专利名称：一种灌注式生物反应器的制作方法
技术领域：
本发明属于组织工程领域，具体涉及一种灌注式生物反应器，该生物反应器是一种可对细胞/支架复合物进行灌注式培养的工程化组织培养装置。
背景知识组织工程涉及种子细胞、支架材料和培养环境。工程化组织的构建是从种子细胞和支架复合开始的，培养环境对工程化组织的形成具有重要影响。生物反应器的目的就是帮助在体外培养新的组织和提供培养的细胞一定的刺激。为进行不同目的的培养，人们设计出不同生物反应器，在这些生物反应器中有代表性的为旋转瓶式和旋转壁式生物反应器。旋转瓶式生物反应器通过电磁棒的搅拌来维持培养液混合均匀，电磁棒产生的对流力有助于减小支架材料表面培养液浓度梯度。旋转壁式生物反应器具有模拟微重力、低剪切力优点，可进行高密度和三维培养。尽管这些生物反应器具有自身的优点，并且缓和了支架材料外部和内部的氧气、养料和代谢废物的扩散限制，但它们不能使培养液和其它的营养物渗透到支架材料的多孔网络中去，这样内部的细胞因为氧气、养料供应受限及代谢废物的聚集导致生长和发育受限，甚至死亡。
发明内容
本发明涉及一种组织工程化培养装置，该装置根据工程化组织培养对传质的要求而设计的。旋转瓶和旋转壁式生物反应器缓和了内部和外部的扩散限制，但不能使培养液和其他营养物渗透到支架材料的多孔网络中去。本实验设计的灌注式生物反应器通过削弱内部和外部的扩散限制，培养液不仅扩散到每一个支架材料上，而且通过了它的每一个内部结构，增加了培养液完全通过支架时的扩散能力。该装置由三个部分组成培养室装置、蠕动泵和储液容器，三部分间通过硅胶管相连，培养液通过蠕动泵在整个装置中进行流动。培养室装置设置四个培养小室，种子细胞/支架复合体放置在培养小室中，通过蠕动泵的作用使培养液扩散通过培养的细胞/支架复合体，将氧气和养料带入支架，同时将其中细胞代谢产生的废物带出，改善传质效果，同时还可对支架中的细胞施加剪切力的作用，从而提高细胞的成活和工程化组织的发育水平，提高构建复合物的厚度。不同大小的种子细胞/支架复合体均可在生物反应器中进行培养。本发明装置除可对预先成型的多孔支架进行培养外，还可对液态材料为支架，如液态胶原等构建复合体进行灌注式培养。
具体实施例方式
实施例一 软骨细胞调成5×107/ml细胞悬液，接种在用培养液预湿的PLGA上。12小时后将软骨细胞/支架复合体置于灌注式生物反应器卡式盒中(图4)，加注培养液，旋紧压紧螺栓(图5)，盖上顶盖(图3)，从顶盖排气口排掉装置中残留的气体。整个装置置于37℃、5％CO2孵箱中。调节流速，打开蠕动泵开关进行流体灌注。开始时以较小的流速进行液体灌注，随着培养时间的延长流体灌注速度逐渐加大，以提高传质能力和对细胞给以流体剪切力刺激。经过培养后，形成的组织厚度较常规培养增厚，细胞外基质分泌增多(图6)。
实施例二新分离的新生大鼠心室肌心肌细胞调成5×107/ml细胞悬液，接种在用培养液预湿的聚羟基丁酸酯支架上。12小时后将心肌细胞/支架复合体置于灌注式生物反应器卡式盒中(图4)，加注培养液，旋紧压紧螺栓(图5)，盖上顶盖(图3)，从顶盖排气口排掉装置中残留的气体。整个装置置于37℃、5％CO2孵箱中。调节流速，打开蠕动泵开关进行流体灌注。开始时以较小的流速进行液体灌注，随着培养时间的延长流体灌注速度逐渐加大，以提高传质能力和对细胞给以流体剪切力刺激。经过灌注式培养，组织学检测显示细胞层数明显增厚，透射电镜观察显示心肌细胞的发育水平要比新生大鼠心肌的发育水平有所提高(图7)。
