无细胞蛋白合成所用的昆虫细胞提取液,其制备和应用的制作方法

文档序号:455205阅读:307来源:国知局
专利名称:无细胞蛋白合成所用的昆虫细胞提取液,其制备和应用的制作方法
技术领域
本发明涉及用于无细胞蛋白合成(cell-free protein synthesis)的昆虫细胞提取液的制备方法、昆虫细胞提取液和利用所述的昆虫细胞提取液在非细胞体系中合成蛋白质的方法,以及含有所述的昆虫细胞提取液的试剂盒,该试剂盒可以用于非细胞体系中蛋白质合成。
背景技术
近年来,大量生物的遗传信息(如人类基因组)已经披露。在这样的情况下,基于这些遗传信息的蛋白质功能分析和基因药物正向着后基因组研究的方向发展。与这些遗传信息相关的蛋白质在用于制备药物等产品的应用中时,需要在短时间内且能够简便易行的大量合成蛋白质。
现在,通过基因重组技术生成的能够自行生长发育的酵母细胞(下文中称为“细胞体系”)、昆虫细胞等表达体系,已被广泛地应用于蛋白质的合成中。但是,能自行生长发育的细胞因为需要保持其功能而表现出清除外源蛋白的倾向,由于在能自行生长发育细胞中毒性蛋白的表达而抑制了细胞的生长,使得许多蛋白质不能轻易的表达出来。
另一方面,作为脱离细胞体系的蛋白生产方法,无细胞蛋白合成的方法是已知的,它包含在试管中加入基质、酶等细胞破碎物、以及能够提供在较宽范围内选择生物遗传信息翻译体系的提取液等物质,这样就重新构建了一个合成体系,该体系能够将氨基酸残基按照由mRNA编码的目的蛋白质的特定顺序连接起来。这样的无细胞蛋白合成相对于上面提到的细胞体系不受任何限制,并且它能够在不损伤生物体的情况下合成蛋白质。另外,由于这样的蛋白质合成与生物体的生长过程等没有关系,因此相对与细胞体系而言能够在短时间内合成大量的蛋白质。而且由于无细胞蛋白合成方法能够大量的合成蛋白质,合成的蛋白质中还包含不能被生物体利用的氨基酸序列,所以它是很有前景的蛋白质表达体系。除了细胞破碎物或提取液应用于无细胞蛋白合成中外,还应该考虑使用由生物衍生而来的各种基质。昆虫细胞并不需要这样的基质,而不象许多哺乳动物那样,而它能在二氧化碳气体中生长,也能在没有血清的培养物中生长,并且够能大量表达出在细胞体系中经过翻译后修饰的具有特异生物活性的蛋白质,因此能够利用它们来表达各种各样的蛋白质。如果昆虫细胞能够用于非细胞体系、翻译后修饰(如糖基化)等中,这将是一个充满前景的应用。因此,昆虫细胞的应用发展受到越来越多的关注。
通常,为了从昆虫细胞中获得用于无细胞蛋白合成的提取液,使用如下已知的方法(参见JP-A-2000-325076),将昆虫细胞用惰性气体密封,然后降低压力,从而将昆虫细胞破碎获得提取液。然而,这种从昆虫细胞获得提取液的方法,需要特殊的装置和工具,还有复杂的操作过程。而且,复杂的操作是必要的,因为非细胞体系合成蛋白的能力很大程度上依赖于细胞的数量、氮气压力和在制备提提取液过程中密封的时间。另外,通过上述方法利用所述的提取液合成的蛋白质的数量是很少的,其可以检测到的水平是经过放射性标记的氨基酸。
因此,对昆虫细胞提取液制备方法的做了进一步研究,使得制备方法更加简单,以便满足大量合成蛋白质的需要。
发明概述本发明解决了上述提到的问题,并且提供了一种用于无细胞蛋白合成的昆虫细胞提取液的制备方法,所述的提取液容易制备且比一般的提取液具有更高的蛋白质合成能力,还提供了所述的昆虫细胞提取液和利用所述的昆虫细胞提取液在非细胞体系中合成蛋白质的方法,以及含有所述的昆虫细胞提取液的试剂盒,该试剂盒可以用于非细胞体系中蛋白质的合成。
本发明的发明者为了解决上面提到的问题进行了深入的研究,进而完成了本发明,提供了如下的

发明内容
(1)一种用于非细胞体系蛋白合成中的昆虫细胞提取液的制备方法,该方法包括至少一步快速冷冻悬浮在溶液中的昆虫细胞,为了从昆虫细胞中获得提取液。
(2)根据(1)所述的方法,所述的提取液来自于昆虫细胞,该昆虫细胞包含经过融化的快速冷冻过的昆虫细胞和经过离心的昆虫细胞。
(3)根据(1)或(2)所述的方法,所述的昆虫细胞在液氮中冷冻。
(4)根据(2)或(3)所述的方法,所述的昆虫细胞在-10℃至20℃的水浴或冰浴中融化。
(5)根据(1)至(4)所述的任一方法,所述的用于提取的溶液包含蛋白酶抑制剂。
(6)根据(1)至(5)所述的任一方法,进一步包括核酸酶的处理。
(7)根据(1)至(6)所述的任一方法,所述的昆虫细胞是一种来源于粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)卵子细胞(ovum)或草地夜蛾(Spodoptera fruglperda)卵巢细胞(ovary cell)或由粉纹夜蛾卵子细胞和草地夜蛾卵巢细胞形成的细胞组合物。
(8)一种用于无细胞蛋白合成的昆虫细胞提取液,所述的提取液根据(1)至(7)所述的任一方法制备得到。
(9)一种用于无细胞蛋白合成的方法,该方法包括使用(1)至(8)任一所述的昆虫细胞提取液。
(10)根据(9)所述的方法,还包括使用具有帽子结构的外源mRNA。
(11)一种用于无细胞蛋白合成的试剂盒,该试剂盒含有(8)中所述的昆虫细胞提取液。


图1是本发明优选的制备方法1-3的简明流程图。
图2是利用实施例1的昆虫细胞提取液进行反应的时间与合成的萤光素酶含量的关系图,纵坐标表示合成的萤光素酶含量(μg/ml),横坐标表示反应的时间(h)。
图3是分别使用实施例1和2的昆虫细胞提取液反应5h内合成的萤光素酶含量的变化关系图,纵坐标表示萤光素酶的相对含量(%),以没有用核酸酶处理过的提取液作为反应溶液在5h内合成的萤光素酶的含量作为100%,横坐标表示反应时间(h)。
图4是分别使用实施例1的昆虫细胞提取液和含有参考例3提到的mRNA的昆虫细胞提取液在10h内合成的萤光素酶相对含量与反应时间的关系图。
