专利名称：一种建立黑麦草转基因受体体系的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属作物生物工程育种领域或作物育种领域。具体说，涉及一种建立黑麦草遗传转化体系的方法及应用背景技术黑麦草是禾本科黑麦草属植物，有一年生黑麦草和多年生黑麦草之分。多年生黑麦草又叫宿根黑麦草。一年生黑麦草又叫多花黑麦草或意大利黑麦草，原产于西南欧、北非和亚洲西南，20世纪50年代作为优质牧草被引进我国。黑麦草分蘖多，产量高，质地柔软，绿期长，是良好的绿色饲料；另外其根系发达，适生性强，耐践踏，有耐盐碱潜力，能增加土壤有机质，改善土壤结构，防止水土流失，又是很好的草坪草。多年生黑麦草在城市绿化中广泛应用。然而，多数黑麦草品种耐旱性较差，且耐盐程度也达不到在盐碱地种植的要求。黑麦草为异花授粉作物，采用常规育种技术培育耐盐耐旱品种周期长，难度大。为了适应黑麦草育种工作的需要，黑麦草的离体培养和转基因技术受到越来越多的重视。
良好的黑麦草遗传转化体系建立的难度较大，主要是由于已有的黑麦草组织培养和植株再生体系不能满足转基因的需要。1988年Greemers Molenaar以未成熟的多年生黑麦草和一年生黑麦草的花序为外植体，诱导愈伤组织发生，研究了2，4-D和供体植物环境对植株再生的影响，获得了再生植株。但黑麦草愈伤组织诱导率低，且在继代培养过程中胚性容易丧失，再生植株易发生体细胞无性系变异。1994年，陈文品以一年生黑麦草和多年生黑麦草幼穗为外植体，不经愈伤组织阶段，直接从幼穗分化成苗，但只有一年生黑麦草诱导率较高，影响了进一步的应用。黑麦草的遗传转化工作虽开始较早，但进展不大。早在1993年，Hensgens等研究了gusA和水稻基因的融合基因在多年生黑麦草中的瞬时和稳定表达。1994年，Van der Maas等将gusA报告基因转入多年生黑麦草愈伤组织，并研究了其在细胞中的长效表达情况。1995年，Spangenberg等开展了利用微弹轰击法转化多年生黑麦草的胚性悬浮细胞的工作。1997年Ye等用同样方法转化一年生黑麦草胚性悬浮细胞获得转基因植株。1998年，Folling等研究了黑麦草原生质体核酸酶活性的降低对转化效率的影响。同年，Dalton等利用硅碳纤维介导法转化一年生黑麦草和多年生黑麦草悬浮细胞系，分别获得转基因植株。1999年Dalton等又尝试利用微弹轰击法转化一年生和多年生黑麦草。2001年，Ye等将SacB基因转入一年生黑麦草，研究了转基因植株中果聚糖的变化。同年，Xu等获得了抗花叶病毒的多年生黑麦草转基因植株。2003年，Dalton实验室尝试了利用农杆菌介导法转化一年生黑麦草。在以上工作中，选用的遗传转化受体通常为具有再生能力的愈伤组织或悬浮培养细胞，由于愈伤组织诱导率低、继代容易变异、再生能力差，只有几个实验室获得了转基因黑麦草植株，且频率较低，很多实验室转化后未得到转基因植株。因此找到合适的受体系统对黑麦草细胞工程和基因工程研究有重要意义。
发明内容
针对上述技术的不足，本发明以一年生黑麦草和多年生黑麦草优良品种或黑麦草种属间杂种的无菌种子苗或试管苗的茎尖为材料，在诱导培养基上诱导丛生芽发生，然后转到增殖培养基上产生大量丛生芽，提供转基因的受体材料。采用基因枪轰击法或农杆菌介导法将外源基因导入受体细胞，经选择获得转化细胞及植株。在此基础上，确立了在农杆菌介导的遗传转化中，采用表面活性剂Silwet L-77处理和减压处理有效提高了转化频率，从而建立起一个高效的基因型制约小的黑麦草转基因技术体系。
本发明主要步骤包括以黑麦草种子苗茎尖或幼穗切段为试验材料，诱导其发生丛生芽，后者在增殖培养基上持续增生，提供转基因的受体材料。利用丛生芽生长点和无菌小苗生长点为受体，采用基因枪轰击法或农杆菌介导法将外源基因导入受体细胞，经选择获得转化细胞及植株，并对转基因植株进行鉴定和选择。
本发明中所述的黑麦草包括多花黑麦草(一年生黑麦草)品种、多年生黑麦草品种、黑麦草种间杂种品种和黑麦草与羊茅杂种品种。
