专利名称：一种检测鉴定支原体的方法
技术领域：
本发明涉及微生物的检测鉴定方法，特别是支原体的检测鉴定方法，具体涉及使用新的支原体种特异性探针结合反向线点杂交(Reverse Line Blot Hybridisation)方法检测和鉴定十种常见细胞污染和致病支原体。
背景技术：
支原体污染是细胞培养实验、制药工业和生物制剂生产中常见的问题，它能导致实验的失败和生物产品质量下降。在不同实验室的报道中，15％-85％的细胞培养中存在支原体污染。在目前已知的20多种细胞污染支原体中，精氨酸支原体(Mycoplasma arginin)、发酵支原体(Mycoplasma fermentans)、猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)，口腔支原体(Mycoplasma orale)和莱氏无胆甾原体(Acholeplasma laidlawii)是最常见的。在细胞培养中，95％以上的支原体污染是由这五种支原体污染所致。生殖道支原体(Mycoplasmagenitalium)、人型支原体(Mycoplasma hominis)、微小脲原体(Ureaplasma parvum)、解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum)和肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)是五种临床常见的致病支原体。生殖道支原体、人型支原体、微小脲原体和解脲脲原体寄生于人体泌尿道和生殖道，在临床上它们能导致非淋菌性尿道炎、宫颈炎、不孕和不育等一系列疾病。肺炎支原体是导致人类尤其是儿童肺炎的病原体之一。由于支原体形态微小和生长缓慢，它们的感染不易在临床和实验室中被早期诊断、鉴定。且支原体种类繁多，约120多种。传统的支原体诊断方法主要有支原体培养、支原体DNA荧光染色、核酸分子杂交和支原体种特异多聚合酶链式扩增(PCR)等方法。PCR方法是目前最常用的诊断方法(参考文献Kong，F.等2001.Species-specific PCR for identification of commoncontaminant mollicutes in cell culture.Appl.Environ.Microbiol.673195-3200)，但使用PCR检测、鉴定多种支原体存在耗时长、重复步骤多的缺点。目前没有一个快速的、同时检测多种支原体，且灵敏、特异性高和成本低的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的检测鉴定支原体的方法，使其具有能同时检测鉴定多种支原体，且具有快速、灵敏、特异性高和成本低等特点，以克服现有技术的不足。
本发明提供的检测鉴定支原体的方法，包括下列步骤 (1)提取待测样品的DNA； (2)使用经标记的支原体通用引物，以PCR方法扩增待测样品之DNA； (3)将PCR扩增产物与定位标记在尼龙膜上的支原体种特异性探针杂交； (4)显示和判别杂交结果。
实现本发明的技术方案，包括设计出诊断支原体种的特异性探针和反向线点杂交。
在支原体属中，它们的16S-23S rRNA间隔区的核酸序列是目前已知的最具支原体种间差异的核酸序列(参考文献Harasawa，R.等.2000.Comparison of the 16S-23S rRNAintergenic spacer regions among strains of the Mycoplasma mycoides cluster，and reassessmentof the taxonomic position of Mycoplasma sp.bovine group 7.Int.J.Syst.Evol.Microbiol.50 Pt31325-1329)。目前国内外文献报道中，尚无人在这一区域设计诊断支原体种的特异性探针。
反向线点杂交是建立在DNA多聚合酶链式扩增(PCR)基础上的杂交鉴定方法。此方法最早应用于结核的分种鉴定中(参考文献Aranaz，A等.1996.Spoligotyping ofMycobacterium biovis strains from cattleand other animalsa tool for epidemiology oftuberculosis.J.Clin.Microbiol.342734-2740.)。它的优点在于能灵敏、快速进行微生物的分种、分型鉴定。因此我们设计支原体新的种特异性探针并结合反向线点杂交方法，建立一种新的、快速检测鉴定多种支原体方法，为实验室和临床工作提供有力的帮助，以弥补现有技术的不足。