图5是使用实施例3的昆虫细胞提取液合成的萤光素酶的含量与反应时间的关系图,纵坐标表示合成的萤光素酶的含量(μg/ml),横坐标表示反应的时间(h)。
发明详述本发明的说明书中所述的“无细胞蛋白合成”是指利用非细胞翻译体系来合成由外源mRNA编码的蛋白质。这里所述的“蛋白质”是根据本发明所述的合成方法在非细胞体系中合成的,它包含有多种氨基酸残基组成的任意分子量的分子,例如从小分子量到发分子量的多肽。本发明所述的“蛋白质”还包括经过糖基化的糖蛋白。

发明内容
下文将具体的描述本发明的内容。
本发明提供了一种用于无细胞蛋白合成的昆虫细胞提取液的制备方法,其特征在于至少含有一步快速冷冻悬浮在用于提取的溶液中的昆虫细胞的步骤,为的是从昆虫细胞中得到提取液。为了获得上述的昆虫细胞提取液,将细胞在相对于上述通常的方法(详见JP-A-2000-325076)较温和的条件下破碎细胞,这样就可以在不损伤细胞的情况下把用于无细胞蛋白合成的基本成分提取出来,比用通常方法得到的提取液具有更高的在非细胞体系中合成蛋白质的能力。依据本发明所述的方法,此外,可以用加入核糖核酸酶及其类似物等手段阻止污染,基质的结合同时也阻止了翻译的进行,应当在细胞破碎时考虑使用降解剂及其类似物,以避免上述基质结合的发生。
本发明所述的制备方法需要快速冷冻悬浮在用于提取的溶液中的昆虫细胞。在本发明所述的制备方法中,“快速冷冻”是指在对细胞进行冷冻处理时冷冻的时间不超过10秒钟,最好不超过2秒钟。在本发明中如果昆虫细胞没有被快速的冷冻,那么用于蛋白质合成的基本成分就会失去活性,并且前述的本发明的效果就不能实现。
正如上面提到的那样,快速冷冻昆虫细胞的温度一般不高于-80℃,最好不高于-150℃。这是因为细胞快速冷冻的温度高于-80℃时,合成蛋白质的基本成分就会失去活性,那么合成蛋白质的能力就会下降。
上面提到的快速冷冻昆虫细胞的方法是可以实现的,例如使用液体氮气、液体氦气等惰性气体。最好使用液体氮气,因为较容易得到而且也比较经济。
根据本发明所述的制备方法,至少含有一步用于快速冷冻悬浮于提取用的溶液中的昆虫细胞,该步骤中含有昆虫细胞提取液,而其它的步骤没有特别的限制。例如,通常从大肠杆菌、小麦病菌提取用于无细胞蛋白合成的提取液的方法也可以用于昆虫细胞的破碎和提取,这样的方法还包括在研钵中捣碎细胞、使用杜恩斯匀浆机和使用玻璃珠等方法。由于昆虫细胞相对于大肠杆菌、小麦病菌等在用于制备无细胞蛋白合成的提取液时较容易破碎,并且可以得到具有高蛋白质合成能力的提取液,这是因为在细胞破碎的过程中进行了冷冻和融化,从而将用于蛋白质合成的基本成分的活性保留了下来,因此特别优选的使用经过快速冷冻、融化和离心过的上述的昆虫细胞。
当上述经过快速冷冻的昆虫细胞需要融化和离心时,所述细胞可以在-10℃至20℃的水浴或冰浴、放置在室温(25℃)中等条件下进行融化。为了防止合成蛋白质的基本成分的失活,当然也是为了防止蛋白质合成能力的降低,所述细胞最好在0℃至20℃的水浴或冰浴中融化(更优选于4℃至10℃中)。融化后的细胞在相关技术领域通常的条件下(10,000×g-50,000×g,0℃-10℃,10分钟-60分钟)进行离心。离心后的上清液含有所需的昆虫细胞提取液。
用于本发明的昆虫细胞的种类不受任何特别的限制,例如,所述的细胞优选于来源于鳞翅目昆虫、直翅目昆虫、双翅目昆虫、膜翅目昆虫、鞘翅目昆虫、脉翅目昆虫、半翅目昆虫等的细胞,而其它许多生物细胞系已经被确定了。此外,用于本发明的昆虫细胞可以是来自于任何组织的细胞,例如,血细胞、性腺衍生来的细胞、脂肪体衍生来的细胞、胚胎衍生来的细胞、孵化幼虫衍生来的细胞等,而没有任何特别的限制。当然,优先使用由性腺衍生来的细胞,因为它具有较高的蛋白质合成能力。特别的,使用来源于粉纹夜蛾卵子的High Five细胞(由Invitrogen生产)或来源于草地夜蛾卵巢的Sf21细胞(由Invitrogen生产)作为优选的昆虫细胞,因为它们在细胞体系中具有高的蛋白质合成能力而且还可以在没有血清的培养基中生长。
在本发明中,所述的昆虫细胞并不局限于单一物种的同一组织中,还可以是来源于同一昆虫种类的不同组织,或者是不同昆虫种类的不同组织。
本发明所述的制备方法中,用于提取的溶液没有特别的限制,但最好是含有一种蛋白酶抑制剂。当用于提取的溶液中含有蛋白酶抑制剂时,昆虫细胞提取液中的蛋白酶活性就会被抑制,从而防止了在所述提取液中不必要的活性蛋白质的降解,这样来源于昆虫细胞的提取液就具有了更高效的蛋白质合成能力。
上述的蛋白酶抑制剂没有特别的限制,只要它具有抑制蛋白酶的作用,例如,苯甲醇磺基的氟化物(下文中被称为“PMSF”)、抑酶肽、苯丁抑制素、亮抑酶肽、抑胃酶肽A、E-64(L-反式-环氧琥珀酰-L-亮氨酸(4-胍基)丁烷)、乙二胺四乙酸、膦酰二肽等都可以使用。由于昆虫细胞提取液中含有丝氨酸蛋白酶,所以优先使用上面提到的PMSF,因为它能特异性的抑制丝氨酸蛋白酶的活性。不仅可以使用单一蛋白酶抑制剂,而且还可以使用多种蛋白酶抑制剂的混合物(蛋白酶抑制剂的鸡尾酒)。
用于提取的溶液中蛋白酶抑制剂的含量没有任何特殊的限制,但较好在1μM-50mM,最好在0.01mM-5mM的范围内,此时蛋白酶的活性被较好的抑制住,因为蛋白酶的分解对于实现本发明的反应来说是必要的。这是因为蛋白酶抑制剂的含量的含量低于1μM时,蛋白酶的活性不能被完全的抑制,当含量高于50mM时,合成蛋白质的反应可能会被抑制。
本发明中所述的用于提取的溶液,除了含有上面提到的蛋白酶抑制剂外,最好至少还含有钾盐、镁盐、二硫代苏糖醇和缓冲剂只要不抑制本发明所述的反应,上面提到的钾盐没有任何特别的限制,可以用它的一般的形式,例如醋酸钾、碳酸钾、碳酸氢钾、氯化钾、磷酸氢二钾、柠檬酸氢钾、硫酸钾、磷酸二氢钾、碘化钾磷酸钾等形式,可以参考给出的醋酸钾。钾盐是所述的蛋白质合成反应中的辅助因子。
