgcggtcga1197ggggcgggac cactgcgtca gcttcggctt catctatgcc ccacccgtgg acaagctgaa1257gcaggatctg aagcggtcgg gtgtcctgcg cccccaggac gagcgtccgt cgtgatctct1317gatcccggcg tggccgcatg aaatccgacg tgctgctggc aggggccggc cttgccaacg1377gactgatcgc gctggcgatc cgcaaggcgc ggcccgacct tcgcgtgctg ctgctggacc1437gtgcggcggg cgcctcggac gggcatactt ggtcctgcca cgacaccgat ttggcgccgc1497actggctgga ccgcctgaag ccgatcaggc gtggcgactg gcccgatcag gaggtgcggt1557tcccagacca ttcgcgaagg ctccgggccg gatatggctc gatcgacggg cgggggctga1617tgcgtgcggt gacc 1631<210>8<211>242<212>PRT<213>产碱菌
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Val Phe Gly Thr Trp Leu Pro His Arg Pro Gly His Asp Asp Phe Pro180 185 190Asp Arg His Asn Ala Arg Ser Thr Gly Ile Gly Asp Pro Leu Ser Leu195 200 205Leu Thr Cys Phe His Phe Gly Gly Tyr His His Glu His His Leu His210 215 220Pro His Val Pro Trp Trp Arg Leu Pro Arg Thr Arg Lys Thr Gly Gly225 230 235 240Arg Ala<210>9<211>729<212>DNA<213>Paracoccus marcusii<220>
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gcg ctg tgg ttt ctg gac gcg gcg gcc cat ccc atc ctg gcg gtc gcg 144Ala Leu Trp Phe Leu Asp Ala Ala Ala His Pro Ile Leu Ala Val Ala35 40 45aat ttc ctg ggg ctg acc tgg ctg tcg gtc gga ttg ttc atc atc gcg 192Asn Phe Leu Gly Leu Thr Trp Leu Ser Val Gly Leu Phe Ile Ile Ala50 55 60cat gac gcg atg cac ggg tcg gtc gtg ccg ggg cgt ccg cgc gcc aat 240His Asp Ala Met His Gly Ser Val Val Pro Gly Arg Pro Arg Ala Asn65 70 75 80gcg gcg atg ggc cag ctt gtc ctg tgg ctg tat gcc gga ttt tcg tgg 288Ala Ala Met Gly Gln Leu Val Leu Trp Leu Tyr Ala Gly Phe Ser Trp85 90 95cgc aag atg atc gtc aag cac atg gcc cat cac cgc cat gcc gga acc 336Arg Lys Met Ile Val Lys His Met Ala His His Arg His Ala Gly Thr100 105 110gac gac gac cca gat ttc gac cat ggc ggc ccg gtc cgc tgg tac gcc 384Asp Asp Asp Pro Asp Phe Asp His Gly Gly Pro Val Arg Trp Tyr Ala115 120 125cgc ttc atc ggc acc tat ttc ggc tgg cgc gag ggg ctg ctg ctg ccc 432Arg Phe Ile Gly Thr Tyr Phe Gly Trp Arg Glu Gly Leu Leu Leu Pro130 135 140gtc atc gtg acg gtc tat gcg ctg atc ctg ggg gat cgc tgg atg tac 480Val Ile Val Thr Val Tyr Ala Leu Ile Leu Gly Asp Arg Trp Met Tyr145 150 155 160gtg gtc ttc tgg ccg ttg ccg tcg atc ctg gcg tcg atc cag ctg ttc 528Val Val Phe Trp Pro Leu Pro Ser Ile Leu Ala Ser Ile Gln Leu Phe165 170 175gtg ttc ggc act tgg ctg ccg cac cgc ccc ggc cac gac gcg ttc ccg 576Val Phe Gly Thr Trp Leu Pro His Arg Pro Gly His Asp Ala Phe Pro180 185 190gac cgc cat aat gcg cgg tcg tcg cgg atc agc gac cct gtg tcg ctg 624Asp Arg His Asn Ala Arg Ser Ser Arg Ile Ser Asp Pro Val Ser Leu195 200 205ctg acc tgc ttt cat ttt ggc ggt tat cat cac gaa cac cac ctg cac 672Leu Thr Cys Phe His Phe Gly Gly Tyr His His Glu His His Leu His210 215 220
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<220>
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aat tgc gct cgg gtc ttt tta aaa caa caa cgt cgt ttt tgg taa 1629Asn Cys Ala Arg Val Phe Leu Lys Gln Gln Arg Arg Phe Trp530 535 540<210>12<211>542<212>PRT<213>聚球藻<400>12Met Ile Thr Thr Asp Val Val Ile Ile Gly Ala Gly His Asn Gly Leu1 5 10 15Val Cys Ala Ala Tyr Leu Leu Gln Arg Gly Leu Gly Val Thr Leu Leu20 25 30Glu Lys Arg Glu Val Pro Gly Gly Ala Ala Thr Thr Glu Ala Leu Met35 40 45Pro Glu Leu Ser Pro Gln Phe Arg Phe Asn Arg Cys Ala Ile Asp His50 55 60Glu Phe Ile Phe Leu Gly Pro Val Leu Gln Glu Leu Asn Leu Ala Gln65 70 75 80Tyr Gly Leu Glu Tyr Leu Phe Cys Asp Pro Ser Val Phe Cys Pro Gly85 90 95Leu Asp Gly Gln Ala Phe Met Ser Tyr Arg Ser Leu Glu Lys Thr Cys100 105 110Ala His Ile Ala Thr Tyr Ser Pro Arg Asp Ala Glu Lys Tyr Arg Gln
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<221>CDS<222>(1)..(774)<223>
<400>13atg cat gca gca acc gcc aag gct act gag ttc ggg gcc tct cgg cgc48Met His Ala Ala Thr Ala Lys Ala Thr Glu Phe Gly Ala Ser Arg Arg1 5 10 15gac gat gcg agg cag cgc cgc gtc ggt ctc acg ctg gcc gcg gtc atc96Asp Asp Ala Arg Gln Arg Arg Val Gly Leu Thr Leu Ala Ala Val Ile20 25 30atc gcc gcc tgg ctg gtg ctg cat gtc ggt ctg atg ttc ttc tgg ccg 144Ile Ala Ala Trp Leu Val Leu His Val Gly Leu Met Phe Phe Trp Pro35 40 45ctg acc ctt cac agc ctg ctg ccg gct ttg cct ctg gtg gtg ctg cag 192Leu Thr Leu His Ser Leu Leu Pro Ala Leu Pro Leu Val Val Leu Gln50 55 60
acc tgg ctc tat gta ggc ctg ttc atc atc gcg cat gac tgc atg cac 240Thr Trp Leu Tyr Val Gly Leu Phe Ile Ile Ala His Asp Cys Met His65 70 75 80ggc tcg ctg gtg ccg ttc aag ccg cag gtc aac cgc cgt atc gga cag 288Gly Ser Leu Val Pro Phe Lys Pro Gln Val Asn Arg Arg Ile Gly Gln85 90 95ctc tgc ctg ttc ctc tat gcc ggg ttc tcc ttc gac gct ctc aat gtc 336Leu Cys Leu Phe Leu Tyr Ala Gly Phe Ser Phe Asp Ala Leu Asn Val100 105 110gag cac cac aag cat cac cgc cat ccc ggc acg gcc gag gat ccc gat 384Glu His His Lys His His Arg His Pro Gly Thr Ala Glu Asp Pro Asp115 120 125ttc gac gag gtg ccg ccg cac ggc ttc tgg cac tgg ttc gcc agc ttt 432Phe Asp Glu Val Pro Pro His Gly Phe Trp His Trp Phe Ala Ser Phe130 135 140ttc ctg cac tat ttc ggc tgg aag cag gtc gcg atc atc gca gcc gtc 480Phe Leu His Tyr Phe Gly Trp Lys Gln Val Ala Ile Ile Ala Ala Val145 150 155 160tcg ctg gtt tat cag ctc gtc ttc gcc gtt ccc ttg cag aac atc ctg 528Ser Leu Val Tyr Gln Leu Val Phe Ala Val Pro Leu Gln Asn Ile Leu165 170 175ctg ttc tgg gcg ctg ccc ggg ctg ctg tcg gcg ctg cag ctg ttc acc 576Leu Phe Trp Ala Leu Pro Gly Leu Leu Ser Ala Leu Gln Leu Phe Thr180 185 190ttc ggc acc tat ctg ccg cac aag ccg gcc acg cag ccc ttc gcc gat 624Phe Gly Thr Tyr Leu Pro His Lys Pro Ala Thr Gln Pro Phe Ala Asp195 200 205cgc cac aac gcg cgg acg agc gaa ttt ccc gcg tgg ctg tcg ctg ctg 672Arg His Asn Ala Arg Thr Ser Glu Phe Pro Ala Trp Leu Ser Leu Leu210 215 220acc tgc ttc cac ttc ggc ttt cat cac gag cat cat ctg cat ccc gat 720Thr Cys Phe His Phe Gly Phe His His Glu His His Leu His Pro Asp225 230 235 240gcg ccg tgg tgg cgg ctg ccg gag atc aag cgg cgg gcc ctg gaa agg 768Ala Pro Trp Trp Arg Leu Pro Glu Ile Lys Arg Arg Ala Leu Glu Arg245 250 255
cgt gac ta776Arg Asp<210>14<211>258<212>PRT<213>慢生根瘤菌<400>14Met His Ala Ala Thr Ala Lys Ala Thr Glu Phe Gly Ala Ser Arg Arg1 5 10 15Asp Asp Ala Arg Gln Arg Arg Val Gly Leu Thr Leu Ala Ala Val Ile20 25 30Ile Ala Ala Trp Leu Val Leu His Val Gly Leu Met Phe Phe Trp Pro35 40 45Leu Thr Leu His Ser Leu Leu Pro Ala Leu Pro Leu Val Val Leu Gln50 55 60Thr Trp Leu Tyr Val Gly Leu Phe Ile Ile Ala His Asp Cys Met His65 70 75 80Gly Ser Leu Val Pro Phe Lys Pro Gln Val Asn Arg Arg Ile Gly Gln85 90 95Leu Cys Leu Phe Leu Tyr Ala Gly Phe Ser Phe Asp Ala Leu Asn Val100 105 110Glu His His Lys His His Arg His Pro Gly Thr Ala Glu Asp Pro Asp
115 120 125Phe Asp Glu Val Pro Pro His Gly Phe Trp His Trp Phe Ala Ser Phe130 135 140Phe Leu His Tyr Phe Gly Trp Lys Gln Val Ala Ile Ile Ala Ala Val145 150 155 160Ser Leu Val Tyr Gln Leu Val Phe Ala Val Pro Leu Gln Asn Ile Leu165 170 175Leu Phe Trp Ala Leu Pro Gly Leu Leu Ser Ala Leu Gln Leu Phe Thr180 185 190Phe Gly Thr Tyr Leu Pro His Lys Pro Ala Thr Gln Pro Phe Ala Asp195 200 205Arg His Asn Ala Arg Thr Ser Glu Phe Pro Ala Trp Leu Ser Leu Leu210 215 220Thr Cys Phe His Phe Gly Phe His His Glu His His Leu His Pro Asp225 230 235 240Ala Pro Trp Trp Arg Leu Pro Glu Ile Lys Arg Arg Ala Leu Glu Arg245 250 255Arg Asp<210>15<211>777<212>DNA<213>念珠藻(Nostoc sp.)
<220>
<221>CDS<222>(1)..(777)<223>
<400>15atg gtt cag tgt caa cca tca tct ctg cat tca gaa aaa ctg gtg tta48Met Val Gln Cys Gln Pro Ser Ser Leu His Ser Glu Lys Leu Val Leu1 5 10 15ttg tca tcg aca atc aga gat gat aaa aat att aat aag ggt ata ttt96Leu Ser Ser Thr Ile Arg Asp Asp Lys Asn Ile Asn Lys Gly Ile Phe20 25 30att gcc tgc ttt atc tta ttt tta tgg gca att agt tta atc tta tta 144Ile Ala Cys Phe Ile Leu Phe Leu Trp Ala Ile Ser Leu Ile Leu Leu35 40 45ctc tca ata gat aca tcc ata att cat aag agc tta tta ggt ata gcc 192Leu Ser Ile Asp Thr Ser Ile Ile His Lys Ser Leu Leu Gly Ile Ala50 55 60atg ctt tgg cag acc ttc tta tat aca ggt tta ttt att act gct cat 240Met Leu Trp Gln Thr Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe Ile Thr Ala His65 70 75 80gat gcc atg cac ggc gta gtt tat ccc aaa aat ccc aga ata aat aat 288Asp Ala Met His Gly Val Val Tyr Pro Lys Asn Pro Arg Ile Asn Asn85 90 95ttt ata ggt aag ctc act cta atc ttg tat gga cta ctc cct tat aaa 336Phe Ile Gly Lys Leu Thr Leu Ile Leu Tyr Gly Leu Leu Pro Tyr Lys100 105 110gat tta ttg aaa aaa cat tgg tta cac cac gga cat cct ggt act gat 384Asp Leu Leu Lys Lys His Trp Leu His His Gly His Pro Gly Thr Asp115 120 125tta gac cct gat tat tac aat ggt cat ccc caa aac ttc ttt ctt tgg 432Leu Asp Pro Asp Tyr Tyr Asn Gly His Pro Gln Asn Phe Phe Leu Trp130 135 140
tat cta cat ttt atg aag tct tat tgg cga tgg acg caa att ttc gga 480Tyr Leu His Phe Met Lys Ser Tyr Trp Arg Trp Thr Gln Ile Phe Gly145 150 155 160tta gtg atg att ttt cat gga ctt aaa aat ctg gtg cat ata cca gaa 528Leu Val Met Ile Phe His Gly Leu Lys Asn Leu Val His Ile Pro Glu165 170 175aat aat tta att ata ttt tgg atg ata cct tct att tta agt tca gta 576Asn Asn Leu Ile Ile Phe Trp Met Ile Pro Ser Ile Leu Ser Ser Val180 185 190caa cta ttt tat ttt ggt aca ttt ttg cct cat aaa aag cta gaa ggt 624Gln Leu Phe Tyr Phe Gly Thr Phe Leu Pro His Lys Lys Leu Glu Gly195 200 205ggt tat act aac ccc cat tgt gcg cgc agt atc cca tta cct ctt ttt 672Gly Tyr Thr Asn Pro His Cys Ala Arg Ser Ile Pro Leu Pro Leu Phe210 215 220tgg tct ttt gtt act tgt tat cac ttc ggc tac cac aag gaa cat cac 720Trp Ser Phe Val Thr Cys Tyr His Phe Gly Tyr His Lys Glu His His225 230 235 240gaa tac cct caa ctt cct tgg tgg aaa tta cct gaa gct cac aaa ata 768Glu Tyr Pro Gln Leu Pro Trp Trp Lys Leu Pro Glu Ala His Lys Ile245 250 255tct tta taa 777Ser Leu<210>16<211>258<212>PRT<213>念珠藻<400>16Met Val Gln Cys Gln Pro Ser Ser Leu His Ser Glu Lys Leu Val Leu
1 5 10 15Leu Ser Ser Thr Ile Arg Asp Asp Lys Asn Ile Asn Lys Gly Ile Phe20 25 30Ile Ala Cys Phe Ile Leu Phe Leu Trp Ala Ile Ser Leu Ile Leu Leu35 40 45Leu Ser Ile Asp Thr Ser Ile Ile His Lys Ser Leu Leu Gly Ile Ala50 55 60Met Leu Trp Gln Thr Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe Ile Thr Ala His65 70 75 80Asp Ala Met His Gly Val Val Tyr Pro Lys Asn Pro Arg Ile Asn Asn85 90 95Phe Ile Gly Lys Leu Thr Leu Ile Leu Tyr Gly Leu Leu Pro Tyr Lys100 105 110Asp Leu Leu Lys Lys His Trp Leu His His Gly His Pro Gly Thr Asp115 120 125Leu Asp Pro Asp Tyr Tyr Asn Gly His Pro Gln Asn Phe Phe Leu Trp130 135 140Tyr Leu His Phe Met Lys Ser Tyr Trp Arg Trp Thr Gln Ile Phe Gly145 150 155 160Leu Val Met Ile Phe His Gly Leu Lys Asn Leu Val His Ile Pro Glu165 170 175Asn Asn Leu Ile Ile Phe Trp Met Ile Pro Ser Ile Leu Ser Ser Val180 185 190Gln Leu Phe Tyr Phe Gly Thr Phe Leu Pro His Lys Lys Leu Glu Gly
195 200 205Gly Tyr Thr Asn Pro His Cys Ala Arg Ser Ile Pro Leu Pro Leu Phe210 215 220Trp Ser Phe Val Thr Cys Tyr His Phe Gly Tyr His Lys Glu His His225 230 235 240Glu Tyr Pro Gln Leu Pro Trp Trp Lys Leu Pro Glu Ala His Lys Ile245 250 255Ser Leu<210>17<211>1608<212>DNA<213>雨生红球藻<220>
<221>CDS<222>(3)..(971)<223>
<400>17ct aca ttt cac aag ccc gtg agc ggt gca agc gct ctg ccc cac atc 47Thr Phe His Lys Pro Val Ser Gly Ala Ser Ala Leu Pro His Ile1 5 10 15ggc cca cct cct cat ctc cat cgg tca ttt gct gct acc acg atg ctg95Gly Pro Pro Pro His Leu His Arg Ser Phe Ala Ala Thr Thr Met Leu20 25 30
tcg aag ctg cag tca atc agc gtc aag gcc cgc cgc gtt gaa cta gcc 143Ser Lys Leu Gln Ser Ile Ser Val Lys Ala Arg Arg Val Glu Leu Ala35 40 45cgc gac atc acg cgg ccc aaa gtc tgc ctg cat gct cag cgg tgc tcg 191Arg Asp Ile Thr Arg Pro Lys Val Cys Leu His Ala Gln Arg Cys Ser50 55 60tta gtt cgg ctg cga gtg gca gca cca cag aca gag gag gcg ctg gga 239Leu Val Arg Leu Arg Val Ala Ala Pro Gln Thr Glu Glu Ala Leu Gly65 70 75acc gtg cag gct gcc ggc gcg ggc gat gag cac agc gcc gat gta gca 287Thr Val Gln Ala Ala Gly Ala Gly Asp Glu His Ser Ala Asp Val Ala80 85 90 95ctc cag cag ctt gac cgg gct atc gca gag cgt cgt gcc cgg cgc aaa 335Leu Gln Gln Leu Asp Arg Ala Ile Ala Glu Arg Arg Ala Arg Arg Lys100 105 110cgg gag cag ctg tca tac cag gct gcc gcc att gca gca tca att ggc 383Arg Glu Gln Leu Ser Tyr Gln Ala Ala Ala Ile Ala Ala Ser Ile Gly115 120 125gtg tca ggc att gcc atc ttc gcc acc tac ctg aga ttt gcc atg cac 431Val Ser Gly Ile Ala Ile Phe Ala Thr Tyr Leu Arg Phe Ala Met His130 135 140atg acc gtg ggc ggc gca gtg cca tgg ggt gaa gtg gct ggc act ctc 479Met Thr Val Gly Gly Ala Val Pro Trp Gly Glu Val Ala Gly Thr Leu145 150 155ctc ttg gtg gtt ggt ggc gcg ctc ggc atg gag atg tat gcc cgc tat 527Leu Leu Val Val Gly Gly Ala Leu Gly Met Glu Met Tyr Ala Arg Tyr160 165 170 175gca cac aaa gcc atc tgg cat gag tcg cct ctg ggc tgg ctg ctg cac 575Ala His Lys Ala Ile Trp His Glu Ser Pro Leu Gly Trp Leu Leu His180 185 190aag agc cac cac aca cct cgc act gga ccc ttt gaa gcc aac gac ttg 623Lys Ser His His Thr Pro Arg Thr Gly Pro Phe Glu Ala Asn Asp Leu195 200 205ttt gca atc atc aat gga ctg ccc gcc atg ctc ctg tgt acc ttt ggc 671Phe Ala Ile Ile Asn Gly Leu Pro Ala Met Leu Leu Cys Thr Phe Gly210 215 220
ttc tgg ctg ccc aac gtc ctg ggg gcg gcc tgc ttt gga gcg ggg ctg 719Phe Trp Leu Pro Asn Val Leu Gly Ala Ala Cys Phe Gly Ala Gly Leu225 230 235ggc arc acg cta tac ggc atg gca tat atg ttt gta cac gat ggc ctg 767Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Met Ala Tyr Met Phe Val His Asp Gly Leu240 245 250 255gtg cac agg cgc ttt ccc acc ggg ccc atc gct ggc ctg ccc tac atg 815Val His Arg Arg Phe Pro Thr Gly Pro Ile Ala Gly Leu Pro Tyr Met260 265 270aag cgc ctg aca gtg gcc cac cag cta cac cac agc ggc aag tac ggt 863Lys Arg Leu Thr Val Ala His Gln Leu His His Ser Gly Lys Tyr Gly275 280 285ggc gcg ccc tgg ggt atg ttc ttg ggt cca cag gag ctg cag cac att 911Gly Ala Pro Trp Gly Met Phe Leu Gly Pro Gln Glu Leu Gln His Ile290 295 300cca ggt gcg gcg gag gag gtg gag cga ctg gtc ctg gaa ctg gac tgg 959Pro Gly Ala Ala Glu Glu Val Glu Arg Leu Val Leu Glu Leu Asp Trp305 310 315tcc aag cgg tag ggtgcggaac caggcacgct ggtttcacac ctcatgcctg 1011Ser Lys Arg320tgataaggtg tggctagagc gatgcgtgtg agacgggtat gtcacggtcg actggtctga1071tggccaatgg catcggccat gtctggtcat cacgggctgg ttgcctgggt gaaggtgatg1131cacatcatca tgtgcggttg gaggggctgg cacagtgtgg gctgaactgg agcagttgtc1191caggctggcg ttgaatcagt gagggtttgt gattggcggt tgtgaagcaa tgactccgcc1251catattctat ttgtgggagc tgagatgatg gcatgcttgg gatgtgcatg gatcatggta1311gtgcagcaaa ctatattcac ctagggctgt tggtaggatc aggtgaggcc ttgcacattg1371catgatgtac tcgtcatggt gtgttggtga gaggatggat gtggatggat gtgtattctc1431agacgtagac cttgactgga ggcttgatcg agagagtggg ccgtattctt tgagagggga1491ggctcgtgcc agaaatggtg agtggatgac tgtgacgctg tacattgcag gcaggtgaga1551tgcactgtct cgattgtaaa atacattcag atgcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 1608