在支原体16S-23S rRNA间隔区设计、合成不同支原体种的特异性探针，5’端氨基酸标记，将特异性探针标记在尼龙膜上。再设计、合成前述常见十种支原体的16S-23S rRNA间隔区公共引物，5’端生物素标记。使用标记有生物素的公共引物扩增十种常见的支原体16S-23SrRNA间隔区DNA。将PCR产物与定位标记在尼龙膜上的支原体种特异性探针结合。在尼龙膜上加入显影剂，显影剂和PCR产物上标记的生物素结合，激发荧光，使x光底片曝光，如有黑点，表示结果为阳性，并通过底片上不同位置显现的黑点鉴定支原体种；如无黑点，表示结果为阴性。
本发明提供的检测鉴定支原体的方法，能敏感、快速检测鉴定支原体，在2天时间内可同时检测、鉴定多种支原体。这种方法的敏感性和特异性不低于目前常用的支原体PCR检测方法，且一次可同时检测多达45个样本，而探针标记的尼龙膜可反复使用20次左右，即一张探针标记的尼龙膜可足够检测900个样本，从而大大降低每一个样本的检测成本。
本发明的另一个任务是提供一种检测鉴定支原体的试剂盒，其特征在于它含有 容器； 本发明提供的用于扩增支原体16S-23SrRNA间隔区DNA的通用引物； 至少一种具有序列表中SEQ ID NO5至SEQ ID NO24所述碱基序列的支原体种特异性探针； 以及使用说明。
该试剂盒还可含有PCR反应所需要的试剂。
图1为本发明支原体检测鉴定方法底片暴光显色结果。
具体实施例方式 实施例 使用的仪器有-20℃和4℃冰箱，常温高速离心机(Eppendorf公司，德国)，PCR仪(Eppendorf公司，德国)，Miniblotter(Immunetic公司，美国)，杂交箱(Thermo公司，美国)，暗盒。
使用的试剂有罗氏呼吸道标本DNA提取试剂盒(罗氏诊断试剂公司，美国)，Taq酶，dNTP，10×PCR buffer，超净水，0.5M NAHCO3(PH8.4)，0.1M NaOH，16％w/v 1Ethyl-3-(3 Dimethylamino-propyl)carbodiimide(EDAC)(Sigma公司，美国)，20×SSPE(0.2MNa2HPO4，3.6M NaCl，20mMEDTA，PH7.4)，2×SSPE/0.1％SDS，2×SSPE/0.5％SDS，2×SSPE，1％SDS，20mM EDTA，Biodyne C尼龙膜(Immunetic公司，美国)，Streptavidin-peroxidase conjugate(罗氏诊断试剂公司，美国)，Enhancedchemiluminescence(ECL)显影剂(Amersham公司，英国)，X光片(Amersham公司，英国)。
操作步骤 一、使用罗氏呼吸道标本DNA提取试剂盒提取DNA 将待测样品在常温下以13000转/分离心10分钟，去除上清液，保留10μl液体，加入500μl洗液(由罗氏呼吸道标本DNA提取试剂盒配备)，混匀；再以13000转/分离心10分钟，去除上清液，加入50μl，在60℃孵育45分钟，最后加入50μl平衡液(由罗氏呼吸道标本DNA提取试剂盒配备)，混匀，将DNA提取液保存于-20℃，备用。
二、使用巢式PCR扩增支原体16S-23S rRNA间隔区 本发明设计了两对通用引物，即SPS1，SPA2；SPS2，SPA1，扩增十种支原体16S-23SrRNA间隔区。SPS1，SPA2为外引物；SPS2，SPA1为内引物。SPS2和SPA1的5’端给予生物素标记，如使用羧基丁二亚酰胺酯(biotinyl N hydroxy succinimide ester，BNHS)标记。该引物由Sigma公司合成，其序列如下 外引物 SPS15’-CCCTACGRGAACGTGGGGVTGGAWYACCTCCT-3’(SEQ ID NO1) SPA25’-CSDDGCWTWTCGSWGDTWRDYVCGTCCTTCATCG-3’(SEQ IDNO4) 内引物 SPS25’-CGRGAACGTGGGGVTGGAWYACCTCCTTTC-3’(SEQ ID NO2) SPA15’-CGTCCTTCATCGMCTNTYYDGWSCCAAGGCATYCAC-3’(SEQ IDNO3) PCR方案是第一次扩增变性、退火、延伸的条件分别为94℃10秒、65℃10秒、74℃1分钟，30个循环；第二次扩增变性、退火、延伸的条件分别为94℃10秒、70℃10秒、74℃1分钟，30个循环。取20μl PCR扩增产物用于反向线点杂交实验。
