专利名称：一种选育甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育纯合两用系的方法
技术领域：
本发明属于植物新品种选育的方法，具体涉及到一种选育甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育纯合两用系的方法。
背景技术：
显性细胞核雄性不育是油菜杂种优势育种的一条重要途径，它具有雄性不育性稳定、种子生产风险小等优点。但其缺点是其不育系中有50％的可育株，在杂交种子生产过程中，需要人工于开花前将这50％的可育株拔除，从而增加种子生产成本，若拔除不彻底，还会影响种子纯度。为了克服这一缺点，上海市农业科学院作物育种栽培研究所李树林等人发明了甘蓝型油菜细胞核雄性不育三系育种及制种技术(专利号ZL89109310.9)，该发明根据甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育是由Ms和Rf两对显性上位、抑制互作的遗传学原理，采用纯合型两用系、临保系和恢复系三系配套的方法来生产杂交种子。该专利技术的核心技术是纯合型两用系(基因型为1/2MsMsRfrf+1/2MsMsrfrf)的选育。在传统的育种方法中，当用纯合型不育系与其它具有优良性状的供体亲本杂交，来改良纯合型不育两用系时，其杂交后代的基因型比较复杂，从表现型上很难区别其基因型，选择难度大。因此，用传统育种方法改良现有油菜纯合型两用系十分困难。这就是为什么自该专利技术公开以来，我国乃至世界上还没有利用该体系生产杂交种子的主要原因之一。
近年来，随着分子标记技术的发展及其辅助选择技术的成熟，为解决上述问题提供了可能。所谓分子标记辅助选择，就是借助与目标基因紧密连锁的分子标记基因型的分析，鉴定分离出群体中含有目标等位基因的个体，从而加速育种进程。但到目前为止，还没有人将分子标记辅助选择技术运用于油菜显性细胞核雄性不育纯合型两用系的选育。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种有效、可靠的分子标记辅助选育甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育纯合两用系的方法，以提高甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育纯合两用系的育种效率。
本发明通过以下技术方案实现一种选育甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育纯合两用系的方法，其步骤包括杂交、回交、自交、育性鉴定和分子标记检测的方法，其特征在于，采用一次杂交、二次回交和一次自交的育种程序，将目标基因Ms和Rf同时导入到不同的甘蓝型油菜品种或品系中，采用聚合酶链式反应(PCR)检测并选择与目标基因紧密连锁的分子标记基因型，使含有目标基因的导入片断尽可能小，应用扩增片断长度多态性(AFLP)标记、微卫星(SSR)标记对遗传背景实施选择，使除开目标基因区段之外，新选育的纯合型不育两用系与被导入的甘蓝型油菜品种或品系相同，并对选育的纯合型不育两用系进行育性鉴定、繁殖和杂种生产。
本发明的具体步骤如下列步骤所述一种选育甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育纯合两用系的方法如下A、以纯合两用系中的可育株或同时含有显性不育基因Ms和恢复基因Rf的品系为供体亲本，以具有优良性状的品系或材料为轮回亲本杂交，所得杂种一代(F1)再与轮回亲本回交，得到回交一代，代号为为BC1F1；B、对BC1F1单株进行育性鉴定，并对可育株进行PCR检测，选出同时含有Ms和Rf基因者进行AFLP筛选，选出轮回亲本遗传背景最多的单株再与轮回亲本回交，得到回交二代，代号为BC2F1；C、对BC2F1单株进行育性鉴定，并对可育株进行PCR检测，选出同时含有Ms和Rf基因者进行AFLP筛选，选出轮回亲本遗传背景最多的单株自交，得到回交二代的F2代，代号为BC2F2；D、对BC2F2单株进行育性鉴定，并对所有单株进行PCR检测，选择出基因型分别为MsMsrfrf和MsMsRfrf且轮回亲本遗传背景最多的单株进行相互杂交，其杂交后代即为纯合型不育两用系。
在本发明中，所述PCR检测方法包括A、PCR反应体系为，各待检测单株的DNA各30-50ng，依据与目标基因共分离或紧密连锁的分子标记设计的特异正向引物和反向引物各0.15uM，Taq DNA聚合酶1U，四种脱氧核糖核苷酸dATP，dTTP，dGTP和dCTP各0.1mM，Tris-HCl(pH8.3)和KCl各10mM，以及MgCl2各2mM，PCR反应体积为15ul；B、PCR循环程序为，首先在94℃变性5分钟，然后在94℃变性45秒，55-58℃退火0.5-1分钟，72℃延伸1分钟，运行30个循环，最后在72℃延伸8-10分钟；C、PCR产物的检测为，在1％-1.4％的琼脂糖凝胶上点样，在80-120伏直流电压下电泳3-4小时，进行溴化乙啶染色，置于紫外光下读取各样品的PCR带型，确定各样品的分子标记基因型。