<210>18<211>322<212>PRT<213>雨生红球藻<400>18Thr Phe His Lys Pro Val Ser Gly Ala Ser Ala Leu Pro His Ile Gly1 5 10 15Pro Pro Pro His Leu His Arg Ser Phe Ala Ala Thr Thr Met Leu Ser20 25 30Lys Leu Gln Ser Ile Ser Val Lys Ala Arg Arg Val Glu Leu Ala Arg35 40 45Asp Ile Thr Arg Pro Lys Val Cys Leu His Ala Gln Arg Cys Ser Leu50 55 60Val Arg Leu Arg Val Ala Ala Pro Gln Thr Glu Glu Ala Leu Gly Thr65 70 75 80Val Gln Ala Ala Gly Ala Gly Asp Glu His Ser Ala Asp Val Ala Leu85 90 95Gln Gln Leu Asp Arg Ala Ile Ala Glu Arg Arg Ala Arg Arg Lys Arg100 105 110Glu Gln Leu Ser Tyr Gln Ala Ala Ala Ile Ala Ala Ser Ile Gly Val115 120 125Ser Gly Ile Ala Ile Phe Ala Thr Tyr Leu Arg Phe Ala Met His Met
130 135 140Thr Val Gly Gly Ala Val Pro Trp Gly Glu Val Ala Gly Thr Leu Leu145 150 155 160Leu Val Val Gly Gly Ala Leu Gly Met Glu Met Tyr Ala Arg Tyr Ala165 170 175His Lys Ala Ile Trp His Glu Ser Pro Leu Gly Trp Leu Leu His Lys180 185 190Ser His His Thr Pro Arg Thr Gly Pro Phe Glu Ala Asn Asp Leu Phe195 200 205Ala Ile Ile Asn Gly Leu Pro Ala Met Leu Leu Cys Thr Phe Gly Phe210 215 220Trp Leu Pro Asn Val Leu Gly Ala Ala Cys Phe Gly Ala Gly Leu Gly225 230 235 240Ile Thr Leu Tyr Gly Met Ala Tyr Met Phe Val His Asp Gly Leu Val245 250 255His Arg Arg Phe Pro Thr Gly Pro Ile Ala Gly Leu Pro Tyr Met Lys260 265 270Arg Leu Thr Val Ala His Gln Leu His His Ser Gly Lys Tyr Gly Gly275 280 285Ala Pro Trp Gly Met Phe Leu Gly Pro Gln Glu Leu Gln His Ile Pro290 295 300Gly Ala Ala Glu Glu Val Glu Arg Leu Val Leu Glu Leu Asp Trp Ser305 310 315 320Lys Arg
<210>19<211>1503<212>DNA<213>番茄<220>
<221>CDS<222>(1)..(1503)<223>
<400>19atg gat act ttg ttg aaa acc cca aat aac ctt gaa ttt ctg aac cca48Met Asp Thr Leu Leu Lys Thr Pro Asn Asn Leu Glu Phe Leu Asn Pro1 5 10 15cat cat ggt ttt gct gtt aaa gct agt acc ttt aga tct gag aag cat96His His Gly Phe Ala Val Lys Ala Ser Thr Phe Arg Ser Glu Lys His20 25 30cat aat ttt ggt tct agg aag ttt tgt gaa act ttg ggt aga agt gtt 144His Asn Phe Gly Ser Arg Lys Phe Cys Glu Thr Leu Gly Arg Ser Val35 40 45tgt gtt aag ggt agt agt agt gct ctt tta gag ctt gta cct gag acc 192Cys Val Lys Gly Ser Ser Ser Ala Leu Leu Glu Leu Val Pro Glu Thr50 55 60aaa aag gag aat ctt gat ttt gag ctt cct atg tat gac cct tca aaa 240Lys Lys Glu Asn Leu Asp Phe Glu Leu Pro Met Tyr Asp Pro Ser Lys65 70 75 80ggg gtt gtt gtg gat ctt gct gtg gtt ggt ggt ggc cct gca gga ctt 288Gly Val Val Val Asp Leu Ala Val Val Gly Gly Gly Pro Ala Gly Leu85 90 95
gct gtt gca cag caa gtt tct gaa gca gga ctc tct gtt tgt tca att 336Ala Val Ala Gln Gln Val Ser Glu Ala Gly Leu Ser Val Cys Ser Ile100 105 110gat ccg aat cct aaa ttg ata tgg cct aat aac tat ggt gtt tgg gtg 384Asp Pro Asn Pro Lys Leu Ile Trp Pro Asn Asn Tyr Gly Val Trp Val115 120 125gat gaa ttt gag gct atg gac ttg tta gat tgt cta gat gct acc tgg 432Asp Glu Phe Glu Ala Met Asp Leu Leu Asp Cys Leu Asp Ala Thr Trp130 135 140tct ggt gca gca gtg tac att gat gat aat acg gct aaa gat ctt cat 480Ser Gly Ala Ala Val Tyr Ile Asp Asp Asn Thr Ala Lys Asp Leu His145 150 155 160aga cct tat gga agg gtt aac cgg aaa cag ctg aaa tcg aaa atg atg 528Arg Pro Tyr Gly Arg Val Asn Arg Lys Gln Leu Lys Ser Lys Met Met165 170 175cag aaa tgt ata atg aat ggt gtt aaa ttc cac caa gcc aaa gtt ata 576Gln Lys Cys Ile Met Asn Gly Val Lys Phe His Gln Ala Lys Val Ile180 185 190aag gtg att cat gag gaa tcg aaa tcc atg ttg ata tgc aat gat ggt 624Lys Val Ile His Glu Glu Ser Lys Ser Met Leu Ile Cys Asn Asp Gly195 200 205att act att cag gca acg gtg gtg ctc gat gca act ggc ttc tct aga 672Ile Thr Ile Gln Ala Thr Val Val Leu Asp Ala Thr Gly Phe Ser Arg210 215 220tct ctt gtt cag tat gat aag cct tat aac ccc ggg tat caa gtt gct 720Ser Leu Val Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Asn Pro Gly Tyr Gln Val Ala225 230 235 240tat ggc att ttg gct gaa gtg gaa gag cac ccc ttt gat gta aac aag 768Tyr Gly Ile Leu Ala Glu Val Glu Glu His Pro Phe Asp Val Asn Lys245 250 255atg gtt ttc atg gat tgg cga gat tct cat ttg aag aac aat act gat 816Met Val Phe Met Asp Trp Arg Asp Ser His Leu Lys Asn Asn Thr Asp260 265 270ctc aag gag aga aat agt aga ata cca act ttt ctt tat gca atg cca 864Leu Lys Glu Arg Asn Ser Arg Ile Pro Thr Phe Leu Tyr Ala Met Pro275 280 285
ttt tca tcc aac agg ata ttt ctt gaa gaa aca tca ctc gta gct cgt 912Phe Ser Ser Asn Arg Ile Phe Leu Glu Glu Thr Ser Leu Val Ala Arg290295 300cct ggc ttg cgt ata gat gat att caa gaa cga atg gtg gct cgt tta 960Pro Gly Leu Arg Ile Asp Asp Ile Gln Glu Arg Met Val Ala Arg Leu305 310 315 320aac cat ttg ggg ata aaa gtg aag agc att gaa gaa gat gaa cat tgt 1008Asn His Leu Gly Ile Lys Val Lys Ser Ile Glu Glu Asp Glu His Cys325 330 335cta ata cca atg ggt ggt cca ctt cca gta tta cct cag aga gtc gtt 1056Leu Ile Pro Met Gly Gly Pro Leu Pro Val Leu Pro Gln Arg Val Val340 345 350gga atc ggt ggt aca gct ggc atg gtt cat cca tcc acc ggt tat atg 1104Gly Ile Gly Gly Thr Ala Gly Met Val His Pro Ser Thr Gly Tyr Met355 360 365gtg gca agg aca cta gct gcg gct cct gtt gtt gcc aat gcc ata att 1152Val Ala Arg Thr Leu Ala Ala Ala Pro Val Val Ala Asn Ala Ile Ile370 375 380caa tac ctc ggt tct gaa aga agt cat tcg ggt aat gaa tta tcc aca 1200Gln Tyr Leu Gly Ser Glu Arg Ser His Ser Gly Asn Glu Leu Ser Thr385 390 395 400gct gtt tgg aaa gat ttg tgg cct ata gag agg aga cgt caa aga gag 1248Ala Val Trp Lys Asp Leu Trp Pro Ile Glu Arg Arg Arg Gln Arg Glu405 410 415ttc ttc tgc ttc ggt atg gat att ctt ctg aag ctt gat tta cct gct 1296Phe Phe Cys Phe Gly Met Asp Ile Leu Leu Lys Leu Asp Leu Pro Ala420 425 430aca aga agg ttc ttt gat gca ttc ttt gac tta gaa cct cgt tat tgg 1344Thr Arg Arg Phe Phe Asp Ala Phe Phe Asp Leu Glu Pro Arg Tyr Trp435 440 445cat ggc ttc tta tcg tct cga ttg ttt cta cct gaa ctc ata gtt ttt 1392His Gly Phe Leu Ser Ser Arg Leu Phe Leu Pro Glu Leu Ile Val Phe450 455 460ggg ctg tct cta ttc tct cat gct tca aat act tct aga ttt gag ata 1440Gly Leu Ser Leu Phe Ser His Ala Ser Asn Thr Ser Arg Phe Glu Ile465 470 475 480
atg aca aag gga act gtt cca tta gta aat atg atc aac aat ttg tta 1488Met Thr Lys Gly Thr Val Pro Leu Val Asn Met Ile Asn Asn Leu Leu485 490 495cag gat aaa gaa tga 1503Gln Asp Lys Glu500<210>20<211>500<212>PRT<213>番茄<400>20Met Asp Thr Leu Leu Lys Thr Pro Asn Asn Leu Glu Phe Leu Asn Pro1 5 10 15His His Gly Phe Ala Val Lys Ala Ser Thr Phe Arg Ser Glu Lys His20 25 30His Asn Phe Gly Ser Arg Lys Phe Cys Glu Thr Leu Gly Arg Ser Val35 40 45Cys Val Lys Gly Ser Ser Ser Ala Leu Leu Glu Leu Val Pro Glu Thr50 55 60Lys Lys Glu Asn Leu Asp Phe Glu Leu Pro Met Tyr Asp Pro Ser Lys65 70 75 80Gly Val Val Val Asp Leu Ala Val Val Gly Gly Gly Pro Ala Gly Leu85 90 95Ala Val Ala Gln Gln Val Ser Glu Ala Gly Leu Ser Val Cys Ser Ile
100 105 110Asp Pro Asn Pro Lys Leu Ile Trp Pro Asn Asn Tyr Gly Val Trp Val115 120 125Asp Glu Phe Glu Ala Met Asp Leu Leu Asp Cys Leu Asp Ala Thr Trp130 135 140Ser Gly Ala Ala Val Tyr Ile Asp Asp Asn Thr Ala Lys Asp Leu His145 150 155 160Arg Pro Tyr Gly Arg Val Asn Arg Lys Gln Leu Lys Ser Lys Met Met165 170 175Gln Lys Cys Ile Met Asn Gly Val Lys Phe His Gln Ala Lys Val Ile180 185 190Lys Val Ile His Glu Glu Ser Lys Ser Met Leu Ile Cys Asn Asp Gly195 200 205Ile Thr Ile Gln Ala Thr Val Val Leu Asp Ala Thr Gly Phe Ser Arg210 215 220Ser Leu Val Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Asn Pro Gly Tyr Gln Val Ala225 230 235 240Tyr Gly Ile Leu Ala Glu Val Glu Glu His Pro Phe Asp Val Asn Lys245 250 255Met Val Phe Met Asp Trp Arg Asp Ser His Leu Lys Asn Asn Thr Asp260 265 270Leu Lys Glu Arg Asn Ser Arg Ile Pro Thr Phe Leu Tyr Ala Met Pro275 280 285Phe Ser Ser Asn Arg Ile Phe Leu Glu Glu Thr Ser Leu Val Ala Arg
290 295 300Pro Gly Leu Arg Ile Asp Asp Ile Gln Glu Arg Met Val Ala Arg Leu305 310 315 320Asn His Leu Gly Ile Lys Val Lys Ser Ile Glu Glu Asp Glu His Cys325 330 335Leu Ile Pro Met Gly Gly Pro Leu Pro Val Leu Pro Gln Arg Val Val340 345 350Gly Ile Gly Gly Thr Ala Gly Met Val His Pro Ser Thr Gly Tyr Met355 360 365Val Ala Arg Thr Leu Ala Ala Ala Pro Val Val Ala Asn Ala Ile Ile370 375 380Gln Tyr Leu Gly Ser Glu Arg Ser His Ser Gly Asn Glu Leu Ser Thr385 390 395 400Ala Val Trp Lys Asp Leu Trp Pro Ile Glu Arg Arg Arg Gln Arg Glu405 410 415Phe Phe Cys Phe Gly Met Asp Ile Leu Leu Lys Leu Asp Leu Pro Ala420 425 430Thr Arg Arg Phe Phe Asp Ala Phe Phe Asp Leu Glu Pro Arg Tyr Trp435 440 445His Gly Phe Leu Ser Ser Arg Leu Phe Leu Pro Glu Leu Ile Val Phe450 455 460Gly Leu Ser Leu Phe Ser His Ala Ser Asn Thr Ser Arg Phe Glu Ile465 470 475 480Met Thr Lys Gly Thr Val Pro Leu Val Asn Met Ile Asn Asn Leu Leu
485 490 495Gln Asp Lys Glu500<210>21<211>195<212>DNA<213>马铃薯<220>
<221>内含子<222>(1)..(195)<223>
<400>21tacgtaagtt tctgcttcta cctttgatat atatataata attatcatta attagtagta 60atataatatt tcaaatattt ttttcaaaat aaaagaatgt agtatatagc aattgctttt 120ctgtagttta taagtgtgta tattttaatt tataactttt ctaatatatg accaaaattt 180gttgatgtgc agctg 195<210>22<211>1155<212>DNA<213>雨生红球藻
<220>
<221>CDS<222>(6)..(995)<223>
<400>22gaagc atg cag cta gca gcg aca gta atg ttg gag cag ctt acc gga agc 50Met Gln Leu Ala Ala Thr Val Met Leu Glu Gln Leu Thr Gly Ser1 5 10 15gct gag gca ctc aag gag aag gag aag gag gtt gca ggc agc tct gac98Ala Glu Ala Leu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Val Ala Gly Ser Ser Asp20 25 30gtg ttg cgt aca tgg gcg acc cag tac tcg ctt ccg tca gag gag tca 146Val Leu Arg Thr Trp Ala Thr Gln Tyr Ser Leu Pro Ser Glu Glu Ser35 40 45gac gcg gcc cgc ccg gga ctg aag aat gcc tac aag cca cca cct tcc 194Asp Ala Ala Arg Pro Gly Leu Lys Asn Ala Tyr Lys Pro Pro Pro Ser50 55 60gac aca aag ggc atc aca atg gcg cta gct gtc atc ggc tcc tgg gcc 242Asp Thr Lys Gly Ile Thr Met Ala Leu Ala Val Ile Gly Ser Trp Ala65 70 75gca gtg ttc ctc cac gcc att ttt caa atc aag ctt ccg acc tcc ttg 290Ala Val Phe Leu His Ala Ile Phe Gln Ile Lys Leu Pro Thr Ser Leu80 85 90 95gac cag ctg cac tgg ctg ccc gtg tca gat gcc aca gct cag ctg gtt 338Asp Gln Leu His Trp Leu Pro Val Ser Asp Ala Thr Ala Gln Leu Val100 105 110agc ggc agc agc agc ctg ctg cac atc gtc gta gta ttc ttt gtc ctg 386Ser Gly Ser Ser Ser Leu Leu His Ile Val Val Val Phe Phe Val Leu115 120 125gag ttc ctg tac aca ggc ctt ttt atc acc acg cat gat gct atg cat 434Glu Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe Ile Thr Thr His Asp Ala Met His130 135 140ggc acc atc gcc atg aga aac agg cag ctt aat gac ttc ttg ggc aga 482
Gly Thr Ile Ala Met Arg Asn Arg Gln Leu Asn Asp Phe Leu Gly Arg145 150 155gta tgc atc tcc ttg tac gcc tgg ttt gat tac aac atg ctg cac cgc 530Val Cys Ile Ser Leu Tyr Ala Trp Phe Asp Tyr Asn Met Leu His Arg160 165 170 175aag cat tgg gag cac cac aac cac act ggc gag gtg ggc aag gac cct 578Lys His Trp Glu His His Asn His Thr Gly Glu Val Gly Lys Asp Pro180 185 190gac ttc cac agg gga aac cct ggc att gtg ccc tgg ttt gcc agc ttc 626Asp Phe His Arg Gly Asn Pro Gly Ile Val Pro Trp Phe Ala Ser Phe195 200 205atg tcc agc tac atg tcg atg tgg cag ttt gcg cgc ctc gca tgg tgg 674Met Ser Ser Tyr Met Ser Met Trp Gln Phe Ala Arg Leu Ala Trp Trp210 215 220acg gtg gtc atg cag ctg ctg ggt gcg cca atg gcg aac ctg ctg gtg 722Thr Val Val Met Gln Leu Leu Gly Ala Pro Met Ala Asn Leu Leu Val225 230 235ttc atg gcg gcc gcg ccc atc ctg tcc gcc ttc cgc ttg ttc tac ttt 770Phe Met Ala Ala Ala Pro Ile Leu Ser Ala Phe Arg Leu Phe Tyr Phe240 245 250 255ggc acg tac atg ccc cac aag cct gag cct ggc gcc gcg tca ggc tct 818Gly Thr Tyr Met Pro His Lys Pro Glu Pro Gly Ala Ala Ser Gly Ser260 265 270tca cca gcc gtc atg aac tgg tgg aag tcg cgc act agc cag gcg tcc 866Ser Pro Ala Val Met Asn Trp Trp Lys Ser Arg Thr Ser Gln Ala Ser275 280 285gac ctg gtc agc ttt ctg acc tgc tac cac ttc gac ctg cac tgg gag 914Asp Leu Val Ser Phe Leu Thr Cys Tyr His Phe Asp Leu His Trp Glu290 295 300cac cac cgc tgg ccc ttt gcc ccc tgg tgg gag ctg ccc aac tgc cgc 962His His Arg Trp Pro Phe Ala Pro Trp Trp Glu Leu Pro Asn Cys Arg305 310 315cgc ctg tct ggc cga ggt ctg gtt cct gcc tag ctggacacac tgcagtgggc1015Arg Leu Ser Gly Arg Gly Leu Val Pro Ala320 325cctgctgcca gctgggcatg caggttgtgg caggactggg tgaggtgaaa agctgcaggc1075
gctgctgccg gacacgctgc atgggctacc ctgtgtagct gccgccacta ggggaggggg1135tttgtagctg tcgagcttgc1155<210>23<211>329<212>PRT<213>雨生红球藻<400>23Met Gln Leu Ala Ala Thr Val Met Leu Glu Gln Leu Thr Gly Ser Ala1 5 10 15Glu Ala Leu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Val Ala Gly Ser Ser Asp Val20 25 30Leu Arg Thr Trp Ala Thr Gln Tyr Ser Leu Pro Ser Glu Glu Ser Asp35 40 45Ala Ala Arg Pro Gly Leu Lys Asn Ala Tyr Lys Pro Pro Pro Ser Asp50 55 60Thr Lys Gly Ile Thr Met Ala Leu Ala Val Ile Gly Ser Trp Ala Ala65 70 75 80Val Phe Leu His Ala Ile Phe Gln Ile Lys Leu Pro Thr Ser Leu Asp85 90 95Gln Leu His Trp Leu Pro Val Ser Asp Ala Thr Ala Gln Leu Val Ser100 105 110Gly Ser Ser Ser Leu Leu His Ile Val Val Val Phe Phe Val Leu Glu
115 120 125Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe Ile Thr Thr His Asp Ala Met His Gly130 135 140Thr Ile Ala Met Arg Asn Arg Gln Leu Asn Asp Phe Leu Gly Arg Val145 150 155 160Cys Ile Ser Leu Tyr Ala Trp Phe Asp Tyr Asn Met Leu His Arg Lys165 170 175His Trp Glu His His Asn His Thr Gly Glu Val Gly Lys Asp Pro Asp180 185 190Phe His Arg Gly Asn Pro Gly Ile Val Pro Trp Phe Ala Ser Phe Met195 200 205Ser Ser Tyr Met Ser Met Trp Gln Phe Ala Arg Leu Ala Trp Trp Thr210 215 220Val Val Met Gln Leu Leu Gly Ala Pro Met Ala Asn Leu Leu Val Phe225 230 235 240Met Ala Ala Ala Pro Ile Leu Ser Ala Phe Arg Leu Phe Tyr Phe Gly245 250 255Thr Tyr Met Pro His Lys Pro Glu Pro Gly Ala Ala Ser Gly Ser Ser260 265 270Pro Ala Val Met Asn Trp Trp Lys Ser Arg Thr Ser Gln Ala Ser Asp275 280 285Leu Val Ser Phe Leu Thr Cys Tyr His Phe Asp Leu His Trp Glu His290 295 300His Arg Trp Pro Phe Ala Pro Trp Trp Glu Leu Pro Asn Cys Arg Arg