所述的丛生芽是指外植体在培养基上产生的成丛密集的小芽及其继代培养物。丛生芽块是指离体培养的丛生小芽和未组织化的分裂细胞构成的组织块及其继代培养物。
所述的转基因受体是指去掉叶片或芽鞘的茎尖离体培养产生的丛生芽生长点或/和无菌小苗生长点。
无菌苗可来源于黑麦草种子无菌萌发、或组织培养产生的小苗、或不定芽长成的小苗、或丛生芽分割后长成的小苗。
利用丛生芽或无菌苗为受体进行遗传转化时，首先剥去丛生芽小叶或无菌苗叶鞘，裸露生长点，后者用于农杆菌感染或基因枪轰击。
本发明中的选择剂包括除草剂(绿黄隆、草丁膦、草干膦等)、抗生素(潮霉素、卡那霉素等)。选择剂抗性基因有除草剂抗性基因如als(突变的乙酰乳酸合成酶基因)、bar(基因)等，抗生素抗性基因如hpt(潮酶素磷酸转移酶基因)、nptII(卡那霉素抗性基因)等。
所述的培养基配方为丛生芽诱导培养基的组成MS培养基、200-500mg L-1的水解酪蛋白(CH)、蔗糖30-60g L-1、6-BA 0.001-4.0mg.L-1、2，4-D 0.001-2.0mg.L-1、琼脂6.5g L-1，pH5.8-6.0。
丛生芽增殖培养基的组成MS培养基、200-500mg L-1的水解酪蛋白(CH)、蔗糖30-40g L-1、6-BA 0.001-3.0mg.L-1、2，4-D0-0.1mg.L-1、琼脂6.5g L-1，pH5.8-6.0。
小苗生根培养基的组成1/2MS培养基、200mg L-1水解酪蛋白(CH)、蔗糖20-40gL-1、NAA 0.2-2.5mg L-1、琼脂6.5g L-1，pH5.8-6.0。
所述的遗传转化方法可以黑麦草丛生芽或无菌苗茎尖为受体采用农杆菌感染丛生芽块及裸露生长点法。即将丛生芽块及裸露生长点放入菌液中浸染并附以0.98-0.10个大气压(0.98×105Pa-1×104Pa)处理，浸染3-18分钟。然后用无菌滤纸吸去菌液，将感染后组织转入增殖培养基上共培养2-3天，再转入加有适宜浓度选择剂和100-200ppm头孢霉素的筛选培养基上连续筛选3代(每代20天)，获得抗选择剂小苗。将2-3cm的小苗转入生根培养基中生根，获得转化植株。
所述的农杆菌(Agrobacterium，包括A.tumefaciens和A.rhizogenes)介导的遗传转化程序基本上同石田(Ishida，1996)等报道的。在转染液中添加乙酰丁香酮(acetosyringone，As)等酚类化合物、表面活性剂Silwet L-77(浓度为0-0.3％)和中性单糖(葡萄糖、木糖)，丛生芽块或裸露茎尖放在悬浮农杆菌的转染液中，在0.98-0.10个大气压(0.98×105Pa-1×104Pa)下浸染3-18分钟，然后在培养基上共培养2-15天。转化体在含有适宜抗生素的培养基上抑菌，在加有合适浓度选择剂的培养基上筛选，然后在增殖培养基上分化小苗。
所述的基因枪轰击法(particle bomrdment；microprojectile；biolistics；particle gun)是籍高速度的金属微粒将核酸分子引入活细胞中的一种遗传转化技术。最初是美国康乃尔大学萨伏特(Sanford)等研制成功的火药基因枪及转化技术，此后有不同学者研制出的多种基因枪及不断改进的转化技术。本发明研究中所用的基因枪为美国Bio-RAD公司产品，型号为Biolistic PDS-1000/He Particle Delivery System。按使用说明书操作。轰击参数为可裂圆片与载体的距离为2.5厘米，载体与阻挡网的距离为0.8厘米，氦气压力为1100psi，真空度28inchHg，微弹飞行距离在3-9厘米间取值。