用于提取的溶液中的钾盐含量没有任何特别的限制,但从稳定性方面考虑,钾盐的含量较好在10mM-500mM,最好在50mM-300mM的范围内,在这中情况下使用单价的钾盐,如醋酸钾等。当钾盐的含量低于10mM或高于500mM时,用于蛋白质合成的基本成分可能会不稳定。
只要不抑制本发明所述的反应,上面提到的镁盐没有任何特别的限制,可以用它的一般的形式,例如醋酸镁、硫酸镁、氯化镁、柠檬酸镁、磷酸氢镁、碘化镁、乳酸镁、草酸镁等,可以参考给出的醋酸镁。镁盐也是所述的蛋白质合成反应中的辅助因子。
用于提取的溶液中的镁盐含量没有任何特别的限制,但从稳定性方面考虑,钾盐的含量较好在0.1mM-10mM,最好在0.5mM-5mM的范围内,在这中情况下使用二价的钾盐,如醋酸镁等。当镁盐的含量低于0.1mM或高于10mM时,用于蛋白质合成的基本成分可能会不稳定。
上面提到的二硫代苏糖醇(下文中被称为“DTT”)是作为抗氧化剂被加入的,它在提取液中的含量较好在0.1mM-10mM,最好在0.5mM-5mM的范围内。当DTT的含量低于0.1mM或高于10mM时,用于蛋白质合成的所述基本成分可能会不稳定。
上面提到的缓冲剂使得提取液具有一定的缓冲容量,该缓冲剂可以防止由提取液pH急剧变化而引起的提取液变性,例如在提取液中加入酸性或碱性物质时。这样的缓冲剂没有任何特别的限制,例如可以是HEPES-KOH、Tris-HCL、醋酸-醋酸钠、柠檬酸-柠檬酸钠、磷酸、硼酸、MES、PIPES等。
所述的缓冲剂能够将提取液的pH值维持在4-10的范围内,最好是pH6.5-8.5的范围内。当所述提取液的pH值低于4或高于10时,用于本发明所述反应的基本成分就会失活,从这方面考虑,特别优选使用HEPES-KOH(pH6.5-8.5)的缓冲体系。
所述提取液中缓冲剂的含量没有任何特殊的限制,在优选的5mM-200mM,更优选的10mM-100mM范围内时具有更好的缓冲容量。当缓冲剂的含量低于5mM时,由于酸性或碱性物质的加入会使pH值会急剧的改变,当缓冲剂的含量高于200mM时,由于盐浓度太高而使得用于蛋白质合成的基本成分变得不稳定。
此外,如果在上面提到的用于提取的溶液中加入氯化钙和甘油,那么就进一步提高了昆虫细胞提取液的蛋白质合成能力。
在这种情况下,氯化钙的含量没有特别的限制。为了更有效的发挥上面提到的提取液的蛋白质合成能力,氯化钙的含量范围优选于0.1mM-10mM,更优选于0.5mM-5mM。此外,甘油的含量也没有特别的限制,为了更有效的发挥上面提到的提取液的蛋白质合成能力,甘油的添加比例优选于5(v/v)%-80(v/v)%,更优选于10(v/v)%-50(v/v)%。
在制备本发明所述的昆虫细胞提取液时,为了得到用于无细胞蛋白合成的昆虫细胞提取液,而进行的细胞破碎,但破碎之后的其它步骤没有特别的限制。图1是本发明优选的制备方法1-3的简明流程图。在图1中制备方法1-3中每一个制备方法都含有前述的快速冷冻、融化和离心用于破碎细胞的方法。
如图1所示,用本发明所述的制备方法破碎细胞之后,经过上述的离心步骤后得到的上清液(上清液1A),也可以作为提取液,或者进一步将上清夜1A离心(10,000×g-100,000℃×g,0℃-10℃,10分钟-120分钟)后得到的上清液(上清液1B),也可以作为提取液(上清液1)(下文中称为制备方法1)。而且,上述的上清液1(上清液1A和1B)经过凝胶过滤后得到的组分(具有高吸光度的组分),在280nm处有不低于10的吸光度,该组分也可以作为提取液(下文中被称为制备方法2)。下面将具体的描述制备方法2的操作步骤。
首先,将悬浮液1A或1B进行凝胶过滤。为了进行凝胶过滤,优先使用脱盐柱(由Amersham Biosciences公司生产),根据通常的方法,用上面提到的用于凝胶过滤的缓冲液来平衡柱子、上样和洗脱。通常所知的含有适当组分的缓冲液可以作为凝胶过滤的缓冲液,而没有任何特别的限制。例如,用于凝胶过滤的缓冲液,含有10mM-100mM的HEOES-KOH(pH6.5-8.5)、50mM-300mM的醋酸钾、0.5mM-5mM醋酸镁、0.5mM-5mM的DTT和0.01mM-5mM的PMSF。凝胶过滤后的滤液通常被分成0.1-1mL的组分,优选于每组分是0.4-0.6mL,这样就可以有效的得到具有高蛋白质合成能力的组分。
其次,经过凝胶过滤后且在280nm处的吸光度不低于30的组分被过滤分离出来,通过Ultrospec 3300 pro(由Amersham Biosciences公司生产)检测,该组分可以作为提取液。
利用上述制备方法2得到的具有高吸光度的组分,还可以再进一步的离心而得到的上清液(上清液2)也可以作为提取液(下文中被称为制备方法3)。经过凝胶过滤之后的离心条件优选于30,000×g-100,000×g、0℃-10℃、10分钟-60分钟,为的是除去抑制翻译进行的不溶性组分。
使用本发明所述制备方法的细胞,最好在所述的快速冷冻前预先进行清洗,清洗液最好是使用含有与上述的用于昆虫细胞提取的溶液相同的组合物的溶液,除了该溶液不含有蛋白酶抑制剂和甘油,这样用于培养的培养基将不再进行转化反应。清洗还包括使用用于清洗昆虫细胞的清洗液,在离心的条件下清洗细胞(如7,000×g,4℃下10分钟)。为完全去除培养基,用于清洗的清洗液含量优选于5mL-100mL,更优选于10mL-50mL每1g(净重)的昆虫细胞。清洗的次数优选于1-5次,更优选于2-4次。
另外,虽然本发明所述的制备方法中昆虫细胞的含量没有特别的限制,但优选于在每1mL的提取液中含有0.1g-5g的昆虫细胞,更优选于0.5g-2g,这样可以较好的保持提取液的效率。