305 310 315 320Leu Ser Gly Arg Gly Leu Val Pro Ala325<210>24<211>1111<212>DNA<213>雨生红球藻<220>
<221>CDS<222>(4)..(951)<223>
<400>24tgc atg cta gag gca ctc aag gag aag gag aag gag gtt gca ggc agc48Met Leu Glu Ala Leu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Val Ala Gly Ser1 5 10 15tct gac gtg ttg cgt aca tgg gcg acc cag tac tcg ctt ccg tca gaa96Ser Asp Val Leu Arg Thr Trp Ala Thr Gln Tyr Ser Leu Pro Ser Glu20 25 30gag tca gac gcg gcc cgc ccg gga ctg aag aat gcc tac aag cca cca 144Glu Ser Asp Ala Ala Arg Pro Gly Leu Lys Asn Ala Tyr Lys Pro Pro35 40 45cct tcc gac aca aag ggc atc aca atg gcg cta gct gtc atc ggc tcc 192Pro Ser Asp Thr Lys Gly Ile Thr Met Ala Leu Ala Val Ile Gly Ser50 55 60tgg gcc gca gtg ttc ctc cac gcc att ttt caa atc aag ctt ccg acc 240Trp Ala Ala Val Phe Leu His Ala Ile Phe Gln Ile Lys Leu Pro Thr65 70 75
tcc ttg gac cag ctg cac tgg ctg ccc gtg tca gat gcc aca gct cag 288Ser Leu Asp Gln Leu His Trp Leu Pro Val Ser Asp Ala Thr Ala Gln80 85 90 95ctg gtt agc ggc agc agc agc ctg ctg cac atc gtc gta gta ttc ttt 336Leu Val Ser Gly Ser Ser Ser Leu Leu His Ile Val Val Val Phe Phe100 105 110gtc ctg gag ttc ctg tac aca ggc ctt ttt atc acc acg cat gat gct 384Val Leu Glu Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe Ile Thr Thr His Asp Ala115 120 125atg cat ggc acc atc gcc atg aga aac agg cag ctt aat gac ttc ttg 432Met His Gly Thr Ile Ala Met Arg Asn Arg Gln Leu Asn Asp Phe Leu130 135 140ggc aga gta tgc atc tcc ttg tac gcc tgg ttt gat tac aac atg ctg 480Gly Arg Val Cys Ile Ser Leu Tyr Ala Trp Phe Asp Tyr Asn Met Leu145 150 155cac cgc aag cat tgg gag cac cac aac cac act ggc gag gtg ggc aag 528His Arg Lys His Trp Glu His His Asn His Thr Gly Glu Val Gly Lys160 165 170 175gac cct gac ttc cac agg gga aac cct ggc att gtg ccc tgg ttt gcc 576Asp Pro Asp Phe His Arg Gly Asn Pro Gly Ile Val Pro Trp Phe Ala180 185 190agc ttc atg tcc agc tac atg tcg atg tgg cag ttt gcg cgc ctc gca 624Ser Phe Met Ser Ser Tyr Met Ser Met Trp Gln Phe Ala Arg Leu Ala195 200 205tgg tgg acg gtg gtc atg cag ctg ctg ggt gcg cca atg gcg aac ctg 672Trp Trp Thr Val Val Met Gln Leu Leu Gly Ala Pro Met Ala Asn Leu210 215 220ctg gtg ttc atg gcg gcc gcg ccc atc ctg tcc gcc ttc cgc ttg ttc 720Leu Val Phe Met Ala Ala Ala Pro Ile Leu Ser Ala Phe Arg Leu Phe225 230 235tac ttt ggc acg tac atg ccc cac aag cct gag cct ggc gcc gcg tca 768Tyr Phe Gly Thr Tyr Met Pro His Lys Pro Glu Pro Gly Ala Ala Ser240 245 250 255ggc tct rca cca gcc gtc atg aac tgg tgg aag tcg cgc act agc cag 816Gly Ser Ser Pro Ala Val Met Asn Trp Trp Lys Ser Arg Thr Ser Gln260 265 270
gcg tcc gac ctg gtc agc ttt ctg acc tgc tac cac ttc gac ctg cac 864Ala Ser Asp Leu Val Ser Phe Leu Thr Cys Tyr His Phe Asp Leu His275 280 285tgg gag cac cac cgc tgg ccc ttc gcc ccc tgg tgg gag ctg ccc aac 912Trp Glu His His Arg Trp Pro Phe Ala Pro Trp Trp Glu Leu Pro Asn290 295 300tgc cgc cgc ctg tct ggc cga ggt ctg gtt cct gcc tag ctggacacac961Cys Arg Arg Leu Ser Gly Arg Gly Leu Val Pro Ala305 310 315tgcagtgggc cctgctgcca gctgggcatg caggttgtgg caggactggg tgaggtgaaa1021agctgcaggc gctgctgccg gacacgttgc atgggctacc ctgtgtagct gccgccacta1081ggggaggggg tttgtagctg tcgagcttgc 1111<210>25<211>315<212>PRT<213>雨生红球藻<400>25Met Leu Glu Ala Leu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Val Ala Gly Ser Ser1 5 10 15Asp Val Leu Arg Thr Trp Ala Thr Gln Tyr Ser Leu Pro Ser Glu Glu20 25 30Ser Asp Ala Ala Arg Pro Gly Leu Lys Asn Ala Tyr Lys Pro Pro Pro35 40 45Ser Asp Thr Lys Gly Ile Thr Met Ala Leu Ala Val Ile Gly Ser Trp50 55 60
Ala Ala Val Phe Leu His Ala Ile Phe Gln Ile Lys Leu Pro Thr Ser65 70 75 80Leu Asp Gln Leu His Trp Leu Pro Val Ser Asp Ala Thr Ala Gln Leu85 90 95Val Ser Gly Ser Ser Ser Leu Leu His Ile Val Val Val Phe Phe Val100 105 110Leu Glu Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe Ile Thr Thr His Asp Ala Met115 120 125His Gly Thr Ile Ala Met Arg Asn Arg Gln Leu Asn Asp Phe Leu Gly130 135 140Arg Val Cys Ile Ser Leu Tyr Ala Trp Phe Asp Tyr Asn Met Leu His145 150 155 160Arg Lys His Trp Glu His His Asn His Thr Gly Glu Val Gly Lys Asp165 170 175Pro Asp Phe His Arg Gly Asn Pro Gly Ile Val Pro Trp Phe Ala Ser180 185 190Phe Met Ser Ser Tyr Met Ser Met Trp Gln Phe Ala Arg Leu Ala Trp195 200 205Trp Thr Val Val Met Gln Leu Leu Gly Ala Pro Met Ala Asn Leu Leu210 215 220Val Phe Met Ala Ala Ala Pro Ile Leu Ser Ala Phe Arg Leu Phe Tyr225 230 235 240Phe Gly Thr Tyr Met Pro His Lys Pro Glu Pro Gly Ala Ala Ser Gly245 250 255
Ser Ser Pro Ala Val Met Asn Trp Trp Lys Ser Arg Thr Ser Gln Ala260 265 270Ser Asp Leu Val Ser Phe Leu Thr Cys Tyr His Phe Asp Leu His Trp275 280 285Glu His His Arg Trp Pro Phe Ala Pro Trp Trp Glu Leu Pro Asn Cys290 295 300Arg Arg Leu Ser Gly Arg Gly Leu Val Pro Ala305 310 315<210>26<211>1031<212>DNA<213>雨生红球藻<220>
<221>CDS<222>(6)..(1031)<223>
<400>26gaagc atg cag cta gca gcg aca gta atg ttg gag cag ctt acc gga agc 50Met Gln Leu Ala Ala Thr Val Met Leu Glu Gln Leu Thr Gly Ser1 5 10 15gct gag gca ctc aag gag aag gag aag gag gtt gca ggc agc tct gac98Ala Glu Ala Leu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Val Ala Gly Ser Ser Asp20 25 30gtg ttg cgt aca tgg gcg acc cag tac tcg ctt ccg tca gag gag tca 146
Val Leu Arg Thr Trp Ala Thr Gln Tyr Ser Leu Pro Ser Glu Glu Ser35 40 45gac gcg gcc cgc ccg gga ctg aag aat gcc tac aag cca cca cct tcc 194Asp Ala Ala Arg Pro Gly Leu Lys Asn Ala Tyr Lys Pro Pro Pro Ser50 55 60gac aca aag ggc atc aca atg gcg cta gct gtc atc ggc tcc tgg gct 242Asp Thr Lys Gly Ile Thr Met Ala Leu Ala Val Ile Gly Ser Trp Ala65 70 75gca gtg ttc ctc cac gcc att ttt caa atc aag ctt ccg acc tcc ttg 290Ala Val Phe Leu His Ala Ile Phe Gln Ile Lys Leu Pro Thr Ser Leu80 85 90 95gac cag ctg cac tgg ctg ccc gtg tca gat gcc aca gct cag ctg gtt 338Asp Gln Leu His Trp Leu Pro Val Ser Asp Ala Thr Ala Gln Leu Val100 105 110agc ggc agc agc agc ctg ctg cac atc gtc gta gta ttc ttt gtc ctg 386Ser Gly Ser Ser Ser Leu Leu His Ile Val Val Val Phe Phe Val Leu115 120 125gag ttc ctg tac aca ggc ctt ttt atc acc acg cat gat gct atg cat 434Glu Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe Ile Thr Thr His Asp Ala Met His130 135 140ggc acc atc gcc atg aga aac agg cag ctt aat gac ttc ttg ggc aga 482Gly Thr Ile Ala Met Arg Asn Arg Gln Leu Asn Asp Phe Leu Gly Arg145 150 155gta tgc atc tcc ttg tac gcc tgg ttt gat tac aac atg ctg cac cgc 530Val Cys Ile Ser Leu Tyr Ala Trp Phe Asp Tyr Asn Met Leu His Arg160 165 170 175aag cat tgg gag cac cac aac cac act ggc gag gtg ggc aag gac cct 578Lys His Trp Glu His His Asn His Thr Gly Glu Val Gly Lys Asp Pro180 185 190gac ttc cac agg gga aac cct ggc att gtg ccc tgg ttt gcc agc ttc 626Asp Phe His Arg Gly Asn Pro Gly Ile Val Pro Trp Phe Ala Ser Phe195 200 205atg tcc agc tac atg tcg atg tgg cag ttt gcg cgc ctc gca tgg tgg 674Met Ser Ser Tyr Met Ser Met Trp Gln Phe Ala Arg Leu Ala Trp Trp210 215 220acg gtg gtc atg cag ctg ctg ggt gcg cca atg gcg aac ctg ctg gtg 722
Thr Val Val Met Gln Leu Leu Gly Ala Pro Met Ala Asn Leu Leu Val225 230 235ttc atg gcg gcc gcg ccc arc ctg tcc gcc ttc cgc ttg ttc tac ttt 770Phe Met Ala Ala Ala Pro Ile Leu Ser Ala Phe Arg Leu Phe Tyr Phe240 245 250 255ggc acg tac atg ccc cac aag cct gag cct ggc gcc gcg tca ggc tct 818Gly Thr Tyr Met Pro His Lys Pro Glu Pro Gly Ala Ala Ser Gly Ser260 265 270tca cca gcc gtc atg aac tgg tgg aag tcg cgc act agc cag gcg tcc 866Ser Pro Ala Val Met Asn Trp Trp Lys Ser Arg Thr Ser Gln Ala Ser275 280 285gac ctg gtc agc ttt ctg acc tgc tac cac ttc gac ctg cac tgg gag 914Asp Leu Val Ser Phe Leu Thr Cys Tyr His Phe Asp Leu His Trp Glu290 295 300cac cac cgc tgg ccc ttt gcc ccc tgg tgg gag ctg ccc aac tgc cgc 962His His Arg Trp Pro Phe Ala Pro Trp Trp Glu Leu Pro Asn Cys Arg305 310 315cgc ctg tct ggc cga ggt ctg gtt cct gcc gag caa aaa ctc atc tca 1010Arg Leu Ser Gly Arg Gly Leu Val Pro Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser320 325 330 335gaa gag gat ctg aat agc tag 1031Glu Glu Asp Leu Asn Ser340<210>27<211>341<212>PRT<213>雨生红球藻<400>27Met Gln Leu Ala Ala Thr Val Met Leu Glu Gln Leu Thr Gly Ser Ala1 5 10 15
Glu Ala Leu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Val Ala Gly Ser Ser Asp Val20 25 30Leu Arg Thr Trp Ala Thr Gln Tyr Ser Leu Pro Ser Glu Glu Ser Asp35 40 45Ala Ala Arg Pro Gly Leu Lys Asn Ala Tyr Lys Pro Pro Pro Ser Asp50 55 60Thr Lys Gly Ile Thr Met Ala Leu Ala Val Ile Gly Ser Trp Ala Ala65 70 75 80Val Phe Leu His Ala Ile Phe Gln Ile Lys Leu Pro Thr Ser Leu Asp85 90 95Gln Leu His Trp Leu Pro Val Ser Asp Ala Thr Ala Gln Leu Val Ser100 105 110Gly Ser Ser Ser Leu Leu His Ile Val Val Val Phe Phe Val Leu Glu115 120 125Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe Ile Thr Thr His Asp Ala Met His Gly130 135 140Thr Ile Ala Met Arg Asn Arg Gln Leu Asn Asp Phe Leu Gly Arg Val145 150 155 160Cys Ile Ser Leu Tyr Ala Trp Phe Asp Tyr Asn Met Leu His Arg Lys165 170 175His Trp Glu His His Asn His Thr Gly Glu Val Gly Lys Asp Pro Asp180 185 190Phe His Arg Gly Asn Pro Gly Ile Val Pro Trp Phe Ala Ser Phe Met195 200 205
Ser Ser Tyr Met Ser Met Trp Gln Phe Ala Arg Leu Ala Trp Trp Thr210 215 220Val Val Met Gln Leu Leu Gly Ala Pro Met Ala Asn Leu Leu Val Phe225 230 235 240Met Ala Ala Ala Pro Ile Leu Ser Ala Phe Arg Leu Phe Tyr Phe Gly245 250 255Thr Tyr Met Pro His Lys Pro Glu Pro Gly Ala Ala Ser Gly Ser Ser260 265 270Pro Ala Val Met Asn Trp Trp Lys Ser Arg Thr Ser Gln Ala Ser Asp275 280 285Leu Val Ser Phe Leu Thr Cys Tyr His Phe Asp Leu His Trp Glu His290 295 300His Arg Trp Pro Phe Ala Pro Trp Trp Glu Leu Pro Asn Cys Arg Arg305 310 315 320Leu Ser Gly Arg Gly Leu Val Pro Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu325 330 335Glu Asp Leu Asn Ser340<210>28<211>777<212>DNA<213>拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)
<220>
<221>启动子<222>(1)..(777)<223>
<400>28gagctcactc actgatttcc attgcttgaa aattgatgat gaactaagat caatccatgt 60tagtttcaaa acaacagtaa ctgtggccaa cttagttttg aaacaacact aactggtcga120agcaaaaaga aaaaagagtt tcatcatata tctgatttga tggactgttt ggagttagga180ccaaacatta tctacaaaca aagacttttc tcctaacttg tgattccttc ttaaacccta240ggggtaatat tctattttcc aaggatcttt agttaaaggc aaatccggga aattattgta300atcatttggg gaaacatata aaagatttga gttagatgga agtgacgatt aatccaaaca360tatatatctc tttcttctta tttcccaaat taacagacaa aagtagaata ttggctttta420acaccaatat aaaaacttgc ttcacaccta aacacttttg tttactttag ggtaagtgca480aaaagccaac caaatccacc tgcactgatt tgacgtttac aaacgccgtt aagtcgatgt540ccgttgattt aaacagtgtc ttgtaattaa aaaaatcagt ttacataaat ggaaaattta600tcacttagtt ttcatcaact tctgaactta cctttcatgg attaggcaat actttccatt660tttagtaact caagtggacc ctttacttct tcaactccat ctctctcttt ctatttcact720tctttcttct cattatatct cttgtcctct ccaccaaatc tcttcaacaa aaagctt 777<210>29<211>22<212>DNA<213>合成的
<220>
<221>引物_结合<222>(1)..(22)<223>
<400>29gcaagctcga cagctacaaa cc 22<210>30<211>24<212>DNA<213>合成的<220>
<221>引物_结合<222>(1)..(24)<223>
<400>30gaagcatgca gctagcagcg acag24<210>31<211>30<212>DNA
<213>合成的<220>
<221>引物_结合<222>(1)..(30)<223>
<400>31tgcatgctag aggcactcaa ggagaaggag30<210>32<211>59<212>DNA<213>合成的<220>
<221>引物_结合<222>(1)..(59)<223>
<400>32ctagctattc agatcctctt ctgagatgag tttttgctcg gcaggaacca gacctcggc 59<210>33<211>28
<212>DNA<213>合成的<220>
<221>引物_结合<222>(1)..(28)<223>
<400>33gagctcactc actgatttcc attgcttg 28<210>34<211>37<212>DNA<213>合成的<220>
<221>引物_结合<222>(1)..(37)<223>
<400>34cgccgttaag tcgatgtccg ttgatttaaa cagtgtc 37<210>35
<211>34<212>DNA<213>合成的<220>
<221>引物_结合<222>(1)..(34)<223>
<400>35atcaacggac atcgacttaa cggcgtttgt aaac 34<210>36<211>25<212>DNA<213>合成的<220>
<221>引物_结合<222>(1)..(25)<223>
<400>36taagcttttt gttgaagaga tttgg 25
<210>37<211>212<212>DNA<213>合成序列<220>
<221>内含子<222>(1)..(212)<223>
<400>37gtcgactacg taagtttctg cttctacctt tgatatatat ataataatta tcattaatta60gtagtaatat aatatttcaa atattttttt caaaataaaa gaatgtagta tatagcaatt120gcttttctgt agtttataag tgtgtatatt ttaatttata acttttctaa tatatgacca180aaatttgttg atgtgcaggt atcaccggat cc 212<210>38<211>1830<212>DNA<213>万寿菊(Tagetes erecta)<220>
<221>CDS<222>(141)..(1691)<223>
<400>38ggcacgaggc aaagcaaagg ttgtttgttg ttgttgttga gagacactcc aatccaaaca 60gatacaaggc gtgactggat atttctctct cgttcctaac aacagcaacg aagaagaaaa120agaatcatta ctaacaatca atg agt atg aga gct gga cac atg acg gca aca173Met Ser Met Arg Ala Gly His Met Thr Ala Thr1 5 10atg gcg gct ttt aca tgc cct agg ttt atg act agc atc aga tac acg 221Met Ala Ala Phe Thr Cys Pro Arg Phe Met Thr Ser Ile Arg Tyr Thr15 20 25aag caa att aag tgc aac gct gct aaa agc cag cta gtc gtt aaa caa 269Lys Gln Ile Lys Cys Asn Ala Ala Lys Ser Gln Leu Val Val Lys Gln30 35 40gag att gag gag gaa gaa gat tat gtg aaa gcc ggt gga tcg gag ctg 317Glu Ile Glu Glu Glu Glu Asp Tyr Val Lys Ala Gly Gly Ser Glu Leu45 50 55ctt ttt gtt caa atg caa cag aat aag tcc atg gat gca cag tct agc 365Leu Phe Val Gln Met Gln Gln Asn Lys Ser Met Asp Ala Gln Ser Ser60 65 70 75cta tcc caa aag ctc cca agg gta cca ata gga gga gga gga gac agt 413Leu Ser Gln Lys Leu Pro Arg Val Pro Ile Gly Gly Gly Gly Asp Ser80 85 90aac tgt ata ctg gat ttg gtt gta att ggt tgt ggt cct gct ggc ctt 461Asn Cys Ile Leu Asp Leu Val Val Ile Gly Cys Gly Pro Ala Gly Leu95 100 105gct ctt gct gga gaa tca gcc aag cta ggc ttg aat gtc gca ctt atc 509Ala Leu Ala Gly Glu Ser Ala Lys Leu Gly Leu Asn Val Ala Leu Ile110 115 120ggc cct gat ctt cct ttt aca aat aac tat ggt gtt tgg gag gat gaa 557Gly Pro Asp Leu Pro Phe Thr Asn Asn Tyr Gly Val Trp Glu Asp Glu125 130 135ttt ata ggt ctt gga ctt gag ggc tgt att gaa cat gtt tgg cga gat 605Phe Ile Gly Leu Gly Leu Glu Gly Cys Ile Glu His Val Trp Arg Asp140 145 150 155
