一种抗病毒药物的筛选方法

文档序号:455064阅读:306来源:国知局
专利名称:一种抗病毒药物的筛选方法
技术领域
本发明属于抗病毒药物筛选技术领域。具体涉及一种抗RNA病毒药物的筛选方法。
背景技术
药物筛选在新药的研究和开发过程中是一个至关重要的环节,简便有效的筛选方法可以大大缩短新药开发的进程。常规的药物筛选是从细胞空斑实验开始,经动物模型的有效性及毒性测定评估后进入临床实验。现代的药物筛选增加了细胞致病性抑制实验,体外反应抑制实验等方法[1-3]。每种方法都有针对特定病毒的特殊的设计依据,各有优缺点。例如体外反应抑制实验的优点是快速,但是必需事先获得病毒以及宿主的特定因子以及建立适合的测试体系[4-14],并且目前已知的这类特定因子还很少。理想的筛选方法应该具有明显的检测标记,而且高效、简便。但是对大多数RNA病毒而言,理想的筛选方法还非常缺乏。尤其在抗植物病毒和真菌病毒病的药物开发方面,目前还没有简易、快速和高效的筛选方法。

发明内容
无病毒的丝状真菌真菌板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)EP-721(-)菌株具有桔黄色的表现型,而感染了双链RNA低毒病毒CHV1-EP721的板栗疫病菌EP-721(-)菌株(命名为EP-721,ATCC编号66024)则具有菌丝体为白色的稳定的表现型。EP-721除携带病毒外,与无病毒菌株EP-721(-)的遗传背景完全相同。当带毒株EP-721失去可自主复制的低毒病毒时或者其滴度显著降低时,菌丝体变为桔黄色。这种颜色变化提供了判断病毒是否存在或其滴度水平的一个方便的初步标记。因此,有可能把低毒病毒/板栗疫病菌系统发展成为一个筛选抗RNA病毒复制和缓解RNA病毒感染所引起的病害症状的抗病毒化合物高通量筛选方法。
本发明的目的是提供一种简便、快速的抗RNA病毒药物的筛选方法。该方法是基于一种双链RNA病毒和它的天然宿主—板栗疫病菌所组成的测试系统,在此系统中,无病毒的板栗疫病菌EP-721(-)菌株是桔黄色的,有很强的产生分生孢子的能力(图1-A);当该菌株携带CHV1-EP721病毒后,则是白色的,不能产孢(图1-B)。这种颜色变化可以作为判断病毒存在与否或其浓度水平的一个方便的初步标记。用药物处理这种带病毒菌株,然后根据用药前后菌株颜色的变化,就可以初步判断所用药物对RNA病毒的复制是否有抑制作用,或对受RNA病毒感染的真菌的症状是否有缓解作用。
该方法所需材料如下菌种携带低毒病毒CHV1-EP721的板栗疫病菌EP-721菌株来自美国菌种保藏中心(编号ATCC66024),无病毒的板栗疫病菌EP721(-)是通过将EP-721菌株经常规分生孢子单孢分离脱毒而获得。
培养基PDA固体培养基(配方见附1.1)待测药物各种已知成份或未知成份的药物或化合物或天然成份。
方法步骤1.首先将待筛选药物配制成一定浓度的溶液。
2.所配待筛选药物溶液按照一定的浓度梯度加到已灭菌的PDA固体培养基,摇动混匀。
3.将上述培养基分装在透光的直径为100毫米的培养皿(20ml/皿)。
4.将EP-721和EP-721(-)接种到上述培养基中。
5.在不加药物的PDA固体培养基上接种EP-721和EP-721(-),做为对照。
6.在室温22-25℃、室内光照(200-3000Lux)下,按每天有光14小时,黑暗10小时,培养5-10天。
7.表型观察在不同的时间段进行菌落和菌丝体颜色的观察并记录结果。给药的处理与不给药的对照相比,如果菌落变黄或产孢能力恢复,视为阳性结果,即所用药物对RNA病毒的复制有抑制作用或对RNA病毒感染所引起的症状有缓解作用;8.病毒相对量的分析以真菌EP-721的核糖体RNA作为内参照,检验用药前后菌丝体中双链RNA病毒的含量是否有所下降。双链RNA病毒提取方法如下从平板上刮下大约200-500mg的菌丝放于研钵中,加液氮研磨至粉末状后,快速加入2ml提取缓冲溶液(配方见附1.2)并搅拌均匀,然后转移到合适的离心管中,加等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提两次以上至看不到中间蛋白质层为止;吸出上层水相加1/4体积10M的LiCl,-20℃沉淀2-3个小时,高速离心去沉淀;在溶液中加2倍体积预冷的无水乙醇,-20℃沉淀1个小时,高速离心沉淀,用75%乙醇洗涤沉淀2-3次,自然凉干,加100ul无RNA酶的超纯水溶解沉淀,取出小部分用适量DNA酶37℃消化1个小时。在0.7%琼脂糖凝胶中电泳,照相记录结果。
