专利名称：羧端含前s2免疫决定簇的乙肝表面抗原融合基因及蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的乙肝表面抗原编码基因，具体地说涉及通过基因工程方法构建的羧端含前S2免疫决定簇的乙肝表面抗原融合基因。
本发明还涉及该基因的重组载体及其编码的蛋白质。
背景技术：
乙型肝炎是一种由乙型肝炎病毒引起的具有严重危害的传染性疾病，在全球广泛分布，据估计，仅在我国就有约1.2亿的乙肝病毒携带者，其中患者约有1000万人。目前对乙型肝炎还缺乏有效的治疗方法，而进行乙肝疫苗免疫接种是预防和控制乙型肝炎切实有效的途径。
早期的乙肝疫苗是从乙肝病毒健康携带者血浆中分离的乙肝表面抗原颗粒制成的，由于血浆来源有限，加之成本和安全性方面的考虑，这类疫苗在我国已停止使用。目前国内外广泛使用的重组酵母或CHO细胞产生的由乙肝病毒表面抗原主蛋白(S)构成的重组基因工程疫苗。与血源疫苗相比，基因工程疫苗成本较低，安全性更好，已取得了很好的免疫效果。但同时这种单S的重组疫苗也有诸多不足，如免疫程序过长，乙肝病毒突变株导致的免疫逃逸及部分人群无应答或低应答等。因此，开发免疫原性更好、价格更为低廉的新型疫苗仍有其紧迫性。
乙肝病毒包膜蛋白含有大(L)，中(M)和主蛋白(S)三种成分，其中S蛋白由226个氨基酸组成，在S蛋白之前，有一个由119个氨基酸组成的前S1(preS1)区和由55个氨基酸组成的前S2(preS2)区，其中，PreS2和S一起构成中蛋白，preS1和M一起构成大蛋白。有研究表明，preS2抗原具有比S蛋白更强的免疫原性，用同时含preS2和S区的乙肝表面抗原免疫小鼠，可以让对S抗原无应答的小鼠产生抗体应答(Milich DR.，Thornton GB.，Neurath AR.，et al.Enhancedimmunogenicity of the preS region of hepatitis B surface antigen.Science1985，2281195-1199)。因此，在疫苗中加入preS2抗原成分可能会进一步增强其免疫效果。由于preS2抗原含有多个蛋白酶敏感位点，特别是其N端第48位精氨酸与49位苏氨酸之间的肽键易受到蛋白酶的作用而断裂(Langley KE.，Egan KM.，Barendt JM.，et al.Characterization of purified hepatitis B surface antigen containingpre-S(2) epitopes expressed in saccharomyces cerevisiae.Gene 1988，67229-245)，致使preS2抗原在表达和制备的过程中易于降解而失活。合成的preS2多肽证实，其氨基末端的26个氨基酸(Met1-Gly26)是该区域主要的抗体结合位点，该合成多肽的抗体能够中和乙肝病毒的毒力(Neurath AR.，Kent SBH.，Parker K，et al.Antibodies to a syntheticpeptide from the preS120-145 region of the hepatitis B virus envelope arevirus neutralizing.Vaccine 1986，435-37)。由于preS2和S基因含有各自的翻译起始位点，preS2+S的结构在进行体外表达时，将会产生中蛋白和主蛋白两种产物，从而降低了产物中前S2抗原的含量(HuiJ，Li G， Kong Y et al. Expression and Characterization of chimerichepatitis B surface antigen particles carrying preS epitopes.Journal ofBiotechnoly，1999，7249-59；中国专利CN 1067721C；中国专利CN1058525C)。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种新的编码乙肝病毒表面抗原的基因，含有编码乙肝表面抗原S蛋白的核苷酸序列和编码乙肝表面抗原前S2蛋白的核苷酸序列，其特征在于编码所述前S2蛋白的1-26位氨基酸的核苷酸序列连接于编码所述S蛋白的核苷酸序列的3’端，在本发明的一个具体实施方案中构建了如SEQ ID NO.1所示的序列的新基因。