act gta gta tat ctt gat gac aac gat ccc att ctc ata ggt cgt gcc653Thr Val Val Tyr Leu Asp Asp Asn Asp Pro Ile Leu Ile Gly Arg Ala160 165 170tat gga cga gtt agt cgt gat tta ctt cac gag gag ttg ttg act agg701Tyr Gly Arg Val Ser Arg Asp Leu Leu His Glu Glu Leu Leu Thr Arg175 180 185tgc atg gag tca ggc gtt tca tat ctg agc tcc aaa gtg gaa cgg att749Cys Met Glu Ser Gly Val Ser Tyr Leu Ser Ser Lys Val Glu Arg Ile190 195 200act gaa gct cca aat ggc cta agt ctc ata gag tgt gaa ggc aat atc797Thr Glu Ala Pro Asn Gly Leu Ser Leu Ile Glu Cys Glu Gly Asn Ile205 210 215aca att cca tgc agg ctt gct act gtc gct tct gga gca gct tct gga845Thr Ile Pro Cys Arg Leu Ala Thr Val Ala Ser Gly Ala Ala Ser Gly220 225 230 235aaa ctt ttg cag tat gaa ctt ggc ggt ccc cgt gtt tgc gtt caa aca893Lys Leu Leu Gln Tyr Glu Leu Gly Gly Pro Arg Val Cys Val Gln Thr240 245 250gct tat ggt ata gag gtt gag gtt gaa agc ata ccc tat gat cca agc941Ala Tyr Gly Ile Glu Val Glu Val Glu Ser Ile Pro Tyr Asp Pro Ser255 260 265cta atg gtt ttc atg gat tat aga gac tac acc aaa cat aaa tct caa989Leu Met Val Phe Met Asp Tyr Arg Asp Tyr Thr Lys His Lys Ser Gln270 275 280tca cta gaa gca caa tat cca aca ttt ttg tat gtc atg cca atg tct1037Ser Leu Glu Ala Gln Tyr Pro Thr Phe Leu Tyr Val Met Pro Met Ser285 290 295cca act aaa gta ttc ttt gag gaa act tgt ttg gct tca aaa gag gcc1085Pro Thr Lys Val Phe Phe Glu Glu Thr Cys Leu Ala Ser Lys Glu Ala300 305 310 315atg cct ttt gag tta ttg aag aca aaa ctc atg tca aga tta aag act1133Met Pro Phe Glu Leu Leu Lys Thr Lys Leu Met Ser Arg Leu Lys Thr320 325 330atg ggg atc cga ata acc aaa act tat gaa gag gaa tgg tca tat att1181Met Gly Ile Arg Ile Thr Lys Thr Tyr Glu Glu Glu Trp Ser Tyr Ile335 340 345
cca gta ggt gga tcc tta cca aat acc gag caa aag aac ctt gca ttt1229Pro Val Gly Gly Ser Leu Pro Asn Thr Glu Gln Lys Asn Leu Ala Phe350 355 360ggt gct gct gct agc atg gtg cat cca gcc aca gga tat tcg gtt gta1277Gly Ala Ala Ala Ser Met Val His Pro Ala Thr Gly Tyr Ser Val Val365 370 375aga tca ctg tca gaa gct cct aat tat gca gca gta att gca aag att1325Arg Ser Leu Ser Glu Ala Pro Asn Tyr Ala Ala Val Ile Ala Lys Ile380 385 390 395tta ggg aaa gga aat tca aaa cag atg ctt gat cat gga aga tac aca1373Leu Gly Lys Gly Asn Ser Lys Gln Met Leu Asp His Gly Arg Tyr Thr400 405 410acc aac atc tca aag caa gct tgg gaa aca ctt tgg ccc ctt gaa agg1421Thr Asn Ile Ser Lys Gln Ala Trp Glu Thr Leu Trp Pro Leu Glu Arg415 420 425aaa aga cag aga gca ttc ttt ctc ttt gga tta gca ctg att gtc cag1469Lys Arg Gln Arg Ala Phe Phe Leu Phe Gly Leu Ala Leu Ile Val Gln430 435 440atg gat att gag ggg acc cgc aca ttc ttc cgg act ttc ttc cgc ttg1517Met Asp Ile Glu Gly Thr Arg Thr Phe Phe Arg Thr Phe Phe Arg Leu445 450 455ccc aca tgg atg tgg tgg ggg ttt ctt gga tct tcg tta tca tca act1565Pro Thr Trp Met Trp Trp Gly Phe Leu Gly Ser Ser Leu Ser Ser Thr460 465 470 475gac ttg ata ata ttt gcg ttt tac atg ttt atc ata gca ccg cat agc1613Asp Leu Ile Ile Phe Ala Phe Tyr Met Phe Ile Ile Ala Pro His Ser480 485 490ctg aga atg ggt ctg gtt aga cat ttg ctt tct gac ccg aca gga gga1661Leu Arg Met Gly Leu Val Arg His Leu Leu Ser Asp Pro Thr Gly Gly495 500 505aca atg tta aaa gcg tat ctc acg ata taa ataactctag tcgcgatcag 1711Thr Met Leu Lys Ala Tyr Leu Thr Ile510 515tttagattat aggcacatct tgcatatata tatgtataaa ccttatgtgt gctgtatcct 1771tacatcaaca cagtcattaa ttgtatttct tggggtaatg ctgatgaagt attttctgg 1830
<210>39<211>516<212>PRT<213>万寿菊<400>39Met Ser Met Arg Ala Gly His Met Thr Ala Thr Met Ala Ala Phe Thr1 5 10 15Cys Pro Arg Phe Met Thr Ser Ile Arg Tyr Thr Lys Gln Ile Lys Cys20 25 30Asn Ala Ala Lys Ser Gln Leu Val Val Lys Gln Glu Ile Glu Glu Glu35 40 45Glu Asp Tyr Val Lys Ala Gly Gly Ser Glu Leu Leu Phe Val Gln Met50 55 60Gln Gln Asn Lys Ser Met Asp Ala Gln Ser Ser Leu Ser Gln Lys Leu65 70 75 80Pro Arg Val Pro Ile Gly Gly Gly Gly Asp Ser Asn Cys Ile Leu Asp85 90 95Leu Val Val Ile Gly Cys Gly Pro Ala Gly Leu Ala Leu Ala Gly Glu100 105 110Ser Ala Lys Leu Gly Leu Asn Val Ala Leu Ile Gly Pro Asp Leu Pro115 120 125Phe Thr Asn Asn Tyr Gly Val Trp Glu Asp Glu Phe Ile Gly Leu Gly130 135 140
Leu Glu Gly Cys Ile Glu His Val Trp Arg Asp Thr Val Val Tyr Leu145 150 155 160Asp Asp Asn Asp Pro Ile Leu Ile Gly Arg Ala Tyr Gly Arg Val Ser165 170 175Arg Asp Leu Leu His Glu Glu Leu Leu Thr Arg Cys Met Glu Ser Gly180 185 190Val Ser Tyr Leu Ser Ser Lys Val Glu Arg Ile Thr Glu Ala Pro Asn195 200 205Gly Leu Ser Leu Ile Glu Cys Glu Gly Asn Ile Thr Ile Pro Cys Arg210 215 220Leu Ala Thr Val Ala Ser Gly Ala Ala Ser Gly Lys Leu Leu Gln Tyr225 230 235 240Glu Leu Gly Gly Pro Arg Val Cys Val Gln Thr Ala Tyr Gly Ile Glu245 250 255Val Glu Val Glu Ser Ile Pro Tyr Asp Pro Ser Leu Met Val Phe Met260 265 270Asp Tyr Arg Asp Tyr Thr Lys His Lys Ser Gln Ser Leu Glu Ala Gln275 280 285Tyr Pro Thr Phe Leu Tyr Val Met Pro Met Ser Pro Thr Lys Val Phe290 295 300Phe Glu Glu Thr Cys Leu Ala Ser Lys Glu Ala Met Pro Phe Glu Leu305 310 315 320Leu Lys Thr Lys Leu Met Ser Arg Leu Lys Thr Met Gly Ile Arg Ile325 330 335
Thr Lys Thr Tyr Glu Glu Glu Trp Ser Tyr Ile Pro Val Gly Gly Ser340 345 350Leu Pro Asn Thr Glu Gln Lys Asn Leu Ala Phe Gly Ala Ala Ala Ser355 360 365Met Val His Pro Ala Thr Gly Tyr Ser Val Val Arg Ser Leu Ser Glu370 375 380Ala Pro Asn Tyr Ala Ala Val Ile Ala Lys Ile Leu Gly Lys Gly Asn385 390 395400Ser Lys Gln Met Leu Asp His Gly Arg Tyr Thr Thr Asn Ile Ser Lys405 410 415Gln Ala Trp Glu Thr Leu Trp Pro Leu Glu Arg Lys Arg Gln Arg Ala420 425 430Phe Phe Leu Phe Gly Leu Ala Leu Ile Val Gln Met Asp Ile Glu Gly435 440 445Thr Arg Thr Phe Phe Arg Thr Phe Phe Arg Leu Pro Thr Trp Met Trp450 455 460Trp Gly Phe Leu Gly Ser Ser Leu Ser Ser Thr Asp Leu Ile Ile Phe465 470 475 480Ala Phe Tyr Met Phe Ile Ile Ala Pro His Ser Leu Arg Met Gly Leu485 490 495Val Arg His Leu Leu Ser Asp Pro Thr Gly Gly Thr Met Leu Lys Ala500 505 510Tyr Leu Thr Ile515
<210>40<211>445<212>DNA<213>万寿菊<220>
<221>有意片段<222>(1)..(445)<223>
<400>40aagcttgcac gaggcaaagc aaaggttgtt tgttgttgtt gttgagagac actccaatcc 60aaacagatac aaggcgtgac tggatatttc tctctcgttc ctaacaacag caacgaagaa120gaaaaagaat cattactaac aatcaatgag tatgagagct ggacacatga cggcaacaat180ggcggctttt acatgcccta ggtttatgac tagcatcaga tacacgaagc aaattaagtg240caacgctgct aaaagccagc tagtcgttaa acaagagatt gaggaggaag aagattatgt300gaaagccggt ggatcggagc tgctttttgt tcaaatgcaa cagaataagt ccatggatgc360acagtctagc ctatcccaaa agctcccaag ggtaccaata ggaggaggag gagacagtaa420ctgtatactg gatttggttg tcgac 445<210>41<211>446<212>DNA
<213>万寿菊<220>
<221>反义片段<222>(1)..(446)<223>
<400>41gaattcgcac gaggcaaagc aaaggttgtt tgttgttgtt gttgagagac actccaatcc 60aaacagatac aaggcgtgac tggatatttc tctctcgttc ctaacaacag caacgaagaa120gaaaaagaat cattactaac aatcaatgag tatgagagct ggacacatga cggcaacaat180ggcggctttt acatgcccta ggtttatgac tagcatcaga tacacgaagc aaattaagtg240caacgctgct aaaagccagc tagtcgttaa acaagagatt gaggaggaag aagattatgt300gaaagccggt ggatcggagc tgctttttgt tcaaatgcaa cagaataagt ccatggatgc360acagtctagc ctatcccaaa agctcccaag ggtaccaata ggaggaggag gagacagtaa420ctgtatactg gatttggttg gatcct 446<210>42<211>393<212>DNA<213>万寿菊<220>
<221>有意片段
<222>(1)..(393)<223>
<400>42aagctttgga ttagcactga ttgtccagat ggatattgag gggacccgca cattcttccg 60gactttcttc cgcttgccca catggatgtg gtgggggttt cttggatctt cgttatcatc120aactgacttg ataatatttg cgttttacat gtttatcata gcaccgcata gcctgagaat180gggtctggtt agacatttgc tttctgaccc gacaggagga acaatgttaa aagcgtatct240cacgatataa ataactctag tcgcgatcag tttagattat aggcacatct tgcatatata300tatgtataaa ccttatgtgt gctgtatcct tacatcaaca cagtcattaa ttgtatttct360tggggtaatg ctgatgaagt attttctgtc gac 393<210>43<211>397<212>DNA<213>万寿菊<220>
<221>反义片段<222>(1)..(397)<223>
<400>43gaattctctt tggattagca ctgattgtcc agatggatat tgaggggacc cgcacattct 60tccggacttt cttccgcttg cccacatgga tgtggtgggg gtttcttgga tcttcgttat120
catcaactga cttgataata tttgcgtttt acatgtttat catagcaccg catagcctga180gaatgggtct ggttagacat ttgctttctg acccgacagg aggaacaatg ttaaaagcgt240atctcacgat ataaataact ctagtcgcga tcagtttaga ttataggcac atcttgcata300tatatatgta taaaccttat gtgtgctgta tccttacatc aacacagtca ttaattgtat360ttcttggggt aatgctgatg aagtattttc tggatcc 397<210>44<211>1537<212>DNA<213>-<220>
<221>启动子<222>(1)..(1537)<223>
<400>44gagctctaca aattagggtt actttattca ttttcatcca ttctctttat tgttaaattt 60tgtacattta ttcaataata ttatatgttt attacaaatt ctcactttct tattcatacc120tattcactca agcctttacc atcttccttt tctatttcaa tactatttct acttcatttt180tcacgttttt aacatctttc tttatttctt gtccacttcg tttagggatg cctaatgtcc240caaatttcat ctctcgtagt aacacaaaac caatgtaatg ctacttctct ctacattttt300aatacaaata aagtgaaaca aaatatctat aaataaacaa atatatatat tttgttagac360gctgtctcaa cccatcaatt aaaaaatttt gttatatttc tactttacct actaaatttg420tttctcatat ttacctttta acccccacaa aaaaaaatta taaaaaagaa agaaaaaagc480
taaaccctat ttaaatagct aactataaga tcttaaaatt atcctcatca gtgtatagtt540taattggtta ttaacttata acattatata tctatgacat atactctctc ctagctattt600ctcacatttt ttaacttaag aaaatagtca taacatagtc taaaattcaa acatccacat660gctctaattt gattaacaaa aagttagaaa tatttattta aataaaaaag actaataaat720atataaaatg aatgttcata cgcagaccca tttagagatg agtatgcttt cacatgctga780gattattttc aaaactaagg ttgtagcaat attaaatcaa taaaattatt ataaataaca840aaattaacct gctcgtgttt gctgtatatg ggaggctaca aaataaatta aactaaagat900gattatgttt tagacatttt ttctatctgt attagtttat acatattaat tcaggagctg960cacaacccaa ttctattttc gttccttggt ggctgggttt ctcacaaggt tcaatagtca1020atattaggtt ttattggact tttaatagta tcaaacaaat ctatgtgtga acttaaaaat1080tgtattaaat atttagggta acctgttgcc gtttttagaa taatgtttct tcttaataca1140cgaaagcgta ttgtgtattc attcatttgg cgcctcacat gcttcggttg gctcgcttta1200gtctctgcct tctttgtata ttgtactccc cctcttccta tgccacgtgt tctgagctta1260acaagccacg ttgcgtgcca ttgccaaaca agtcatttta acttcacaag gtccgatttg1320acctccaaaa caacgacaag tttccgaaca gtcgcgaaga tcaagggtat aatcgtcttt1380ttgaattcta tttctcttta tttaatagtc cctctcgtgt gatagttttt aaaagatttt1440taaaacgtag ctgctgttta agtaaatccc agtccttcag tttgtgcttt tgtgtgtttt1500gtttctctga tttacggaat ttggaaataa taagctt 1537<210>45<211>734<212>DNA<213>合成序列
<220>
<221>变异<222>(1)..(734)<223>
<400>45ctaacaatca atgagtagag agctggacac atgacggcaa caatggcggc ttttacatgc 60cctaggttta tgactagcat cagatacacg aagcaaatta agtgcaacgc tgctaaaagc120cagctagtcg ttaaacaaga gattgaggag gaagaagatt atgtgaaagc cggtggatcg180gagctgcttt ttgttcaaat gcaacagaat aagtccatgg atgcacagtc tagcctatcc240caaaaggtca ctccagactt aattgcttat aaataaataa atatgttttt taggaataat300gatatttaga tagattagct atcacctgtg ctgtggtgtg cagctcccaa gggtcttacc360gatagtaaaa tcgttagtta tgattaatac ttgggaggtg ggggattata ggctttgttg420tgagaatgtt gagaaagagg tttgacaaat cggtgtttga atgaggttaa atggagttta480attaaaataa agagaagaga aagattaaga gggtgatggg gatattaaag acggscaata540tagtgatgcc acgtagaaaa aggtaagtga aaacatacaa cgtggcttta aaagatggct600tggctgctaa tcaactcaac tcaactcata tcctatccat tcaaattcaa ttcaattcta660ttgaatgcaa agcaaagcaa aggttgtttg ttgttgttgt tgagagacac tccaatccaa720acagatacaa ggcg 734<210>46<211>280<212>DNA
<213>合成序列<220>
<221>变异<222>(1)..(280)<223>
<400>46gtcgagtatg gagttcaatt aaaataaaga gaagaraaag attaagaggg tgatggggat 60attaaagacg gccaatrtag tgatgccacg taagaaaaag gtaagtgaaa acatacaacg120tggctttaaa agatggcttg gctgctaatc aactcaactc aactcatatc ctatccattc180aaattcaatt caattctatt gaatgcaaag caaagcaaag caaaggttgt ttgttgttgt240tgttgagaga cactccaatc caaacagata caaggcgtga 280<210>47<211>358<212>DNA<213>万寿菊<220>
<221>有意启动子<222>(1)..(358)<223>
<400>47
aagcttaccg atagtaaaat cgttagttat gattaatact tgggaggtgg gggattatag 60gctttgttgt gagaatgttg agaaagaggt ttgacaaatc ggtgtttgaa tgaggttaaa120tggagtttaa ttaaaataaa gagaagagaa agattaagag ggtgatgggg atattaaaga180cggccaatat agtgatgcca cgtagaaaaa ggtaagtgaa aacatacaac gtggctttaa240aagatggctt ggctgctaat caactcaact caactcatat cctatccatt caaattcaat300tcaattctat tgaatgcaaa gcaaagcaaa gcaaaggttg tttgttgttg ttgtcgac 358<210>48<211>361<212>DNA<213>万寿菊<220>
<221>反义启动子<222>(1)..(361)<223>
<400>48ctcgagctta ccgatagtaa aatcgttagt tatgattaat acttgggagg tgggggatta 60taggctttgt tgtgagaatg ttgagaaaga ggtttgacaa atcggtgttt gaatgaggtt120aaatggagtt taattaaaat aaagagaaga gaaagattaa gagggtgatg gggatattaa180agacggccaa tatagtgatg ccacgtagaa aaaggtaagt gaaaacatac aacgtggctt240taaaagatgg cttggctgct aatcaactca actcaactca tatcctatcc attcaaattc300aattcaattc tattgaatgc aaagcaaagc aaagcaaagg ttgtttgttg ttgttggatc360c361
<210>49<211>28<212>DNA<213>合成序列<220>
<221>引物<222>(1)..(28)<223>
<400>49gagctcactc actgatttcc attgcttg 28<210>50<211>37<212>DNA<213>合成序列<220>
<221>引物<222>(1)..(37)<223>
<400>50
cgccgttaag tcgatgtccg ttgatttaaa cagtgtc 37<210>51<211>34<212>DNA<213>合成序列<220>
<221>引物<222>(1)..(34)<223>
<400>51atcaacggac atcgacttaa cggcgtttgt aaac 34<210>52<211>25<212>DNA<213>合成序列<220>
<221>引物<222>(1)..(25)<223>
<400>52taagcttttt gttgaagaga tttgg25<210>53<211>23<212>DNA<213>合成序列<220>
<221>引物<222>(1)..(23)<223>
<400>53gaaaatactt catcagcatt acc 23<210>54<211>28<212>DNA<213>合成序列<220>
<221>引物<222>(1)..(28)<223>
<400>54gtcgactacg taagtttctg cttctacc 28<210>55<211>26<212>DNA<213>合成序列<220>
<221>引物<222>(1)..(26)<223>
<400>55ggatccggtg atacctgcac atcaac 26<210>56<211>28<212>DNA<213>合成序列<220>
<221>引物<222>(1)..(28)<223>
<400>56aagcttgcac gaggcaaagc aaaggttg 28<210>57<211>29<212>DNA<213>合成序列<220>
<221>引物<222>(1)..(29)<223>
<400>57gtcgacaacc aaatccagta tacagttac29<210>58<211>30<212>DNA<213>合成序列<220>
<221>引物<222>(1)..(30)
<223>
<400>58aggatccaac caaatccagt atacagttac 30<210>59<211>28<212>DNA<213>合成序列<220>
<221>引物<222>(1)..(28)<223>
<400>59gaattcgcac gaggcaaagc aaaggttg28<210>60<211>25<212>DNA<213>合成序列<220>
<221>引物
<222>(1)..(25)<223>
<400>60aagctttgga ttagcactga ttgtc 25<210>61<211>29<212>DNA<213>合成序列<220>
<221>引物<222>(1)..(29)<223>
<400>61gtcgacagaa aatacttcat cagcattac 29<210>62<211>29<212>DNA<213>合成序列<220>
<221>引物<222>(1)..(29)<223>
<400>62ggatccagaa aatacttcat cagcattac 29<210>63<211>27<212>DNA<213>合成序列<220>
<221>引物<222>(1)..(27)<223>
<400>63gaattctctt tggattagca ctgattg27<210>64<211>23<212>DNA<213>合成序列
<220>
<221>引物<222>(1)..(23)<223>
<400>64cgccttgtat ctgtttggat tgg23<210>65<211>24<212>DNA<213>合成序列<220>
<221>引物<222>(1)..(24)<223>
<400>65ctaacaatca atgagtatga gagc 24<210>66<211>26<212>DNA<213>合成序列
<220>
<221>引物<222>(1)..(26)<223>
<400>66agagcaaggc cagcaggacc acaacc 26<210>67<211>26<212>DNA<213>合成序列<220>
<221>引物<222>(1)..(26)<223>
<400>67ccttgggagc ttttgggata ggctag 26<210>68<211>26<212>DNA
<213>合成序列<220>
<221>引物<222>(1)..(26)<223>
<400>68tcacgccttg tatctgtttg gattgg 26<210>69<211>15<212>DNA<213>合成序列<220>
<221>引物<222>(1)..(15)<223>
<400>69gtcgagtatg gagtt 15<210>70<211>28
<212>DNA<213>合成序列<220>
<221>引物<222>(1)..(28)<223>
<400>70aagcttaccg atagtaaaat cgttagtt28<210>71<211>31<212>DNA<213>合成序列<220>
<221>引物<222>(1)..(31)<223>
