专利名称：一种从蛇毒中分离l－氨基酸氧化酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种L-氨基酸氧化酶，具体地说涉及一种L-氨基酸氧化酶的分离方法。
背景技术：
L-氨基酸氧化酶能催化L-氨基酸的脱氨基作用，生成相应的α-酮酸，氨和过氧化氢。在工业生产上，L-氨基酸氧化酶被用来生产α-酮酸；在L-氨基酸和D-氨基酸混和物中能降解L-氨基酸，从而分离出D-氨基酸。L-氨基酸氧化酶还可用来制备测定L-氨基酸的酶电极。蛇毒是L-氨基酸氧化酶的主要来源之一。蛇毒的黄色就是L-氨基酸氧化酶产生的。目前已经从蛇毒中分离到多个L-氨基酸氧化酶，并对它们的理化性质以及生理活性进行了大量的研究，发现L-氨基酸氧化酶有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抑制或者诱导血小板聚集等活性，这些活性直接或者间接与其酶反应产生的过氧化氢有关。
蛇毒L-氨基酸氧化酶具有许多共同特征它们都是由两个相同亚基构成，表观分子量在120kD左右；每个亚基在60kD左右；都含有两个非共价结合的辅基FAD或者FMN。研究表明冷冻和pH变化使辅基脱离而导致酶活性的降低甚至丧失。目前报道的L-氨基酸氧化酶分离工艺中，大多数都包括浓缩和透析换缓冲体系的步骤，这必然造成对该酶活性的影响，从而影响对该酶酶学性质和生理活性的研究以及在工业上的应用。因此，寻找一种能够在较短时间内，没有浓缩和缓冲体系变化的L-氨基酸氧化酶分离方法对于该酶的深入研究和开发利用有着极为重要的作用。
发明内容
本发明的目的在于针对现有L-氨基酸氧化酶分离技术中包括浓缩和透析换缓冲体系，从而对L-氨基酸氧化酶酶活性造成影响的问题，提供一种没有浓缩和透析换缓冲体系的L-氨基酸氧化酶分离方法。
本发明的技术方案是这样实现的一种从白眉蝮蛇蛇毒中分离L-氨基酸氧化酶的方法，其特点在于通过亲和层析和离子交换层析两步层析法实现。
其中，上述的亲和层析为肝素亲和层析；上述的离子交换层析为阴离子交换层析。
上述的肝素亲和层析包括如下步骤(1)样品处理将蛇毒溶解于Tris-HCl缓冲液中，离心，取上清液；(2)装柱流动相A液为Tris-HCl缓冲液，B液为含有NaCl的A液；填料为Heparin-Sepharose Fast Flow；先用A液充分平衡层析柱到电导值不变化时，再上经过上述样品处理的蛇毒样品上清液；(3)洗脱先用A液洗脱，再用0％B-100％B线形梯度洗脱，然后用100％B洗层析柱；流速为0.5～3mL/min；
(4)收集检测收集洗脱液，在280nm的光吸收下检测洗脱液。上述的肝素亲和层析具体包括如下步骤(1)样品处理将蛇毒溶解于25mmol/L Tris-HCl缓冲液中，pH＝8.5，在4℃条件下，10000r/min离心10min，取上清液；(2)装柱色谱柱体积25ml，填料为Heparin-Sepharose FastFlow，流动相A液为25mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH＝8.5，B液为含有1mol/L的NaCl的A液，先用A液充分平衡到电导值不变化时，再上经样品处理的蛇毒样品；(3)洗脱先用50mL A液洗脱后，再以0％B-100％B线形梯度洗脱250mL，然后用100％B洗柱50mL，流速为2mL/min；(4)收集检测用分步收集器收集洗脱液，在280nm的光吸收下检测蛋白质含量。