本发明的再一目的在于提供一种具有乙肝病毒表面抗原S和前S2抗原性的蛋白质，该蛋白质包含由本发明的新基因所编码的氨基酸序列，在一个具体的实施方案中，本发明具有乙肝病毒表面抗原S和前S2抗原性的蛋白由SEQ ID NO.1编码，具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
本发明的另一目的在于提供含有本发明新基因的重组载体，在本发明的一个具体实施例中，构建了含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的重组载体。
本发明的再一目的在于提供重组乙肝表面抗原融合蛋白的制备方法，通过将所述重组载体转染宿主细胞，获得转化体，进一步培养该转化体而制备重组抗原。
根据本发明的一方面，通过基因工程的方法构建了本发明的新基因，根据乙肝病毒(adr亚型)的基因序列设计并合成相应的引物(SEQID NO.3～6)，以含乙肝病毒全长基因的质粒为模板，通过PCR扩增合成了乙肝表面抗原S和preS2(Met1-Gly26)所对应的基因序列，并将preS2(Met1-Gly26)序列融合于S序列的3’末端构建了新型乙肝表面抗原融合基因，其序列如SEQ ID NO.1所示。可以将该新的DNA与载体连接构建成重组载体，进而转(染)化宿主细胞，从而制备重组蛋白。也可以将该基因直接构建成重组DNA疫苗，用于乙型肝炎的预防或治疗。
根据本发明的另一方面，由本发明的基因编码的蛋白含有如SEQID NO.2所示的氨基酸序列，其为一个同时具有S和前S2抗原决定簇的新型乙肝病毒表面抗原(融合抗原)，构建的融合基因将编码前S2的核苷酸序列置于编码S的核苷酸序列的3′端，从而当翻译时只有一种翻译产物产生，有效提高了前S2抗原的含量。同时，由于去除了前S2区主要的蛋白酶敏感位点，该融合抗原具有比天然蛋白更好的稳定性。此外，该融合抗原还能组装成与天然乙肝表面抗原类似的球形结构，这一特点对其免疫原性的维持具有重要作用。所产生的融合抗原经分离纯化后可以制备成重组乙肝疫苗。
本领域技术人员可以理解的是，本发明的蛋白质还包括那些与SEQ ID NO.2基本相同的氨基酸序列、或来自于它的简并的氨基酸序列、以及它们在生物学上的活性同类物，这些同类物具有在SEQ IDNO.2的基础上经过取代的、缺失的、延长的、置换的和甚至修饰的序列，这些序列所编码的蛋白质具有与SEQ ID NO.2所编码的蛋白质基本相同的生物学活性和功能。
根据本发明的再一方面，提供含有本发明核苷酸序列，例如SEQID NO.1序列的重组载体和由重组载体转化的宿主细胞。可以通过酶切后插入的方法将本发明的基因插入各种载体中构建成重组载体。在本发明的一个实施方案中，将合成的SEQ ID NO.1序列的基因经酶切后插入pAO815，载体构建重组载体pAO815-SS2。
在进一步制备表达蛋白时，可以将本发明的重组载体转染宿主细胞而获得可大规模培养并表达的转化体，培养该转化体可以获得表达的重组蛋白，对该蛋白进行分离和纯化后即可用于制备重组乙肝疫苗。可以使用的宿主细胞包括但不限于例如大肠杆菌的原核宿主，以及例如酵母、昆虫和哺乳动物细胞的真核宿主。在本发明的一个实施方案中，将本发明构建的重组载体转(染入)化至毕赤酵母(PichiaPastoris)菌株GS115获得转化体，通过构建含有该融合基因的毕赤酵母工程菌株，高效表达了同时具有S和前S2抗原性的融合颗粒，该融合抗原具有S+preS2(Met1-Gly26)的完整结构，并且具有比天然中蛋白更好的稳定性。
图1为SS2融合蛋白的结构示意图。
图2为PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱。
1，S2；2，S；3，DNA marker(λDNA/EcoR I+Hind III)；4，SS2图3为克隆载体的酶切图谱。
1，DNA marker(λDNA/EcoR I+Hind III)；2，pBlue/EcoR I；3，pBlue-SS2/EcoR I.