根据本发明所述方法制备得到的昆虫细胞提取液,来自于昆虫细胞提取液中的蛋白质浓度优选于1mg/mL-200mg/mL范围内,更优选于10mg/mL-100mg/mL。当提取液中的蛋白质浓度低于1mg/mL时,完成本发明所需的基本成分的浓度就会降低,影响了合成反应的充分进行。当提取液中的蛋白质浓度高于200mg/mL时,使得提取液本身具有了很高的粘度,操作也将变得困难起来。
从昆虫细胞得到的提取液的含量是由上述蛋白质的浓度决定的。例如,可以用BCA蛋白质分析仪(由PIERCE公司生产)检测上述蛋白质的浓度。特别的,将1mL的样品加入到2mL的反应试剂中,在37℃中反应30分钟,用分光光度计(由Amersham Biosciences公司生产的Ultrospec 3300 pro)在562nm处测量吸光度。作为对照,通常用牛血清白蛋白(BSA)建立标准曲线,这样测量的方法就完备了。
上述的提取液不论其是否含有来源于昆虫细胞的的提取液,它还由提取液中核糖体RNA的碱基序列来决定。
本发明所述的提取液最好含有来源于昆虫细胞的提取液,所述的昆虫细胞提取液的蛋白质浓度为10mg/mL-100mg/mL,同时还含有50mM-300mM的醋酸钾、0.5mM-5mM的醋酸镁、0.5mM-5mM的DTT、0.01mM-5mM的PMSF和10mM-100mM的HEPES-KOH(pH6.5-8.5)。
本发明所述的昆虫细胞提取液最好在无细胞蛋白合成之前用核酸酶处理。经过核酸酶处理过的昆虫细胞提取液用于无细胞蛋白合成时,比未经过核酸酶处理的昆虫细胞提取液能够合成更多的目的蛋白质。这是因为下述的理由。
当在非细胞体系中合成目的蛋白质时,来自于细胞提取液的外源mRNA的存在,合成了由该外源mRNA编码的蛋白质。当在非细胞体系中目的蛋白质被标记时,由上述外源mRNA编码的蛋白质也被标记了,这就给后面的目的蛋白质的分析带来了困难。此外,上述外源mRNA的存在使得目的蛋白质的合成量急剧的减少。因此,在用于无细胞蛋白合成的细胞提取液中不希望有上述外源mRNA的存在。
通常已知合适的方法在核酸酶处理中没有特别的限制,由于外源mRNA是被选择性的去除,所以最好选用微球菌核酸酶(由Roche Diagnostics生产)来处理昆虫细胞提取液,该核酸酶在钙离子存在的条件下选择性降解mRNA。
特别的,将微球菌核酸酶(由Roche Diagnostics生产)和氯化钙一起加入到昆虫细胞提取液中混合,在15℃-25℃反应5分钟-60分钟。因为在加入用于蛋白合成的外源mRNA和基本成分翻译开始进行后,这时微球菌核酸酶就会降解,所以微球菌核酸酶最终加入的浓度优选于在10μg/mL-100μg/mL范围内,更优选于30μg/mL-60μg/mL。并且,由于氯化钙可能抑制翻译的进行,而且对微球菌核酸酶的活性起着重要的作用,所以它的最终加入浓度优选于在0.05mM-50mM范围内,更优选于0.1mM-1mM。进行完上述的反应之后,钙离子需要被螯合掉,因为微球菌核酸酶的活性依赖于钙离子,所以加入聚乙二醇二(2-氨乙基乙醚)四乙酸(下文中被称为EGTA)能使微球菌核酸酶失活。为了使钙离子被充分的螯合掉,EGTA的最终加入浓度优选于0.1mM-100mM范围内,更优选于1mM-20mM。
本发明同时也提供了一种利用上述提取液用于无细胞蛋白合成的方法。为了现实这样的合成反应,需要制备所需反应溶液,该反应溶液通常含有上面所述的提取液和在非细胞体系中蛋白质合成的必要添加物。上述的添加物只要能够用于无细胞蛋白合成的领域中,就没有任何特别的限制。
上述的反应溶液优选以如下方式制备包含体积比10(v/v)%-80(v/v)%,特别是30(v/v)%-60(v/v)%的本发明的提取物。
换一种表达方式,反应溶液优选以如下方式制备昆虫细胞提取物在上述反应溶液中的含量是0.1mg/ml-160mg/ml,更优选是3mg/ml-60mg/ml。如果提取物的蛋白含量低于0.1mg/ml或高于160mg/ml,目标蛋白的合成率可能会比较低。
总的来说,上述反应溶液的成分除了包含上述的提取物以外,至少还包含钾盐,镁盐,DTT,5’-三磷酸腺苷,5’-三磷酸鸟苷,磷酸肌氨酸,肌氨酸激酶,氨基酸成分,RNase抑制剂,tRNA,外源mRNA和缓冲液。上述成分使反应溶液用于非细胞体系蛋白的合成得以实现,非细胞体系蛋白合成的优点在于它能在短时间内合成大量的蛋白质。
提到反应溶液中的钾盐,可以使用上述的作为提取物溶液成分的各种钾盐,优选是醋酸钾。从前述的提取物溶液中钾盐的单方面来看,包含在反应溶液中钾盐的比例,优选是10mM-500mM,更优选是50mM-150mM。
提到反应溶液中的镁盐,可以使用上述的作为提取物溶液成分的各种镁盐,优选是醋酸镁。从前述的提取物溶液中镁盐的单方面来看,包含在反应溶液中镁盐的比例,优选是0.1mM-10mM,更优选是0.5mM-3mM。
从前述的提取物溶液中DTT的单方面来看,包含在反应溶液中DTT的比例,优选是0.1mM-10mM,更优选是0.2mM-5mM。
考虑到蛋白的合成率,包含在反应溶液中5’-三磷酸腺苷(下文中有时称为“ATP”)的比例,优选是0.01mM-10mM,更优选是0.1mM-5mM。如果ATP的含量低于0.01mM或高于10mM,蛋白的合成率往往会低一些。
考虑到蛋白的合成率,包含在反应溶液中5’-三磷酸鸟苷(下文中有时称为“GTP”)的比例,优选是0.01mM-10mM,更优选是0.05mM-5mM。如果GTP的含量低于0.01mM或高于10mM,蛋白的合成率往往会低一些。
反应溶液中的磷酸肌氨酸,作为蛋白连续合成的组分之一,用于ATP和GTP的再生。考虑到蛋白的合成率,包含在反应溶液中磷酸肌氨酸的比例,优选是1mM-200mM,更优选是10mM-100mM。如果磷酸肌氨酸的含量低于1mM,大量的ATP和GTP将可能不容易再生。因此,蛋白的合成率往往会更低。如果磷酸肌氨酸的含量超过了200mM,它就会作为一种抑制物质起作用,蛋白的合成率往往也会更低。