<400>71ctcgagctta ccgatagtaa aatcgttagt t31<210>72
<211>28<212>DNA<213>合成序列<400>72gtcgacaaca acaacaaaca acctttgc28<210>73<211>28<212>DNA<213>合成序列<220>
<221>引物<222>(1)..(28)<223>
<400>73ggatccaaca acaacaaaca acctttgc28<210>74<211>28<212>DNA<213>合成序列
<220>
<221>引物<222>(1)..(2 8)<223>
<400>74gtcgactttt tgttgaagag atttggtg 28<210>75<211>28<212>DNA<213>合成序列<220>
<221>引物<222>(1)..(28)<223>
<400>75ctcgagactc actgatttcc attgcttg 28<210>76<211>22<212>DNA<213>合成序列
<220>
<221>引物<222>(1)..(22)<223>
<400>76gagctctaca aattagggtt ac 22<210>77<211>23<212>DNA<213>合成序列<220>
<221>引物<222>(1)..(23)<223>
<400>77aagcttatta tttccaaatt ccg 23<210>78<211>50<212>DNA
<213>合成序列<220>
<221>引物<222>(1)..(50)<223>
<400>78aagctttgca attcatacag aagtgagaaa aatgcagcta gcagcgacag 50<210>79<211>1062<212>DNA<213>雨生红球藻<220>
<221>CDS<222>(32)..(1021)<223>
<400>79aagctttgca attcatacag aagtgagaaa a atg cag cta gca gcg aca gta 52Met Gln Leu Ala Ala Thr Val1 5atg ttg gag cag ctt acc gga agc gct gag gca ctc aag gag aag gag 100Met Leu Glu Gln Leu Thr Gly Ser Ala Glu Ala Leu Lys Glu Lys Glu10 15 20
aag gag gtt gca ggc agc tct gac gtg ttg cgt aca tgg gcg acc cag148Lys Glu Val Ala Gly Ser Ser Asp Val Leu Arg Thr Trp Ala Thr Gln25 30 35tac tcg ctt ccg tca gag gag tca gac gcg gcc cgc ccg gga ctg aag196TVr Ser Leu Pro Ser Glu Glu Ser Asp Ala Ala Arg Pro Gly Leu Lys40 45 50 55aat gcc tac aag cca cca cct tcc gac aca aag ggc atc aca atg gcg244Asn Ala Tyr Lys Pro Pro Pro Ser Asp Thr Lys Gly Ile Thr Met Ala60 65 70cta gct gtc atc ggc tcc tgg gcc gca gtg ttc ctc cac gcc att ttt292Leu Ala Val Ile Gly Ser Trp Ala Ala Val Phe Leu His Ala Ile Phe75 80 85caa atc aag ctt ccg acc tcc ttg gac cag ctg cac tgg ctg ccc gtg340Gln Ile Lys Leu Pro Thr Ser Leu Asp Gln Leu His Trp Leu Pro Val90 95 100tca gat gcc aca gct cag ctg gtt agc ggc agc agc agc ctg ctg cac388Ser Asp Ala Thr Ala Gln Leu Val Ser Gly Ser Ser Ser Leu Leu His105 110 115atc gtc gta gta ttc ttt gtc ctg gag ttc ctg tac aca ggc ctt ttt436Ile Val Val Val Phe Phe Val Leu Glu Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe120 125 130 135atc acc acg cat gat gct atg cat ggc acc atc gcc atg aga aac agg484Ile Thr Thr His Asp Ala Met His Gly Thr Ile Ala Met Arg Asn Arg140 145 150cag ctt aat gac ttc ttg ggc aga gta tgc atc tcc ttg tac gcc tgg532Gln Leu Asn Asp Phe Leu Gly Arg Val Cys Ile Ser Leu Tyr Ala Trp155 160 165ttt gat tac aac atg ctg cac cgc aag cat tgg gag cac cac aac cac580Phe Asp Tyr Asn Met Leu His Arg Lys His Trp Glu His His Asn His170 175 180act ggc gag gtg ggc aag gac cct gac ttc cac agg gga aac cct ggc628Thr Gly Glu Val Gly Lys Asp Pro Asp Phe His Arg Gly Asn Pro Gly185 190 195att gtg ccc tgg ttt gcc agc ttc atg tcc agc tac atg tcg atg tgg676Ile Val Pro Trp Phe Ala Ser Phe Met Ser Ser Tyr Met Ser Met Trp200 205 210 215
cag ttt gcg cgc ctc gca tgg tgg acg gtg gtc atg cag ctg ctg ggt724Gln Phe Ala Arg Leu Ala Trp Trp Thr Val Val Met Gln Leu Leu Gly220 225 230gcg cca atg gcg aac ctg ctg gtg ttc atg gcg gcc gcg ccc atc ctg772Ala Pro Met Ala Asn Leu Leu Val Phe Met Ala Ala Ala Pro Ile Leu235 240 245tcc gcc ttc cgc ttg ttc tac ttt ggc acg tac atg ccc cac aag cct820Ser Ala Phe Arg Leu Phe Tyr Phe Gly Thr Tyr Met Pro His Lys Pro250 255 260gag cct ggc gcc gcg tca ggc tct tca cca gcc gtc atg aac tgg tgg868Glu Pro Gly Ala Ala Ser Gly Ser Ser Pro Ala Val Met Asn Trp Trp265 270 275aag tcg cgc act agc cag gcg tcc gac ctg gtc agc ttt ctg acc tgc916Lys Ser Arg Thr Ser Gln Ala Ser Asp Leu Val Ser Phe Leu Thr Cys280 285 290 295tac cac ttc gac ctg cac tgg gag cac cac cgc tgg ccc ttt gcc ccc964Tyr His Phe Asp Leu His Trp Glu His His Arg Trp Pro Phe Ala Pro300 305 310tgg tgg gag ctg ccc aac tgc cgc cgc ctg tct ggc cga ggt ctg gtt1012Trp Trp Glu Leu Pro Asn Cys Arg Arg Leu Ser Gly Arg Gly Leu Val315 320 325cct gcc tag ctggacacac tgcagtgggc cctgctgcca gctgggcatg c 1062Pro Ala<210>80<211>329<212>PRT<213>雨生红球藻<400>80Met Gln Leu Ala Ala Thr Val Met Leu Glu Gln Leu Thr Gly Ser Ala1 5 10 15
Glu Ala Leu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Val Ala Gly Ser Ser Asp Val20 25 30Leu Arg Thr Trp Ala Thr Gln Tyr Ser Leu Pro Ser Glu Glu Ser Asp35 40 45Ala Ala Arg Pro Gly Leu Lys Asn Ala Tyr Lys Pro Pro Pro Ser Asp50 55 60Thr Lys Gly Ile Thr Met Ala Leu Ala Val Ile Gly Ser Trp Ala Ala65 70 75 80Val Phe Leu His Ala Ile Phe Gln Ile Lys Leu Pro Thr Ser Leu Asp85 90 95Gln Leu His Trp Leu Pro Val Ser Asp Ala Thr Ala Gln Leu Val Ser100 105 110Gly Ser Ser Ser Leu Leu His Ile Val Val Val Phe Phe Val Leu Glu115 120 125Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe Ile Thr Thr His Asp Ala Met His Gly130 135 140Thr Ile Ala Met Arg Asn Arg Gln Leu Asn Asp Phe Leu Gly Arg Val145 150 155 160Cys Ile Ser Leu Tyr Ala Trp Phe Asp Tyr Asn Met Leu His Arg Lys165 170 175His Trp Glu His His Asn His Thr Gly Glu Val Gly Lys Asp Pro Asp180 185 190Phe His Arg Gly Asn Pro Gly Ile Val Pro Trp Phe Ala Ser Phe Met195 200 205
Ser Ser Tyr Met Ser Met Trp Gln Phe Ala Arg Leu Ala Trp Trp Thr210 215 220Val Val Met Gln Leu Leu Gly Ala Pro Met Ala Asn Leu Leu Val Phe225 230 235 240Met Ala Ala Ala Pro Ile Leu Ser Ala Phe Arg Leu Phe Tyr Phe Gly245 250 255Thr Tyr Met Pro His Lys Pro Glu Pro Gly Ala Ala Ser Gly Ser Ser260 265 270Pro Ala Val Met Asn Trp Trp Lys Ser Arg Thr Ser Gln Ala Ser Asp275 280 285Leu Val Ser Phe Leu Thr Cys Tyr His Phe Asp Leu His Trp Glu His290 295 300His Arg Trp Pro Phe Ala Pro Trp Trp Glu Leu Pro Asn Cys Arg Arg305 310 315 320Leu Ser Gly Arg Gly Leu Val Pro Ala325<210>81<211>789<212>DNA<213>点形念珠藻(Nostoc punctiforme)<220>
<221>CDS
<222>(1)..(789)<223>
<400>81ttg aat ttt tgt gat aaa cca gtt agc tat tat gtt gca ata gag caa48Leu Asn Phe Cys Asp Lys Pro Val Ser Tyr Tyr Val Ala Ile Glu Gln1 5 10 15tta agt gct aaa gaa gat act gtt tgg ggg ctg gtg att gtc ata gta96Leu Ser Ala Lys Glu Asp Thr Val Trp Gly Leu Val Ile Val Ile Val20 25 30att att agt ctt tgg gta gct agt ttg gct ttt tta cta gct att aat144Ile Ile Ser Leu Trp Val Ala Ser Leu Ala Phe Leu Leu Ala Ile Asn35 40 45tat gcc aaa gtc cca att tgg ttg ata cct att gca ata gtt tgg caa192Tyr Ala Lys Val Pro Ile Trp Leu Ile Pro Ile Ala Ile Val Trp Gln50 55 60atg ttc ctt tat aca ggg cta ttt att act gca cat gat gct atg cat240Met Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe Ile Thr Ala His Asp Ala Met His65 70 75 80ggg tca gtt tat cgt aaa aat ccc aaa att aat aat ttt atc ggt tca288Gly Ser Val Tyr Arg Lys Asn Pro Lys Ile Asn Asn Phe Ile Gly Ser85 90 95cta gct gta gcg ctt tac gct gtg ttt cca tat caa cag atg tta aag336Leu Ala Val Ala Leu Tyr Ala Val Phe Pro Tyr Gln Gln Met Leu Lys100 105 110aat cat tgc tta cat cat cgt cat cct gct agc gaa gtt gac cca gat384Asn His Cys Leu His His Arg His Pro Ala Ser Glu Val Asp Pro Asp115 120 125ttt cat gat ggt aag aga aca aac gct att ttc tgg tat ctc cat ttc432Phe His Asp Gly Lys Arg Thr Asn Ala Ile Phe Trp Tyr Leu His Phe130 135 140atg ata gaa tac tcc agt tgg caa cag tta ata gta cta act atc cta480Met Ile Glu Tyr Ser Ser Trp Gln Gln Leu Ile Val Leu Thr Ile Leu145 150 155 160ttt aat tta gct aaa tac gtt ttg cac atc cat caa ata aat ctc atc528
Phe Asn Leu Ala Lys Tyr Val Leu His Ile His Gln Ile Asn Leu Ile165 170 175tta ttt tgg agt att cct cca att tta agt tcc att caa ctg ttt tat576Leu Phe Trp Ser Ile Pro Pro Ile Leu Ser Ser Ile Gln Leu Phe Tyr180 185 190ttc gga aca ttt ttg cct cat cga gaa ccc aag aaa gga tat gtt tat624Phe Gly Thr Phe Leu Pro His Arg Glu Pro Lys Lys Gly Tyr Val Tyr195 200 205ccc cat tgc agc caa aca ata aaa ttg cca act ttt ttg tca ttt atc672Pro His Cys Ser Gln Thr Ile Lys Leu Pro Thr Phe Leu Ser Phe Ile210 215 220gct tgc tac cac ttt ggt tat cat gaa gaa cat cat gag tat ccc cat720Ala Cys Tyr His Phe Gly Tyr His Glu Glu His His Glu Tyr Pro His225 230 235 240gta cct tgg tgg caa ctt cca tct gta tat aag cag aga gta ttc aac768Val Pro Trp Trp Gln Leu Pro Ser Val Tyr Lys Gln Arg Val Phe Asn245 250 255aat tca gta acc aat tcg taa789Asn Ser Val Thr Asn Ser260<210>82<211>262<212>PRT<213>点形念珠藻<400>82Leu Asn Phe Cys Asp Lys Pro Val Ser Tyr Tyr Val Ala Ile Glu Gln1 5 10 15Leu Ser Ala Lys Glu Asp Thr Val Trp Gly Leu Val Ile Val Ile Val20 25 30
Ile Ile Ser Leu Trp Val Ala Ser Leu Ala Phe Leu Leu Ala Ile Asn35 40 45Tyr Ala Lys Val Pro Ile Trp Leu Ile Pro Ile Ala Ile Val Trp Gln50 55 60Met Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe Ile Thr Ala His Asp Ala Met His65 70 75 80Gly Ser Val Tyr Arg Lys Asn Pro Lys Ile Asn Asn Phe Ile Gly Ser85 90 95Leu Ala Val Ala Leu Tyr Ala Val Phe Pro Tyr Gln Gln Met Leu Lys100 105 110Asn His Cys Leu His His Arg His Pro Ala Ser Glu Val Asp Pro Asp115 120 125Phe His Asp Gly Lys Arg Thr Asn Ala Ile Phe Trp Tyr Leu His Phe130 135 140Met Ile Glu Tyr Ser Ser Trp Gln Gln Leu Ile Val Leu Thr Ile Leu145 150 155 160Phe Asn Leu Ala Lys Tyr Val Leu His Ile His Gln Ile Asn Leu Ile165 170 175Leu Phe Trp Ser Ile Pro Pro Ile Leu Ser Ser Ile Gln Leu Phe Tyr180 185 190Phe Gly Thr Phe Leu Pro His Arg Glu Pro Lys Lys Gly Tyr Val Tyr195 200 205Pro His Cys Ser Gln Thr Ile Lys Leu Pro Thr Phe Leu Ser Phe Ile210 215 220
Ala Cys Tyr His Phe Gly Tyr His Glu Glu His His Glu Tyr Pro His225 230 235 240Val Pro Trp Trp Gln Leu Pro Ser Val Tyr Lys Gln Arg Val Phe Asn245 250 255Asn Ser Val Thr Asn Ser260<210>83<211>762<212>DNA<213>点形念珠藻<220>
<221>CDS<222>(1)..(762)<223>
<400>83gtg atc cag tta gaa caa cca ctc agt cat caa gca aaa ctg act cca48Val Ile Gln Leu Glu Gln Pro Leu Ser His Gln Ala Lys Leu Thr Pro1 5 10 15gta ctg aga agt aaa tct cag ttt aag ggg ctt ttc att gct att gtc96Val Leu Arg Ser Lys Ser Gln Phe Lys Gly Leu Phe Ile Ala Ile Val20 25 30att gtt agc gca tgg gtc att agc ctg agt tta tta ctt tcc ctt gac114Ile Val Ser Ala Trp Val Ile Ser Leu Ser Leu Leu Leu Ser Leu Asp35 40 45atc tca aag cta aaa ttt tgg atg tta ttg cct gtt ata cta tgg caa192Ile Ser Lys Leu Lys Phe Trp Met Leu Leu Pro Val Ile Leu Trp Gln50 55 60
aca ttt tta tat acg gga tta ttt att aca tct cat gat gcc atg cat240Thr Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe Ile Thr Ser His Asp Ala Met His65 70 75 80ggc gta gta ttt ccc caa aac acc aag att aat cat ttg att gga aca288Gly Val Val Phe Pro Gln Asn Thr Lys Ile Asn His Leu Ile Gly Thr85 90 95ttg acc cta tcc ctt tat ggt ctt tta cca tat caa aaa cta ttg aaa336Leu Thr Leu Ser Leu Tyr Gly Leu Leu Pro Tyr Gln Lys Leu Leu Lys100 105 110aaa cat tgg tta cac cac cac aat cca gca agc tca ata gac ccg gat384Lys His Trp Leu His His His Asn Pro Ala Ser Ser Ile Asp Pro Asp115 120 125ttt cac aat ggt aaa cac caa agt ttc ttt gct tgg tat ttt cat ttt432Phe His Asn Gly Lys His Gln Ser Phe Phe Ala Trp Tyr Phe His Phe130 135 140atg aaa ggt tac tgg agt tgg ggg caa ata att gcg ttg act att att480Met Lys Gly Tyr Trp Ser Trp Gly Gln Ile Ile Ala Leu Thr Ile Ile145 150 155 160tat aac ttt gct aaa tac ata ctc cat atc cca agt gat aat cta act528Tyr Asn Phe Ala Lys Tyr Ile Leu His Ile Pro Ser Asp Asn Leu Thr165 170 175tac ttt tgg gtg cta ccc tcg ctt tta agt tca tta caa tta ttc tat576Tyr Phe Trp Val Leu Pro Ser Leu Leu Ser Ser Leu Gln Leu Phe Tyr180 185 190ttt ggt act ttt tta ccc cat agt gaa cca ata ggg ggt tat gtt cag624Phe Gly Thr Phe Leu Pro His Ser Glu Pro Ile Gly Gly Tyr Val Gln195 200 205cct cat tgt gcc caa aca att agc cgt cct att tgg tgg tca ttt atc672Pro His Cys Ala Gln Thr Ile Ser Arg Pro Ile Trp Trp Ser Phe Ile210 215 220acg tgc tat cat ttt ggc tac cac gag gaa cat cac gaa tat cct cat720Thr Cys Tyr His Phe Gly Tyr His Glu Glu His His Glu Tyr Pro His225 230 235 240att tct tgg tgg cag tta cca gaa att tac aaa gca aaa tag762Ile Ser Trp Trp Gln Leu Pro Glu Ile Tyr Lys Ala Lys245 250
<210>84<211>253<212>PRT<213>点形念珠藻<400>84Val Ile Gln Leu Glu Gln Pro Leu Ser His Gln Ala Lys Leu Thr Pro1 5 10 15Val Leu Arg Ser Lys Ser Gln Phe Lys Gly Leu Phe Ile Ala Ile Val20 25 30Ile Val Ser Ala Trp Val Ile Ser Leu Ser Leu Leu Leu Ser Leu Asp35 40 45Ile Ser Lys Leu Lys Phe Trp Met Leu Leu Pro Val Ile Leu Trp Gln50 55 60Thr Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe Ile Thr Ser His Asp Ala Met His65 70 75 80Gly Val Val Phe Pro Gln Asn Thr Lys Ile Asn His Leu Ile Gly Thr85 90 95Leu Thr Leu Ser Leu Tyr Gly Leu Leu Pro Tyr Gln Lys Leu Leu Lys100 105 110Lys His Trp Leu His His His Asn Pro Ala Ser Ser Ile Asp Pro Asp115 120 125Phe His Asn Gly Lys His Gln Ser Phe Phe Ala Trp Tyr Phe His Phe130 135 140
Met Lys Gly Tyr Trp Ser Trp Gly Gln Ile Ile Ala Leu Thr Ile Ile145 150 155 160Tyr Asn Phe Ala Lys Tyr Ile Leu His Ile Pro Ser Asp Asn Leu Thr165 170 175Tyr Phe Trp Val Leu Pro Ser Leu Leu Ser Ser Leu Gln Leu Phe Tyr180 185 190Phe Gly Thr Phe Leu Pro His Ser Glu Pro Ile Gly Gly Tyr Val Gln195 200 205Pro His Cys Ala Gln Thr Ile Ser Arg Pro Ile Trp Trp Ser Phe Ile210 215 220Thr Cys Tyr His Phe Gly Tyr His Glu Glu His His Glu Tyr Pro His225 230 235 240Ile Ser Trp Trp Gln Leu Pro Glu Ile Tyr Lys Ala Lys245 250<210>85<211>804<212>DNA<213>聚球藻(synechococcus)WH8102<220>
<221>CDS<222>(1)..(804)<223>
<400>85atg aaa acg aca aga tct att tcg tgg cca tcg act tgc tgg cat cac48Met Lys Thr Thr Arg Ser Ile Ser Trp Pro Ser Thr Cys Trp His His1 5 10 15cag ccg agt tgc tca agc tgg gtg gca aat gag ttc agc cct cag gcc96Gln Pro Ser Cys Ser Ser Trp Val Ala Asn Glu Phe Ser Pro Gln Ala20 25 30ctc aaa ggg ttg gct ctg gct ggt ctg att gga tca gcc tgg ctg ctc144Leu Lys Gly Leu Ala Leu Ala Gly Leu Ile Gly Ser Ala Trp Leu Leu35 40 45tcc ctg ggc ctg agc tac acc ctg cca ctt gat cag acg cct ggg ctg192Ser Leu Gly Leu Ser Tyr Thr Leu Pro Leu Asp Gln Thr Pro Gly Leu50 55 60ttg att ggc agc ttg att ctg ctc aga gca ttt ctg cac acc ggg ctg240Leu Ile Gly Ser Leu Ile Leu Leu Arg Ala Phe Leu His Thr Gly Leu65 70 75 80ttc atc gtt gcc cac gat tcc atg cac gcc agt ctg gtt ccg ggt cat288Phe Ile Val Ala His Asp Ser Met His Ala Ser Leu Val Pro Gly His85 90 95ccc gga ttg aac cgc tgg atc ggc aaa gtg tat ttg ttg gtg tat gca336Pro Gly Leu Asn Arg Trp Ile Gly Lys Val Tyr Leu Leu Val Tyr Ala100 105 110ggc ttg tct tat gag cgt tgt tcc cgc aac cac aga cgt cat cac ctg384Gly Leu Ser Tyr Glu Arg Cys Ser Arg Asn His Arg Arg His His Leu115 120 125gca ccg gag acg ttc cag gat cct gac tac caa cgt tgc acc aat aac432Ala Pro Glu Thr Phe Gln Asp Pro Asp Tyr Gln Arg Cys Thr Asn Asn130 135 140aac atc cta gat tgg tat gtt cac ttc atg ggc aac tat ctg ggc atg480Asn Ile Leu Asp Trp Tyr Val His Phe Met Gly Asn Tyr Leu Gly Met145 150 155 160cgg caa ctg tta aat cta agc tgt ctt tgg ctg gcg cta atc att ctc528Arg Gln Leu Leu Asn Leu Ser Cys Leu Trp Leu Ala Leu Ile Ile Leu165 170 175