附1PDA培养基配方1.马铃薯200g洗净、去皮、切成小块,沸水煮1 5-20分钟,过滤去渣,加20g葡萄糖,用蒸馏水定容至1L,加10-13g琼脂粉,高压灭菌分钟。
2.双链RNA病毒提取缓冲溶液(用超纯水配制)Tris.Hcl(pH8.0)100mM,Nacl 200mM,EDTA(pH8.0)4mM,SDS 2%


图1指示菌株在PDA培养基上的菌落形态。
图2经阿昔洛韦处理的EP721的菌落形态。A.3.2mg/ml阿昔洛韦,B.对照图3经快克处理的EP721菌落形态。A.20ug/ml快克,B.对照图4经盐酸吗啉胍处理的EP721菌落形态。A.900ug/ml盐酸吗啉胍,B对照图5不同浓度盐酸吗啉胍处理后EP721病毒dsRNA相对量的变化MλHindIII;1EP-721;2EP-721(-);390ug/ml盐酸吗啉胍;4900ug/ml盐酸吗啉胍;59000ug/ml盐酸吗啉胍图6经双嘧达莫处理的EP721菌落形态。A.1mg/ml双嘧达莫,B.对照图7经贝尔芬处理的EP721菌落形态。A.500 U贝尔芬,B.对照具体实施方式
实施例一阿昔洛韦(100mg/片),用灭菌水配成160mg/ml的溶液,离心除去不溶部分。药物按照32mg/ml,3.2mg/ml,0.32mg/ml的梯度加入PDA固体培养基中。接种EP721,室温培养7天。结果显示,3.2mg/ml药物浓度使得真菌的菌落明显变为桔黄色(图2-A),接近无病毒时的水平,表明症状已明显缓解。而在32mg/ml的药物浓度时,菌落除变为桔黄色外,其生长受到了明显抑制。
实施例二快克(盐酸金刚烷胺100mg/粒),取4粒胶囊用无菌水配制成10ml的溶液,离心除去不溶物。药物按照160,320,640ug/ml三个浓度梯度加入PDA固体培养基中。接种EP721,室温培养7天。结果显示320ug/ml药物浓度使得真菌的菌落明显变为桔黄色(图3-B),而在640ug/ml的药物浓度时,菌落除变为桔黄色外,其生长受到了明显抑制。
实施例三盐酸吗啉胍(100mg/片),取100片用50ml无菌水溶解,离心除去不溶物。药物按照90ug/ml,900ug/ml,9000ug/ml三个梯度加入PDA固体培养基中,接种EP721,室温培养7天。结果显示900ug/ml的药物用量使得真菌的菌落明显变为桔黄色,接近无病毒时的水平,表明症状已明显缓解。而在9000ug/ml的平板上,菌落除变为桔黄色外,其生长受到了明显抑制(图4)。进一步提取dsRNA验证,随着药物浓度的增加,dsRAN的浓度略有下降(图5)。
实施例四双嘧达莫(潘生丁,25mg/片),除去糖衣,用灭菌水配制成100mg/ml的溶液。药物按照0.1,1,10mg/ml三个浓度梯度加入PDA固体培养基中。接种EP721,室温培养7天。结果显示三个药物浓度的真菌菌落都有不同程度的变黄(图6)。
实施例五(阴性结果示例)贝尔芬(重组a干扰素50万U/ml),用500U的贝尔芬处理EP-721,固体培养7天后,颜色几乎没有任何变化(图7)。将浓度增加至5000U,5万U时才出现颜色变黄的现象,说明该系统对这种类型的化合物不是很敏感。
参考文献1.用微孔板培养表达病毒的细胞系,在培养液中待测化合物,通过定量检测病毒基因表达水平来筛选抗病毒化合物的方法(WO99/51776);2.Schimidtake M,Schnittler U,Jahn B,Dahse H,Stelzner A(2001).A rapidassay for evaluation of antiviral activity against coxsackie virus B3,ifluenza virus A,andherpes simplex virus type 1.J Virol Methods 95133-433.McMahon JB,Beutler JA,O’Keefe BR,Goodmm CB,Myers MA,BoydMR.(2000)Development of a cyanovirin-N-HIV-1 gp120 binding assay for highthroughput screening ofnatural product extracts by time-resovled fluorescence.JBiomo.Screen 5169-764.与流感病毒复制有关的宿主人NP-1蛋白及其编码基因(US5750394、WO00111335);5.由宿主人基因编码的艾滋病毒HIV-1整合酶的作用子IN-1(US5872213、US6222024B1);6.与艾滋病毒HIV-1复制有关的由宿主人编码的一个类似MSS-1的蛋白质(JP09028749);7.从拟南芥克隆的与烟草花叶病毒的复制有关的tom-1基因(JP11232678);8.筛选人呼吸道多核体病毒的调节子的方法(EP0926246A2、US6017694);