三、反向线点杂交实验 (一)标记探针 使用的十种支原体种特异性探针序列如下，5’端给予hexylamino标记，由Sigma公司合成 发酵支原体1A 5’-CCC ATA AAA AAG CCA CAT AAC-3’(SEQ ID NO5) 发酵支原体2S 5’-CAT CAT AAC AAA CTA TAA CAA TAG GAA-3’(SEQ ID NO6) 精氨酸支原体1A5’-AAA GAA CAA ATT GAG AGA TAG GTC-3’(SEQ ID NO 7) 精氨酸支原体2S5’-CAA TAG GTC TTA TAC TAC TAT TAA ACA AGA T-3’(SEQ ID NO8) 口腔支原体1A 5’-GAA TAT TGG GCC ATT AAC TAT TT-3’(SEQ ID NO9) 口腔支原体2S 5’-CAA TAG GTC AAA AAT ACT TAT ACG TAA-3’(SEQ ID NO10) 猪鼻支原体1A 5’-CTA GAC ACG AAT CGA TTA TGT AAT-3’(SEQ ID NO 11) 猪鼻支原体2S 5’-AAC GAT CTT TTT TAT AAC CGA G-3’(SEQ ID NO12) 人型支原体1A 5’-CAA AGA ACC GAG AGA TAA ATC T-3’(SEQ ID NO13) 人型支原体2S 5’-CAA TAG GTC ATA CAA TTA ACA AAA C-3’(SEQ ID NO14) 肺炎支原体1A 5’-ACC GAT AAA TAA ATG GAT TTT G-3’(SEQ ID NO15) 肺炎支原体2S 5’-ACA TTT CCG CTT CTT TCA A-3’(SEQ ID NO16) 生殖道支原体1A5’-CAC CGA AAA AAT TAA TGG G-3’(SEQ ID NO17) 生殖道支原体2S5’-AAG AAT GTT TTT GAA CAG TTC TTT-3’(SEQ ID NO 18) 解脲脲原体1A 5’-GGC TAA TAT TCA CAT GGA TTT TTA TA-3’(SEQ ID NO19) 解脲脲原体2S 5’-AAA TAT TTC AAA AGT TCA TAT GGT C-3’(SEQ ID NO20) 莱氏无胆甾原体1A 5’-AAG TGT TAG TTA GCC TTT CTC CT-3’(SEQ ID NO21) 莱氏无胆甾原体2S 5’-AAA TGA TGT CTG AAA AGA AAT AAG-3’(SEQ ID NO 22) 微小脲原体1A 5’-GGC TTA TAT TCA TAT GGA TTT TAA TA-3’(SEQ ID NO23) 微小脲原体2S 5’-TAT TTT TAA AAA TTC ATA TGG TCG-3’(SEQ ID NO 24) 1.使用0.5M NaHCO3(PH8.4)分别稀释上述十种支原体种特异性探针至适宜浓度，(稀释和适宜浓度的确定方法参见Vinje J，Koopmans MP.Simultaneous detectionand genotyping of″Norwalk-like viruses″by oligonucleotide array ina reverse line blot hybridization format.J Clin Microbiol.2000Jul；38(7)2595-601.)； 2.将Biodyne C尼龙膜裁剪为15×15厘米大小； 3.室温下，16％w/v 1 Ethyl-3-(3 Dimethylamino-propyl)carbodiimide(EDAC)孵育BiodyneC尼龙膜10分钟； 4.去离子水漂洗Biodyne C尼龙膜1分钟； 5.将Biodyne C尼龙膜放入Miniblotter中，盖紧，吸除尼龙膜表面液体； 6.将十种己稀释的支原体探针各取150μl分别依次加入Miniblotter槽的不同槽中，室温下孵育5分钟； 7.吸除尼龙膜表面液体； 8.打开Miniblotter，取出尼龙膜，将尼龙膜放入0.1M NaOH液中灭活9分钟； 9.100ml 2×SSPE漂洗Biodyne C尼龙膜5分钟； 10.使用60℃2×SSPE/0.5％SDS液漂洗Biodyne C尼龙膜5分钟； 11.在室温下用200ml 20mM EDTA液清洗Biodyne C尼龙膜20分钟； 12.将Biodyne C尼龙膜放入洁净的塑料袋中，密封保存于4℃冰箱中，备用。