aac ggt tct gat ctc cct gct cag atc atg cat ctg ctg ttg ttc agc576Asn Gly Ser Asp Leu Pro Ala Gln Ile Met His Leu Leu Leu Phe Ser180 185 190gtt ctg ccg ttg atc atc agt tcc tgt caa ttg ttt cta gtg gga acc624Val Leu Pro Leu Ile Ile Ser Ser Cys Gln Leu Phe Leu Val Gly Thr195 200 205tgg tta ccc cac cga cgt ggg gcc acg aca cga ccg ggc gtg aca acg672Trp Leu Pro His Arg Arg Gly Ala Thr Thr Arg Pro Gly Val Thr Thr210 215 220cgc agc ctg gct ttg cat cca gcc ctc tct ttc gca gct tgt tac aac720Arg Ser Leu Ala Leu His Pro Ala Leu Ser Phe Ala Ala Cys Tyr Asn225 230 235 240ttt ggc tat cat cgt gaa cat cat gaa tcg cct tcc aca ccc tgg ttt768Phe Gly Tyr His Arg Glu His His Glu Ser Pro Ser Thr Pro Trp Phe245 250 255cag ctg cca caa ctt cga aat gaa tca ttc act tga804Gln Leu Pro Gln Leu Arg Asn Glu Ser Phe Thr260 265<210>86<211>267<212>PRT<213>聚球藻WH8102<400>86Met Lys Thr Thr Arg Ser Ile Ser Trp Pro Ser Thr Cys Trp His His1 5 10 15Gln Pro Ser Cys Ser Ser Trp Val Ala Asn Glu Phe Ser Pro Gln Ala20 25 30Leu Lys Gly Leu Ala Leu Ala Gly Leu Ile Gly Ser Ala Trp Leu Leu35 40 45
Ser Leu Gly Leu Ser Tyr Thr Leu Pro Leu Asp Gln Thr Pro Gly Leu50 55 60Leu Ile Gly Ser Leu Ile Leu Leu Arg Ala Phe Leu His Thr Gly Leu65 70 75 80Phe Ile Val Ala His Asp Ser Met His Ala Ser Leu Val Pro Gly His85 90 95Pro Gly Leu Asn Arg Trp Ile Gly Lys Val Tyr Leu Leu Val Tyr Ala100 105 110Gly Leu Ser Tyr Glu Arg Cys Ser Arg Asn His Arg Arg His His Leu115 120 125Ala Pro Glu Thr Phe Gln Asp Pro Asp Tyr Gln Arg Cys Thr Asn Asn130 135 140Asn Ile Leu Asp Trp Tyr Val His Phe Met Gly Asn Tyr Leu Gly Met145 150 155 160Arg Gln Leu Leu Asn Leu Ser Cys Leu Trp Leu Ala Leu Ile Ile Leu165 170 175Asn Gly Ser Asp Leu Pro Ala Gln Ile Met His Leu Leu Leu Phe Ser180 185 190Val Leu Pro Leu Ile Ile Ser Ser Cys Gln Leu Phe Leu Val Gly Thr195 200 205Trp Leu Pro His Arg Arg Gly Ala Thr Thr Arg Pro Gly Val Thr Thr210 215 220Arg Ser Leu Ala Leu His Pro Ala Leu Ser Phe Ala Ala Cys Tyr Asn225 230 235 240
Phe Gly Tyr His Arg Glu His His Glu Ser Pro Ser Thr Pro Trp Phe245 250 255Gln Leu Pro Gln Leu Arg Asn Glu Ser Phe Thr260 265<210>87<211>33<212>DNA<213>合成序列<220>
<221>引物_结合<222>(1)..(33)<223>
<400>87gcatgctcta gaccttataa agatattttg tga 33<210>88<211>33<212>DNA<213>合成序列<220>
<221>引物_结合<222>(1)..(33)<223>
<400>88gcatgcatct agaaatggtt cagtgtcaac cat 33<210>89<211>805<212>DNA<213>念珠藻PCC7120株<220>
<221>变异<222>(1)..(805)<223>
<400>89gcatgcatct agaaatggtt cagtgtcaac catcatctct gcattcagaa aaactggtgt 60tattgtcatc gacaatcaga gatgataaaa atattaataa gggtatattt attgcctgct120ttatcttatt tttatgggca attagtttaa tcttattact ctcaatagat acatccataa180ttcataagag cttattaggt atagccatgc tttggcagac cttcttatat acaggtttat240ttattactgc tcatgatgcc atgcacggcg tagtttatcc caaaaatccc agaataaata300attttatagg taagctcact ctaatcttgt atggactact cccttataaa gatttattga360aaaaacattg gttacaccac ggacatcctg gtactgattt agaccctgat tattacaatg420
gtcatcccca aaacttcttt ctttggtatc tacattttat gaagtcttat tggcgatgga480cgcaaatttt cggattagtg atgatttttc atggacttaa aaatctggtg catataccag540aaaataattt aattatattt tggatgatac cttctatttt aagttcagta caactatttt600attttggtac atttttgcct cataaaaagc tagaaggtgg ttatactaac ccccattgtg660cgcgcagtat cccattacct cttttttggt cttttgttac ttgttatcac ttcggctacc720acaaggaaca tcacgaatac cctcaacttc cttggtggaa attacctgaa gctcacaaaa780tatctttata aggtctagag catgc 805<210>90<211>35<212>DNA<213>合成序列<220>
<221>引物_结合<222>(1)..(35)<223>
<400>90gagctcttca ttatttcgat tttgatttcg tgacc 35<210>91<211>44<212>DNA<213>合成序列
<220>
<221>引物_结合<222>(1)..(44)<223>
<400>91aagcttgagc tcggttgatc agaagaagaa gaagaagatg aact 44<210>92<211>653<212>DNA<213>拟南芥菜<220>
<221>启动子<222>(1)..(653)<223>
<400>92gagctcttca ttatttcgat tttgatttcg tgaccagcga acgcagaata ccttgttgtg 60taatacttta cccgtgtaaa tcaaaaacaa aaaggctttt gagctttttg tagttgaatt120tctctggctg atcttttctg tacagattca tatatctgca gagacgatat cattgattat180ttgagcttct tttgaactat ttcgtgtaat ttgggatgag agctctatgt atgtgtgtaa240actttgaaga caacaagaaa ggtaacaagt gagggaggga tgactccatg tcaaaataga300
tgtcataaga ggcccatcaa taagtgcttg agcccattag ctagcccagt aactaccaga360ttgtgagatg gatgtgtgaa cagttttttt tttgatgtag gactgaaatg tgaacaacag420gcgcatgaaa ggctaaatta ggacaatgat aagcagaaat aacttatcct ctctaacact480tggcctcaca ttgcccttca cacaatccac acacatccaa tcacaacctc atcatatatc540tcccgctaat ctttttttct ttgatctttt tttttttgct tattattttt ttgactttga600tctcccatca gttcatcttc ttcttcttct tctgatcaac cgagctcaag ctt 653<210>93<211>28<212>DNA<213>合成序列<220>
<221>引物_结合<222>(1)..(28)<223>
<400>93gagctcactc actgatttcc attgcttg 28<210>94<211>30<212>DNA<213>合成序列
<220>
<221>引物_结合<222>(1)..(30)<223>
<400>94aagcttgagc tctttgttga agagatttgg30<210>95<211>37<212>DNA<213>合成序列<220>
<221>引物_结合<222>(1)..(37)<223>
<400>95cgccgttaag tcgatgtccg ttgatttaaa cagtgtc37<210>96<211>34<212>DNA<213>合成序列
<220>
<221>引物_结合<222>(1)..(34)<223>
<400>96atcaacggac atcgacttaa cggcgtttgt aaac 34<210>97<211>831<212>DNA<213>雨生红球藻<220>
<221>CDS<222>(1)..(831)<223>
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Thr Ala Arg Ala Val Val Ser Gly Val His Ile Leu Thr Thr Ala Asn275 280 285Ala Leu Pro Ala Glu Tyr Val Pro Ser Ala Ala Arg Asn Val Arg Val290 295 300Gly Asn Gly Phe Gly Met Ile Leu Arg Leu Ala Leu Ser Glu Lys Val305 310 315 320Lys Tyr Arg His His Thr Glu Pro Asp Ser Arg Ile Gly Leu Gly Leu325 330 335Leu Ile Lys Asn Glu Arg Gln Ile Met Gln Gly Tyr Gly Glu Tyr Leu340 345 350Ala Gly Gln Pro Thr Thr Asp Pro Pro Leu Val Ala Met Ser Phe Ser355 360 365Ala Val Asp Asp Ser Leu Ala Pro Pro Asn Gly Asp Val Leu Trp Leu370 375 380Trp Ala Gln Tyr Tyr Pro Phe Glu Leu Ala Thr Gly Ser Trp Glu Thr385 390 395 400Arg Thr Ala Glu Ala Arg Glu Asn Ile Leu Arg Ala Phe Glu His Tyr405 410 415Ala Pro Gly Thr Arg Asp Thr Ile Val Gly Glu Leu Val Gln Thr Pro420 425 430Gln Trp Leu Glu Thr Asn Leu Gly Leu His Arg Gly Asn Val Met His435 440 445Leu Glu Met Ser Phe Asp Gln Met Phe Ser Phe Arg Pro Trp Leu Lys450 455 460
Ala Ser Gln Tyr Arg Trp Pro Gly Val Gln Gly Leu Tyr Leu Thr Gly465 470 475 480Ala Ser Thr His Pro Gly Gly Gly Ile Met Gly Ala Ser Gly Arg Asn485 490 495Ala Ala Arg Val Ile Val Lys Asp Leu Thr Arg Arg Arg Trp Lys500 505 510<210>107<211>1666<212>DNA<213>食用番茄(Lycopersicon esculentum)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1494)<223>
<400>107atg gaa gct ctt ctc aag cct ttt cca tct ctt tta ctt tcc tct cct 48Met Glu Ala Leu Leu Lys Pro Phe Pro Ser Leu Leu Leu Ser Ser Pro1 5 10 15aca ccc cat agg tct att ttc caa caa aat ccc tct ttt cta agt ccc 96Thr Pro His Arg Ser Ile Phe Gln Gln Asn Pro Ser Phe Leu Ser Pro20 25 30acc acc aaa aaa aaa tca aga aaa tgt ctt ctt aga aac aaa agt agt144Thr Thr Lys Lys Lys Ser Arg Lys Cys Leu Leu Arg Asn Lys Ser Ser35 40 45aaa ctt ttt tgt agc ttt ctt gat tta gca ccc aca tca aag cca gag192Lys Leu Phe Cys Ser Phe Leu Asp Leu Ala Pro Thr Ser Lys Pro Glu
50 55 60tct tta gat gtt aac atc tca tgg gtt gat cct aat tcg aat cgg gct240Ser Leu Asp Val Asn Ile Ser Trp Val Asp Pro Asn Ser Asn Arg Ala65 70 75 80caa ttc gac gtg atc att atc gga gct ggc cct gct ggg ctc agg cta288Gln Phe Asp Val Ile Ile Ile Gly Ala Gly Pro Ala Gly Leu Arg Leu85 90 95gct gaa caa gtt tct aaa tat ggt att aag gta tgt tgt gtt gac cct336Ala Glu Gln Val Ser Lys Tyr Gly Ile Lys Val Cys Cys Val Asp Pro100 105 110tca cca ctc tcc atg tgg cca aat aat tat ggt gtt tgg gtt gat gag384Ser Pro Leu Ser Met Trp Pro Asn Asn Tyr Gly Val Trp Val Asp Glu115 120 125ttt gag aat tta gga ctg gaa aat tgt tta gat cat aaa tgg cct atg432Phe Glu Asn Leu Gly Leu Glu Asn Cys Leu Asp His Lys Trp Pro Met130 135 140act tgt gtg cat ata aat gat aac aaa act aag tat ttg gga aga cca480Thr Cys Val His Ile Asn Asp Asn Lys Thr Lys Tyr Leu Gly Arg Pro145 150 155 160tat ggt aga gtt agt aga aag aag ctg aag ttg aaa ttg ttg aat agt528Tyr Gly Arg Val Ser Arg Lys Lys Leu Lys Leu Lys Leu Leu Asn Ser165 170 175tgt gtt gag aac aga gtg aag ttt tat aaa gct aag gtt tgg aaa gtg576Cys Val Glu Asn Arg Val Lys Phe Tyr Lys Ala Lys Val Trp Lys Val180 185 190gaa cat gaa gaa ttt gag tct tca att gtt tgt gat gat ggt aag aag624Glu His Glu Glu Phe Glu Ser Ser Ile Val Cys Asp Asp Gly Lys Lys195 200 205ata aga ggt agt ttg gtt gtg gat gca agt ggt ttt gct agt gat ttt672Ile Arg Gly Ser Leu Val Val Asp Ala Ser Gly Phe Ala Ser Asp Phe210 215 220ata gag tat gac agg cca aga aac cat ggt tat caa att gct cat ggg720Ile Glu Tyr Asp Arg Pro Arg Asn His Gly Tyr Gln Ile Ala His Gly225 230 235 240gtt tta gta gaa gtt gat aat cat cca ttt gat ttg gat aaa atg gtg768Val Leu Val Glu Val Asp Asn His Pro Phe Asp Leu Asp Lys Met Val
245 250 255ctt atg gat tgg agg gat tct cat ttg ggt aat gag cca tat tta agg 816Leu Met Asp Trp Arg Asp Ser His Leu Gly Asn Glu Pro Tyr Leu Arg260 265 270gtg aat aat gct aaa gaa cca aca ttc ttg tat gca atg cca ttt gat 864Val Asn Asn Ala Lys Glu Pro Thr Phe Leu Tyr Ala Met Pro Phe Asp275 280 285aga gat ttg gtt ttc ttg gaa gag act tct ttg gtg agt cgt cct gtt 912Arg Asp Leu Val Phe Leu Glu Glu Thr Ser Leu Val Ser Arg Pro Val290 295 300tta tcg tat atg gaa gta aaa aga agg atg gtg gca aga tta agg cat 960Leu Ser Tyr Met Glu Val Lys Arg Arg Met Val Ala Arg Leu Arg His305 310 315 320ttg ggg atc aaa gtg aaa agt gtt att gag gaa gag aaa tgt gtg atc1008Leu Gly Ile Lys Val Lys Ser Val Ile Glu Glu Glu Lys Cys Val Ile325 330 335cct atg gga gga cca ctt ccg cgg att cct caa aat gtt atg gct att1056Pro Met Gly Gly Pro Leu Pro Arg Ile Pro Gln Asn Val Met Ala Ile340 345 350ggt ggg aat tca ggg ata gtt cat cca tca aca ggg tac atg gtg gct1104Gly Gly Asn Ser Gly Ile Val His Pro Ser Thr Gly Tyr Met Val Ala355 360 365agg agc atg gct tta gca cca gta cta gct gaa gcc atc gtc gag ggg1152Arg Ser Met Ala Leu Ala Pro Val Leu Ala Glu Ala Ile Val Glu Gly370 375 380ctt ggc tca aca aga atg ata aga ggg tct caa ctt tac cat aga gtt1200Leu Gly Ser Thr Arg Met Ile Arg Gly Ser Gln Leu Tyr His Arg Val385 390 395 400tgg aat ggt ttg tgg cct ttg gat aga aga tgt gtt aga gaa tgt tat1248Trp Asn Gly Leu Trp Pro Leu Asp Arg Arg Cys Val Arg Glu Cys Tyr405 410 415tca ttt ggg atg gag aca ttg ttg aag ctt gat ttg aaa ggg act agg1296Ser Phe Gly Met Glu Thr Leu Leu Lys Leu Asp Leu Lys Gly Thr Arg420 425 430aga ttg ttt gac gct ttc ttt gat ctt gat cct aaa tac tgg caa ggg1344Arg Leu Phe Asp Ala Phe Phe Asp Leu Asp Pro Lys Tyr Trp Gln Gly
435 440 445ttc ctt tct tca aga ttg tct gtc aaa gaa ctt ggt tta ctc agc ttg 1392Phe Leu Ser Ser Arg Leu Ser Val Lys Glu Leu Gly Leu Leu Ser Leu450 455 460tgt ctt ttc gga cat ggc tca aac atg act agg ttg gat att gtt aca 1440Cys Leu Phe Gly His Gly Ser Asn Met Thr Arg Leu Asp Ile Val Thr465 470 475 480aaa tgt cct ctt cct ttg gtt aga ctg att ggc aat cta gca ata gag 1488Lys Cys Pro Leu Pro Leu Val Arg Leu Ile Gly Asn Leu Ala Ile Glu485 490 495agc ctt tgaatgtgaa aagtttgaat cattttcttc attttaattt ctttgattat 1544Ser Leutttcatattt tctcaattgc aaaagtgaga taagagctac atactgtcaa caaataaact1604actattggaa agttaaaata tgtgtttgtt gtatgttatt ctaatggaat ggattttgta1664aa 1666<210>108<211>498<212>PRT<213>食用番茄<400>108Met Glu Ala Leu Leu Lys Pro Phe Pro Ser Leu Leu Leu Ser Ser Pro1 5 10 15Thr Pro His Arg Ser Ile Phe Gln Gln Asn Pro Ser Phe Leu Ser Pro20 25 30Thr Thr Lys Lys Lys Ser Arg Lys Cys Leu Leu Arg Asn Lys Ser Ser35 40 45
Lys Leu Phe Cys Ser Phe Leu Asp Leu Ala Pro Thr Ser Lys Pro Glu50 55 60Ser Leu Asp Val Asn Ile Ser Trp Val Asp Pro Asn Ser Asn Arg Ala65 70 75 80Gln Phe Asp Val Ile Ile Ile Gly Ala Gly Pro Ala Gly Leu Arg Leu85 90 95Ala Glu Gln Val Ser Lys Tyr Gly Ile Lys Val Cys Cys Val Asp Pro100 105 110Ser Pro Leu Ser Met Trp Pro Asn Asn Tyr Gly Val Trp Val Asp Glu115 120 125Phe Glu Asn Leu Gly Leu Glu Asn Cys Leu Asp His Lys Trp Pro Met130 135 140Thr Cys Val His Ile Asn Asp Asn Lys Thr Lys Tyr Leu Gly Arg Pro145 150 155 160Tyr Gly Arg Val Ser Arg Lys Lys Leu Lys Leu Lys Leu Leu Asn Ser165 170 175Cys Val Glu Asn Arg Val Lys Phe Tyr Lys Ala Lys Val Trp Lys Val180 185 190Glu His Glu Glu Phe Glu Ser Ser Ile Val Cys Asp Asp Gly Lys Lys195 200 205Ile Arg Gly Ser Leu Val Val Asp Ala Ser Gly Phe Ala Ser Asp Phe210 215 220Ile Glu Tyr Asp Arg Pro Arg Asn His Gly Tyr Gln Ile Ala His Gly225 230 235 240
Val Leu Val Glu Val Asp Asn His Pro Phe Asp Leu Asp Lys Met Val245 250 255Leu Met Asp Trp Arg Asp Ser His Leu Gly Asn Glu Pro Tyr Leu Arg260 265 270Val Asn Asn Ala Lys Glu Pro Thr Phe Leu Tyr Ala Met Pro Phe Asp275 280 285Arg Asp Leu Val Phe Leu Glu Glu Thr Ser Leu Val Ser Arg Pro Val290 295 300Leu Ser Tyr Met Glu Val Lys Arg Arg Met Val Ala Arg Leu Arg His305 310 315 320Leu Gly Ile Lys Val Lys Ser Val Ile Glu Glu Glu Lys Cys Val Ile325 330 335Pro Met Gly Gly Pro Leu Pro Arg Ile Pro Gln Asn Val Met Ala Ile340 345 350Gly Gly Asn Ser Gly Ile Val His Pro Ser Thr Gly Tyr Met Val Ala355 360 365Arg Ser Met Ala Leu Ala Pro Val Leu Ala Glu Ala Ile Val Glu Gly370 375 380Leu Gly Ser Thr Arg Met Ile Arg Gly Ser Gln Leu Tyr His Arg Val385 390 395 400Trp Asn Gly Leu Trp Pro Leu Asp Arg Arg Cys Val Arg Glu Cys Tyr405 410 415Ser Phe Gly Met Glu Thr Leu Leu Lys Leu Asp Leu Lys Gly Thr Arg420 425 430
Arg Leu Phe Asp Ala Phe Phe Asp Leu Asp Pro Lys Tyr Trp Gln Gly435 440 445Phe Leu Ser Ser Arg Leu Ser Val Lys Glu Leu Gly Leu Leu Ser Leu450 455 460Cys Leu Phe Gly His Gly Ser Asn Met Thr Arg Leu Asp Ile Val Thr465 470 475 480Lys Cys Pro Leu Pro Leu Val Arg Leu Ile Gly Asn Leu Ala Ile Glu485 490 495Ser Leu<210>109<211>1125<212>DNA<213>食用番茄<220>
<221>CDS<222>(20)..(946)<223>
<400>109ttggtcatct ccacaatca atg gct gcc gcc gcc aga atc tcc gcc tcc tct52Met Ala Ala Ala Ala Arg Ile Ser Ala Ser Ser1 5 10