在本发明中，所述运用AFLP筛选遗传背景的方法包括A、在37℃对各待测单株的DNA进行限制性内切酶MseI和EcoRI双酶消化5小时后，再在65℃灭活30-45分钟，然后加入T4 DNA连接酶在22℃连接4小时或室温过夜；B、取酶切连接产物加入EcoRI+1引物和MseI+1引物以及Taq DNA聚合酶在56℃的退火温度下进行预扩增；
C、取预扩增产物加入EcoRI+3引物和Mse1+3引物以及Taq DNA聚合酶，在65℃向56℃递减的退火温度下进行选择性扩增；D、加入预扩增产物、EcoRI+3引物、MseI+3引物以及Taq DNA聚合酶，在65℃的退火温度下进行选择性扩增；E、PCR产物在6-8％的聚丙烯酰胺凝胶上点样，在70瓦功率下电泳2.5-3.5小时分离PCR产物；F、电泳完毕取下胶板按银染程序进行染色与显影；G、读取各样品的AFLP带型，计算各样品恢复轮回亲本基因型的比率。
所述育性鉴定方法为，于油菜花期检查花药发育情况，凡花药干瘪者为雄性不育，花药发育正常为雄性可育，以此作为育性鉴定的指标。
所述甘蓝型油菜显性细胞核纯合两用系的繁殖方法包括A、将纯合型两用系种植于人工隔离或天然屏障隔离条件下，种子成熟时于不育株上收获种子；B、将收获的纯合型两用系种子与临保系种子按2∶1或3∶1或4∶1或5∶1或6∶1行比种植于人工隔离或天然屏障隔离条件下，开花期从纯合型两用系中拔除约50％的可育株，种子成熟时于不育株上收获种子，繁殖出大田制种亲本不育系种子。
所述纯合型不育系的杂种生产方法是将繁殖的大田制种亲本不育系与恢复系按2∶1或3∶1或4∶1或5∶1行比种植于人工隔离或天然屏障隔离条件下，种子成熟时于不育系上收获种子，即为纯合型不育系的杂种种子。
本发明的优点在于1、通过对与目标基因共分离和紧密连锁分子标记基因型的PCR分析和选择，有效地解决了油菜常规回交育种中长期存在的连锁累赘问题，即由于不利基因与目标基因紧密连锁致使所得改良体与预期的目标不尽一致的现象；2、通过运用AFLP技术对各回交后代个体基因组的背景选择，有效地解决了油菜常规回交育种中轮回亲本基因型恢复的偏离问题，使得在改良目标性状的同时，原轮回亲本所特有的高配合力、强适应性等优良性状得以保持，因而改良体可以替代原轮回亲本直接用于杂种生产；3、分子标记技术的运用，使得油菜回交育种的周期缩短，育种进程加快，适应了杂交育种的需要。
具体实施例方式
实施例1甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育纯合两用系代号为195AB的选育a.以纯合两用系中的可育株为显性不育基因Ms和恢复基因Rf的品系为供体亲本，以优良品系195A为轮回亲本(油菜195A已于2003年9月5日公开销售)杂交，所得杂种一代(F1)再与轮回亲本回交，得到回交一代，代号为BC1F1；b.对320株BC1F1单株进行育性鉴定，并对其中175株可育株进行PCR检测，选出同时含有Ms和Rf基因者进行AFLP筛选，选出轮回亲本遗传背景最多的3个单株再与轮回亲本195A回交，得到回交二代，代号为BC2F1；c.对其中一个BC2F1群体260个单株进行育性鉴定，并对其中136个可育行PCR检测，选出同时含有Ms和Rf基因者进行AFLP筛选，选出轮回亲本195A遗传背景最多的3个单株自交，得到BC2F2代；d.对150个BC2F2单株进行育性鉴定，并对所有单株进行PCR检测，选择出基因型分别为MsMsrfrf和MsMsRfrf且轮回亲本195A遗传背景最多的一对单株进行相互杂交，其杂交后代即为纯合型不育两用系195AB。
说明在本实施例中，所述的PCR、AFLP、SSR操作、田间试验选择的具体操作按照本说明书的《发明内容》所示步骤和标准实施。
权利要求
1.一种选育甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育纯合两用系的方法，其步骤包括杂交、回交、自交、育性鉴定，其特征在于，采用一次杂交、二次回交和一次自交的育种程序，将目标基因Ms和Rf同时导入到不同的甘蓝型油菜品种或品系中，采用聚合酶链式反应(PCR)检测并选择与目标基因紧密连锁的分子标记基因型，使含有目标基因的导入片断尽可能小，应用扩增片断长度多态性(AFLP)标记、微卫星(SSR)标记对遗传背景实施选择，使除开目标基因区段之外，新选育的纯合型不育两用系与被导入的甘蓝型油菜品种或品系相同，并对选育的纯合型不育两用系进行育性鉴定、繁殖和杂种生产。