专利名称：肿瘤多药耐药性逆转药物筛选新方法
技术领域：
本发明涉及到一种肿瘤多药耐药性逆转药物筛选新方法，更具体地说涉及到通过药物对靶蛋白ATPase酶活的抑制率来鉴定和评价该药物是否为肿瘤多药耐药性逆转药物。
背景技术：
本发明属于利用基因工程技术构建的肿瘤多药耐药性逆转药物筛选新方法。
多药耐药性(multidrug resistance，MDR)是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生耐药性的同时，对结构和作用机制不同的抗肿瘤药物产生交叉耐药性。在抗肿瘤化疗(chemotherapy)中，肿瘤细胞在受到一种抗肿瘤药物作用之后，甚至在抗肿瘤药物作用之前，会产生针对这种药物及其相关药物，甚至无关药物的抗性，因此MDR是肿瘤化学治疗的主要障碍之一。
MDR的逆转剂与抗癌药物合用，将会大幅度地提高化疗药物对MDR肿瘤的疗效。但至今尚未开发成功有效的应用于临床的MDR逆转药物。本发明的目的就是利用基因工程技术构建的肿瘤多药耐药性逆转药物筛选方法，筛选出有效的MDR逆转药物，解决肿瘤化疗治疗领域的难题，具有重要的经济效益和社会效益。
常规的评价方法是通过待测药物作用于抗药性细胞或移植有抗药性细胞的小鼠，判断其是否对化疗药物有增敏增效的作用。这些方法费时费力，不适合大规模的筛选。
目前研究表明，MDR的产生与MDR1基因所编码的P-gp的过度表达有关。P-gp是一种ABC(ATP Binding Cassette)转运蛋白，具有ATP依赖的膜泵结构特点。本发明确定并获得了人MDR1基因的核酸结合区域基因片段(NBD)，通过药物体外作用于靶蛋白，测定其对靶蛋白ATPase酶活的抑制率来鉴定和评价该药物是否为肿瘤多药耐药性逆转药物，构建了新型的筛选方法。
发明内容
本发明构建了一种新的肿瘤多药耐药性逆转药物筛选方法，筛选逆转药物的靶蛋白是由包含人MDR1基因核酸结合区域(NBD)片断所编码的，所述的MDR1基因核酸结合区域片断的基因序列与其所编码的靶蛋白序列如下1 M P N T L E G N V T F G E V V F N Y P T R P D I P1 atgccgaacacattggaaggaaatgtcacatttggtgaagttgtattcaactatcccacccgaccggacatccca26 V L Q G L S L E V K K G Q T L A L V G S S G C G K76 gtgcttcagggactgagcctggaggtgaagaagggccagacgctggctctggtgggcagcagtggctgtgggaag51 S T V V Q L L E R F Y D P L A G K V L L D G K E I151 agcacagtggtccagctcctggagcggttctacgaccccttggcagggaaagtgctgcttgatggcaaagaaata76 K R L N V Q W L R A H L G I V S Q E P I L F D C S226 aagcgactgaatgttcagtggctccgagcacacctgggcatcgtgtcccaggagcccatcctgtttgactgcagc101 I A E N I A Y G D N S R V V S Q E E I V R A A K E301 attgctgagaacattgcctatggagacaacagccgggtggtgtcacaggaagagatcgtgagggcagcaaaggag126 A N I H A F I E S L P N K Y S T K V G D K G T Q L376 gccaacatacatgccttcatcgagtcactgcctaataaatatagcactaaagtaggagacaaaggaactcagctc151 S G G Q K Q R I A I A R A L V R Q P H I L L L D E451 tctggtggccagaaacaacgcattgccatagctcgtgcccttgttagacagcctcatattttgcttttggatgaa176 A T S A L D T E S E K V V Q E A L D K A R E G R T526 gccacgtcagctctggatacagaaagtgaaaaggttgtccaagaagccctggacaaagccagagaaggccgcacc201 C I V I A H R L S T I Q N A D L I V V F Q N G R V601 tgcattgtgattgctcaccgcctgtccaccatccagaatgcagacttaatagtggtgtttcagaatggcagagtc226 K E H G T H Q Q L L A Q K G I Y F S M V S V Q A G676 aaggagcatggcacgcatcagcagctgctggcacagaaaggcatctatttttcaatggtcagtgtccaggctgga251 T K R Q*751 acaaagcgccagtga通过逆转药物体外作用于靶蛋白，测定逆转药物对靶蛋白ATPase酶活的抑制率来鉴定和评价该逆转药物是否为肿瘤多药耐药性逆转药物。
逆转药物可以是蛋白(抗体等)、多肽、天然药物、化学合成药物。
本发明与现有技术相比有以下的明显优点和技术进步本发明用于筛选逆转药物的靶蛋白是人MDR1基因核酸结合区域(NBD)片断，它适于在原核表达系统中得到高效表达。本发明通过在分子水平体外测定靶蛋白ATPase酶活的抑制率来筛选逆转药物，较常规的细胞、动物水平的实验方法具有操作简便、快速、微量、费用低廉的特点，适用在普通实验室进行高通量筛选。