(二)反向线点杂交 1.将每一样本的20μl PCR扩增产物和150μl 2×SSPE/0.1％SDS混匀加入EP管中，加热至100℃10分钟，将EP管快速放置于冰上； 2.用250ml 60℃2×SSPE/0.1％SDS液漂洗已标记探针的Biodyne C尼龙膜5分钟； 3.将洗后的Biodyne C尼龙膜放置于Miniblotter中，吸除尼龙膜表面液体； 4.在Miniblotter槽中分别依次加入150μl PCR扩增产物和2×SSPE/0.1％SDS混液(其方向与探针方向垂直)，放入60℃杂交箱杂交60分钟； 5.吸除Biodyne C尼龙膜表面液体； 6.从Miniblotter中取出Biodyne C尼龙膜。用250ml 60℃2×SSPE/0.5％SDS液洗Biodyne C尼龙膜两次，每次10分钟； 7.将洗后的Biodyne C尼龙膜放入滚筒中，加入10ml 2×SSPE/0.5％SDS和1/5000Streptavidin-peroxidase conjugate混合液，在42℃杂交45分钟； 8.用250ml 42℃2×SSPE/0.5％SDS液洗Biodyne C尼龙膜两次，每次10分钟； 9.室温下用250ml 2×SSPE液洗Biodyne C尼龙膜两次，每次5分钟； 10.加入20ml Enhanced chemiluminescence(ECL)显影剂于Biodyne C尼龙膜上，室温孵育1分钟； 11.将Biodyne C尼龙膜放入暗盒中，在暗盒中放入X光片，曝光5分钟，洗片，观察结果相应探针区域显现黑色圆点为阳性，说明有与探针相应的支原体；如果相应探针区域不显现色则为阴性，说明没有与探针相应的支原体。
将Biodyne C尼龙膜用80℃250ml 1％SDS洗两次，每次30分钟，再用200ml 20mMEDTA液清洗Biodyne C尼龙膜15分钟，将Biodyne C尼龙膜放入洁净的塑料袋中，密封保存于4℃冰箱中，可备下次使用。
用本发明支原体反向线点杂交方法检测19株支原体ATCC标准株，包括M.hyorhinisATCC 17981，发酵支原体ATCC 19989，莱氏无胆甾原体ATCC 23206，肺炎支原体ATCC 29342(M129)，生殖器支原体ATCC 33530，14株微小脲原体和解脲脲原体ATCC标准株。同时也检测了分别从澳大利亚和北京分离的精氨酸支原体、口腔支原体、人型支原体各一株。结果显示使用支原体反向线点杂交方法能准确的检测19株支原体ATCC标准株及精氨酸支原体、口腔支原体、人型支原体各一分离株。(见附图，在附图中，对于微小脲原体和解脲脲原体，仅显示微小脲原体以血清型3及解脲脲原体血清型8检测结果)。
用支原体种PCR和用本发明支原体反向线点杂交方法同时检测180个临床样本，包括80个细胞培养物样本，86个泌尿、生殖道分泌物样本，14个呼吸道分泌物样本(表1、表2)，比较两种方法检测结果。结果显示在临床样本检测中，用支原体种特异性PCR和用本发明支原体反向线点杂交检测方法的检测结果是一致的。
表1细胞培养物中使用两种方法检测支原体结果比较 物种名称及例数反向线点杂交检测结果种特异性PCR检测结果发酵支原体13例精氨酸支原体24例口腔支原体9例猪鼻支原体16例发酵支原体和精氨酸支原体5例发酵支原体、精氨酸支原体和口腔支原体2例精氨酸支原体和口腔支原体4例口腔支原体和猪鼻支原体7例总计 13例阳性 24例阳性 9例阳性 16例阳性 5例阳性 2例阳性 4例阳性 7例阳性 80例阳性 13例阳性 24例阳性 9例阳性 16例阳性 5例阳性 2例阳性 4例阳性 7例阳性 80例阳性 表2泌尿、生殖道、呼吸道分泌物样本中使用两种方法检测支原体结果比较物种名称及例数 反向线点杂交检测结果 种特异性PCR检测结果肺炎支原体14例14例阳性14例阳性生殖道支原体6例微小脲原体60例解脲脲原体20例总计6例阳性60例阳性20例阳性100例阳性6例阳性60例阳性20例阳性100例阳性 通过支原体种特异性PCR检测方法和支原体反向线点杂交方法检测临床样本的结果比较可以看出，本发明方法及所设计的支原体种特异性探针能灵敏、特异的检测和鉴定支原体。本发明支原体反向线点杂交方法敏感性和特异性与支原体种特异性PCR检测方法是相同的，此方法的优势在于能在短时间内(2天)同时检测多种支原体，而PCR方法则需要反复多次才能确定每一种支原体，说明本发明是一种具有能同时检测鉴定多种支原体，且具有快速、灵敏、特异性高和成本低的支原体检测方法。
序列表
<110>武汉市第一医院
<120>一种支原体的检测鉴定方法
<130>
<160>24
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>32
<212>DNA