反应溶液中的肌氨酸激酶,作为蛋白连续合成的组分之一,与磷酸肌氨酸同时加入,用于ATP和GTP的再生。考虑到蛋白的合成率,包含在反应溶液中肌氨酸激酶的比例,优选是1μg/ml-1000μg/ml,更优选是10μg/ml-500μg/ml。如果肌氨酸激酶的含量低于1μg/ml,大量的ATP和GTP将可能不会再生。因此,蛋白的合成率往往会更低。如果肌氨酸激酶的含量超过了1000μg/ml,它就会作为一种抑制物质起作用,蛋白的合成率往往也会更低。
反应溶液中的氨基酸成分,包含至少20种氨基酸,例如,缬氨酸,甲硫氨酸,谷氨酸,丙氨酸,亮氨酸,苯丙氨酸,甘氨酸,脯氨酸,异亮氨酸,色氨酸,天冬酰氨,丝氨酸,苏氨酸,组氨酸,天冬氨酸,酪氨酸,赖氨酸,谷氨酰氨,半胱氨酸,以及精氨酸。氨基酸也包括放射性同位素标记的氨基酸。如果需要,而且也可以包含修饰的氨基酸。氨基酸成分在总体上包含几乎等量的上述20种氨基酸。
本发明中,考虑到蛋白的合成率,包含在反应溶液中上述氨基酸成分的比例,优选是1μM-1000μM,更优选是10μM-200μM。如果氨基酸成分的含量低于1μM或高于1000μM,蛋白的合成率往往会低一些。
反应溶液中的RNasc抑制剂,在本发明的非细胞体系蛋白合成中,可以防止RNase酶解mRNA和tRNA,从而防止其阻碍蛋白的合成。RNase来自于昆虫细胞,是提取溶液的干扰物质。包含在反应溶液中RNase抑制剂的比例,优选是0.1U/μL-100U/μL,更优选是1U/μL-10U/μL。如果RNase抑制剂的含量少于0.1U/μL,RNase的降解活性往往不能被充分抑制;如果RNase抑制剂的含量超过100U/μL,蛋白的合成反应往往被抑制。
提到反应溶液中的外源mRNA,它编码的蛋白(包括肽)没有特别的限制,只要mRNA不是来自昆虫细胞,以及mRNA能编码一种毒性蛋白或一种糖蛋白。包含在反应溶液中的mRNA,是外源性的mRNA,还是来自于昆虫细胞的mRNA,可以通过以下步骤来确定分离纯化来自提取溶液的mRNA,使用反转录酶合成cDNA,分析获得的cDNA的碱基序列,以及与已知的外源mRNAs比较碱基序列。
使用的外源mRNA在碱基的数量上没有特别的限制,所有的外源mRNAs可以有数量不同的碱基,只要它们能合成目标蛋白。另外,只要序列的同源性达到允许目标蛋白合成的程度,每个外源mRNA有至少多于一个的碱基,可以缺失,替换,插入或添加。
本发明的外源mRNA可以是商业上有用的mRNA,或者是把目标蛋白的ORF(开放阅读框)插入到商业上可用的载体—5’-β-球蛋白引导序列—的下游,如pTNT载体(Promega公司生产),用得到的载体进行转录反应。另外,由核糖核酸的甲基化及其类似方法而形成的具有帽结构的外源mRNA在转录反应中也可以使用。
考虑到蛋白的合成率,包含在反应溶液中的外源mRNA的比例,优选是5μg/ml-2000μg/ml,更优选是20μg/ml-1000μg/ml。如果外源mRNA的含量少于5μg/ml或超过2000μg/ml,蛋白的合成率往往会降低。
反应溶液中的tRNA,包含几乎等量的相应于上述20种氨基酸的每一种tRNAs。在本发明中,考虑到蛋白的合成率,包含在反应溶液中的tRNA的比例,优选是1μg/ml-1000μg/ml,更优选是10μg/ml-500μg/ml。如果tRNA的含量少于1μg/ml或超过1000μg/ml,蛋白的合成率往往会降低。
反应溶液中的缓冲液,优选是与本发明前述提取液中使用的缓冲液类似。HEPES-KOH(PH6.5-8.5)由于它与本发明前述提取液中使用的缓冲液相同,所以是优选的。从前述的包含在提取液中的缓冲液的单方面来看,缓冲液的含量优选是5mM-200mM,更优选是10mM-50mM。
上述的反应溶液最好包含EGTA。这是因为,提取液中的EGTA与其中的金属离子可以形成一种螯合剂,使核糖核酸酶、蛋白酶及其类似物失活,从而可以抑制本发明蛋白合成中的必需组分的降解。即使上述的提取液使用了核酸酶的处理,核酸酶对随后的无细胞蛋白合成的不利影响也肯定能够被抑制,因为反应溶液中包含有EGTA。上述反应溶液中包含的EGTA,优选是0.01mM-50mM,更优选是0.1mM-10mM,考虑到其能够较好的发挥上述的降解抑制能力。如果EGTA的含量少于0.01mM,必需组分的降解不能被充分抑制。如果EGTA的含量超过了50mM,往往能够抑制蛋白的合成反应。
也就是说,用于本发明的无细胞蛋白合成方法的反应溶液,优选包含体积比为30(v/v)%-60(v/v)%的上述提取液,50mM-150mM的醋酸钾,0.5mM-3mM的醋酸镁,0.2mM-5mM的DTT,0.1mM-5mM的ATP,0.05mM-5mM的GTP,10mM-100mM的磷酸肌氨酸,10μg/mL-500μg/mL的肌氨酸激酶,10μM-200μM的氨基酸成分,1U/μL-10U/μL的RNase抑制剂,10μg/mL-500μg/mL的tRNA,20μg/mL-1000μg/mL的外源mRNA,以及10mM-50mM的HEPES-KOH(PH6.5-8.5)。另外,除了上述的物质以外,反应溶液最好还包括0.1mM-10mM的EGTA。
本发明的非细胞体系蛋白合成方法,用上述的本发明的提取液,例如,在常规已知的低温培养器中进行。在合成反应中,包含上述提取液的反应溶液通常被制备和使用。
反应温度通常在10℃-40℃的范围内,优选是15℃-30℃。如果反应温度低于10℃,蛋白的合成率往往会更低;如果反应温度超过40℃,反应溶液中的必需组分往往会发生变性。
反应时间通常是1hr-72hr,最好是3hr-24hr。
本发明也涉及到包含本发明昆虫细胞提取液的非细胞体系蛋白合成的试剂盒。包含在试剂盒里的昆虫细胞提取液,最好经过核酸酶处理。昆虫细胞,最好是来自于粉纹夜蛾卵子或草地夜蛾卵巢细胞的培养细胞。