图1是人MDR1基因的NBD基因片段RT-PCR凝胶电泳图；图2是靶蛋白NBD SDS-PAGE分析图；图3是靶蛋白NBD ATPase酶活测定图；图4是药物对靶蛋白NBD ATPase酶活的抑制图。
具体实施例方式
本发明内容通过以下的实施例和附图作进一步阐述，但并不限制本发明的范围。
实施例11、人MDR1基因的核酸结合区域基因片段(NBD)的获得从多药耐药性的人表皮癌细胞KB-A1中用Trizol试剂抽提总RNA，经变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性。用提取的总RNA反转录成cDNA，以此为模板，经PCR扩增，得扩增产物，琼脂糖凝胶电泳结果表明片段大小与预期基因片段大小相符，如图1所示，序列如下。
1 atgccgaaca cattggaagg aaatgtcaca tttggtgaag ttgtattcaa ctatcccacc61 cgaccggaca tcccagtgct tcagggactg agcctggagg tgaagaaggg ccagacgctg121 gctctggtgg gcagcagtgg ctgtgggaag agcacagtgg tccagctcct ggagcggttc181 tacgacccct tggcagggaa agtgctgctt gatggcaaag aaataaagcg actgaatgtt241 cagtggctcc gagcacacct gggcatcgtg tcccaggagc ccatcctgtt tgactgcagc301 attgctgaga acattgccta tggagacaac agccgggtgg tgtcacagga agagatcgtg361 agggcagcaa aggaggccaa catacatgcc ttcatcgagt cactgcctaa taaatatagc421 actaaagtag gagacaaagg aactcagctc tctggtggcc agaaacaacg cattgccata481 gctcgtgccc ttgttagaca gcctcatatt ttgcttttgg atgaagccac gtcagctctg541 gatacagaaa gtgaaaaggt tgtccaagaa gccctggaca aagccagaga aggccgcacc601 tgcattgtga ttgctcaccg cctgtccacc atccagaatg cagacttaat agtggtgttt661 cagaatggca gagtcaagga gcatggcacg catcagcagc tgctggcaca gaaaggcatc721 tatttttcaa tggtcagtgt ccaggctgga acaaagcgcc agtga2、含NBD基因片段的表达载体pGEX-NBD的构建RT-PCR产物提纯的片段、载体质粒(pGEX)均经BamHI、EcoRI 37℃双酶切过夜，酶切产物纯化后二者以5∶1浓度加入并加入T4 DNA连接酶16℃连接过夜。
3、能高效表达靶蛋白NBD的大肠杆菌重组株E.coli BL21(pGEX-NBD)的构建用CaCl2法将连接产物转化E.coli BL21，在含氨苄青霉素的LB平板上筛选转化子，经鉴定获得含pGEX4T-1-NBD的重组转化子E.coli BL21(pGEX-NBD)。
4、利用大肠杆菌E.coli BL21(pGEX-NBD)表达靶蛋白NBD构建的表达菌种接种于5ml 2×YT(Amp)中，37℃，300rpm过夜培养。过夜培养的饱和菌1∶50接种于200ml 2×YT(Amp)中，37℃，300rpm培养至OD600＝0.6。IPTG诱导至终浓度0.4mM，继续培养3-5hr。8000rpm离心10min，去上清，收集菌体，-80℃保存。
5、靶蛋白NBD的纯化收集所得菌体重悬，加入1M DTT至最终浓度为5mM，PMSF至最终浓度为100ug/ml，冰浴超声裂解细胞成匀浆，加20％Triton X-100至终浓度1％，冰浴30min，12000rpm离心10min，取上清。上清用Glutathione Sepharose 4B纯化得靶蛋白NBD。靶蛋白NBD透析，取少量进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图2所示。
6、靶蛋白NBD ATPase酶活的测定靶蛋白NBD于反应液(50mM Tris pH 7.5，5mM sodium azide，2mM EGTA，2mM ouabain，50mM NaCl，and 6mM MgCl2)终浓度100μg/mL。取45μL加入5μL of ATP至ATP终浓度2mM，37℃反应20min。50μL 6％SDS终止反应，加入50μL 3％ascorbate，0.5M sodium molybdate in 0.5M HCl室温4分钟，加入50μL 2％sodium citrate，2％sodium meta-arsenite and 2％aceticacid 37℃10min，测定850nm吸光度，如图3所示。
7、肿瘤多药耐药性逆转药物EGCG的ATPase酶活抑制率测定药物EGCG和靶蛋白NBD于反应液(50mM Tris pH 7.5，5mM sodium azide，2mM EGTA，2mM ouabain，50mM NaCl，and 6mM MgCl2)共孵育2小时。取45μL加入5μL of ATP至ATP终浓度2mM，37℃反应20min。50μL 6％SDS终止反应，加入50μL 3％ascorbate，0.5M sodium molybdate in 0.5M HCl室温4分钟，加入50μL 2％sodium citrate，2％sodium meta-arsenite and 2％acetic acid 37℃10min，测定850nm吸光度，计算其抑制率，如图4所示。