<213>合成的引物
<400>1
ccctacgrga acgtggggvt ggawyacctc ct32
<210>2
<211>30
<212>DNA
<213>合成的引物
<400>2
cgrgaacgtg gggvtggawy acctcctttc 30
<210>3
<211>36
<212>DNA
<213>合成的引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(16)
<223>n＝a或g或c或t
<400>3
cgtccttcat cgmctntyyd gwsccaaggc atycac36
<210>4
<211>34
<212>DNA
<213>合成的引物
<400>4
csddgcwtwt cgswgdtwrd yvcgtccttc atcg 34
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>发酵支原体(Mycoplasma fermentans)
<400>5
cccataaaaa agccacataa c21
<210>6
<211>52
<212>DNA
<213>发酵支原体(Mycoplasma fermentans)
<400>6
catcataaca aactataaca ataggaa 27
<210>7
<211>24
<212>DNA
<213>精氨酸支原体(Mycoplasma arginini)
<400>7
aaagaacaaa ttgagagata ggtc 24
<210>8
<211>31
<212>DNA
<213>精氨酸支原体(Mycoplasma arginini)
<400>8
caataggtct tatactacta ttaaacaaga t 31
<210>9
<211>23
<212>DNA
<213>口腔支原体(Mycoplasma orale)
<400>9
gaatattggg ccattaacta ttt 23
<210>10
<211>27
<212>DNA
<213>口腔支原体(Mycoplasma orale)
<400>10
caataggtca aaaatactta tacgtaa 27
<210>11
<211>24
<212>DNA
<213>猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)
<400>11
ctagacacga atcgattatg taat 24
<210>12
<211>22
<212>DNA
<213>猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)
<400>12
aacgatcttt tttataaccg ag 22
<210>13
<211>22
<212>DNA
<213>人型支原体(Mycoplasma hominis)
<400>13
caaagaaccg agagataaat ct 22
<210>14
<211>25
<212>DNA
<213>人型支原体(Mycoplasma hominis)
<400>14
caataggtca tacaattaac aaaac25
<210>15
<211>25
<212>DNA
<213>肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)
<400>15
accgataaat aaatggattt tg 22
<210>16
<211>19
<212>DNA
<213>肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)
<400>16
acatttccgc ttctttcaa 19
<210>17
<211>19
<212>DNA
<213>生殖道支原体(Mycoplasma genitalium)
<400>17
caccgaaaaa attaatggg 19
<210>18
<211>24
<212>DNA
<213>生殖道支原体(Mycoplasma genitalium)
<400>18
aagaatgttt ttgaacagtt cttt 24
<210>19
<211>26
<212>DNA
<213>解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum)
<400>19
ggctaatatt cacatggatt tttata 26
<210>20
<211>25
<212>DNA