丛生芽诱导体系可以种子苗茎尖为外植体，在加有适宜浓度6-BA和2，4-D的诱导培养基上培养，诱导生长点及其外叶鞘膨大，从膨大的生长点表面上发生小芽，培养10-15天后形成由8-10个密集小芽组成的丛生芽。具体步骤为黑麦草种子经70％酒精灭菌1min，0.2％升汞灭菌5min，无菌水洗4次。在MS无激素培养基上黑暗条件下萌发，温度25±2℃。4-5天后，胚芽伸长至2-3cm时，切取茎尖部位(2-3mm的上胚轴和茎尖)作为诱导丛生芽的外植体，接种到含有不同浓度6-BA和2，4-D的诱导培养基上。培养条件温度25±2℃，光照12小时/天，光强800-1000Lx。15-20天后形成丛生芽块。外源激素的种类和浓度对黑麦草丛生芽的形态发生起着极为重要的作用。在无6-BA和2，4-D的培养基上没有丛生芽发生；培养基不含2，4-D，小芽丛叶色浓绿，部分玻璃化，叶面有黄斑；培养基2，4-D浓度较低(0.01-0.2mg.L-1)，诱导的小芽叶片往往扭曲，芽基部较细，诱导率也较低；在2，4-D浓度高于0.5mg.L-1的诱导培养基上，芽基部愈伤化较严重，芽块上发生较多叶片，小芽数变少，且芽基部有很多根发生。将继代培养20天后形成的从生芽块剥去老叶，然后分成单芽或小芽块(2毫米大小)转移到增殖培养基上培养，每20天继代一次。对于大多数基因型而言，增殖培养基以MS+2.0mg.L-16-BA为适，在此培养基上每个芽丛的平均芽数最多(9.96)，丛生芽长势好，在继代培养3代后，芽增生非常旺盛，一个单芽或小芽块在继代培养20天后可产生50个左右小芽。
在继代培养过程中去掉芽尖周围的叶鞘对丛生芽发生有重要作用，叶鞘包裹会使丛生芽发生受阻。在继代培养过程中，若2，4-D和6-BA浓度过高，会引起小芽愈伤组织化，最终导致白化苗产生频率增高。6-BA浓度过高(超过2.0mg.L-1)时，小芽出现叶尖发黄和叶片出现褪绿条纹。另外，6-BA浓度过高会影响生根。
丛生芽诱导体系也可以黑麦草幼穗(0.2-1.5厘米长)切段为外植体，在适宜激素组合的培养基上诱导不定芽或/和丛生芽发生和大量扩增。
所述的遗传转化方法可以黑麦草丛生芽或无菌苗茎尖为受体用基因枪轰击法将携带目的基因和选择剂抗性基因的质粒导入受体细胞，具体程序为从宿主菌中提取携带目的基因和选择剂抗性基因的质粒并纯化，稀释DNA浓度为1μg/μl；称取金粉并彻底洗涤；分散金粉并依次加入质粒DNA、CaCl2和亚精胺，边旋涡边加样，达到用DNA包裹微弹；微弹滴在载体上用基因枪轰击，可裂圆片与载体的距离为2.5cm，载体与阻挡网的距离为0.8cm，微弹飞行距离6-9cm；轰击后的组织块在暗中恢复培养2-3天，然后将它们转入成分不变的新培养基中培养3周，使转入的基因得到充分表达，然后将它们转入加有选择剂(抗生素或除草剂)的增殖培养基上连续筛选三代，每代15-20天；挑选出三代筛选后存活的组织块转移到无选择剂的继代及成丛培养基上诱导丛生芽形成，并通过在增殖培养基上继代培养一次获得较大的丛生芽及小苗。从丛生芽块上切取2-3厘米的小苗转入生根培养基中诱导生根；小苗根长到2-3cm时放在自然光下培养1-2天，然后去掉封口膜炼苗1-2天，于清晨或傍晚移栽到花盆或田间；提取转化植株叶片DNA，根据目标基因或/和选择标记基因的DNA序列设计PCR引物。通过PCR检测初步确定转基因植株。取PCR阳性的植株进行Southern印迹法鉴定，探针为目的基因片段。
本发明能获得大量的具有很强植株再生能力的丛生芽块和无菌苗，可从绝大多数基因型中高效获得转基因植株，且再生植株体细胞无性系变异小，多数植株生长发育正常。本发明的特点在于1)大幅度减少基因型障碍，可诱导绝大多数基因型的黑麦草茎尖产生丛生芽；2)转化频率较高；3)取材不受季节限制；4)转基因植株绝大多数保持原基因型的特征特性。
具体实施例方式
实施例1、采用农杆菌介导法产生黑麦草转基因植株及利用丛生芽诱导与继代培养 植物材料为多年生黑麦草品种泰垂莱特。黑麦草种子经70％酒精灭菌1min，0.2％升汞灭菌5min，无菌水洗4次后，在无激素培养基上黑暗条件下萌发，温度25±2℃。4～5d后，胚芽伸长至2～3cm时，切取长约2-3mm的茎尖部位作为外植体，接种到含有2.0mg.L-16-BA和0.5mg.L-12，4-D的诱导培养基上。培养条件温度25±2℃，光照12h/d，光强800-1000Lx。15-20天后形成丛生芽块。将丛生芽块剥去较老的叶片，分成单芽或小芽块(2毫米大小)转移到6-BA2.0mg.L-1的增殖培养基上培养，在同样光温条件下培养，每20天继代培养一次。