图4为毕赤酵母表达载体pAO815-SS2的酶切鉴定图谱(1％琼脂糖凝胶电泳)。
1，DNA marker(λDNA/EcoR I+Hind III)；2，pAO815；3，pAO815-SS2.。上述两种质粒均用Avr II和BamH I进行双酶切。
图5为SS2融合抗原的Western blot分析结果。
A，S抗体检测；B，用前S2抗体检测；1，蛋白质预染Marker；2，表达产物。
图6为SS2融合抗原的透射电镜照片。
具体实施例方式
下面结合附图，通过对本发明较佳实施方式的详细描述，说明但不限制本发明。
实施例1羧端含前S2免疫决定簇的乙肝表面抗原融合基因的合成和序列测定材料与方法1.菌种和质粒Pichia酵母菌株GS115(His-，Mut+)，大肠杆菌Top10F’及Pichia表达质粒pAO815购自Invitrogen公司，大肠杆菌DH5α和克隆载体pBluescript II SK(+)为通用的菌株和质粒。
2.主要材料和试剂限制性内切酶和Taq DNA聚合酶购自NEB公司，小牛肠碱性磷酸酶(CIP)，T4 DNA连接酶购自MBI公司，DNA片断回收试剂盒购自Boehringer Mannheim公司。反相血凝试剂盒购自兰州生物制品研究所，S和前S2酶免试剂盒分别购自上海科华生物技术有限公司和北京肝炎试剂研制中心。
3.PCR引物合成及SS1融合基因片段的扩增根据文献(琦祖和，阎君，熊伟军，等乙型肝炎病毒adr NC-1DNA的全序列测定.中国科学(B辑)，1988，121300-1304.)报道的乙肝病毒(adr亚型)基因序列，合成下列四条引物P15’-AAAGAATTCACCATGGAGAACACAGCATCA-3’；(SEQ IDNO.3)P25’-AATGTATACCCAAAGAC-3’；(SEQ ID NO.4)P35’-TGGGTATACATTATGCAGTGGAACTCC-3’；(SEQ ID NO.5)P45’-AAAGAATTCTCAGCCACCAGCAGG-3’；(SEO ID NO.6)
其中P3引物5’端有12个碱基与P2引物互补，P1和P4引物编码区以外各含一个EcoR I位点。以含乙肝表面抗原全长基因片段的质粒(琦祖和，阎君，熊伟军，等.乙型肝炎病毒adr NC-1 DNA的全序列测定.中国科学(B辑)，1988，121300-1304.)pHBV为底物，以P1和P2为引物合成S片段，以P3和P4为引物合成S2片段，然后以上述反应的产物为底物，以P1和P4为引物合成SS2嵌合基因片段。具体反应条件如下S和S2片段的合成条件为94℃3min(分)；94℃30s(秒)，45℃45s，72℃75s，25个循环；72℃5min。分别回收S和S2片段，各取1ul作底物进行SS2融合片段的扩增。PCR反应条件如下94℃3min；94℃30s，55℃45s，72℃70s，25个循环；72℃5min。
图1为SS2嵌合基因片段的结构示意图。
4.克隆载体的构建和基因序列测定将PCR产物用EcoR I消化，与经EcoR I线性化并用去磷酸化酶(CIP)处理的pBluescript II SK(+)载体 连接获得重组载体(pBlue-SS2)，转化大肠杆菌DH5α，进行质粒制备后分析EcoR I酶切图谱，挑选插入单一片段的重组子，委托上海基康生物技术有限公司进行序列测定。构建的新基因的序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2羧端含前S2免疫决定簇的乙肝表面融合抗原在毕赤酵母(Pichia Pastoris)中的表达5.表达载体的构建和鉴定用EcoR I消化插入SS2片段的pBluescript II SK(+)载体，分离插入片段，与经EcoR I线性化并用CIP碱性磷酸酶处理的pAO815载体连接，转化大肠杆菌Top10F’，挑取单菌落制备质粒，用Avr II和BamH I双酶切，分析酶切图谱，挑选单一正向插入的重组子。
6.重组质粒向酵母细胞的转化和阳性克隆的初步筛选用Bgl II线性化重组表达质粒，经酚/氯仿抽提，酒精沉淀后用电穿孔法转化GS115细胞。用MD[1.34％YNB(无氨基酸)，4×10-5％生物素，2％葡萄糖]琼脂平板筛选阳性克隆。