9.利用人丙肝病毒编码的NS4B蛋白(ATP酶)筛选NS4B的抑制子或激活子的方法(EP998585A1);10.利用人丙肝病毒编码的NS5B的截短了的蛋白筛选抗病毒化合物的方法(EP1037974、US6228576B1、WO99/29843);11.以艾滋病毒HIV-1gp41核心结构为靶标的抗病毒化合物的筛选方法(WO55377A1);12.以宿主人NP-1蛋白与流感病毒NP蛋白相互作用为基础,筛选抗病毒化合物的方法(WO01/11335A2);13.以流感病毒基质蛋白M1的结晶态N-末端的三维结构筛选抗RNA病毒化合物的方法(US6090690);14.依据人呼吸道多核体病毒M2-1蛋白与病毒核衣壳蛋白相互作用及磷酸化原理,通过观察M2-1功能的丧失来筛选抗病毒化合物的方法(WO00/50646)。
权利要求
1.一种双链RNA病毒和它的天然宿主一板栗疫病菌所组成的一种抗RNA病毒药物的筛选方法,该方法涉及(1)菌种,无病毒的板栗疫病菌EP-721(-)菌株和携带CHV1-EP721病毒的EP-721菌株;(2)配制待筛选药物溶液;(3)菌种EP-721和EP-721(-)接种到施药和不施药的培养基中;(4)菌种经培养后进行菌落、菌丝体颜色的观察和病毒相对量的分析,给药的处理与不给药的对照相比,根据菌落颜色变化或产孢能力的变化的一种抗RNA病毒药物的筛选方法。
2.根据权利要求1所述的一种抗RNA病毒药物的筛选方法,其所述的菌种无病毒的板栗疫病菌EP-721(-)菌株是桔黄色的,有很强的产生分生孢子的能力,当该菌株携带CHV1-EP721病毒后,则是白色的,不能产孢,当带毒株EP-721失去可自主复制的低毒病毒时,菌丝体变为桔黄色,这种颜色变化作为判断病毒存在与否或其浓度水平的一个标记。
3.根据权利要求1所述的一种抗RNA病毒药物的筛选方法,其具体方法步骤1)首先将待筛选药物配制成一定浓度的溶液,2)所配待筛选药物溶液按照一定的浓度梯度加到已灭菌的PDA固体培养基,摇动混匀,3)将上述培养基分装在透光的直径为100毫米的培养皿(20ml/皿),4)将EP-721和EP-721(-)接种到上述培养基中,5)在不加药物的PDA固体培养基上接种EP-721和EP-721(-),作为对照。6)在室温22-25℃、室内光照(200-3000Lux)下,按每天有光14小时,黑暗10小时,培养5-10天,7)表型观察在不同的时间段进行菌落和菌丝体颜色的观察并记录结果。给药的处理与不给药的对照相比,如果菌落变黄或产孢能力恢复,视为阳性结果,即所用药物对RNA病毒的复制有抑制作用或对RNA病毒感染所引起的症状有缓解作用;8)病毒相对量的分析以真菌EP-721的核糖体RNA作为内参照,检验用药前后菌丝体中双链RNA病毒的含量是否有所下降。
4.根据权利要求1-3所述的一种抗RNA病毒药物的筛选方法在筛选抗RNA病毒药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种简便、快速的抗RNA病毒药物的筛选方法。该方法是基于一种双链RNA病毒和它的天然宿主—板栗疫病菌所组成的测试系统,在此系统中,无病毒的板栗疫病菌EP-721(-)菌株是桔黄色的,有很强的产生分生孢子的能力;当该菌株携带CHV1-EP721病毒后,则是白色的,不能产孢。这种颜色变化可以作为判断病毒存在与否或其浓度水平的一个方便的初步标记。用药物处理这种带病毒菌株,然后根据用药前后菌株颜色的变化,就可以初步判断所用药物对RNA病毒的复制是否有抑制作用,或对受RNA病毒感染的真菌的症状是否有缓解作用。
文档编号C12Q1/18GK1624150SQ200310116878
公开日2005年6月8日 申请日期2003年12月1日 优先权日2003年12月1日
发明者陈保善, 林海燕, 戴璐 申请人:广西大学
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