筛选剂浓度的确定 将丛生芽切成单芽接种于加有不同浓度潮霉素的继代培养基上，每15天继代一次，共继代培养3代。在每种筛选培养基上接种小苗100-300株，通常取8个选择剂浓度。浓度及浓度梯度因选择剂种类和受体材料基因型不同而变化。连续筛选3代后统计小苗存活率。以未转基因小苗接近全部死亡的选择剂浓度为转化细胞的筛选浓度。确定的潮霉素浓度为10mg.L-1。
农杆菌介导的遗传转化 将带有植物表达载体pCAMBIA1300-hpt-betA的根瘤农杆菌LBA4404放在附加抗生素的LB培养基中28℃下震荡培养，使细菌处于对数生长期(OD600＝0.4-0.6)。然后离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2浓度的液体基本培养基洗涤，再离心收集。再将菌体用添加乙酰丁香酮(acetosyringone，As)100μmol L-1和表面活性剂Silwet L-77 0.02％的1/2浓度的液体基本培养基悬浮，稀释10-20倍用于转化。将继代培养8天的丛生芽块切至暴露出芽尖生长点，放入菌液中浸染6-8分钟，并附以0.95-0.10个大气压(0.95×105Pa-1×104Pa)负压处理。转染后组织块用无菌滤纸吸干后转入增殖培养基(6-BA 2mg L-1)培养2-4天，然后转入加有潮霉素10mg.L-1和100ppm头孢霉素的筛选培养基上连续筛选3代(每代20天)，获得抗选择剂小苗。将2-3cm的小苗转入生根培养基中生根。在生根培养基上，当小苗根长到2-3cm时放在自然光下培养1-2天，然后去掉封口膜炼苗1-2天，于清晨或傍晚移栽到花盆或田间。移栽成活的小苗取叶片用于分子生物学检测。经PCR和Southern印迹法分析，转化率(产生转基因植株的芽块数/农杆菌感染的芽块数*100)为6％左右。
实例2、采用基因枪轰击法产生黑麦草转基因植株及利用丛生芽诱导与继代培养和筛选剂浓度的确定受体为一年生黑麦草海湾品种，其它同实例1。
质粒为pCAMBIA1300-hpt-antiport。提取和纯化采用标准程序及方法(参见《分子克隆》)。质粒质量为OD260/OD280在1.7-1.8之间。质粒DNA稀释为1μg/μl。
DNA包裹微弹1)、称取3mg 1.0μm大小的金粉，放入一个Eppendorf管中，加入1ml 70％乙醇剧烈涡旋3-5分钟，然后静置15分钟，室温下15000rpm离心5秒后去除上清液。2)、加1ml无菌水，剧烈涡旋1分钟，静置1分钟，室温下15000rpm离心5秒后去除上清液。此步骤重复3次。3)、第三次洗涤后的金粉，加50μl 50％灭菌甘油(终浓度为60mg/ml微弹。该制备液室温可贮存2周)。4)、使用时涡旋5分钟打破金粉凝集。5)、分散后金粉依次加入5μl质粒DNA(1μg/μl)、50μl 12.5MCaCl2、20μl 0.1M亚精胺，边旋涡边加样。6)、继续旋涡2-3分钟，静置1分钟。7)、15000rpm离心2秒后弃上清液，加140μl 70％乙醇，静置沉淀，15000rpm离心2秒后弃上清液。8)、加48μl无水乙醇，轻弹管壁数次，低速下涡旋2-3秒，然后取样加在微弹载体上。微弹用量为每弹0.5mg。
基因枪轰击 在直径9cm的培养皿中倒入0.4cm厚的培养基，然后将丛生芽块(2-3mm大小，继代培养后6-9天)或茎尖生长点高密度放入培养皿中，用基因枪轰击。每皿轰击1-2次。轰击参数取可裂圆片与载体的距离为2.5cm，载体与阻挡网的距离为0.8cm，微弹飞行距离8或9cm。其它参数按使用说明书取值。