acc tca cga act ttt tat ttc cgt cat tca ccg ttt ctt ggc cca aaa100Thr Ser Arg Thr Phe Tyr Phe Arg His Ser Pro Phe Leu Gly Pro Lys15 20 25cct act tcg aca acc tca cat gtt tct cca atc tct cct ttt tct ctt148Pro Thr Ser Thr Thr Ser His Val Ser Pro Ile Ser Pro Phe Ser Leu30 35 40aat cta ggc cca att ttg agg tct aga aga aaa ccc agt ttc act gtt196Asn Leu Gly Pro Ile Leu Arg Ser Arg Arg Lys Pro Ser Phe Thr Val45 50 55tgc ttt gtt ctc gag gat gag aag ctg aaa cct caa ttt gac gat gag244Cys Phe Val Leu Glu Asp Glu Lys Leu Lys Pro Gln Phe Asp Asp Glu60 65 70 75gct gag gat ttt gaa aag aag att gag gaa cag atc tta gct act cgc292Ala Glu Asp Phe Glu Lys Lys Ile Glu Glu Gln Ile Leu Ala Thr Arg80 85 90ttg gcg gag aaa ctg gct agg aag aaa tcg gag agg ttt act tat ctt340Leu Ala Glu Lys Leu Ala Arg Lys Lys Ser Glu Arg Phe Thr Tyr Leu95 100 105gtg gct gct ata atg tct agt ttt ggg att act tct atg gct gtt atg388Val Ala Ala Ile Met Ser Ser Phe Gly Ile Thr Ser Met Ala Val Met110 115 120gct gtt tat tac aga ttt tcg tgg caa atg gag gga gga gaa gtt cct436Ala Val Tyr Tyr Arg Phe Ser Trp Gln Met Glu Gly Gly Glu Val Pro125 130 135gta acc gaa atg ttg ggt aca ttt gct ctc tct gtt ggt gct gct gta484Val Thr Glu Met Leu Gly Thr Phe Ala Leu Ser Val Gly Ala Ala Val140 145 150 155gga atg gag ttt tgg gcg aga tgg gca cac aaa gca ctg tgg cat gct532Gly Met Glu Phe Trp Ala Arg Trp Ala His Lys Ala Leu Trp His Ala160 165 170tca cta tgg cac atg cat gag tca cac cac aaa cca aga gaa gga cct580Ser Leu Trp His Met His Glu Ser His His Lys Pro Arg Glu Gly Pro175 180 185ttt gag ctg aac gac gtt ttc gcc ata aca aac gct gtt cca gca ata628Phe Glu Leu Asn Asp Val Phe Ala Ile Thr Asn Ala Val Pro Ala Ile190 195 200
gcc ctc ctc aac tat ggt ttc ttc cat aaa ggc ctc att gcc gga cta676Ala Leu Leu Asn Tyr Gly Phe Phe His Lys Gly Leu Ile Ala Gly Leu205 210 215tgc ttc ggt gct ggg cta ggg atc aca gta ttt gga atg gca tac atg724Cys Phe Gly Ala Gly Leu Gly Ile Thr Val Phe Gly Met Ala Tyr Met220 225 230 235ttt gtt cac gat ggt ttg gtt cac aag aga ttc cca gtt gga cct gta772Phe Val His Asp Gly Leu Val His Lys Arg Phe Pro Val Gly Pro Val240 245 250gcc aat gta cct tat ctt agg aag gtg gct gct gct cat tcg ctt cat820Ala Asn Val Pro Tyr Leu Arg Lys Val Ala Ala Ala His Ser Leu His255 260 265cac tca gag aag ttc aat ggt gtc cca tat ggc ttg ttc ttc gga cct868His Ser Glu Lys Phe Asn Gly Val Pro Tyr Gly Leu Phe Phe Gly Pro270 275 280aag gaa ctg gaa gaa gta gga ggg acg gaa gag ttg gaa aag gaa gtg916Lys Glu Leu Glu Glu Val Gly Gly Thr Glu Glu Leu Glu Lys Glu Val285 290 295ata cga agg acg aga ctt tcg aaa gga tca tgaacgattg ttcataaaca 966Ile Arg Arg Thr Arg Leu Ser Lys Gly Ser300 305tagaatgtca ttttacactt cttatcaatg aggaagggtg atttttgatg tatttgatag 1026tagagaaaaa tgtagctctc ttgatgaaat gaatttgtat ttatgtaggc tcttcttatt 1086cagtaagatt ttttcttttt tttgatctcg tgccgaatt 1125<210>110<211>309<212>PRT<213>食用番茄<400>110
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Glu Pro Ile Val Thr Glu Ser Leu Pro Glu Glu Asp Glu Glu Ile Val165 170 175aaa tcg gtt atc gac gga gtt att cca tcg tac tcg ctt gaa tct cgt 576Lys Ser Val Ile Asp Gly Val Ile Pro Ser Tyr Ser Leu Glu Ser Arg180 185 190ctc ggt gat tgc aaa aga gcg gcg tcg att cgt cgt gag gcg ttg cag 624Leu Gly Asp Cys Lys Arg Ala Ala Ser Ile Arg Arg Glu Ala Leu Gln195 200 205aga gtc acc ggg aga tcg att gaa ggg tta ccg ttg gat gga ttt gat 672Arg Val Thr Gly Arg Ser Ile Glu Gly Leu Pro Leu Asp Gly Phe Asp210 215 220tat gaa tcg att ttg ggg caa tgc tgt gag atg cct gtt gga tac att 720Tyr Glu Ser Ile Leu Gly Gln Cys Cys Glu Met Pro Val Gly Tyr Ile225 230 235 240cag att cct gtt ggg att gct ggt cca ttg ttg ctt gat ggt tat gag 768Gln Ile Pro Val Gly Ile Ala Gly Pro Leu Leu Leu Asp Gly Tyr Glu245 250 255tac tct gtt cct atg gct aca acc gaa ggt tgt ttg gtt gct agc act 816Tyr Ser Val Pro Met Ala Thr Thr Glu Gly Cys Leu Val Ala Ser Thr260 265 270aac aga ggc tgc aag gct atg ttt atc tct ggt ggc gcc acc agt acc 864Asn Arg Gly Cys Lys Ala Met Phe Ile Ser Gly Gly Ala Thr Ser Thr275 280 285gtt ctt aag gac ggt atg acc cga gca cct gtt gtt cgg ttc gct tcg 912Val Leu Lys Asp Gly Met Thr Arg Ala Pro Val Val Arg Phe Ala Ser290 295 300gcg aga cga gct tcg gag ctt aag ttt ttc ttg gag aat cca gag aac 960Ala Arg Arg Ala Ser Glu Leu Lys Phe Phe Leu Glu Asn Pro Glu Asn305 310 315 320ttt gat act ttg gca gta gtc ttc aac agg tcg agt aga ttt gca aga1008Phe Asp Thr Leu Ala Val Val Phe Asn Arg Ser Ser Arg Phe Ala Arg325 330 335ctg caa agt gtt aaa tgc aca atc gcg ggg aag aat gct tat gta agg1056Leu Gln Ser Val Lys Cys Thr Ile Ala Gly Lys Asn Ala Tyr Val Arg340 345 350ttc tgt tgt agt act ggt gat gct atg ggg atg aat atg gtt tct aaa1104
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<223>
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gtt acc gga ata gta ggt tgt gcg gga cta aag cct acg gtt gct gca 576Val Thr Gly Ile Val Gly Cys Ala Gly Leu Lys Pro Thr Val Ala Ala180 185 190att gaa gca gga aag gac att gct ctt gca aac aaa gag aca tta atc 624Ile Glu Ala Gly Lys Asp Ile Ala Leu Ala Asn Lys Glu Thr Leu Ile195 200 205gca ggt ggt cct ttc gtg ctt ccg ctt gcc aac aaa cat aat gta aag 672Ala Gly Gly Pro Phe Val Leu Pro Leu Ala Asn Lys His Asn Val Lys210 215 220att ctt ccg gca gat tca gaa cat tct gcc ata ttt cag tgt att caa 720Ile Leu Pro Ala Asp Ser Glu His Ser Ala Ile Phe Gln Cys Ile Gln225 230 235 240ggt ttg cct gaa ggc gct ctg cgc aag ata atc ttg act gca tct ggt 768Gly Leu Pro Glu Gly Ala Leu Arg Lys Ile Ile Leu Thr Ala Ser Gly245 250 255gga gct ttt agg gat tgg cct gtc gaa aag cta aag gaa gtt aaa gta 816Gly Ala Phe Arg Asp Trp Pro Val Glu Lys Leu Lys Glu Val Lys Val260 265 270gcg gat gcg ttg aag cat cca aac tgg aac atg gga aag aaa atc act 864Ala Asp Ala Leu Lys His Pro Asn Trp Asn Met Gly Lys Lys Ile Thr275 280 285gtg gac tct gct acg ctt ttc aac aag ggt ctt gag gtc att gaa gcg 912Val Asp Ser Ala Thr Leu Phe Asn Lys Gly Leu Glu Val Ile Glu Ala290 295 300cat tat ttg ttt gga gct gag tat gac gat ata gag att gtc att cat 960His Tyr Leu Phe Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Ile Glu Ile Val Ile His305 310 315 320ccg caa agt atc ata cat tcc atg att gaa aca cag gat tca tct gtg1008Pro Gln Ser Ile Ile His Ser Met Ile Glu Thr Gln Asp Ser Ser Val325 330 335ctt gct caa ttg ggt tgg cct gat atg cgt tta ccg att ctc tac acc1056Leu Ala Gln Leu Gly Trp Pro Asp Met Arg Leu Pro Ile Leu Tyr Thr340 345 350atg tca tgg ccc gat aga gtt cct tgt tct gaa gta act tgg cca aga1104Met Ser Trp Pro Asp Arg Val Pro Cys Ser Glu Val Thr Trp Pro Arg355 360 365
ctt gac ctt tgc aaa ctc ggt tca ttg act ttc aag aaa cca gac aat1152Leu Asp Leu Cys Lys Leu Gly Ser Leu Thr Phe Lys Lys Pro Asp Asn370 375 380gtg aaa tac cca tcc atg gat ctt gct tat gct gct gga cga gct gga1200Val Lys Tyr Pro Ser Met Asp Leu Ala Tyr Ala Ala Gly Arg Ala Gly385 390 395 400ggc aca atg act gga gtt ctc agc gcc gcc aat gag aaa gct gtt gaa1248Gly Thr Met Thr Gly Val Leu Ser Ala Ala Asn Glu Lys Ala Val Glu405 410 415atg ttc att gat gaa aag ata agc tat ttg gat atc ttc aag gtt gtg1296Met Phe Ile Asp Glu Lys Ile Ser Tyr Leu Asp Ile Phe Lys Val Val420 425 430gaa tta aca tgc gat aaa cat cga aac gag ttg gta aca tca ccg tct1344Glu Leu Thr Cys Asp Lys His Arg Asn Glu Leu Val Thr Ser Pro Ser435 440 445ctt gaa gag att gtt cac tat gac ttg tgg gca cgt gaa tat gcc gcg1392Leu Glu Glu Ile Val His Tyr Asp Leu Trp Ala Arg Glu Tyr Ala Ala450 455 460aat gtg cag ctt tct tct ggt gct agg cca gtt cat gca tga1434Asn Val Gln Leu Ser Ser Gly Ala Arg Pro Val His Ala465 470 475<210>118<211>477<212>PRT<213>拟南芥菜<400>118Met Met Thr Leu Asn Ser Leu Ser Pro Ala Glu Ser Lys Ala Ile Ser1 5 10 15Phe Leu Asp Thr Ser Arg Phe Asn Pro Ile Pro Lys Leu Ser Gly Gly
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405 410 415Met Phe Ile Asp Glu Lys Ile Ser Tyr Leu Asp Ile Phe Lys Val Val420 425 430Glu Leu Thr Cys Asp Lys His Arg Asn Glu Leu Val Thr Ser Pro Ser435 440 445Leu Glu Glu Ile Val His Tyr Asp Leu Trp Ala Arg Glu Tyr Ala Ala450 455 460Asn Val Gln Leu Ser Ser Gly Ala Arg Pro Val His Ala465 470 475<210>119<211>884<212>DNA<213>巴勒斯提纳侧金盏花(Adonis palaestina)克隆ApIPI28<220>
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Met Gly Glu Val Ala Asp Ala Gly Met Asp Ala Val Gln Lys Arg Leu1 5 10 15atg ttc gac gat gaa tgt att ttg gtg gat gag aat gac aag gtc gtc275Met Phe Asp Asp Glu cys Ile Leu Val Asp Glu Asn Asp Lys Val Val20 25 30gga cat gat tcc aaa tac aac tgt cat ttg atg gaa aag ata gag gca323Gly His Asp Ser Lys Tyr Asn Cys His Leu Met Glu Lys Ile Glu Ala35 40 45gaa aac ttg ctt cac aga gcc ttc agt gtt ttc tta ttc aac tca aaa371Glu Asn Leu Leu His Arg Ala Phe Ser Val Phe Leu Phe Asn Ser Lys50 55 60tac gag ttg ctt ctt cag caa cga tct gca acg aag gta aca ttc ccg419Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Gln Arg Ser Ala Thr Lys Val Thr Phe Pro65 70 75 80ctc gta tgg aca aac acc tgt tgc agc cat ccc ctc ttc cgt gat tcc467Leu Val Trp Thr Asn Thr Cys Cys Ser His Pro Leu Phe Arg Asp Ser85 90 95gaa ctc ata gaa gaa aat ttt ctc ggg gta cga aac gct gca caa agg515Glu Leu Ile Glu Glu Asn Phe Leu Gly Val Arg Asn Ala Ala Gln Arg100 105 110aag ctt tta gac gag cta ggc att cca gct gaa gac gta cca gtt gat563Lys Leu Leu Asp Glu Leu Gly Ile Pro Ala Glu Asp Val Pro Val Asp115 120 125gaa ttc act cct ctt ggt cgc att ctt tac aaa gct cca tct gac gga611Glu Phe Thr Pro Leu Gly Arg Ile Leu Tyr Lys Ala Pro Ser Asp Gly130 135 140aaa tgg gga gag cac gaa ctg gac tat ctt ctg ttt att gtc cga gat659Lys Trp Gly Glu His Glu Leu Asp Tyr Leu Leu Phe Ile Val Arg Asp145 150 155 160gtg aaa tac gat cca aac cca gat gaa gtt gct gac gct aag tac gtt707Val Lys Tyr Asp Pro Asn Pro Asp Glu Val Ala Asp Ala Lys Tyr Val165 170 175aat cgc gag gag ttg aaa gag ata ctg aga aaa gct gat gca ggt gaa755Asn Arg Glu Glu Leu Lys Glu Ile Leu Arg Lys Ala Asp Ala Gly Glu180 185 190gag gga ata aag ttg tct cct tgg ttt aga ttg gtt gtg gat aac ttt803
Glu Gly Ile Lys Leu Ser Pro Trp Phe Arg Leu Val Val Asp Asn Phe195 200 205ttg ttc aag tgg tgg gat cat gta gag gag ggg aag att aag gac gtc851Leu Phe Lys Trp Trp Asp His Val Glu Glu Gly Lys Ile Lys Asp Val210 215 220gcc gac atg aaa act atc cac aag ttg act taa884Ala Asp Met Lys Thr Ile His Lys Leu Thr225 230<210>120<211>234<212>PRT<213>巴勒斯提纳侧金盏花克隆ApIPI28<400>120Met Gly Glu Val Ala Asp Ala Gly Met Asp Ala Val Gln Lys Arg Leu1 5 10 15Met Phe Asp Asp Glu Cys Ile Leu Val Asp Glu Asn Asp Lys Val Val20 25 30Gly His Asp Ser Lys Tyr Asn Cys His Leu Met Glu Lys Ile Glu Ala35 40 45Glu Asn Leu Leu His Arg Ala Phe Ser Val Phe Leu Phe Asn Ser Lys50 55 60Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Gln Arg Ser Ala Thr Lys Val Thr Phe Pro65 70 75 80Leu Val Trp Thr Asn Thr Cys Cys Ser His Pro Leu Phe Arg Asp Ser85 90 95
Glu Leu Ile Glu Glu Asn Phe Leu Gly Val Arg Asn Ala Ala Gln Arg100 105 110Lys Leu Leu Asp Glu Leu Gly Ile Pro Ala Glu Asp Val Pro Val Asp115 120 125Glu Phe Thr Pro Leu Gly Arg Ile Leu Tyr Lys Ala Pro Ser Asp Gly130 135 140Lys Trp Gly Glu His Glu Leu Asp Tyr Leu Leu Phe Ile Val Arg Asp145 150 155 160Val Lys Tyr Asp Pro Asn Pro Asp Glu Val Ala Asp Ala Lys Tyr Val165 170 175Asn Arg Glu Glu Leu Lys Glu Ile Leu Arg Lys Ala Asp Ala Gly Glu180 185 190Glu Gly Ile Lys Leu Ser Pro Trp Phe Arg Leu Val Val Asp Asn Phe195 200 205Leu Phe Lys Trp Trp Asp His Val Glu Glu Gly Lys Ile Lys Asp Val210 215 220Ala Asp Met Lys Thr Ile His Lys Leu Thr225 230<210>121<211>1402<212>DNA<213>拟南芥菜
<220>
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Ile Leu Leu Leu Met Ala Thr Ala Leu Asp Val Arg Val Pro Glu Ala135 140 145ttg att ggg gaa tca aca gat ata gtc aca tca gaa tta cgc gta agg 537Leu Ile Gly Glu Ser Thr Asp Ile Val Thr Ser Glu Leu Arg Val Arg150 155 160caa cgg ggt att gct gaa atc act gaa atg ata cac gtc gca agt cta 585Gln Arg Gly Ile Ala Glu Ile Thr Glu Met Ile His Val Ala Ser Leu165 170 165ctg cac gat gat gtc ttg gat gat gcc gat aca agg cgt ggt gtt ggt 633Leu His Asp Asp Val Leu Asp Asp Ala Asp Thr Arg Arg Gly Val Gly180 185 190tcc tta aat gtt gta atg ggt aac aag atg tcg gta tta gca gga gac 681Ser Leu Asn Val Val Met Gly Asn Lys Met Ser Val Leu Ala Gly Asp195 200 205 210ttc ttg ctc tcc cgg gct tgt ggg gct ctc gct gct tta aag aac aca 729Phe Leu Leu Ser Arg Ala Cys Gly Ala Leu Ala Ala Leu Lys Asn Thr215 220 225gag gtt gta gca tta ctt gca act gct gta gaa cat ctt gtt acc ggt 777Glu Val Val Ala Leu Leu Ala Thr Ala Val Glu His Leu Val Thr Gly230 235 240gaa acc atg gag ata act agt tca acc gag cag cgt tat agt atg gac 825Glu Thr Met Glu Ile Thr Ser Ser Thr Glu Gln Arg Tyr Ser Met Asp245 250 255tac tac atg cag aag aca tat tat aag aca gca tcg cta atc tct aac 873Tyr Tyr Met Gln Lys Thr Tyr Tyr Lys Thr Ala Ser Leu Ile Ser Asn260 265 270agc tgc aaa gct gtt gcc gtt ctc act gga caa aca gca gaa gtt gcc 921Ser Cys Lys Ala Val Ala Val Leu Thr Gly Gln Thr Ala Glu Val Ala275 280 285 290gtg tta gct ttt gag tat ggg agg aat ctg ggt tta gca ttc caa tta 969Val Leu Ala Phe Glu Tyr Gly Arg Asn Leu Gly Leu Ala Phe Gln Leu295 300 305ata gac gac att ctt gat ttc acg ggc aca tct gcc tct ctc gga aag1017Ile Asp Asp Ile Leu Asp Phe Thr Gly Thr Ser Ala Ser Leu Gly Lys310 315 320gga tcg ttg tca gat att cgc cat gga gtc ata aca gcc cca atc ctc1065
Gly Ser Leu Ser Asp Ile Arg His Gly Val Ile Thr Ala Pro Ile Leu325 330 335ttt gcc atg gaa gag ttt cct caa cta cgc gaa gtt gtt gat caa gtt1113Phe Ala Met Glu Glu Phe Pro Gln Leu Arg Glu Val Val Asp Gln Val340 345 350gaa aaa gat cct agg aat gtt gac att gct tta gag tat ctt ggg aag1161Glu Lys Asp Pro Arg Asn Val Asp Ile Ala Leu Glu Tyr Leu Gly Lys355 360 365 370agc aag gga ata cag agg gca aga gaa tta gcc atg gaa cat gcg aat1209Ser Lys Gly Ile Gln Arg Ala Arg Glu Leu Ala Met Glu His Ala Asn375 380 385cta gca gca gct gca atc ggg tct cta cct gaa aca gac aat gaa gat1257Leu Ala Ala Ala Ala Ile Gly Ser Leu Pro Glu Thr Asp Asn Glu Asp390 395 400gtc aaa aga tcg agg cgg gca ctt att gac ttg acc cat aga gtc atc1305Val Lys Arg Ser Arg Arg Ala Leu Ile Asp Leu Thr His Arg Val Ile405 410 415acc aga aac aag tgagattaag taatgtttct ctctatacac caaaacattc1357Thr Arg Asn Lys420ctcatttcat ttgtaggatt ttgttggtcc aattcgtttc acgaa 1402<210>122<211>422<212>PRT<213>拟南芥菜<400>122Met Leu Phe Thr Arg Ser Val Ala Arg Ile Ser Ser Lys Phe Leu Arg1 5 10 15Asn Arg Ser Phe Tyr Gly Ser Ser Gln Ser Leu Ala Ser His Arg Phe
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405 410415Val Ile Thr Arg Asn Lys420<210>123<211>1155<212>DNA<213>拟南芥菜<220>
<221>CDS<222>(1)..(1155)<223>