试剂盒最好还进一步包括选自下列组的全部或部分钾盐,镁盐,DTT,5’-三磷酸腺苷,5’-三磷酸鸟苷,磷酸肌氨酸,肌氨酸激酶,氨基酸成分,RNase抑制剂,tRNA,和缓冲液。这些组分,以粉末或溶液的形式包含在试剂盒中。这些组分的全部或部分,可以以混合的状态包含在试剂盒中。试剂盒的各种组分,最好分别包装于一个包装盒中。
用本发明的非细胞体系蛋白合成方法合成的蛋白,可以用酶活分析,SDS-PAGE,免疫分析,以及其它的类似方法来测定。
用本发明的非细胞体系蛋白合成方法合成的蛋白,不受任何特别的限制。
实施例部分本发明在下文中以实施例的方式进行详细地解释,但不是限制性的解释。
参考实施例1昆虫细胞的培养High Five(Invitrogen公司生产)昆虫细胞(2.1×107个细胞)用ExpressFive无血清培养基(Invitrogen公司生产),补加L-谷氨酰胺,在培养瓶(600cm2)中27℃培养6天。结果是,细胞量达到1.0×108,湿重1.21g。
实施例1昆虫细胞提取液的制备收集上述参考实施例1中培养的昆虫细胞,用下列组合物组成的抽提用的溶液洗涤3次(700×g,4℃下离心10分钟),然后悬浮在1mL的抽提溶液中。
60mM HEPES-KOH(PH7.9)200mM醋酸钾4mM 醋酸镁4mM DTT
0.5mM PMSF上述悬浮液在液氮中迅速冷冻(在10秒之内)。充分冷冻之后,悬浮液在大约10℃的水浴中解冻。完全解冻之后,15000×g 4℃下离心15分钟(himacCR20B3,Hitachi Koki公司制造),回收上清液。回收的上清液(1.5mL),用下列组分的凝胶过滤缓冲液平衡过的PD-10脱盐柱(AmershamBiosciences公司生产)处理。
40mM HEPES-KOH(PH7.9)100mM醋酸钾2mM 醋酸镁1mM DTT0.5mMPMSF脱盐处理之后,上清液用凝胶过滤缓冲液(4mL)洗脱,使用分光光度计(Ultrospec 3300 pro,Amersham Biosciences公司制造)对在280nm处吸光度不低于30的洗脱液部分进行回收。回收的滤液,进一步进行45,000×g,4℃下离心30分钟,其上清液用作昆虫细胞提取液。
参考实施例2外源mRNA的制备(1)载体DNA的构建用pGEM-luc载体(5ng,Promega公司生产)作为模板,加入SEQ ID;NO 1描述的碱基序列引物(Luc T7-F3-Kpn),SEQ ID;NO 2描述的碱基序列引物(Luc T7-R4-Kpn),以及KOD(TOYOBO公司生产),97℃,15秒;55℃,30秒;68℃,120秒,运行30个PCR循环。DNA片段用乙醇沉淀纯化,再用KpnI限制性酶消化。
相应地,pTNT载体(Promega公司生产)也用KpnI限制性酶消化。消化过的反应溶液,通过琼脂糖凝胶电泳进行分离,再使用Gen洗脱凝胶纯化试剂盒(Gen Elute Gel Purification Kit,SIGMA公司生产),进行DNA片段的纯化。使用Ligation High(TOYOBO公司生产),对纯化的DNA片段进行连接,然后转化Escherichia coli DH5α(TOYOBO公司生产)。质粒DNA用碱-SDS抽提法从转化的Escherichia coli中分离,然后用SEQ ID;NO 3描述的碱基序列引物(T7启动子)和Big Dye终止子循环顺序FS(Big Dye TerminatorCycle Sequencing FS,Applied Biosystems公司生产)进行扩增测序反应(96℃下10秒,50℃下5秒,60℃下4分钟,运行30个循环)。扩增的反应溶液,用ABI PRISM 310基因测序仪(ABI PRISM 310 Genetic Analyzer,Applied Biosystems公司生产)进行碱基序列的分析。将把荧光素酶基因的起始密码子插入到源自5’-β-球蛋白引导序列的pTNT载体下游的质粒,命名为pTNT-Luc。
(2)体外转录反应上述(1)中制备的pTNT-Luc用BamHI酶消化,然后用苯酚-氯仿抽提,乙醇沉淀纯化。用纯化的pTNT-Luc作为模板,进行体外转录反应。转录反应溶液使用下列的组合物[转录反应溶液组合物]80mM HEPES-KOH(PH7.4)24mM 醋酸镁40mM DTT7.5mM NTPs(ATP,GTP,UTP,CTP)2mM 亚精胺1U/μLRNase抑制剂(来源于人胎盘)1U/μLT7 RNA聚合酶50μg/mL pTNT-Luc/BamHINTPs(SIGMA公司生产),RNase抑制剂(TAKARA SHUZO公司生产),和T7 RNA聚合酶(Promega公司生产)分别使用。使用低温干燥仪MG-1000(TOKYO RIKAKIKAI公司生产)作为反应装置。转录反应在37℃进行4小时,反应溶液的量是20μL。
(3)外源mRNA的纯化转录反应完成之后,1U不含RNase的RQ1 DNase(RQ1 RNase freeDNase,Promega公司生产)加入到上述(2)的反应溶液(20μL)中。混合物在37℃保温15分钟,使模板DNA消化。蛋白用苯酚-氯仿抽提法除去,加入终浓度为0.3M的醋酸钾,进行乙醇沉淀。获得的沉淀,用100μL的双蒸水溶解,然后上Nick柱(Amersham Biosciences公司生产)用双蒸水(400μL)洗脱。洗脱部分进行回收,再加入终浓度为0.3M的醋酸钾,接着进行乙醇沉淀。合成的外源mRNA,在260nm处进行吸光度的测量。结果是,20μL的反应溶液中有大约60μg的外源mRNA合成。
实验实施例1用实施例1中的昆虫细胞提取液和参考实施例2中的外源mRNA进行非细胞体系蛋白合成用实施例1中制备的昆虫细胞提取液和参考实施例2中合成的外源mRNA,制备如下组分的反应溶液,进行非细胞系统的蛋白合成。
