专利名称：一种大肠杆菌质粒载体及其应用方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及可在基因重组技术中使用的质粒载体及其应用方法，更具体地说，涉及由大肠杆菌热休克系统调控的质粒载体，以及用该质粒载体表达外源基因产生目标蛋白的方法。
背景技术：
大肠杆菌表达系统由表达载体和相应的宿主细胞两部分构成，是发展最早、应用最广、最容易操作的基因高效表达系统。在大肠杆菌表达系统中，表达载体通常运用可调控型启动子控制外源基因的表达；这些启动子的类型对控制被表达的目标蛋白对细胞生长的抑制、减少细胞蛋白酶对目标蛋白的降解作用，以及目标蛋白的产量和可溶性等起着至关重要的作用。因此，所用启动子的性质决定了相应表达载体的生产效率和应用潜力。经过二十多年的发展，一些具有不同启动子类型的表达载体已经被广泛应用于科学研究和商品蛋白的生产过程。其中研究和应用最为成功的代表类型是带有lac/tac启动子、PL/PR启动子、T7启动子的系列载体(Sambrook，J，and DW Russell.2001.Molecular Cloninga laboratory manual，3rded.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)。
lac/tac启动子带有这类启动子的表达载体是通过大肠杆菌的lac操纵基因来实现表达调控的。无诱导剂存在时，lacI编码的阻遏蛋白与启动子下游的操纵基因紧密结合阻止转录的起始；诱导剂的加入使阻遏蛋白从操纵基因上解离出来，从而使基因得到转录或表达。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)是最有效、应用最广泛的诱导剂，但是由于其价格昂贵并且具有一定的毒性，使lac/tac系列的表达载体在工业酶或药用蛋白生产中的应用受到限制。也有用乳糖代替IPTG作诱导剂，但是因为乳糖是可代谢底物，其诱导效果不够理想。
PL/PR启动子PL/PR是λ噬菌体的早期转录启动子，受基因cI所编码的阻遏蛋白抑制。cI基因的温度敏感型突变体cI857ts所产生的阻遏蛋白在较低温度时(30℃)对PL/PR具有阻遏功能，在较高温度(如40℃)时失去活性并且解阻遏(Elvin，CM et al.1990.Modifiedbacteriophage lambda promoter vectors for overproduction of proteins in Escherichiacoli.Gene，87123-126)。通过热激进行外源基因的诱导表达的PL/PR表达载体已经发展得比较成熟。但是一般认为在进行大体积培养时难以实现快速升温(Glazer，AN，and H Nikaido.1995.Microbial Biotechnology.WH Freeman and Company，New York)，而升温缓慢又会影响表达水平；同时可能存在的另一个问题是在热激诱导过程中，大肠杆菌热休克系统被激活，从而合成蛋白酶对目标蛋白进行降解。
T7启动子T7启动子来源于大肠杆菌T7噬菌体，由T7 RNA聚合酶选择性识别和启动转录。这种表达载体是通过控制T7 RNA聚合酶的合成而进行调控的将编码T7 RNA聚合酶的基因插入λ噬菌体，使它处于lac启动子或PL启动子的控制下；用这些λ噬菌体的衍生株感染大肠杆菌获得溶源菌DE3或CE6；以这些溶源菌为宿主细胞就可以通过IPTG诱导或热激诱导T7 RNA聚合酶的合成，从而启动T7启动子转录和表达。目前所有表达系统中，表达目的基因水平最高的是具有T7启动子的系列表达载体。但是T7表达载体也有不足之处，如有赖于辅助基因、需要采取其它措施控制本底表达水平、易产生不溶性表达产物等等(Russell D.1999.Gene expression systems based on bacteriophage T7 RNA polymerase.In GeneExpression Systems(Fernandez，JM，and JP Hoeffler，eds.)，pp 9-44.Academic Press，London)。同时，因为人们在对T7启动子进行诱导表达时间接地使用了lac或PL启动子，所以同样会遇到诱导剂或诱导方法方面的问题。