转化后组织块的培养和植株再生轰击后组织块在暗中恢复培养2-3天，然后将它们转入增殖培养基中培养3周。此期丛生芽块或茎尖生长良好，转入的目标基因得到充分表达。然后将恢复培养后的丛生芽块或茎尖转入加有潮霉素10mg.L-1的增殖培养基上进行筛选培养。连续筛选3代，每代20天。挑选出三代筛选后存活的组织块转移到无潮霉素的增殖培养基上再生小苗。
转化小苗的生根、移栽和分子生物学检测同实施例1。
权利要求
1.一种建立黑麦草转基因受体体系的方法及其应用，其特征在于①种子萌发小苗的茎尖离体培养及培养基，②茎尖组织诱导丛生芽及培养基，③丛生芽块继代培养，④以丛生芽块为受体进行遗传转化及受体组织继代培养时间和转化参数；所述的转基因受体体系是指茎尖离体培养产生的丛生芽块及其扩增和继代培养物；丛生芽块是指离体培养茎尖在含有2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)和6-BA(6-苄基嘌呤)的培养基上产生的由丛生小芽和未组织化细胞组成的组织块及其继代培养物。
2.如权利要求1所述的一种建立黑麦草转基因受体体系的方法及其应用，其特征在于，所述的黑麦草是一年生黑麦草品种、多年生黑麦草品种、黑麦草种间杂种品种和黑麦草与羊茅杂种品种之一。
3.如权利要求1所述的一种建立黑麦草转基因受体体系的方法及其应用，其特征在于，所述的培养基配方为丛生芽诱导培养基的组成MS培养基、200-500mg L-1的水解酪蛋白(CH)、蔗糖30-60g L-1、6-BA 0.001-4.0mg.L-1、2，4-D 0.001-2.0mg.L-1、琼脂6.5g L-1，pH5.8-6.0；丛生芽增殖培养基的组成MS培养基、200-500mg L-1的水解酪蛋白(CH)、蔗糖30-40g L-1、6-BA 0.001-3.0mg.L-1、2，4-D 0-0.1mg.L-1、琼脂6.5g L-1，pH5.8-6.0；小苗生根培养基的组成1/2MS培养基、200mg L-1水解酪蛋白(CH)、蔗糖20-40g L-1、0.2-2.5mg L-1NAA、琼脂6.5g L-1，pH5.8-6.0。
4.按照权利要求1所述的一种建立黑麦草转基因受体体系的方法及其应用，其特征在于，离体茎尖取自无菌萌发的种子，待小苗长到2-3厘米时，切取茎尖部位接种到诱导培养基上，于弱光下诱导丛生芽发生，丛生芽块在增殖培养基上扩增，小苗在生根培养基上生根长大。
5.根据权利要求1限定的一种建立黑麦草转基因受体体系的方法及其应用，其特征在于，用基因枪轰击法或农杆菌介导法进行丛生块遗传转化，转化后材料恢复培养后，在抑菌或/和在选择培养基上连续筛选，通过加压筛选获得转基因细胞及丛生芽块，进而再生出转基因植株。
6.按照权利要求1或5限定的一种建立黑麦草转基因受体体系的方法及其应用，其特征在于，取继代后培养7-12天的丛生芽块作为转基因受体。
7.按照权利要求1或5限定的一种建立黑麦草转基因受体体系的方法及其应用，其特征在于，采用农杆菌介导法在0.98-0.10个大气压(0.98×105Pa-1×104Pa)下进行遗传转化，在菌液中加入浓度为0-0.3％的表面活性剂Silwet L-77。
全文摘要
本发明公开一种建立黑麦草转基因受体体系的方法及其应用，主要步骤包括以一年生或多年生黑麦草无菌种子苗茎尖为材料，在诱导培养基上诱导丛生芽发生，在增殖培养基上丛生芽块持续增殖，转入生根培养基后产生完整植株。在增殖培养基上取适宜生长期的丛生芽块，剥去丛生芽小叶片，裸露生长点，采用基因枪轰击法或农杆菌介导法进行遗传转化，获得转基因植株。在农杆菌介导的遗传转化中，采用表面活性剂Silwet L－77处理和减压处理有效提高了转化频率，从而建立起一个高效的基因型制约小的黑麦草转基因技术体系。
文档编号C12N5/04GK1597933SQ200410024550
公开日2005年3月23日 申请日期2004年8月13日 优先权日2004年8月13日
发明者杨爱芳, 张举仁, 尹小燕, 张可炜, 谷晓峰 申请人:山东大学