50(v/v)%昆虫细胞提取液40mM HEPES-KOH(PH7.9)100mM醋酸钾2mM 醋酸镁2mM DTT0.5mMATP0.25mM GTP20mM 磷酸肌氨酸200μg/mL肌氨酸激酶80μM氨基酸(20种)0.25mM EGTA1U/μL RNase抑制剂(来源于人胎盘)200μg/mLtRNA320μg/mL外源mRNAATP(SIGMA公司生产),GTP(SIGMA公司生产),氨基酸(20种,SIGMA公司生产),RNase抑制剂(TAKARA SHUZO公司生产),以及tRNA(RocheDiagnostics公司生产)要分别使用。使用低温干燥仪MG-1000作为反应装置。反应溶液量是25μL,反应温度是25℃,反应时间间隔取样,测定荧光素酶的合成量。合成的荧光素酶,用荧光素酶分析试剂盒(E-1500,Promega公司生产)定量。将反应溶液(2.5μL)加入到荧光素酶分析试剂(50μL)中,由荧光素酶产生的荧光用光度计(Tuner Designs TD-20/20,Promega公司生产)进行测量。
图2显示了用实施例1中的昆虫细胞提取液在每个反应时间间隔合成的荧光素酶量。图2中,纵坐标表示合成的荧光素酶量(μg/mL),横坐标表示反应时间(h)。如图2所示,蛋白合成反应在反应开始后进行了8小时,合成了24.7μg/mL的荧光素酶。
实施例2实施例1中的昆虫细胞提取液的核酸酶处理在实施例1中的提取液中,加入微球菌核酸酶(Roche Diagnostics公司生产,终浓度36μg/mL)和氯化钙(终浓度0.36mM),混合溶液在20℃反应15分钟。反应后,加入终浓度为6mM的EGTA,得到的混合溶液再用作昆虫细胞提取液。
实验实施例2用实施例2中的昆虫细胞提取液和参考实施例2中的外源mRNA进行非细胞体系蛋白合成除了使用了实施例2中制备的昆虫细胞提取液和参考实施例2中合成的外源mRNA以外,其它组分与实验实施例1中的相同,制备与实施例1中有相似组分的反应溶液,进行非细胞体系的蛋白合成。
图3显示了用实验实施例1和2的昆虫细胞提取液,在合成反应开始后的5小时中,荧光素酶合成量的变化。图3中,纵坐标是以未经核酸酶处理的提取液在反应5小时后反应溶液中荧光素酶含量作为100%计算,来表示的荧光素酶的相对合成量(%),横坐标表示反应时间(h)。如图3所示,如果使用实施例2中核酸酶处理过的昆虫细胞提取液,蛋白的合成量会增加。
参考实施例3帽结构的添加已知许多真核细胞mRNAs中的7-甲基鸟嘌呤5’帽结构,能够使mRNA稳定,并且可以提高mRNA对核糖体的亲和力。如果在转录反应中加入甲基化的核糖核苷酸,转录产物的5’末端会形成帽结构。更明确地,有帽结构的外源mRNA可以按下文中的步骤合成。
以参考实施例2(1)中相同方式生产的pTNT-Luc,用BamHI消化,然后用苯酚-氯仿抽提和乙醇沉淀,进行纯化。以纯化的pTNT-Luc作为模板,核糖7-甲基帽类似物(Ribo m7Cap Analog,Promega公司生产)作为甲基化的核糖核苷酸,进行体外转录反应。转录反应溶液的组成如下[转录反应溶液组合物]80mM HEPES-KOH(PH7.9)24mM 醋酸镁40mM DTT7.5mM ATP7.5mM UTP7.5mM CTP0.6mM GTP3mM核糖7-甲基帽类似物2mM亚精胺1U/μL RNase抑制剂(来源于人胎盘)1U/μL T7 RNA聚合酶50μg/mL pTNT-Luc/BamHI实验实施例3除了使用了实施例1中制备的昆虫细胞提取液和参考实施例3中合成的有帽结构的外源mRNA以外,制备与实施例1中有相同组分的反应溶液,进行非细胞体系的蛋白合成。结果是,反应10小时后合成的荧光素酶,大约是无帽结构外源mRNA合成量(实验实施例1)的2.6倍。
图4显示了用实施例1中的昆虫细胞提取液和参考实施例3中的mRNA,在合成反应开始后的10小时中,荧光素酶合成量的变化。图4中,纵坐标是以实施例1中的昆虫细胞提取液和无帽结构的外源mRNA(参考实施例2)在反应10小时后反应溶液中荧光素酶含量作为100%计算,来表示的荧光素酶的相对合成量(%),横坐标表示反应时间(h)。
比较实施例1除了将参考实施例1中以相同方式培养的High Five(Invitrogen公司生产)昆虫细胞冷却,悬浮,剧烈振荡5分钟用于抽提之外,以实施例1和实验实施例1中相同的方式,进行非细胞体系的蛋白合成。
结果是,反应在2小时后终止了,荧光素酶的合成量是20ng/mL,大约是实验实施例1中合成量的1/1000。
比较实施例2除了将参考实施例1中以相同方式培养的High Five(Invitrogen公司生产)昆虫细胞溶解在一种细胞裂解试剂中(Cell Culture Lysis Reagent,Promega公司生产)然后抽提之外,以实施例1和实验实施例1中相同的方式,进行非细胞体系的蛋白合成。
结果是,反应在2小时后终止了,荧光素酶的合成量是200ng/mL,大约是实验实施例1中合成量的1/100。
参考实施例4昆虫细胞的培养Sf21(Invitrogen公司生产)昆虫细胞27℃在sf900-II无血清培养基上培养。将每毫升培养基含有的6.0×105个Sf21细胞,在培养基中(50mL)悬浮培养,以125mL厄氏摇瓶(Erlenmeyer flask),27℃,130rpm,培养5天。结果是,每毫升培养基细胞量达到了1.0×108,湿重3g。用这些细胞,制备细胞提取液。
实施例3昆虫细胞提取液的制备首先,收集上述参考实施例4中培养的昆虫细胞,用下列组分组成的洗涤溶液洗涤3次(700×g,4℃下离心10分钟),然后悬浮在3mL有下列组分的抽提溶液中。
40mMHEPES-KOH(PH7.9)100mM 醋酸钾2mM 醋酸镁2mM 氯化钙1mM DTT[抽提溶液组合物]40mMHEPES-KOH(PH7.9)100mM 醋酸钾2mM 醋酸镁2mM 氯化钙20%(v/v)甘油