发明内容
本发明的目的在于构建一种通过热激诱导，且表达水平高于其它大肠杆菌表达载体的新型质粒。
本发明的目的通过以下技术方案得以实现(1)构建一种质粒载体，其特征在于具有由大肠杆菌σ因子σ32识别和调控的启动子。
(2)上述(1)中所述的质粒载体，其特征在于所述的由大肠杆菌σ因子σ32识别和调控的启动子，其序列为5’-CCCCCTTGAA TGTGGGGGAA ACATCCCCAT GATCCAAGGA G-3’。
(3)上述(1)中所述的质粒载体，其特征在于所述的由大肠杆菌σ因子σ32识别和调控的启动子，其序列为5’-CGGCGTTGAA TGTGGGGGAA ACATCCCCAT ATACTGACGT A-3’或5’-CCCCCTTGAT GACGTGGTTT ACGACCCCAT TTAGTAGTCA-3’。
(4)一种质粒载体，其中待表达的目的基因被整合进上述(1)至(3)任一项的质粒载体中。
(5)一种应用上述质粒载体表达目的基因的方法，其特征在于在大肠杆菌宿主细胞中导入一种质粒载体，在所述质粒载体中待表达的目的基因被整合进上述(1)至(3)任一项的质粒载体中；并用热激诱导方法诱导目的基因的表达。
本发明的质粒作为表达载体应用于构建大肠杆菌基因工程菌，并通过热激诱导外源基因的表达，但诱导表达机理不同于其它表达载体，受热激诱导的宿主蛋白酶活性很低，表达水平远远高于PL载体，而且目标蛋白的群体表达量(mg/L)一般高于T7载体。
本发明的质粒载体可以通过以下方法构建1.新型启动子和终止子的设计和合成根据大肠杆菌σ32识别的启动子的碱基共同序列设计新型启动子，其序列为5’-CCCCCTTGAA TGTGGGGGAA ACATCCCCAT GATCCAAGGA G-3’(划线部分为共同序列)，命名为热激启动子(Hsh promoter，图1)；同时，大肠杆菌热激蛋白基因lon和dnaK P1的启动子也被用于本系列表达载体的启动子，其序列为5’-CGGCGTTGAA TGTGGGGGAA ACATCCCCATATACTGACGT A-3’(lon)，或5’-CCCCCTTGAT GACGTGGTTT ACGACCCCAT TTAGTAGTCA-3’(dnaKP1)。
根据GeneBank文件ECORPSRPO，设计一个不依赖于大肠杆菌Rho的GAAA终止子，其序列为5’-GA AGGCCGCTTCCGAAAGGAAGCGGCT TTTTT-3’，命名为热激终止子(Hsh terminator，图1)。大肠杆菌的其它依赖于或不依赖于Rho的终止子也可以用于本质粒，终止由上述启动子所启动的基因转录，如ECOPROC的终止子5’-CGGACGTCAGGCCGCCACTTCGGTGCGGTTACGTCCGGCTTTCTTT-3’，或ECOXYLE的终止子5’-CTTCCTGTCCAGCACGCCGCGCCATTTCGGCGTGCTGACTTTTT-3’等等(下划线标明终止子中配对形成茎环的序列)。
2.新型表达载体各元件的扩增和组装方法(1)设计并合成一对带有新型启动子或终止子的引物，它们的序列是5’-CCGGAATTCCTCCTTGGATC ATGGGGATGT TTCCCCCACA TTCAAGGGGGCTCTTCCGCT TCCTCTC-3’和5’-TGAAGCTTGAAGGCCGCTTC CGAAAGGAAG CGGCTTTTTTGCCTGATGCG GTATTTTC-3’(划线部分为添加的限制性内切酶识别位点以及与模板配对的序列)。以pUC19为模板，用DNA聚合酶Pyrobest(TaKaRaBiotech，Co.，Ltd.，Dalian，China)进行聚合酶链式反应(PCR)扩增出其复制起点(Ori)、氨苄青霉素抗性基因(Ampr)。
(2)通过PCR从海栖热袍菌Thermotoga maritima(ATCC43589)基因组DNA中扩增木聚糖酶基因B(xynB)，在其上游加入限制性内切酶BamH I识别位点，在其下游融合一个Xho I识别位点和六个组氨酸密码子，并在末端加入限制性内切酶Hind III识别位点。将所扩增的DNA片段插入载体pAlter-ex2(Promega Corp.，Madison，WI，USA)相应的位点构成pAlter-ex2-xynB。
