专利名称：蚓激酶粗品中去除杂蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及一种分离方法，尤其是涉及一种采用加压CO2作为挥发性酸，乙醇作为助沉淀剂的等电沉淀杂蛋白分离提纯蚓激酶的方法。
背景技术：
蚓激酶(lumbrokinase)是自蚯蚓中提取出来的具有纤溶酶活性的多组分蛋白质的总称，是目前较有开发前景的纤溶药物之一。现有文献表明，蚓激酶是一组分子量为20～40kD、具有激酶和纤溶酶活性的丝氨酸蛋白酶，其中较多活性组分等电点集中在4.0以下。此外，蚯蚓中还含有其他一些生物活性成分，因而采用温和、环保的办法分离提纯蚓激酶对于其中多种营养和药物有效成分的分离具有较重要的意义。目前蚓激酶是将新鲜的赤子爱胜蚓捣碎，离心收集上清夜，然后从上清液中盐析得到沉淀，继而脱盐冻干后的粗加工制品[1]。专利00132716.X公开了一种蚓激酶的分离工艺，包括食盐处理、洗净、加缓冲液、制浆、离心、亲和层析，离子交换层析等步骤，该过程操作复杂，酶损失量较大。且该分离工艺没有考虑到蚯蚓中其他活性组分的提取和分离问题。
参考文献[1]王东鹏，孙贵宝，高活性蚓激酶提取工艺研究，宁夏科技，2001，(6)，44-45发明内容本发明的目的是提供一种蚓激酶粗品中去除杂蛋白的方法。
方法的步骤如下1)首先，将蚓激酶粗品溶于乙醇-水溶液中，配制粗酶浓度为2～7％(质量百分比)，乙醇浓度为0～40％(体积百分比)的溶液，反复搅拌溶解后滤去不溶物；2)然后，取20mL上述混合溶液加入到预热温度为20～40℃高压釜中，继而通入预热温度为20～40℃，压力为3.5～8.5MPa的加压CO2同时搅拌，调节溶液的pH为4.4，在高压下保持20～60分钟，蚓激酶粗品中的杂蛋白在该条件下完全沉淀出来，而活性成分仍存留在溶液中，再将沉淀分离出去即可。
本发明与传统等电沉淀方法相比，酶活损失少，同时又比传统的等电沉淀体系具有较多的优势，如操作条件比较温和，且可同时得到蚓激酶粗品中的多种活性成分。另外乙醇的加入可使水溶性较强的蛋白质易于沉淀出来，所加助剂乙醇量较有机溶剂沉淀法要少很多，因而酶活损失很少。采用加压CO2进行pH的调节可以避免用无机酸等调节溶液pH时酸过量或局部pH过低的情况，减少因此带来的蛋白质变性。由于CO2在溶液中大多以分子形式存在，这使得溶液离子强度不会因此过多升高，因而比无机酸更适于等电沉淀中的pH调节。本发明解决了现有技术所存在的操作条件苛刻，无法同时得到蚯蚓酶中其它活性成分，酶损失量较大等技术问题，提供了一种操作条件相对温和，可以同时得到其它活性组分，酶活基本无损失的蚓激酶的分离提纯方法。本发明还解决了现有技术所存在的操作条件难以精确控制，操作过程波动较大等技术问题，提供了一种操作参数可精确控制，操作过程无波动的一种蚓激酶的分离提纯方法。
具体实施例方式
本发明采用加压CO2作为挥发性酸，乙醇作为助沉淀剂，形成加压CO2-乙醇-水体系蛋白质等电沉淀技术；分离提纯步骤包括蚓激酶乙醇-水溶液的配制，用加压CO2将溶液pH调至所需范围，过滤沉淀出来的杂蛋白，而蚓激酶仍然存留在滤液中。为实现该过程，首先配制合适浓度的蚓激酶的乙醇-水溶液，然后取适量的溶液加入到高压釜中，继而通入加压CO2，用来调节溶液的pH至所需范围，由于蚓激酶粗品中的一些无激酶活性蛋白质的沉淀pH在3.0～5.0之间，而在此范围内蚓激酶类并不沉淀，因而用CO2将溶液pH调至此范围时，蚓激酶中的无激酶活性蛋白质就会沉淀出来，从而达到分离提纯的效果。本发明所采用的加压CO2-乙醇-水体系用于等电沉淀蛋白质，蚓激酶的分离提纯方法的高压釜预热温度和CO2预热温度为20～40℃，CO2压力为3.5～8.5MPa，纤维素酶质量百分比浓度为2～7％，乙醇溶液体积百分比浓度为0～40％，CO2压力维持时间为20～60分钟。
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。实施例1称取适量的蚓激酶粗品配制成乙醇浓度为30％(体积百分比)，粗酶浓度为4％(质量百分比)的溶液，反复搅拌溶解后滤去不溶物。然后取20mL的溶液加入到预热至25℃的高压釜中。继而通入预热温度25℃的加压CO2同时搅拌，使压力增至7.0MPa，并调节操作温度至25℃，此时溶液的pH为4.4，釜内沉淀现象明显，在高压下保持40分钟，蚓激酶粗品中的杂蛋白在该条件下完全沉淀出来，而活性成分仍存留在溶液中。然后将沉淀分离出来，酶活得率为98.6％，该过程的纯化倍数2.53。本方法采用加压CO2作为挥发性酸，乙醇作为助沉淀剂，形成加压CO2-乙醇-水体系蛋白质等电沉淀技术，把蚓激酶粗品中的杂蛋白沉淀出来。该方法具有操作条件相对温和，可以同时得到其它活性组分，酶基本无损失等的特点。