7.抗原的诱导表达及初提液的制备挑取His+的单菌落，接种于100ml MGY培养基(1.34％YNB，1％甘油，4×10-5％生物素)30℃震荡培养过夜，收获菌体，悬浮于20mlMM培养基(1.34％YNB，4×10-5％生物素，0.5％甲醇)继续培养。每24hr补加100μl甲醇并取样，离心收集菌体，共诱导72hr。
在菌体中加入适量破壁缓冲液(50mM磷酸缓冲液pH7.4，1mMPMSF，1mM EDTA，5％甘油)和等体积玻璃珠(直径0.5mm)，在振荡器上剧烈振荡30s后，冰浴30s，重复8次，离心抽取上清，即为抗原初提液。
实施例3表达产物的检测8.表达产物的抗原性检测通过反相血凝法(RPHA)和ELISA对初提液进行抗原性检测，操作方法分别按试剂盒说明书进行。
9.表达产物的Western blot鉴定将抗原粗提液经SDS-PAGE电泳并转移到硝酸纤维素膜上，分别以兔抗S(Oxford Biotechnology Limited)和兔抗preS2(Orbigen Inc.)为一抗，以碱性磷酸酶(AP)标记的羊抗兔IgG为酶标二抗，以NBT/BCIP为显色底物，进行印迹分析。
10.融合抗原的电镜观察将纯化的SS2融合抗原经2％磷钨酸负染后进行透射电镜观察。
结果1. SS2融合基因片段的扩增第一步PCR反应扩增出了预期大小的S(690bp)和S2(90bp)片段，再以S和S2为模板，以P1和P4为引物进行第二次PCR反应，拼接成了完整的SS2(770bp)融合基因片段(图2)。
2.克隆载体的构建和基因序列测定从PCR产物中回收SS2片段，用EcoR I消化，克隆到pBluescriptII SK(+)载体的RcoR I位点，构建重组质粒。重组质粒经EcoR I酶切分析，片段大小与预期一致(图3)。序列分析结果显示，SS2融合基因片段拼接正确，没有发生移码突变。
3.表达载体的构建和鉴定将经测序证实的SS2片段从pBluescript II SK(+)载体中分离出来，克隆到pAO815质粒的EcoR I位点。用Avr II和BamH I消化重组质粒，经琼脂糖凝胶电泳进行酶切图谱分析。由于Avr II酶切位点位于S基因5′端(距5’端约30个核苷酸)，而pAO815载体含单一BamH I位点，因此重组质粒在用Avr II和BamH I双酶切后，可以根据电泳条带的不同分布区分不同的插入方式(正向、反向以及多片段插入)。图4为单一正向插入SS1片段的pAO815载体的酶切分析图。
4.表达菌株的构建及产物的抗原性检测将pAO815-SS2经Bgl II酶解后用电转化法导入Pichia GS115细胞，用MD琼脂平板(无组氨酸)筛选His+表型的转化子。由于宿主菌本身不能合成组氨酸，只有整合了重组质粒的宿主细胞才能生长。随机挑选重组菌落作小规模诱导表达，用乙肝表面抗原反相血凝试剂盒检测表达产物，挑选表达量较高的菌株，并进一步用ELISA检测S和前S2抗原。从8个His+表型的转化子中，我们筛选到一个能高效表达S和前S2抗原的重组菌株，测定结果如表1。
表1 融合抗原SS2的抗原性检测
5.重组抗原Western blot检测Western Blot分析结果表明表达产物既能与S抗体(图5A)也能与前S2抗体(图5B)结合，融合抗原分子量约为27kd，可以形成二聚体和部分多聚体。图5A和图5B的印迹结果还进一步显示，SS2融合抗原在表达和提取过程中，没有降解条带的产生。
6.重组抗原的电镜观察纯化的SS2重组抗原可以组装成直径20-35nm的球形颗粒，如图6所示。
从上述结果可以看出，将乙肝病毒前S2抗原决定簇的编码序列融合于全长S基因的3’末端后，可以表达出同时具有S和前S2抗原性的融合蛋白颗粒。该融合抗原在变性条件下，既能识别S抗体，也能识别前S2抗体，二者的显色带型一致，表明所有的翻译产物都含有前S2成分。本发明所述的新型融合抗原能够组装成与天然乙肝表面抗原类似的球形颗粒，并且具有比天然中蛋白更好的稳定性，这些特性为开发廉价、高效的新一代乙肝疫苗提供了很好的条件。
以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。