(3)用限制性内切酶EcoR I和Hind III从pAlter-ex2-xynB上切下带有SD序列、多克隆位点、xynB和组氨酸标签的DNA片段；用限制性内切酶EcoR I和Hind III处理PCR扩增的带有新型启动子及终止子的pUC19的复制子和抗性基因的DNA片段；用T4 DNA连接酶将两个DNA片段连接起来获得带有xynB的载体pHsh-xynB。
(4)用限制性内切酶BamH I和Xho I从pHsh-xynB中切除xynB，用T4 DNA聚合酶将粘性末端补平，并用T4 DNA连接酶进行环化连接获得新载体pHsh(图1)。
以其它热激蛋白启动子及其类似序列替换本质粒中的启动子得到一系列由大肠杆菌σ32调控的基因表达载体，如pHsh-lon、pHsh-dK等。可以用以下方法进行替换设计带有lon或dnaK P1等热激蛋白启动子的引物，以pHsh为模板，用DNA聚合酶Pyrobest扩增，并用DNA激酶磷酸化和DNA连接酶环化连接，产生带有不同热激蛋白启动子的系列载体pHsh-lon或pHsh-dK等。
本发明的质粒载体的应用效果为了检验本发明所构建的表达载体pHsh在外源基因表达中的有益效果，乙醇嗜热厌氧杆菌Thermoanaerobacter ethanolicus(ATCC31936)中的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双活性酶基因xarB和T.maritima基因xynB的突变体xynIII(本实验室诱变产生)等外源基因被分别克隆到商品化载体pTrc99A(tac启动子，Pharmacia，Piscataway，NJ，USA)、pET28(T7启动子)(Novagen，Inc.，Madison，WI，USA)和已得到广泛使用的热激诱导质粒pJLA503(PL启动子，Schauder，B et al.1987.Inducible expression vectors incorporating theEscherichia coli atpE translational initiation region.Gene，52279-283)，构建成基因重组菌株进行了表达水平的比较试验。该试验中所用到的基因克隆的技术均参照冷泉港实验室出版的实验手册《分子克隆》第三版(Sambrook，et al.，2001)。表达水平试验中各载体的表达诱导采用了相应的供应商所建议的最佳条件将以pTrc99A、pET28为表达载体的重组菌置于37℃通气培养，细胞密度(OD600)达到0.8左右时向培养液中分别加入5mM和1mM IPTG进行诱导；或将以pJLA503、pHsh为表达载体的重组菌置于30℃摇床振荡培养，细胞密度(OD600)达到0.8左右时将培养管或三角瓶从30℃摇床移入42℃水浴摇床振荡培养。
阿拉伯糖苷酶基因表达试验以T.ethanolicus基因组DNA为模板扩增出基因xarB，将它分别克隆到表达载体pTrc99A、pET-28a和pHsh中得到的重组质粒，并转化大肠杆菌JM109或JM109(DE3)得到相应的重组菌株pTrc-xar、pET-xar、pHsh-xar，经培养和表达诱导后，根据阿拉伯糖苷酶(arabinosidase)活性的增加进行表达水平的比较。试验结果(图2)表明在以pHsh为载体的重组菌pHsh-xar中阿拉伯糖苷酶的表达水平比以pTrc99A为载体的重组菌pTrc-xar高2.6倍左右，比以pET28为载体的重组菌pET-xar高0.5倍以上，而且pHsh-xar的本底表达明显低于pET-xar。
木聚糖酶基因表达试验将T.maritimas基因xynB的突变体xynIII克隆到表达载体pJLA503、pET-28a和pHsh中得到的重组质粒；并将它们分别转化到大肠杆菌JM109或JM109(DE3)得到相应的重组菌株pJLA-xynIII、pET-xynIII和pHsh-xynIII，经培养和表达诱导后，测定木聚糖酶活性的增加。试验结果表明在以pHsh为载体的重组菌pHsh-xynIII中木聚糖酶的表达水平比以pJLA503为载体的重组菌pJLA-xynIII高2倍以上，比以pET28为载体的重组菌pET-xynIII高10倍左右(图3)。