1mM DTT0.5mM PMSF上述悬浮液在液氮中迅速冷冻(在10秒之内)。充分冷冻之后,悬浮液在大约4℃的冰水浴中解冻。完全解冻之后,30,000×g,4℃下离心10分钟(himacCR20B3,Hitachi Koki公司制造),上清液1A回收。回收的上清液1A,进一步在45,000×g,4℃下离心30分钟(himacCR20B3,Hitachi Koki公司制造),得到上清液1B。回收的上清液1B(2.5mL),用下列组分的凝胶过滤缓冲液平衡过的PD-10脱盐柱(Amersham Biosciences公司生产)处理。
40mMHEPES-KOH(PH7.9)100mM 醋酸钾2mM 醋酸镁1mM DTT0.5mM PMSF脱盐处理之后,上清液用凝胶过滤缓冲液(3mL)洗脱,使用分光光度计(Ultrospec 3300 pro,Amersham Biosciences公司制造)对在280nm处吸光度不低于30的洗脱液部分进行回收,用作昆虫细胞提取液。
实验实施例4用实施例3中的昆虫细胞提取液和参考实施例2中的外源mRNA进行非细胞体系蛋白合成用实施例3中制备的昆虫细胞提取液和参考实施例2中合成的外源mRNA,制备如下组分的反应溶液,进行非细胞体系的蛋白合成。
50(v/v)%昆虫细胞提取液40mM HEPES-KOH(pH7.9)100mM醋酸钾1.5mM醋酸镁2mM DTT0.25mM ATP0.1mMGTP20mM 磷酸肌氨酸
200μg/mL 肌氨酸激酶80μM 氨基酸(20种)0.1mM EGTA1U/μL RNase抑制剂200μg/mL tRNA320μg/mL 外源mRNA(编码荧光素酶基因)要使用ATP(SIGMA公司生产),GTP(SIGMA公司生产),氨基酸(20种,SIGMA公司生产),RNase抑制剂(TAKARA SHUZO公司生产),以及tRNA(Roche Diagnostics公司生产)。使用低温干燥仪MG-1000作为反应装置。反应溶液量是25μL,反应温度是25℃,反应时间是6小时。以实验实施例1中相同的方式,随时间测定荧光素酶的合成量。结果是,合成了16.3μg/mL的荧光素酶(图5)。
工业实用性本发明提供了一种用于非细胞体系蛋白合成的昆虫细胞提取液的制备方法(该提取液制备简单,并且可以合成大量的蛋白),昆虫细胞提取液,非细胞体系的蛋白合成方法(该方法使用了昆虫细胞提取液),以及非细胞体系蛋白合成的试剂盒(包含昆虫细胞提取液)。
本申请是在申请号为382415/2002的日本专利基础上进行的申请,其内容一并引入这里作为参考。
序列表(自由格式文本(free text))SEQ ID;NO 1引物Luc T7-F3-KpnSEQ ID;NO 2引物Luc T7-R4-KpnSEQ ID;NO 3引物T7启动子序列表<110>联合株式会社(RENGO CO,LTD.)<120>无细胞蛋白合成所用的昆虫细胞提取液的制备方法,昆虫细胞提取液和利用昆虫细胞提取液进行的无细胞蛋白合成<130>1160<140>
<141>
<150>JP 2002-382415<151>2002-12-27<160>3<210>1<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Luc T7-F3-Kpn<400>1ggggtaccat ggaagacgcc aaaaacataa 30<210>2<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Luc T7-R4-Kpn<400>2ggggtacctt acaatttgga ctttccgcc 29
<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>T7启动子<400>3taatacgact cactataggc20
权利要求
1.无细胞蛋白合成所用的昆虫细胞提取液的制备方法,包括至少一个将悬浮在抽提溶液中的昆虫细胞迅速冷冻的步骤,以便允许从所述昆虫细胞进行抽提。
2.权利要求1的方法,其中从所述昆虫细胞进行抽提包括将所述昆虫细胞在迅速冷冻之后解冻,并对所述细胞进行离心。
3.权利要求1或2的方法,其中昆虫细胞用液氮冷冻。
4.权利要求2或3的方法,其中昆虫细胞在-10℃-20℃的水浴或冰水浴中解冻。
5.权利要求1-4任意一项的方法,其中抽提溶液包括蛋白酶抑制剂。
6.权利要求1-5任意一项的方法,还包括进行核酸酶处理。
7.权利要求1-6任意一项的方法,其中昆虫细胞是来自于粉纹夜蛾卵子细胞或草地夜蛾卵巢细胞的培养细胞,或者是粉纹夜蛾卵子细胞和草地夜蛾卵巢细胞的细胞组合物。
8.由权利要求1-7任一方法制备的用于无细胞蛋白合成的昆虫细胞提取液。
9.一种无细胞蛋白合成方法,包括使用权利要求8的昆虫细胞提取液。
10.权利要求9的方法,包括使用具有帽结构的外源mRNA。
11.一种无细胞蛋白合成试剂盒,包含权利要求8的昆虫细胞提取液。
全文摘要
本发明提供了一种用于无细胞蛋白合成的昆虫细胞提取液的制备方法,昆虫细胞提取液,使用昆虫细胞提取液的无细胞系统的蛋白合成方法,以及包含昆虫细胞提取液的无细胞蛋白合成试剂盒。该提取液用本发明的方法制备简单,并且比用传统方法制备的提取液能合成更高产量的蛋白。
文档编号C12N1/06GK1609228SQ200310124960
公开日2005年4月27日 申请日期2003年12月27日 优先权日2002年12月27日
发明者江连彻, 东出将贤, 铃木崇, 伊东昌章, 远藤幸喜 申请人:株式会社岛津制作所
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1