专利名称：冬虫夏草菌粉与活性免疫虫草多糖冻干粉的生产方法及产品的制作方法
本
发明内容
属于生化物品制备技术领域，涉及一种利用冬虫夏草菌种制备虫草菌粉的方法和产品以及一种根据以上菌粉原料提取虫草免疫活性多糖的方法和产品。
冬虫夏草(Cordyceps sinensis)是分布于我国四川、西藏、青海、云南、甘肃等省区高山及亚高山草甸地带的一种名贵的食用及药用真菌，属子囊菌纲、麦角菌科。由于冬虫夏草内所含的虫草酸及虫草素等成分具有扩张气管、镇静、抗菌和降血压等功效，中医学上以干燥的子座及虫体入药，可用于治疗虑劳咳嗽痰血、气喘、腰痛、肺结核、慢性肾炎、糖尿病、肿瘤、遗精阳痿、自汗盗汗、失眠健忘等多种病症，此外虫草本身也含有多种人体必需的氨基酸及人体造血所必需的维生素B12，因而它具有极佳的医疗和滋补功能，近年来，社会对其的需求量很大。鉴于野生冬虫夏草所处的生长环境为高寒特殊环境，其寄主蝙蝠蛾需三年以上才能完成一个时代，致使自然繁殖的虫草资源不足，产供矛盾本已十分突出，加之近年来人工过度采掘，又使生态环境遭到严重破坏，一些地区的冬虫夏草已濒临枯竭，建立有效的保护措施也已是刻不容缓。因此，本领域亟待寻求出新型的可通过工业化生产的冬虫夏草的无性型细胞体及其产品，使其成为天然冬虫夏草子实体的代用品，以缓解中药材的供需矛盾，保护生态环境，同时也为我国中草药进入国际市场及生产高附加值产品创一条道路。
本发明的目的之一在于针对已有技术现状，提供一种可替代天然冬虫夏草的冬虫夏草菌粉及其生产方法；本发明的另一个目的在于提供一种以上述冬虫夏草菌粉产品为原料提取种活性免疫虫草多糖冻干粉的生产方法及产品。
用于实现上述发明目的的整体设计思路是这样的依据冬虫夏草的生活史分有性型和无性型的特征，采用现代组织细胞培养技术，从天然冬虫夏草的有性子实体上分离获得冬虫夏草的无性型细胞，对其进行纯化和训化后，利用自动控制发酵法及喷雾干燥、细胞破碎等工序生产出冬虫夏草菌粉；继而以冬虫夏草菌粉为原料通过复合酶提取法及吸附法等工序制备出活性免疫虫草多糖冻干粉。
本发明所述的生产方法与产品包括根据天然冬虫夏草子实体纯菌种制备冬虫夏草菌粉的生产方法与产品以及以冬虫夏草菌粉为原料制备活性免疫虫草多糖冻干粉的生产方法与产品两种。
本发明所述生产冬虫夏草菌粉的方法由以下的生产工序构成(一)、优良纯菌株菌种的获得选天然冬虫夏草子实体的新鲜个体，用常规的初筛和复筛法从菌株中筛选出相对稳定且性能较好的菌株，然后依次通过分离、紫外线诱变、复壮及对照等常规微生物系统分离的方法获得相对优良的蝙蝠蛾拟青霉(paecilomyces hepiali Chen & Dai)菌种；(二)、用发酵法生产冬虫夏草菌体包括固体发酵法和液体发酵法两种，其中a、固体发酵生产法——使经过工序(一)获得的菌种在PH值为6.8～7.2的综合PDA培养基(该综合PDA培养基的每单位份物质配方为土豆粉20个重量单位，蔗糖20个重量单位，磷酸二氢钾1.5个重量单位，硫酸镁1个重量单位，维生素B10.02个重量单位，天然蛋白1.5个重量单位，麦麸30个重量单位，玉米粉10个重量单位。)上接种，并使之与培养基作固体发酵培养15～20天，培养温度为16～25℃，湿度70％；其后对菌体进行低温干燥，温度60℃以下，获得干燥菌体；b、液体发酵生产法——将经工序(一)获得的菌种置入PH值为6.8～7.2的综合PDA培养基液(该综合PDA培养基液的配方为土豆粉20g，蔗糖20g，磷酸二氢钾g，硫酸镁1g，维生素B120mg，天然蛋白0.5g，麦麸30g，玉米粉10g，水1000ml。)发酵缸中接种，并使之在培养基液中做深层发酵培养5～7天，培养温度为16～25℃；其后通过蒸发浓缩及板框过滤的方法使培养基液与生长后的菌体分离，对分离出的菌体进行喷雾干燥，获得干燥菌体；③、粉碎制取超细粉用细胞粉碎机将经工序(二)获得的干燥菌体制成粒度为-300目(粒径为4～10微米)的冬虫夏草菌粉的超细粉，粉碎过程中，环境温度不超过60℃；(四)、成品性能检测、包装、入库。