运用pHsh系列载体进行生物活性蛋白的基因表达可以取得以下有益效果(1)本底表达低，重组蛋白产量高，表达量(mg/L)一般高于T7系统；(2)通过热激诱导外源基因的表达，避免使用IPTG等化学诱导剂；(3)热激诱导机制不同于PL，克服了PL的弱点；(4)载体分子量小，易于进行分子操作，如原位进行定点突变等；(5)对宿主菌株没有特殊要求，不需要对宿主菌株进行特殊的基因改造。
图1是质粒pHsh结构图。其中Hsh promoter是启动子，Hsh terminater是终止子；所标出的限制性内切酶在该质粒上具有单一识别位点。
图2是Thermoanaerobacter ethanolicus阿拉伯糖苷酶基因xarB在不同表达载体中的表达曲线。大肠杆菌培养基为Luria-Bertani(LB)培养基，另加卡那霉素至30μg/ml(pET-xar)或氨苄青霉素至100μg/ml(pTrc-xar和pHsh-xar)；酶活性定义以1mM对硝基苯酚α-阿拉伯糖苷(pNPA，Sigma)为底物，在80℃，pH 5.7的条件下，每分钟产生1μmol对硝基苯酚所需要的酶量定义为1个活性单位。
图3是Thermotoga maritimas基因xynB的突变体xynIII在不同表达载体中的表达曲线。大肠杆菌培养基为Terrific培养基，另加卡那霉素至30μg/ml(pET-xynIII)或氨苄青霉素至100μg/ml(pJAL-xynIII和pHsh-xynIII)；木聚糖酶活性定义以0.5％Oat xylan(Sigma)为底物，在90℃，pH 5.8的条件下，每分钟产生1μmol还原糖所需要的酶量定义为1个活性单位。
具体实施例方式
以下通过实施例进一步说明本发明具体实施方式
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实施例1(1)启动子和终止子的设计和合成根据大肠杆菌σ32识别的启动子的碱基共同序列设计新型启动子，其序列为5’-CCCCCTTGAATGTGGGGGAA ACATCCCCAT GATCCAAGGA G-3’(划线部分为共同序列)，命名为热激启动子(Hshpromoter，图1)；根据GeneBank文件ECORPSRPO，设计一个不依赖于大肠杆菌Rho的GAAA终止子，其序列为5’-GA AGGCCGCTTCCGAAAGGAAGCGGCT TTTTT-3’(下划线标明终止子中配对形成茎环的序列)，命名为热激终止子(Hsh terminator，图1)。
(2)质粒载体各元件的扩增和组装方法设计并合成一对带有新型启动子或终止子的引物，它们的序列是5’-CCGGAATTCCTCCTTGGATC ATGGGGATGT TTCCCCCACA TTCAAGGGGGCTCTTCCGCT TCCTCTC-3’和5’-TGAAGCTTGAAGGCCGCTTC CGAAAGGAAG CGGCTTTTTTGCCTGATGCG GTATTTTC-3’(划线部分为添加的限制性内切酶识别位点以及与模板配对的序列)。以pUC19为模板，用DNA聚合酶Pyrobest(TaKaRaBiotech，Co.，Ltd.，Dalian，China)进行聚合酶链式反应(PCR)扩增出其复制起点(Ori)、氨苄青霉素抗性基因(Ampr)。
通过PCR从海栖热袍菌Thermotoga maritima(ATCC4 3589)基因组DNA中扩增木聚糖酶基因(xynB)，在其上游加入限制性内切酶BamH I识别位点，在其下游融合一个Xho I识别位点和六个组氨酸密码子，并在末端加入限制性内切酶Hind III识别位点。将所扩增的DNA片段插入载体pAlter-ex2(Promega Corp.，Madison，WI，USA)相应的位点构成pAlter-ex2-xynB。
用限制性内切酶EcoR I和Hingd III从pAlter-ex2-xynB上切下带有SD序列、多克隆位点、xynB和组氨酸标签的DNA片段；用限制性内切酶EcoR I和Hind III处理PCR扩增的带有新型启动子及终止子的pUC19的复制子和抗性基因的DNA片段；用T4 DNA连接酶将两个DNA片段连接起来获得带有xynB的载体pHsh-xynB。
用限制性内切酶BamH I和Xho I从pHsh-xynB中切除xynB，用T4 DNA聚合酶将粘性末端补平，并用T4 DNA连接酶进行环化连接获得新载体pHsh(图1)。