上述的阴离子交换层析包括如下步骤(1)装柱流动相A液为Tris-HCl缓冲液，B液为含有NaCl的A液；填料为Heparin-Sepharose Fast Flow；先用A液充分平衡层析柱到电导值不变化时，再上经过权利要求(4)所述亲和层析的蛇毒样品；(2)洗脱先用A液洗脱，再用0％B-100％B线形梯度洗脱，然后用100％B洗层析柱；流速为0.5～3mL/min；(3)检测收集收集洗脱液，在280nm的光吸收下检测洗脱液，收集含L-氨基酸氧化酶的洗脱液上述的阴离子交换层析具体包括如下步骤(1)装柱流动相A液为25mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH＝8.5，B液为含有1mol/L NaCl的A液，填料为Heparin-SepharoseFast Flow；先用A液充分平衡层析柱到电导值不变化时，再上经过亲和层析的蛇毒样品；(2)洗脱先用100mL A液洗脱后，再以0％B-100％B线形梯度洗脱500mL，然后用100％B洗柱100mL，流速为2mL/min；(3)检测收集用部分收集器收集洗脱液，在波长为280nm下检测洗脱液，收集含L-氨基酸氧化酶的洗脱液。
上述的肝素亲和层析和阴离子交换层析都是在AKTA Prime设备上进行。
本发明的有益效果本发明通过肝素亲和层析和阴离子交换层析两步柱层析法从蛇毒中分离出L-氨基酸氧化酶。所分离的L-氨基酸氧化酶在SDS-PAGE电泳图中呈现一条带，分子量约为58000。本发明方法简单、耗时短、回收率高，并且无浓缩和缓冲体系变换的步骤，有效避免了冰冻和pH变化对酶活性的影响，便于推广，可线形放大到生产工艺中。
图1为蛇毒样品在Heparin-Sepharose Fast Flow上的分离图；图2为LAO活性峰在Q-Sepharose High Performace上的分离图谱；图3为LAO在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳图谱。
其中，图1中，L-氨基酸氧化酶活性在穿透峰中；图3中，1为标准蛋白，2为白眉蝮蛇粗毒，3为Heparin-Sepharose Fast Flow下穿透峰，4为Q-Sepharose High Performace分离后的活性峰，SDS-PAGE凝胶浓度为12.5％。
具体实施例方式
实施例1、肝素亲和层析(1)样品处理称取白眉蝮蛇蛇毒200mg，溶解于5mL 25mmol/LTris-HCl缓冲液中(pH8.5)中，在4℃条件下，10000r/min离心10min。取上清液。
(2)装柱色谱柱体积25ml，填料为Heparin-Sepharose Fast Flow。流动相A液为25mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.5)，B液为含有1mol/L的NaCl的A液。用A液充分平衡到电导值不变化时，上蛇毒样品。
(3)洗脱A液50mL后，以0％B-100％B线形梯度洗脱250mL，再用100％B洗柱50mL；流速为2mL/min。
(4)收集检测用分步收集器收集洗脱液，每管收集3mL，在280nm的光吸收下检测蛋白质含量。整个层析过程在AKTA Prime设备上进行。
2、阴离子交换层析，(1)装柱色谱柱体积为75ml，流动相A液为25mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH＝8.5，B液为含有1mol/L NaCl的A液，填料为Heparin-Sepharose Fast Flow；先用A液充分平衡层析柱到电导值不变化时，再上经过亲和层析的蛇毒样品；
(2)洗脱先用100mL A液洗脱后，再以0％B-100％B线形梯度洗脱500mL，然后用100％B洗柱100mL，流速为2mL/min；(3)检测收集用部分收集器收集洗脱液，每管收集4ml，在波长为280nm下检测洗脱液，收集含L-氨基酸氧化酶的洗脱液。整个层析过程在AKTA Prime设备上进行。
权利要求
1.一种从蛇毒中分离L-氨基酸氧化酶的方法，其特征在于包括如下步骤(1)亲和层析；(2)离子交换层析。