本发明所述的冬虫夏草菌粉的产品为经上述工序(一)～(四)制得的菌粉细胞破壁率＞95％。由于细胞及微粉是医药品提高药效的基础，中、西药的主要药效成分通常都分布于细胞内和细胞间质中，且以细胞内为主，当细胞破壁后，其细胞内有效成分暴露出来，细胞破壁率越高，产品的药效就越高，而且起效速度也越快。经陕西省产品检验所、陕西省卫生防疫站、陕西省中医研究院、西安交大附属医学院等单位对菌粉成品所做的测定分析结果表明该产品内核苷酸类物质、甘露醇、活性免疫虫草多糖等的含量均高于或等于天然冬虫夏草的含量，此外它还含有各种氨基酸、微量元素和有机硒等，其卫生指标符合国家标准，抗癌作用明显。这种通过人工制得的冬虫夏草菌粉不仅从化学组成、营养成份、药理作用上达到可以替代天然冬虫夏草的性能，而且其产品的组织形态也达到了国际制药行业对中药的最高要求，使产品可一次到位直接与国际市场接轨。
本发明的最终产品是利用冬虫夏草菌粉提取免疫活性多糖及其它产品。近几年来，本领域中关于真菌免疫活性多糖的研究报道很多，但产品却很少，其主要原因就是目前提取多糖生产工艺(如热水提取法、有机溶剂提取法、常规酶提取法等)的产量低、成本高、活性低。本发明针对现有技术的缺陷，采用复合酶法作为虫草多糖的提取方法，该方法克服了现有技术在提取过程中破坏生物活性分子的立体结构及降低生物活性能力等缺点，提高了提取率，获得了免疫活性高的虫草多糖，同时也降低了生产成本。由冬虫夏草菌粉生产免疫活性虫草多糖的工艺路线是在低于40℃条件下将1份蛋白水解酶、1～2份淀粉水解酶和1份纤维素水解酶分别加入10份冬虫夏草菌粉中，在含水量为75％的条件下将之搅拌均匀，继而在温度为25～40℃及PH值为6.0～8.0条件下作用45～90分钟后，采用常规的有机溶剂沉淀法提取上述物料中的多糖成分；再通过低温冷冻干燥法获得含量为75～85％的多糖粗制品；继而再利用蛋白水解酶、淀粉水解酶和纤维素水解酶分别与粗制品作用进行再提取，并利用吸附法对再提取物进行脱色处理后获得含量在95％以上的多糖精制品，最后再将多糖精制品冻干后，获得活性免疫虫草多糖冻干粉。
与传统的提取多糖法相比，利用复合酶法提取多糖的反应条件温和、酶反应性质专一，在一般条件下，不会破坏或影响多糖的立体结构和大分子主链结构的1，3-糖苷键骨架上的对抗肿瘤活性起重要作用的多羟基基团，从而达到保护活性基团生理活性作用不受影响的目的；此外，复合酶提取法的反应时间短、酶源可以利用糖化酶生产，其工艺简单易行、成本低，可根据需要随时生产，克服了一般酶源较难提取及酶源价值高的问题。根据上述方法获得的虫草多糖具有广泛的药理作用特别是免疫抗肿瘤作用，它的抗瘤活性主要依赖寄主的反应，也就是说它通过活化吞噬细胞和刺激产生抗体而达到提高人体免疫能力的生理功能，当抗体产生后，就表现为强烈的抗肿瘤活性和对癌细胞很强的抑制力，再加上虫草素和有机硒的作用，其药效相对广泛并实用，因而可以说它是预防和治疗一切疾病的功能性基质。
本发明所述产品的生产工艺完全实行生物技术生产，不采用任何化学物质，应用的原材料也全部来源于农副产品，并不产生任何污染源，所获产品属具有高附加值的珍稀中药原料和国内外先进稀少的生化特效药品原料，技术含量高、竞争力强、市场前景好，其技术方案的实施应用可有效缓解保护环境和人类需求的矛盾，并为我国实现珍稀、野生药材人工训化及工厂化生产代用品创立了先例。