SEQUENCE LISTING<110>成都生物制品研究所<120>羧端含前S2免疫决定簇的乙肝表面抗原融合基因及蛋白质<130>2365<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>756<212>DNA<213>Artificial(人工序列)<400>1atggagaaca cagcatcagg attcctagga cccctgctcg tgttacaggc ggggtttttc60ttgttgacaa gaatcctcac aataccacag agtctagact cgtggtggac ttctctcaat120tttctagggg gagcacccac gtgtcctggc caaaattcgc agtccccaac ctccaatcac180tcaccaacct cttgtcctcc aatttgtcct ggctatcgct ggatgtgtct gcggcgtttt240atcatattcc tcttcatcct gctgctatgc ctcatcttct tgttggttct tctggactat300cacggtatgt tgcccgtttg tcctctactt ccaggaacat caactaccag cacgggacca360tgcaagacct gcacgattcc tgctcaagga acctctatgt ttccctcttg ttgctgtaca420aaaccttcgg acggaaactg cacttgtatt cccatcccat catcctgggc tttcgcaaga480ttcctatggg agtgggcctc agtccgtttc tcctggctca gtttactagt gccatttgtt540cagtggttcg tagggctttc ccccactgtt tggctttcag ttatatggat gatgtggtat600tgggggccaa gtctgtacaa catcttgagt ccctttttac ctctattacc aattttcttt
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2权利要求
1.编码乙型肝炎病毒表面抗原的基因，含有编码乙肝表面抗原S蛋白的核苷酸序列和编码乙肝表面抗原前S2蛋白的核苷酸序列，其特征在于编码所述前S2蛋白的1-26位氨基酸(Met1-Gly26)的核苷酸序列连接于编码所述S蛋白的核苷酸序列的3’端，
2.权利要求1所述的基因，其特征在于，其具有SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。
3.一种乙肝表面抗原融合蛋白，其含有由权利要求1所述的基因编码的氨基酸序列。
4.权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，含有SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列。
5.含有权利要求1所述的核苷酸序列的重组载体。
6.权利要求5所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为pAO815-SS2。
7.一种乙肝DNA疫苗，其含有权利要求1所述的核苷酸序列。
8.权利要求7所述的乙肝DNA疫苗，其特征在于，其含有SEQ IDNO.1所述序列的DNA。
9.一种重组乙肝疫苗的制备方法，包括用权利要求5所述重组载体转化宿主细胞，获得转化体，培养所述转化体获得表达的重组乙肝抗原融合蛋白，对该蛋白进行分离和纯化后即可用于制备重组乙肝疫苗。
10.权利要求6所述的方法，其特征在于所述的宿主细胞为酵母菌。
11.权利要求6所述的方法，其特征在于所述的宿主细胞为大肠杆菌、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
12.一种重组乙肝疫苗，其特征在于它以下述方法制备用权利要求5所述重组载体转化宿主细胞，获得转化体，培养所述转化体获得表达的重组乙肝抗原融合蛋白，对该蛋白进行分离和纯化后即可用于制备重组乙肝疫苗。
全文摘要
本发明涉及编码新型乙肝病毒表面抗原的基因及其蛋白，将乙肝病毒具有B细胞和T细胞表位及多聚白蛋白结合位点的前S2抗原(Met
文档编号C12N15/51GK1704475SQ20041002266
公开日2005年12月7日 申请日期2004年5月31日 优先权日2004年5月31日
发明者谭昌耀, 蒋丽明, 葛永红, 袁进, 金瓯 申请人:成都生物制品研究所