实施例三液态I型胶原与2×DMEM(添加有20％胎牛血清)混合，形成的混合液与新分离的新生大鼠心室肌心肌细胞复合，加入特制的卡式盒中铸膜成片状复合物(图4)，1小时后加注培养液，旋紧压紧螺栓(图5)，盖上顶盖(图3)，从顶盖排气口排掉装置中残留的气体。整个装置置于37℃、5％CO2孵箱中。调节流速，打开蠕动泵开关进行流体灌注。灌注式培养14天，构建的复合体形成一致跳动，组织学检测显示细胞层数明显增厚，透射电镜观察显示心肌细胞的发育水平要比新生大鼠心肌细胞发育水平有所提高(图8)。
图1培养装置底座图2培养装置密封圈图3培养装置顶盖图4培养装置培养小室图5培养装置压紧螺栓图6软骨细胞/PLGA复合物培养四周甲苯氨兰染色。
图A经常规培养，形成比较少的软骨团块；图B经灌注式培养，形成较多的软骨团块。图7心肌细胞/胶原纤维膜复合物培养两周H.E.染色。
图A经常规培养，形成的心肌聚集体的细胞层数较薄；图B经灌注式培养，形成的心肌细胞聚集体的细胞层数较厚。
图8心肌细胞/胶原复合物培养两周H.E.染色。
图A经常规培养，心肌细胞束主要分布在材料的边缘，且层数较薄；图B经灌注式培养，心机细胞比较均匀的分布在整个材料中，形成比较厚的组织样结构。
权利要求
1.一种组织工程构建物体外培养装置，可对构建的种子细胞/支架材料复合物进行灌注式培养，提高培养液通过支架材料时的扩散能力。
2.权利要求1中所述的体外培养装置由三个部分组成培养室装置、储液容器和蠕动泵。三部分间通过硅胶管连接起来，蠕动泵驱动培养液在整个系统中循环流动。
3.权利要求2中所述的培养室装置使用的材料为有机玻璃、硅橡胶、聚苯乙烯和不锈钢。整个装置可进行高压消毒。
4.权利要求2中所述的培养室装置的主要部件为培养小室，整个培养室装置中共设置四个培养小室，可同时对四个复合体进行同等条件的培养。
5.权利要求4中所述的培养小室由流动腔、O-型密封圈、卡式盒和压缩螺栓组成，培养小室的结构保证培养液穿过复合体流动。
6.权利要求1中所述的种子细胞/支架复合体可以被放置在权利要求5所述的卡式盒中， 根据复合体的不同大小可以选择不同大小卡式盒。
7.选择权利要求5中所述的卡式盒可以对用液态的支架材料构建的复合体进行灌注培养。将种子细胞/液态支架复合体浇铸在卡式盒中铸模成型再行培养。
8.权利2所述的蠕动泵为单通道、可调速式，单口接入培养室装置，对四个培养小室进行同等的、可调速的灌注式培养。培养初期采用较低流速的培养，以后根据培养要求可采用较高流速的培养。
9.权利要求2中所述的储液容器有三个接口，其中两个接口分别接入进液口、出液口，第三个接口作为与外界进行气体交换的进出口。
10.权利要求9中所述的气体进出口与外界气体可以通过一层过滤除菌膜进行气体交换。
全文摘要
本发明属于组织工程领域，具体涉及一种灌注式生物反应器。该装置由蠕动泵、流动小室和储液容器三部分组成，可对预先成型的和液态的生物材料为支架构建的种子细胞/支架材料复合物进行灌注式培养，提高培养液完全通过材料的扩散能力，同时利用流体产生的剪切力对细胞进行力学刺激。通过灌注式培养可提高构建物组织形成的厚度和发育程度。
文档编号C12N5/00GK1706936SQ20041004638
公开日2005年12月14日 申请日期2004年6月8日 优先权日2004年6月8日
发明者王常勇, 郭希民, 赵云山, 段翠密, 董灵芝 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所