8、肿瘤多药耐药性逆转药物TP的ATPase酶活抑制率测定药物TP和靶蛋白NBD于反应液(50mM Tris pH 7.5，5mM sodium azide，2mM EGTA，2mM ouabain，50mM NaCl，and 6mM MgCl2)共孵育2小时。取45μL加入5μL of ATP至ATP终浓度2mM，37℃反应20min。50μL 6％SDS终止反应，加入50μL 3％ascorbate，0.5M sodium molybdate in 0.5M HCl室温4分钟，加入50μL 2％sodium citrate，2％sodium meta-arsenite and 2％acetic acid 37℃10min，测定850nm吸光度，计算其抑制率，如图4所示。
失败实施例1、根据实施例1中的方法1-4扩增得到完整的人MDR1基因，但无法在大肠杆菌表达系统中表达。
2、根据实施例1中的方法1-6扩增得到MDR1基因片断C21，并在大肠杆菌表达系统中表达，但不具有酶活。
结果表明只有包含实施例1中NBD区域的基因片断才可以在大肠杆菌表达系统中高效表达，该表达产物经过纯化后具有ATPase酶活。
权利要求
1.一种肿瘤多药耐药性逆转药物筛选新方法，其特征在于通过逆转药物体外作用于靶蛋白，测定逆转药物对靶蛋白ATPase酶活的抑制率来鉴定和评价该逆转药物是否为肿瘤多药耐药性逆转药物；筛选逆转药物的靶蛋白是由包含人MDR1基因核酸结合区域片断所编码的，所述的MDR1基因核酸结合区域片断的基因序列与其所编码的靶蛋白序列如下1 M P N T L E G N V T F G E V V F N Y P T R P D I P1 atgccgaacacattggaaggaaatgtcacatttggtgaagttgtattcaactatcccacccgaccggacatccca26 V L Q G L S L E V K K G Q T L A L V G S S G C G K76 gtgcttcagggactgagcctggaggtgaagaagggccagacgctggctctggtgggcagcagtggctgtgggaag51 S T V V Q L L E R F Y D P L A G K V L L D G K E I151 agcacagtggtccagctcctggagcggttctacgaccccttggcagggaaagtgctgcttgatggcaaagaaata76 K R L N V Q W L R A H L G I V S Q E P I L F D C S226 aagcgactgaatgttcagtggctccgagcacacctgggcatcgtgtcccaggagcccatcctgtttgactgcagc101 I A E N I A Y G D N S R V V S Q E E I V R A A K E301 attgctgagaacattgcctatggagacaacagccgggtggtgtcacaggaagagatcgtgagggcagcaaaggag126 A N I H A F I E S L P N K Y S T K V G D K G T Q L376 gccaacatacatgccttcatcgagtcactgcctaataaatatagcactaaagtaggagacaaaggaactcagctc151 S G G Q K Q R I A I A R A L V R Q P H I L L L D E451 tctggtggccagaaacaacgcattgccatagctcgtgcccttgttagacagcctcatattttgcttttggatgaa176 A T S A L D T E S E K V V Q K A L D K A R K G R T526 gccacgtcagctctggatacagaaagtgaaaaggttgtccaagaagccctggacAAAgccagagAAggccgcacc201 C I V I A H R L S T I Q N A D L I V V F Q N G R V601 tgcattgtgattgctcaccgcctgtccaccatccagaatgcagacttaatagtggtgtttcagaatggcagagtc226 K E H G T H Q Q L L A Q K G I Y F S M V S V Q A G676 aaggagcatggcacgcatcagcagctgctggcacagaaaggcatctatttttcaatggtcagtgtccaggctgga251 T K R Q *751 acaaagcgccagtga
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的逆转药物是蛋白、多肽、天然药物、化学合成药物。
全文摘要
本发明构建了一种新的肿瘤多药耐药性逆转药物筛选方法。该方法包括筛选靶蛋白的制备方法和逆转药物的筛选方法。该方法可用于肿瘤多药耐药性逆转药物的鉴定和评价，还可用于该类药物的高通量筛选。
文档编号C12Q1/25GK1528914SQ200310107979
公开日2004年9月15日 申请日期2003年10月16日 优先权日2003年10月16日
发明者魏东芝, 钱峰 申请人:华东理工大学