<400>123atg agt gtg agt tgt tgt tgt agg aat ctg ggc aag aca ata aaa aag48Met Ser Val Ser Cys Cys Cys Arg Asn Leu Gly Lys Thr Ile Lys Lys1 5 10 15gca ata cct tca cat cat ttg cat ctg aga agt ctt ggt ggg agt ctc96Ala Ile Pro Ser His His Leu His Leu Arg Ser Leu Gly Gly Ser Leu20 25 30tat cgt cgt cgt atc caa agc tct tca atg gag acc gat ctc aag tca144Tyr Arg Arg Arg Ile Gln Ser Ser Ser Met Glu Thr Asp Leu Lys Ser35 40 45acc ttt ctc aac gtt tat tct gtt ctc aag tct gac ctt ctt cat gac192Thr Phe Leu Asn Val Tyr Ser Val Leu Lys Ser Asp Leu Leu His Asp50 55 60cct tcc ttc gaa ttc acc aat gaa tct cgt ctc tgg gtt gat cgg atg240Pro Ser Phe Glu Phe Thr Asn Glu Ser Arg Leu Trp Val Asp Arg Met65 70 75 80
ctg gac tac aat gta cgt gga ggg aaa ctc aat cgg ggt ctc tct gtt288Leu Asp Tyr Asn Val Arg Gly Gly Lys Leu Asn Arg Gly Leu Ser Val85 90 95gtt gac agt ttc aaa ctt ttg aag caa ggc aat gat ttg act gag caa336Val Asp Ser Phe Lys Leu Leu Lys Gln Gly Asn Asp Leu Thr Glu Gln100 105 110gag gtt ttc ctc tct tgt gct ctc ggt tgg tgc att gaa tgg ctc caa384Glu Val Phe Leu Ser Cys Ala Leu Gly Trp Cys Ile Glu Trp Leu Gln115 120 125gct tat ttc ctt gtg ctt gat gat att atg gat aac tct gtc act cgc432Ala Tyr Phe Leu Val Leu Asp Asp Ile Met Asp Asn Ser Val Thr Arg130 135 140cgt ggt caa cct tgc tgg ttc aga gtt cct cag gtt ggt atg gtt gcc480Arg Gly Gln Pro Cys Trp Phe Arg Val Pro Gln Val Gly Met Val Ala145 150 155 160atc aat gat ggg att cta ctt cgc aat cac atc cac agg att ctc aaa528Ile Asn Asp Gly Ile Leu Leu Arg Asn His Ile His Arg Ile Leu Lys165 170 175aag cat ttc cgt gat aag cct tac tat gtt gac ctt gtt gat ttg ttt576Lys His Phe Arg Asp Lys Pro Tyr Tyr Val Asp Leu Val Asp Leu Phe180 185 190aat gag gtt gag ttg caa aca gct tgt ggc cag atg ata gat ttg atc624Asn Glu Val Glu Leu Gln Thr Ala Cys Gly Gln Met Ile Asp Leu Ile195 200 205acc acc ttt gaa gga gaa aag gat ttg gcc aag tac tca ttg tca atc672Thr Thr Phe Glu Gly Glu Lys Asp Leu Ala Lys Tyr Ser Leu Ser Ile210 215 220cac cgt cgt att gtc cag tac aaa acg gct tat tac tca ttt tat ctc720His Arg Arg Ile Val Gln Tyr Lys Thr Ala Tyr Tyr Ser Phe Tyr Leu225 230 235 240cct gtt gct tgt gcg ttg ctt atg gcg ggc gaa aat ttg gaa aac cat768Pro Val Ala Cys Ala Leu Leu Met Ala Gly Glu Asn Leu Glu Asn His245 250 255att gac gtg aaa aat gtt ctt gtt gac atg gga atc tac ttc caa gtg816Ile Asp Val Lys Asn Val Leu Val Asp Met Gly Ile Tyr Phe Gln Val260 265 270
cag gat gat tat ctg gat tgt ttt gct gat ccc gag acg ctt ggc aag 864Gln Asp Asp Tyr Leu Asp Cys Phe Ala Asp Pro Glu Thr Leu Gly Lys275 280 285ata gga aca gat ata gaa gat ttc aaa tgc tcg tgg ttg gtg gtt aag 912Ile Gly Thr Asp Ile Glu Asp Phe Lys Cys Ser Trp Leu Val Val Lys290 295 300gca tta gag cgc tgc agc gaa gaa caa act aag ata tta tat gag aac 960Ala Leu Glu Arg Cys Ser Glu Glu Gin Thr Lys Ile Leu Tyr Glu Asn305 310 315 320tat ggt aaa ccc gac cca tcg aac gtt gct aaa gtg aag gat ctc tac1008Tyr Gly Lys Pro Asp Pro Ser Asn Val Ala Lys Val Lys Asp Leu Tyr325 330 335aaa gag ctg gat ctt gag gga gtt ttc atg gag tat gag agc aaa agc1056Lys Glu Leu Asp Leu Glu Gly Val Phe Met Glu Tyr Glu Ser Lys Ser340 345 350tac gag aag ctg act gga gcg att gag gga cac caa agt aaa gca atc1104Tyr Glu Lys Leu Thr Gly Ala Ile Glu Gly His Gln Ser Lys Ala Ile355 360 365caa gca gtg cta aaa tcc ttc ttg gct aag atc tac aag agg cag aag1152Gln Ala Val Leu Lye Ser Phe Leu Ala Lys Ile Tyr Lys Arg Gln Lys370 375 380tag1155<210>124<211>384<212>PRT<213>拟南芥菜<400>124Met Ser Val Ser Cys Cys Cys Arg Asn Leu Gly Lys Thr Ile Lys Lys1 5 10 15
Ala Ile Pro Ser His His Leu His Leu Arg Ser Leu Gly Gly Ser Leu20 25 30Tyr Arg Arg Arg Ile Gln Ser Ser Ser Met Glu Thr Asp Leu Lys Ser35 40 45Thr Phe Leu Asn Val Tyr Ser Val Leu Lys Ser Asp Leu Leu His Asp50 55 60Pro Ser Phe Glu Phe Thr Asn Glu Ser Arg Leu Trp Val Asp Arg Met65 70 75 80Leu Asp Tyr Asn Val Arg Gly Gly Lys Leu Asn Arg Gly Leu Ser Val85 90 95Val Asp Ser Phe Lys Leu Leu Lys Gln Gly Asn Asp Leu Thr Glu Gln100 105 110Glu Val Phe Leu Ser Cys Ala Leu Gly Trp Cys Ile Glu Trp Leu Gln115 120 125Ala Tyr Phe Leu Val Leu Asp Asp Ile Met Asp Asn Ser Val Thr Arg130 135 140Arg Gly Gln Pro Cys Trp Phe Arg Val Pro Gln Val Gly Met Val Ala145 150 155 160Ile Asn Asp Gly Ile Leu Leu Arg Asn His Ile His Arg Ile Leu Lys165 170 175Lys His Phe Arg Asp Lys Pro Tyr Tyr Val Asp Leu Val Asp Leu Phe180 185 190Asn Glu Val Glu Leu Gln Thr Ala Cys Gly Gln Met Ile Asp Leu Ile195 200 205
Thr Thr Phe Glu Gly Glu Lys Asp Leu Ala Lys Tyr Ser Leu Ser Ile210 215 220His Arg Arg Ile Val Gln Tyr Lys Thr Ala Tyr Tyr Ser Phe Tyr Leu225 230 235 240Pro Val Ala Cys Ala Leu Leu Met Ala Gly Glu Asn Leu Glu Asn His245 250 255Ile Asp Val Lys Asn Val Leu Val Asp Met Gly Ile Tyr Phe Gln Val260 265 270Gln Asp Asp Tyr Leu Asp Cys Phe Ala Asp Pro Glu Thr Leu Gly Lys275 280 285Ile Gly Thr Asp Ile Glu Asp Phe Lys Cys Ser Trp Leu Val Val Lys290 295 300Ala Leu Glu Arg Cys Ser Glu Glu Gln Thr Lys Ile Leu Tyr Glu Asn305 310 315 320Tyr Gly Lys Pro Asp Pro Ser Asn Val Ala Lys Val Lys Asp Leu Tyr325 330 335Lys Glu Leu Asp Leu Glu Gly Val Phe Met Glu Tyr Glu Ser Lys Ser340 345 350Tyr Glu Lys Leu Thr Gly Ala Ile Glu Gly His Gln Ser Lys Ala Ile355 360 365Gln Ala Val Leu Lys Ser Phe Leu Ala Lys Ile Tyr Lys Arg Gln Lys370 375 380<210>125
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cgc gtc aga cca gtt ctc tgc atc gcc gcg tgc gag cta gtc gga gga384Arg Val Arg Pro Val Leu Cys Ile Ala Ala Cys Glu Leu Val Gly Gly115 120 125gaa gag tct tta gct atg ccg gcg cgt tgc gcc gtg gaa atg atc cac432Glu Glu Ser Leu Ala Met Pro Ala Arg Cys Ala Val Glu Met Ile His130 135 140acc atg tcg ttg atc cac gac gac ttg cct tgt atg gat aac gac gat480Thr Met Ser Leu Ile His Asp Asp Leu Pro Cys Met Asp Asn Asp Asp145 150 155 160ctc cgc cgc gga aag ccc acg aat cac aaa gtt tac ggc gaa gac gtg528Leu Arg Arg Gly Lys Pro Thr Asn His Lys Val Tyr Gly Glu Asp Val165 170 175gcg gtt tta gcc gga gac gcg ctt ctt tcg ttc gcc ttc gag cat tta576Ala Val Leu Ala Gly Asp Ala Leu Leu Ser Phe Ala Phe Glu His Leu180 185 190gcg tcg gct acg agc tcg gag gtt tct ccg gcg aga gtg gtt aga gct624Ala Ser Ala Thr Ser Ser Glu Val Ser Pro Ala Arg Val Val Arg Ala195 200 205gtg gga gag ttg gct aaa gcc atc ggc acc gaa ggg ctc gtg gcg gga672Val Gly Glu Leu Ala Lys Ala Ile Gly Thr Glu Gly Leu Val Ala Gly210 215 220caa gtg gtg gat ata agc agt gaa ggg ttg gac tta aac aac gtc gga720Gln Val Val Asp Ile Ser Ser Glu Gly Leu Asp Leu Asn Asn Val Gly225 230 235 240ttg gag cat ttg aag ttt ata cat ttg cat aaa acg gcg gcg ttg ctt768Leu Glu His Leu Lys Phe Ile His Leu His Lys Thr Ala Ala Leu Leu245 250 255gaa gct tca gcg gtt ttg ggt ggg atc atc ggt gga ggg agt gat gaa816Glu Ala Ser Ala Val Leu Gly Gly Ile Ile Gly Gly Gly Ser Asp Glu260 265 270gag atc gag agg ctg agg aag ttc gcg agg tgt att ggg ttg ttg ttt864Glu Ile Glu Arg Leu Arg Lys Phe Ala Arg Cys Ile Gly Leu Leu Phe275 280 285cag gtg gtt gat gat atc ttg gac gtg acg aaa tcg tct caa gaa ctg912Gln Val Val Asp Asp Ile Leu Asp Val Thr Lys Ser Ser Gln Glu Leu290 295 300
ggg aaa acc gct ggg aaa gat ttg att gct gat aag ttg act tat ccg960Gly Lys Thr Ala Gly Lys Asp Leu Ile Ala Asp Lys Leu Thr Tyr Pro305 310 315 320aag ctc atg ggt ttg gag aaa tcg aga gag ttc gct gag aag ttg aat1008Lys Leu Met Gly Leu Glu Lys Ser Arg Glu Phe Ala Glu Lys Leu Asn325 330 335aca gag gca cgt gat cag ctt tta ggg ttt gat tcc gac aag gtt gct1056Thr Glu Ala Arg Asp Gln Leu Leu Gly Phe Asp Ser Asp Lys Val Ala340 345 350cct ttg ttg gct ttg gct aat tac att gcc aat aga cag aac tga1101Pro Leu Leu Ala Leu Ala Asn Tyr Ile Ala Asn Arg Gln Asn355 360 365<210>126<211>366<212>PRT<213>白芥<400>126Met Ala Ser Ser Val Thr Pro Leu Gly Ser Trp Val Leu Leu His His1 5 10 15His Pro Ser Thr Ile Leu Thr Gln Ser Arg Ser Arg Ser Pro Pro Ser20 25 30Leu Ile Thr Leu Lys Pro Ile Ser Leu Thr Pro Lys Arg Thr Val Ser35 40 45Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Ile Thr Lys Glu Asp Asn Asn Leu Lys50 55 60Ser Ser Ser Ser Ser Phe Asp Phe Met Ser Tyr Ile Ile Arg Lys Ala65 70 75 80
Asp Ser Val Asn Lys Ala Leu Asp Ser Ala Val Pro Leu Arg Glu Pro85 90 95Leu Lys Ile His Glu Ala Met Arg Tyr Ser Leu Leu Ala Gly Gly Lys100 105 110Arg Val Arg Pro Val Leu Cys Ile Ala Ala Cys Glu Leu Val Gly Gly115 120 125Glu Glu Ser Leu Ala Met Pro Ala Arg Cys Ala Val Glu Met Ile His130 135 140Thr Met Ser Leu Ile His Asp Asp Leu Pro Cys Met Asp Asn Asp Asp145 150 155 160Leu Arg Arg Gly Lys Pro Thr Asn His Lys Val Tyr Gly Glu Asp Val165 170 175Ala Val Leu Ala Gly Asp Ala Leu Leu Ser Phe Ala Phe Glu His Leu180 185 190Ala Ser Ala Thr Ser Ser Glu Val Ser Pro Ala Arg Val Val Arg Ala195 200 205Val Gly Glu Leu Ala Lys Ala Ile Gly Thr Glu Gly Leu Val Ala Gly210 215 220Gln Val Val Asp Ile Ser Ser Glu Gly Leu Asp Leu Asn Asn Val Gly225 230 235 240Leu Glu His Leu Lys Phe Ile His Leu His Lys Thr Ala Ala Leu Leu245 250 255Glu Ala Ser Ala Val Leu Gly Gly Ile Ile Gly Gly Gly Ser Asp Glu260 265 270
Glu Ile Glu Arg Leu Arg Lys Phe Ala Arg Cys Ile Gly Leu Leu Phe275 280 285Gln Val Val Asp Asp Ile Leu Asp Val Thr Lys Ser Ser Gln Glu Leu290 295 300Gly Lys Thr Ala Gly Lys Asp Leu Ile Ala Asp Lys Leu Thr Tyr Pro305 310 315 320Lys Leu Met Gly Leu Glu Lys Ser Arg Glu Phe Ala Glu Lys Leu Asn325 330 335Thr Glu Ala Arg Asp Gln Leu Leu Gly Phe Asp Ser Asp Lys Val Ala340 345 350Pro Leu Leu Ala Leu Ala Asn Tyr Ile Ala Asn Arg Gln Asn355 360 365<210>127<211>930<212>DNA<213>噬夏孢欧文菌(Erwinia uredovora)<220>
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ctg gag cat gaa ggt ctg aac aaa gag aat tat gcg gca cct gaa aac624Leu Glu His Glu Gly Leu Asn Lys Glu Asn Tyr Ala Ala Pro Glu Asn195 200 205cgt cag gcg ctg agc cgt atc gcc cgt cgt ttg gtg cag gaa gca gaa672Arg Gln Ala Leu Ser Arg Ile Ala Arg Arg Leu Val Gln Glu Ala Glu210 215 220cct tac tat ttg tct gcc aca gcc ggc ctg gca ggg ttg ccc ctg cgt720Pro Tyr Tyr Leu Ser Ala Thr Ala Gly Leu Ala Gly Leu Pro Leu Arg225 230 235 240tcc gcc tgg gca atc gct acg gcg aag cag gtt tac cgg aaa ata ggt768Ser Ala Trp Ala Ile Ala Thr Ala Lys Gln Val Tyr Arg Lys Ile Gly245 250 255gtc aaa gtt gaa cag gcc ggt cag caa gcc tgg gat cag cgg cag tca816Val Lys Val Glu Gln Ala Gly Gln Gln Ala Trp Asp Gln Arg Gln Ser260 265 270acg acc acg ccc gaa aaa tta acg ctg ctg ctg gcc gcc tct ggt cag864Thr Thr Thr Pro Glu Lys Leu Thr Leu Leu Leu Ala Ala Ser Gly Gln275 280 285gcc ctt act tcc cgg atg cgg gct cat cct ccc cgc cct gcg cat ctc912Ala Leu Thr Ser Arg Met Arg Ala His Pro Pro Arg Pro Ala His Leu290 295 300tgg cag cgc ccg ctc tag930Trp Gln Arg Pro Leu305<210>128<211>309<212>PRT<213>噬夏孢欧文菌<400>128Met Asn Asn Pro Ser Leu Leu Asn His Ala Val Glu Thr Met Ala Val1 5 10 15
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<400>135
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<221>misc_feature<222>(1)..(332)<223>β-羟化酶反义片段<400>142gaattcggca cgagcctctc tctattttta cacttcaatg gcggcagcaa ttgctgtccc 60ttgtagctca agaccatttg gcttaggtcg aatgcggtta cttggtcata aacccacaac120cataacttgt cacttcccct tttctttttc tatcaaatca tttaccccaa ttgttagggg180cagaagatgt actgtttgtt ttgttgccgg tggcgacagt aatagtaaca gtaataataa240tagtgacagt aatagtaata atccgggtct ggatttaaac ccggcggtta tgaaccgtaa300ccgtttggtt gaagaaaaaa tggagaggat cc 33权利要求
1.含虾青素的万寿菊属植物或植物部分或含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物的用途，用于经口施用于动物。
2.根据权利要求1所述的用途，其中含虾青素的万寿菊属植物或植物部分或含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物用于着色动物及相应的动物产品。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中含虾青素的万寿菊属植物或植物部分或含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物与动物饲料制品混合并且该动物饲料制品经口施用于动物。
4.根据权利要求3所述的用途，其中在与动物饲料制品混合之前，将含虾青素的万寿菊属植物或植物部分或含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物加工成能够与动物饲料制品混合的形式。
5.根据权利要求1或2所述的用途，其中含虾青素的万寿菊属植物或植物部分或含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物直接经口施用于动物。
6.根据权利要求5所述的用途，其中在施用之前，将含虾青素的万寿菊属植物或植物部分或含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物加工成能够直接经口施用于动物的形式。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的用途，其中通过遗传操作已经使含虾青素的万寿菊属植物能够产生虾青素。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的用途，其中动物选自鱼类、甲壳动物、鸡形目和Anatridae。
9.根据权利要求8所述的用途，其中动物选自鲑类、虾、蟹、鸡、鸭、鹅和红鹳。
10.根据权利要求2-9中任意一项所述的用途，其中动物产品选自肉、皮肤、羽毛和卵黄。
11.根据权利要求1-10中任意一项所述的用途，其中所使用的植物部分是头状花序或花瓣。
12.产生动物饲料制品的方法，其为将含虾青素的万寿菊属植物或植物部分或含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物与常规动物饲料成分组合。
13.根据权利要求12所述的方法，其中在与动物饲料组合之前，将含虾青素的万寿菊属植物或植物部分或含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物加工成能够与动物饲料组合的形式。
14.用于着色动物或动物产品的方法，其通过将含虾青素的万寿菊属植物或植物部分或含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物经口施用于动物进行。
15.用于产生着色的动物或动物产品的方法，其为将含虾青素的万寿菊属植物或植物部分或含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物经口施用于动物。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中将含虾青素的万寿菊属植物或植物部分或含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物与动物饲料制品混合并将动物饲料制品经口施用于动物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中在与动物饲料制品混合之前，将含虾青素的万寿菊属植物或植物部分或含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物加工成能够与动物饲料制品混合的形式。
18.根据权利要求14或15所述的方法，其中含虾青素的万寿菊属植物或植物部分或含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物直接经口施用于动物。
19.根据权利要求18所述的方法，其中施用之前，将含虾青素的万寿菊属植物或植物部分或含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物加工成能够直接经口施用于动物的形式。
20.根据权利要求14-19中任意一项所述的方法，其中通过遗传操作已经使含虾青素的万寿菊属植物能够产生虾青素。
21.根据权利要求14-20中任意一项所述的方法，其中动物选自鱼类、甲壳动物、鸡形目和Anatridae。
22.根据权利要求21所述的方法，其中动物选自鲑类、虾、蟹、鸡、鸭、鹅和红鹳。
23.根据权利要求14-22中任意一项所述的方法，其中动物产品选自肉、皮肤、羽毛和卵。
24.根据权利要求14-23中任意一项所述的方法，其中所使用的植物部分是头状花序或花瓣。
25.含虾青素的万寿菊属植物或植物部分或含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物的用途，用作动物饲料或动物饲料添加剂。
26.动物饲料制品，其包含含虾青素的万寿菊属植物或植物部分或含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物。
27.着色剂，其包含含虾青素的万寿菊属植物或植物部分或含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物。
28.根据权利要求27所述的着色剂，其由含虾青素的万寿菊属植物或植物部分或含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物组成。
29.根据权利要求27或28所述的着色剂，其中所使用的植物部分是头状花序或花瓣。
全文摘要
本发明涉及含虾青素的万寿菊属植物或植物部分或含虾青素的万寿菊属植物或植物部分的含虾青素提取物经口施用于动物的用途，产生动物饲料制品的方法，动物饲料制品本身，着色动物或动物产品的方法，以及产生着色动物和动物产品的方法。
文档编号A23L1/303GK1688206SQ03824205
公开日2005年10月26日 申请日期2003年8月18日 优先权日2002年8月20日
发明者R·弗拉赫曼, M·绍尔, C·R·朔普费尔, M·克勒布萨特尔, A-M·普法伊费尔, T·卢克, D·弗斯特 申请人:太阳基因两合公司, 巴斯福股份公司, 巴斯福植物科学有限公司