<213>解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum)
<400>20
aaatatttca aaagttcata tggtc25
<210>21
<211>23
<212>DNA
<213>莱氏无胆甾原体(Acholeplasma laidlawii)
<400>21
aagtgttagt tagcctttct cct 23
<210>22
<211>24
<212>DNA
<213>莱氏无胆甾原体(Acholeplasma laidlawii)
<400>22
aaatgatgtc tgaaaagaaa taag 24
<210>23
<211>26
<212>DNA
<213>微小脲原体(Ureaplasma parvum)
<400>23
ggcttatatt catatggatt ttaata 26
<210>24
<211>24
<212>DNA
<213>微小脲原体(Ureaplasma parvum)
<400>24
tatttttaaa aattcatatg gtcg 2权利要求
1.一种支原体的检测鉴定方法，其特征在于包括下列步骤
(1)提取待测样品的DNA；
(2)使用经标记的支原体通用引物，以PCR方法扩增待测样品之DNA；
(3)将PCR扩增产物与定位标记在尼龙膜上的支原体种特异性探针杂交；
(4)洗去尼龙膜上未杂交的PCR扩增产物；
(5)显示杂交结果。
2.根据权利要求1所述的支原体的检测鉴定方法，其特征在于所述的支原体种特异性探针是具有序列表中SEQ ID NO5至SEQ ID NO24所述碱基序列的探针中的一种或数种或全部。
3.根据权利要求1所述的支原体的检测鉴定方法，其特征在于所述的支原体通用引物包括
外引物
SPS15’-CCCTACGRGAACGTGGGGVTGGAWYACCTCCT-3’(SEQ ID NO1)
SPA25’-CSDDGCWTWTCGSWGDTWRDYVCGTCCTTCATCG-3’(SEQ IDNO4)；
内引物
SPS25’-CGRGAACGTGGGGVTGGAWYACCTCCTTTC-3’(SEQ ID NO2)
SPA15’-CGTCCTTCATCGMCTNTYYDGWSCCAAGGCATYCAC-3’(SEQ IDNO3)。
4.根据权利要求1所述的支原体的检测鉴定方法，其特征在于以生物素标记所述的支原体通用引物。
5.根据权利要求1所述的支原体的检测鉴定方法，其特征在于所述的显示杂交结果的方法是在尼龙膜上加入显影剂，显影剂和PCR产物上标记的生物素结合，激发荧光，使x光底片曝光。
6.用于检测鉴定支原体的基因探针，其特征在于具有序列表中SEQ ID NO5至SEQID NO24所述碱基序列中的任一碱基序列。
7.用于扩增支原体16S-23SrRNA间隔区DNA的通用引物，其特征在于包括具有序列表中SEQ ID NO1所述碱基序列的外引物SPS1、具有序列表中SEQ ID NO4所述碱基序列的外引物SPA2、具有序列表中SEQ ID NO2所述碱基序列的内引物SPS2和具有序列表中SEQ ID NO3所述碱基序列的内引物SPA1。
8.根据权利要求1所述的支原体的检测鉴定方法，其特征在于PCR反应条件是第一次扩增变性、退火、延伸的条件分别为94℃10秒、65℃10秒、74℃1分钟，30个循环；第二次扩增变性、退火、延伸的条件分别为94℃10秒、70℃10秒、74℃1分钟，30个循环。
9.一种检测鉴定支原体试剂盒，其特征在于它含有
容器；
用于扩增支原体16S-23SrRNA间隔区DNA的通用引物；
至少一种具有序列表中SEQ ID NO5至SEQ ID NO24所述碱基序列的支原体种特异性探针；
以及使用说明。
10、根据权利要求9所述的检测鉴定支原体试剂盒，其特征在于该试剂盒还含有PCR反应所需要的试剂。
全文摘要
一种支原体的检测鉴定方法，包括提取待测样品的DNA、使用经标记的支原体通用引物以PCR方法扩增待测样品之DNA、将PCR扩增产物与定位标记在尼龙膜上的支原体种特异性探针杂交、洗去尼龙膜上未杂交的PCR扩增产物、显示杂交结果等步骤，同时，本发明还提供了支原体通用引物和支原体种特异性探针及检测鉴定支原体试剂盒。本发明方法及所设计的支原体种特异性探针能灵敏、特异的检测和鉴定支原体，具有快速、灵敏、特异性高和成本低的特点。
文档编号C12Q1/68GK1676612SQ200410012940
公开日2005年10月5日 申请日期2004年3月29日 优先权日2004年3月29日
发明者王辉, 孔繁荣, 琳·吉尔伯特 申请人:武汉市第一医院