(3)基因克隆将Thermotoga maritimas基因xynB的突变体xynIII通过NcoI和XhoI双位点克隆到表达载体pHsh中构建成重组质粒pHsh-xynIII；用电穿孔法(electroporation)将这个质粒转入大肠杆菌菌株JM109。
(4)表达诱导将菌种(OD600约为2.0)以2％接入装在100ml三角瓶中的30ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基，置于30℃摇床中进行振荡培养；当OD600约为0.8时，将三角瓶移入42℃的水浴摇床继续进行振荡培养；约8个小时后停止培养并离心收集细胞。
实施例2与实施例1基本相同，不同之处在于启动子为大肠杆菌热激蛋白基因lon的启动子，其序列为5’-CGGCGTTGAA TGTGGGGGAA ACATCCCCAT ATACTGACGT A-3’(lon)，设计带有lon热激蛋白启动子的引物，用DNA聚合酶Pyrobest扩增，并用T4 DNA激酶磷酸化和T4DNA连接酶环化连接，获得新载体pHsh-lon。
实施例3与实施例1基本相同，不同之处在于启动子为大肠杆菌热激蛋白基因dnaK P1的启动子，其序列为5’-CCCCCTTGAT GACGTGGTTT ACGACCCCAT TTAGTAGTCA-3’(dnaK P1)，设计带有dnaK P1热激蛋白启动子的引物，用DNA聚合酶Pyrobest扩增，并用T4 DNA激酶磷酸化和T4 DNA连接酶环化连接，获得新载体pHsh-dK。
实施例4与实施例1基本相同，不同之处在于，外源基因为T.maritima中的葡萄糖醛酸酶基因aguA，将它克隆到表达载体pHsh中得到重组质粒，并转化大肠杆菌JM109得到相应得重组菌株pHsh-agu。
实施例5与实施例1基本相同，不同之处在于，外源基因为T.ethanolicus中的木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶双活性酶基因xarB，将它克隆到表达载体pHsh中得到重组质粒，并转化大肠杆菌JM109得到相应得重组菌株pHsh-xar。
实施例6与实施例1基本相同，不同之处在于，宿主菌是大肠杆菌JM109(DE3)。
实施例7与实施例1基本相同，不同之处在于，宿主菌是大肠杆菌DH5α。
实施例8与实施例1基本相同，不同之处在于，采用试管进行培养和诱导在直径为18毫米的试管中装液2.5毫升，并置于30℃摇床振荡培养，细胞密度(OD600)达到0.8左右时将试管从30℃摇床移入42℃水浴摇床振荡培养8小时。
实施例9与实施例1基本相同，不同之处在于，采用换液法进行热激诱导将重组菌pHsh-xar置于30℃摇床振荡培养，细胞密度(OD600)达到0.8左右时，离心弃去上清液，收集细胞，再加入预热至40℃的培养基培养8小时。
权利要求
1.一种质粒载体，其特征在于具有由大肠杆菌σ因子σ32识别和调控的启动子。
2.根据权利要求1所述的质粒载体，其特征在于所述的由大肠杆菌σ因子σ32识别和调控的启动子，其序列为5’-CCCCCTTGAA TGTGGGGGAA ACATCCCCAT GATCCAAGGA G-3’。
3.根据权利要求1所述的质粒载体，其特征在于所述的由大肠杆菌σ因子σ32识别和调控的启动子，其序列为5’-CGGCGTTGAA TGTGGGGGAA ACATCCCCAT ATACTGACGT A-3’或5’-CCCCCTTGAT GACGTGGTTT ACGACCCCAT TTAGTAGTCA-3’。
4.一种质粒载体，其中待表达的目的基因被整合进权利要求1的质粒载体中。
5.一种应用权利要求1所述质粒载体表达目的基因的方法，其特征在于在大肠杆菌宿主细胞中导入一种质粒载体，在所述质粒载体中待表达的目的基因被整合进权利要求1的质粒载体中；并用热激诱导方法诱导目的基因的表达。
全文摘要
一种大肠杆菌质粒载体及其应用方法，涉及可在基因重组技术中使用的质粒载体，以及用该质粒载体表达目的基因的方法。本发明的质粒载体，其特征在于，具有由大肠杆菌σ因子σ
文档编号C12N15/11GK1609223SQ20041004163
公开日2005年4月27日 申请日期2004年8月9日 优先权日2004年8月9日
发明者邵蔚蓝, 吴华伟 申请人:南京师范大学