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述选育甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育纯合两用系的方法采用如下步骤A、以纯合两用系中的可育株或同时含有显性不育基因Ms和恢复基因Rf的品系为供体亲本，以具有优良性状的品系或材料为轮回亲本杂交，所得杂种一代(F1)再与轮回亲本回交，得到回交一代，代号为为BC1F1；B、对BC1F1单株进行育性鉴定，并对可育株进行PCR检测，选出同时含有Ms和Rf基因者进行AFLP筛选，选出轮回亲本遗传背景最多的单株再与轮回亲本回交，得到回交二代，代号为BC2F1；C、对BC2F1单株进行育性鉴定，并对可育株进行PCR检测，选出同时含有Ms和Rf基因者进行AFLP筛选，选出轮回亲本遗传背景最多的单株自交，得到回交二代的F2代，代号为BC2F2；D、对BC2F2单株进行育性鉴定，并对所有单株进行PCR检测，选择出基因型分别为MsMsrfrf和MsMsRfrf且轮回亲本遗传背景最多的单株进行相互杂交，其杂交后代即为纯合型不育两用系。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述PCR检测方法包括A、PCR反应体系为，各待检测单株的DNA各30-50ng，依据与目标基因共分离或紧密连锁的分子标记设计的特异正向引物和反向引物各0.15uM，Taq DNA聚合酶1U，四种脱氧核糖核苷酸dATP，dTTP，dGTP和dCTP各0.1mM，Tris-HCl(pH8.3)和KCl各10mM，以及MgCl2各2mM，PCR反应体积为15ul；B、PCR循环程序为，首先在94℃变性5分钟，然后在94℃变性45秒，55-58℃退火0.5-1分钟，72℃延伸1分钟，运行30个循环，最后在72℃延伸8-10分钟；C、PCR产物的检测为，在1％-1.4％的琼脂糖凝胶上点样，在80-120伏直流电压下电泳3-4小时，进行溴化乙啶染色，置于紫外光下读取各样品的PCR带型，确定各样品的分子标记基因型。
4.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述运用AFLP筛选遗传背景的方法包括；A、在37℃对各待测单株的DNA进行限制性内切酶MseI和EcoRI双酶消化5小时后，再在65℃灭活30-45分钟，然后加入T4 DNA连接酶在22℃连接4小时或室温过夜；B、取酶切连接产物加入EcoRI+1引物和MseI+1引物以及Taq DNA聚合酶在56℃的退火温度下进行预扩增；C、取预扩增产物加入EcoRI+3引物和MseI+3引物以及Taq DNA聚合酶，在65℃向56℃递减的退火温度下进行选择性扩增；D、加入预扩增产物、EcoRI+3引物、MseI+3引物以及Taq DNA聚合酶，在65℃的退火温度下进行选择性扩增；E、PCR产物在6-8％的聚丙烯酰胺凝胶上点样，在70瓦功率下电泳2.5-3.5小时分离PCR产物；F、电泳完毕取下胶板按银染程序进行染色与显影；G、读取各样品的AFLP带型，计算各样品恢复轮回亲本基因型的比率。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甘蓝型油菜显性细胞核纯合两用系的繁殖方法包括A、将纯合型两用系种植于人工隔离或天然屏障隔离条件下，种子成熟时于不育株上收获种子；B、将收获的纯合型两用系种子与临保系种子按2∶1、3∶1、4∶1、5∶1或6∶1行比种植于人工隔离或天然屏障隔离条件下，开花期从纯合型两用系中拔除约50％的可育株，种子成熟时于不育株上收获种子，繁殖出大田制种亲本不育系种子。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纯合型不育系的杂种生产方法是将繁殖的大田制种亲本不育系与恢复系按2∶1或3∶1或4∶1或5∶1行比种植于人工隔离或天然屏障隔离条件下，种子成熟时于不育系上收获种子，即为纯合型不育系的杂种种子。
全文摘要
本发明公开了一种选育甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育纯合两用系的方法，属于植物新品种选育的技术领域。其特征在于，采用一次杂交、二次回交和一次自交的育种程序，将目标基因Ms和Rf同时导入到不同的甘蓝型油菜品种或品系中，采用PCR检测并选择与目标基因紧密连锁的分子标记基因型，使含有目标基因的导入片断尽可能小，应用AFLP标记、SSR标记对遗传背景实施选择，使除开目标基因区段之外，新选育的纯合型不育两用系与被导入的甘蓝型油菜品种或品系相同，并对选育的纯合型不育两用系进行育性鉴定、繁殖和杂种生产。与已有技术相比，本发明显著地提高了甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育纯合两用系的选育效率，同时降低了育种风险。
文档编号C12N15/82GK1559187SQ20041001282
公开日2005年1月5日 申请日期2004年3月9日 优先权日2004年3月9日
发明者杨光圣, 陆光远, 洪登峰, 刘平武 申请人:华中农业大学