权利要求
1.一种用于生产冬虫夏草菌粉的方法，其特征在于包括以下的生产工序1.1、优良纯菌株菌种的获得选天然冬虫夏草子实体的新鲜个体，用常规的初筛和复筛法从菌株中筛选出相对稳定且性能较好的菌株，然后依次通过分离、紫外线诱变、复壮及对照等常规微生物系统分离的方法获得蝙蝠蛾拟青霉菌种；1.2、用蝙蝠蛾拟青霉菌种发酵法生产冬虫夏草菌体包括固体发酵法和液体发酵法两种1.2a、固体发酵生产法——使经过1.1工序获得的菌种在PH值为6.8～7.2的综合PDA培养基上接种，并使之与培养基作固体发酵培养15～20天，培养温度为16～25℃；其后使培养基与生长菌体分离，并对菌体进行低温干燥，温度60℃以下，获得干燥菌体；1.2b、液体发酵生产法——将经1.1工序获得的菌种置入PH值为6.8～7.2的综合PDA培养基液发酵缸中接种，并使之在培养基液中做深层发酵培养5～7天，培养温度为16～25℃；其后通过蒸发浓缩及板框过滤的方法使培养基液与生长后的菌体分离，对分离出的菌体进行喷雾干燥，获得干燥菌体；1.3、粉碎制取超细粉用细胞粉碎机将经1.2工序获得的干燥菌体制成粒度为-300目的超细粉，粉碎过程中环境温度不超过60℃。
2.如权利要求1所述的生产冬虫夏草菌粉的方法，其特征是在1.2a过程中所用的每份固态综合PDA培养基的配方为土豆粉20个重量单位，蔗糖20个重量单位，磷酸二氢钾1.5个重量单位，硫酸镁1个重量单位，维生素B10.02个重量单位，天然蛋白1.5个重量单位，麦麸30个重量单位，玉米粉10个重量单位。
3.如权利要求1所述的生产冬虫夏草菌粉的方法，其特征是在1.2b过程中所用的每单位份综合PDA培养基液的配方为土豆粉20g，蔗糖20g，磷酸二氢钾g，硫酸镁1g，维生素B20mg，天然蛋白1.5g，麦麸30g，玉米粉10g，水1000ml。
4.一种冬虫夏草菌粉，其特征在于所说的菌粉为根据权利要求1所述生产方法制得的细胞破壁率＞95％的产品。
5.一种根据权利要求4所述冬虫夏草菌粉提取活性免疫虫草多糖冻干粉的方法，其特征是在低于40℃条件下将1份蛋白水解酶、1～2份淀粉水解酶和1份纤维素水解酶分别加入10份冬虫夏草菌粉中，在含水量为75％的条件下将之搅拌均匀，继而在温度为25～40℃及PH值为6.0～8.0条件下作用45～90分钟后，采用常规的有机溶剂沉淀法提取上述物料中的多糖成分；再通过低温冷冻干燥法获得含量为75～85％的多糖粗制品；继而再利用蛋白水解酶、淀粉水解酶和纤维素水解酶分别与粗制品作用进行再提取，并利用吸附法对再提取物进行脱色处理后获得含量在95％以上的多糖精制品，最后再将多糖精制品冻干后，获得活性免疫虫草多糖冻干粉。
6.一种活性免疫虫草多糖冻干粉，其特征在于所说的冻干粉为根据权利要求1和5所述生产方法制得的产品。
全文摘要
本发明依据冬虫夏草的生活史特征，采用现代组织细胞培养技术，从天然冬虫夏草的有性子实体上分离获得冬虫夏草的无性型细胞，对其进行纯化和训化后，利用自动控制发酵法及喷雾干燥、细胞破碎等工序生产出冬虫夏草菌粉；继而以冬虫夏草菌粉为原料通过复合酶提取法及吸附法等工序制备出活性免疫虫草多糖冻干粉。其技术方案的实施应用对缓解中药材的供需矛盾，保护生态环境、实现珍稀、野生药材人工训化及生产高附加值中草药产品等方面均具有积极的意义。
文档编号C12N1/14GK1546644SQ200310118988
公开日2004年11月17日 申请日期2003年12月11日 优先权日2003年12月11日
发明者孙悦迎, 陈瑞真, 张鑫 申请人:孙悦迎