2.根据权利要求1所述的从蛇毒中分离L-氨基酸氧化酶的方法，其特征在于步骤(1)所述的亲和层析为肝素亲和层析。
3.根据权利要求1所述的从蛇毒中分离L-氨基酸氧化酶的方法，其特征在于步骤(2)所述的离子交换层析为阴离子交换层析。
4.根据权利要求2所述的从蛇毒中分离L-氨基酸氧化酶的方法，其特征在于所述的肝素亲和层析具体包括如下步骤(1)样品处理将蛇毒溶解于Tris-HCl缓冲液中，离心，取上清液；(2)装柱流动相A液为Tris-HCl缓冲液，B液为含有NaCl的A液；填料为Heparin-Sepharose Fast Flow；先用A液充分平衡层析柱到电导值不变化时，再上经过上述样品处理的蛇毒样品上清液；(3)洗脱先用A液洗脱，再用0％B-100％B线形梯度洗脱，然后用100％B洗层析柱；流速为0.5～3mL/min；(4)收集检测收集洗脱液，在280nm的光吸收下检测洗脱液。
5.根据权利要求3所述的从蛇毒中分离L-氨基酸氧化酶的方法，其特征在于所述的阴离子交换层析具体包括如下步骤(1)装柱流动相A液为Tris-HCl缓冲液，B液为含有NaCl的A液；填料为Heparin-Sepharose Fast Flow；先用A液充分平衡层析柱到电导值不变化时，再上经过亲和层析的蛇毒样品；(2)洗脱先用A液洗脱，再用0％B-100％B线形梯度洗脱，然后用100％B洗层析柱；流速为0.5～3mL/min；(3)检测收集收集洗脱液，在280nm的光吸收下检测洗脱液，收集含L-氨基酸氧化酶的洗脱液。
6.根据权利要求4所述的从蛇毒中分离L-氨基酸氧化酶的方法，其特征在于所述的肝素亲和层析具体包括如下步骤(1)样品处理将蛇毒溶解于25mmol/L Tris-HCl缓冲液中，pH＝8.5，在4℃条件下，10000r/min离心10min，取上清液；(2)装柱色谱柱体积25ml，填料为Heparin-Sepharose FastFlow，流动相A液为25mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH＝8.5，B液为含有1mol/L的NaCl的A液，先用A液充分平衡到电导值不变化时，再上经样品处理的蛇毒样品；(3)洗脱先用50mL A液洗脱后，再以0％B-100％B线形梯度洗脱250mL，然后用100％B洗柱50mL，流速为2mL/min；(4)收集检测用分步收集器收集洗脱液，在280nm的光吸收下检测蛋白质含量。
7.根据权利要求5所述的从蛇毒中分离L-氨基酸氧化酶的方法，其特征在于所述的阴离子交换层析具体包括如下步骤(1)装柱流动相A液为25mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH＝8.5，B液为含有1mol/L NaCl的A液，填料为Heparin-SepharoseFast Flow；先用A液充分平衡层析柱到电导值不变化时，再上经过亲和层析的蛇毒样品；(2)洗脱先用100mL A液洗脱后，再以0％B-100％B线形梯度洗脱500mL，然后用100％B洗柱100mL，流速为2mL/min；(3)检测收集用部分收集器收集洗脱液，在波长为280nm下检测洗脱液，收集含L-氨基酸氧化酶活性的洗脱液。
全文摘要
本发明公开了一种从白眉蝮蛇蛇毒中分离L－氨基酸氧化酶的方法。本发明的特点是通过Heparin－Sepherose Fast Flow和QSepherose Fast Flow两步柱层析法从长白山白眉蝮蛇蛇毒中分离纯化出L－氨基酸氧化酶。该方法中不含有浓缩和缓冲体系变换的步骤，有效避免了冰冻和pH变化对酶活性的影响。本发明的方法简单、耗时短、回收率高，便于推广。
文档编号C12N9/02GK1614012SQ200410052289
公开日2005年5月11日 申请日期2004年11月19日 优先权日2004年11月19日
发明者何韶衡, 魏继福 申请人:汕头大学医学院