专利名称：脱色希瓦氏菌(Shewanella decolorationis)的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的脱色希瓦氏菌(Shewanella decolorationis)CCTCC M 203093，其具有广谱高效降解染料的能力。
背景技术：
染料分子是一种人工合成的复杂的芳香烃类化合物。根据美国C.I.(Color Index)统计，目前在使用的染料达万种之多，它们不仅具有特定的颜色，而且结构复杂，生物降解性较低，大多数具有三致作用。这些合成染料用常规废水处理方法很难进行有效去除，对水环境造成严重的污染，因此有关含染料的印染废水和染料废水的处理问题是当前研究的热点和难点之一。研究化工染料生物降解的特性，有利于正确利用微生物处理印染废水，对保护环境有积极的意义。目前已发现的染料脱色菌主要包括硫酸盐还原菌，反硝化菌，芽孢杆菌，假单胞菌，肠道细菌等。这些细菌大多数只能在厌氧条件下对一种染料进行不完全降解。
希瓦氏菌(Shewanella sp.)是1985年Macdonell和Colwell根据5SrRNA序列从交替单胞菌属中另立的新属。近年来国际有关该菌属的新菌种不断被发现，这些菌种大多具有耐盐、耐低温、厌氧条件下还原金属的能力；但至今未发现希瓦氏菌属中具有降解染料能力的菌种。
发明内容
本发明的目的在于开发具有广谱降解染料能力的菌株。
本发明通过对广州某印染厂废水处理系统的活性污泥进行分离、纯化，得到希瓦氏菌属中的一个新种，具有广谱高效降解染料能力，从而实现了本发明的目的。
本发明是脱色希瓦氏菌(Shewanella decolorationis)CCTCC M 203093。
本发明是脱色希瓦氏菌(Shewanella decolorationis)已于2003年11月24日保存在中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，保藏编号为CCTCC M 203093。
本发明脱色希瓦氏菌从广州某印染厂废水处理系统的活性污泥进行分离、纯化而得。其分离纯化方法如下取5mL活性污泥于两种染料培养基中(每升培养基中含Na2HPO4.7H2O 12.8g，KH2PO43.0g，NaCl 0.5g，NH4Cl 1.0g，并分别添加偶氮和蒽醌两种染料中的一种，使培养基中的染料浓度为50mg/L)，添加适量的葡萄糖，使其在培养基中的浓度为2g/L，30℃静置培养，观察染料的脱色情况，当培养液中的染料基本上完全脱色时，以1/10的接种量转接至另一新鲜的培养基，如此重复几次，直至脱色时间明显缩短，将该培养液进行适当稀释后均匀涂布于LB固体培养基上(含蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 10g/L琼脂条2％，pH7.0)，30℃培养24小时，挑取单菌落进行分离、纯化；将分离纯化到的单菌落采用LB液体培养基进行活化过夜，以1/10的接种量分别接种至各种染料培养基中，静置培养，观察其脱色率。
本发明脱色希瓦氏菌具有如下形态和生理、生化特性(a)菌体形态特性采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，脱色希瓦氏菌的细胞为革兰氏阴性，杆状，大小为(0.6-1.0)×(1.0-6.7)μm，周身纤毛，极生单鞭毛，细胞表面有瘤粒状的凸起(见图1)；(b)菌落形态特性在营养琼脂固体培养基平板上培养24h后，菌落形态为圆形，表面光滑扁平，边缘整齐，肉红色，透明，菌落大小(d/mm)为2～3；(c)主要的生理、生化特征具有兼性厌氧生长的能力，能还原三价铁，能液化明胶，能产生H2S，氧化酶和接触酶为阳性，能以乳酸钠、D-半乳糖、琥珀酸为唯一碳源生长，不能利用硫酸铵和硝酸铵为唯一氮源生长。
上述结果表明本发明脱色希瓦氏菌与希瓦氏菌属的生理生化特性很相似。
本发明脱色希瓦氏菌分子分类地位采用SDS蛋白酶K，氯仿-异戊醇(体积比24.1)抽提，0.6体积异丙醇沉淀的方法提取细菌总DNA。采用细菌16S rDNA通用引物F8和R1542和细菌gyrB基因通用引物UP-1/UP-2rPCR扩增细菌的16S rDNA和gyrB基因；将PCR扩增产物直接进行序列测定，将获得的DNA序列输入Genbank，以Blastn程序对数据库中的所有序列进行比较分析，结果发现本发明脱色希瓦氏菌的16S rDNA序列和gyrB基因序列与GenBank中希瓦氏菌属的多个菌种具有较高的同源性，其中与腐臭希瓦氏菌的模式菌株(Shewanella putrefacion ATCC8071T)的16SrDNA(登录号U91550)同源性达到97％(同一菌种的16S rDNA序列的同源性应大于97.7％)，与其gyrB基因(登录号AF005669)的同源性为87％(同一菌种gyrB基因序列的同源性应大于90％)。
结合上述的生理生化特性、16S rDNA序列和gyrB基因序列的结果，本发明脱色希瓦氏菌应归属于希瓦氏菌属(Shewanella sp.)，是该菌属的一个新种，命名为脱色希瓦氏菌(Shewanella decolorationis)。其判断参考如下文献Venkateswaran K，et al.International Journal of Systematic Bacteriology，1999，49705-724；Statomi M，et al.International Journal of Systematic Bacteriology，2003，53491-499；Yanez M A，et al.International Journal of Systematic Bacteriology，2002，53875-883。
本发明为印染废水和染料废水的处理提供了一种高效率、低成本、所需设备简单、不产生二次污染，可有效降低废水的色度和COD，提高常规废水处理方法的处理效率的染料降解菌。本发明脱色希瓦氏菌对浓度为50mg/L的偶氮染料在20分钟内去除率达16％，在2小时内几乎呈直线上升，去除率已达到93％，在4h内去除率达到96％，其最高耐受浓度达到2000mg/L。本发明脱色希瓦氏菌对浓度为50mg/L的蒽醌染料，在1h内去除率达16％，在15h去除率达99％，对蒽醌染料的最高耐受浓度为1000mg/L。
本发明可对印染废水和染料废水中的偶氮类和蒽醌类染料进行有效的降解，提高常规废水处理方法的效率，改善水生态环境质量。
图1脱色希瓦氏菌(Shewanella decolorationis)CCTCC M 203093的7 000倍(左)和14 500倍(右)的电子显微图片。
具体实施例方式
实施例1在200mL去离子水中添加Na2HPO4.7H2O 2.56g，KH2PO40.6g，NaCl 0.1g，NH4Cl 0.2g，酸性大红GR(C.I.27290)0.01g，211℃条件下灭菌20分钟作为染料培养液。从保存脱色希瓦氏菌的斜面接种至LB液体培养基中，于30℃，150r/min条件下摇床活化菌体，使细菌数达到108数量级，以1/10的接种量接种活化菌液于染料培养液中，30℃静置培养，观察培养液的颜色变化情况，每隔30分钟取10mL染料培养液于6 000r/min离心去菌体，采用DU640紫外分光光度计(BECKMAN)在503nm处测定染料培养液中酸性大红GR(C.I.27290)的吸光值，并以不加菌的染料培养液为对照，计算染料降解率。2小时后脱色希瓦氏菌对酸性大红的去除率达到93％，4小时后去除率达到96％。
实施例2在200mL去离子水中添加Na2HPO4.7H2O 2.56g，KH2PO40.6g，NaCl 0.1g，NH4Cl 0.2g，酸性大红GR(C.I.27290)0.1g，211℃条件下灭菌20分钟作为染料培养液。从保存脱色希瓦氏菌的斜面接种至LB液体培养基中，于30℃，150r/min条件下摇床活化菌体，使细菌数达到108数量级，以1/10的接种量接种活化菌液于染料培养液中，30℃静置培养，观察培养液的颜色变化情况，每隔30分钟取10mL染料培养液于6 000r/min离心去菌体，采用DU640紫外分光光度计(BECKMAN)在503nm处测定染料培养液中酸性大红GR(C.I.27290)的吸光值，并以不加菌的染料培养液为对照，计算染料降解率。4天后脱色希瓦氏菌对酸性大红的去除率达到85％。
实施例3在200mL去离子水中添加Na2HPO4.7H2O 2.56g，KH2PO40.6g，NaCl 0.1g，NH4Cl 0.2g，活性艳蓝(C.I.612051)0.01g，211℃条件下灭菌20分钟作为染料培养液。从保存脱色希瓦氏菌的斜面接种至LB液体培养基中，于30℃，150r/min条件下摇床活化菌体，使细菌数达到108数量级，以1/10的接种量接种活化菌液于染料培养液中，30℃静置培养，观察培养液的颜色变化情况，每隔30分钟取10mL染料培养液于6 000r/min离心去菌体，采用DU640紫外分光光度计(BECKMAN)在592nm处测定染料培养液中活性艳蓝(C.I.612051)的吸光值，并以不加菌的染料培养液为对照，计算染料降解率。15小时后脱色希瓦氏菌对活性艳蓝的去除率达到99％。
实施例4在200mL去离子水中添加Na2HPO4.7H2O 2.56g，KH2PO40.6g，NaCl 0.1g，NH4Cl 0.2g，活性艳蓝(C.I.612051)0.2g，211℃条件下灭菌20分钟作为染料培养液。从保存脱色希瓦氏菌的斜面接种至LB液体培养基中，于30℃，150r/min条件下摇床活化菌体，使细菌数达到108数量级，以1/10的接种量接种活化菌液于染料培养液中，30℃静置培养，观察培养液的颜色变化情况，每隔30分钟取10mL染料培养液于6 000r/min离心去菌体，采用DU640紫外分光光度计(BECKMAN)在592nm处测定染料培养液中活性艳蓝(C.I.612051)的吸光值，并以不加菌的染料培养液为对照，计算染料降解率。7天后脱色希瓦氏菌对活性艳蓝的去除率达到67％。
权利要求
1.脱色希瓦氏菌(Shewanella decolorationis)CCTCC M 203093。
全文摘要
本发明涉及一种新的脱色希瓦氏菌(Shewanelladecolorationis)CCTCC M 203093。本发明通过对广州某印染厂废水处理系统的活性污泥进行分离、纯化，得到希瓦氏菌属中的一个新种。该脱色希瓦氏菌可对印染废水和染料废水中的染料进行有效的降解，提高常规废水处理方法的效率，改善水生态环境质量。
文档编号C12N1/20GK1621513SQ20031011236
公开日2005年6月1日 申请日期2003年11月28日 优先权日2003年11月28日
发明者许玫英, 孙国萍, 郭俊, 钟小燕, 曹渭, 岑英华 申请人:广东省微生物研究所