实施例2称取适量的蚓激酶粗品配制成乙醇浓度为40％(体积百分比)，粗酶浓度为6％(质量百分比)的溶液，反复搅拌溶解后滤去不溶物。然后取20mL的溶液加入到预热至25℃的高压釜中。继而通入预热温度25℃的加压CO2同时搅拌，使压力增至4.5MPa，并调节操作温度至25℃，釜内沉淀现象明显，在高压下保持55分钟，蚓激酶粗品中的杂蛋白在该条件下完全沉淀出来，而活性成分仍存留在溶液中。然后将沉淀分离出来，酶活得率为94.1％，该过程的纯化倍数2.41。本方法采用加压CO2作为挥发性酸，乙醇作为助沉淀剂，形成加压CO2-乙醇-水体系蛋白质等电沉淀技术，把蚓激酶粗品中的杂蛋白沉淀出来。该方法具有操作条件相对温和，可以同时得到其它活性组分，酶基本无损失等的特点。
实施例3称取适量的蚓激酶粗品配制成乙醇浓度为35％(体积百分比)，粗酶浓度为2％(质量百分比)的溶液，反复搅拌溶解后滤去不溶物。然后取20mL的溶液加入到预热至20℃的高压釜中。继而通入预热温度20℃的加压CO2同时搅拌，使压力增至3.5MPa，并调节操作温度至20℃，釜内沉淀现象明显，在高压下保持30分钟，蚓激酶粗品中的杂蛋白在该条件下完全沉淀出来，而活性成分仍存留在溶液中。然后将沉淀分离出来，酶活得率为97.9％，该过程的纯化倍数1.11。本方法采用加压CO2作为挥发性酸，乙醇作为助沉淀剂，形成加压CO2-乙醇-水体系蛋白质等电沉淀技术，把蚓激酶粗品中的杂蛋白沉淀出来。该方法具有操作条件相对温和，可以同时得到其它活性组分，酶基本无损失等的特点。
实施例4称取适量的蚓激酶粗品配制成乙醇浓度为0％(体积百分比)，粗酶浓度为5％(质量百分比)的溶液，反复搅拌溶解后滤去不溶物。然后取20mL的溶液加入到预热至40℃的高压釜中。继而通入预热温度40℃的加压CO2同时搅拌，使压力增至8.5MPa，并调节操作温度至40℃，釜内沉淀现象明显，在高压下保持20分钟，蚓激酶粗品中的杂蛋白在该条件下完全沉淀出来，而活性成分仍存留在溶液中。然后将沉淀分离出来，酶活得率为98.1％，该过程的纯化倍数1.29。本方法采用加压CO2作为挥发性酸，乙醇作为助沉淀剂，形成加压CO2-乙醇-水体系蛋白质等电沉淀技术，把蚓激酶粗品中的杂蛋白沉淀出来。该方法具有操作条件相对温和，可以同时得到其它活性组分，酶基本无损失等的特点。
实施例5称取适量的蚓激酶粗品配制成乙醇浓度为30％(体积百分比)，粗酶浓度为3％(质量百分比)的溶液，反复搅拌溶解后滤去不溶物。然后取20mL的溶液加入到预热至35℃的高压釜中。继而通入预热温度35℃的加压CO2同时搅拌，使压力增至6.0MPa，并调节操作温度至35℃，釜内沉淀现象明显，在高压下保持60分钟，蚓激酶粗品中的杂蛋白在该条件下完全沉淀出来，而活性成分仍存留在溶液中。然后将沉淀分离出来，酶活得率为97.6％，该过程的纯化倍数1.63。本方法采用加压CO2作为挥发性酸，乙醇作为助沉淀剂，形成加压CO2-乙醇-水体系蛋白质等电沉淀技术，把蚓激酶粗品中的杂蛋白沉淀出来。该方法具有操作条件相对温和，可以同时得到其它活性组分，酶基本无损失等的特点。
实施例6称取适量的蚓激酶粗品配制成乙醇浓度为15％，粗酶浓度为7％的溶液，反复搅拌溶解后滤去不溶物。然后取20mL的溶液加入到预热至30℃的高压釜中。继而通入预热温度30℃的加压CO2同时搅拌，使压力增至5.5MPa，并调节操作温度至30℃，釜内沉淀现象明显，在高压下保持50分钟，蚓激酶粗品中的杂蛋白在该条件下完全沉淀出来，而活性成分仍存留在溶液中。然后将沉淀分离出来，酶活得率为97.3％，该过程的纯化倍数2.99。本方法采用加压CO2作为挥发性酸，乙醇作为助沉淀剂，形成加压CO2-乙醇-水体系蛋白质等电沉淀技术，把蚓激酶粗品中的杂蛋白沉淀出来。该方法具有操作条件相对温和，可以同时得到其它活性组分，酶基本无损失等的特点。
实施例7称取适量的蚓激酶粗品配制成乙醇浓度为25％(体积百分比)，粗酶浓度为4％(质量百分比)的溶液，反复搅拌溶解后滤去不溶物。然后取20mL的溶液加入到预热至30℃的高压釜中。继而通入预热温度30℃的加压CO2同时搅拌，使压力增至8.0MPa，并调节操作温度至30℃，釜内沉淀现象明显，在高压下保持35分钟，蚓激酶粗品中的杂蛋白在该条件下完全沉淀出来，而活性成分仍存留在溶液中。然后将沉淀分离出来，酶活得率为98.9％，该过程的纯化倍数2.61。本方法采用加压CO2作为挥发性酸，乙醇作为助沉淀剂，形成加压CO2-乙醇-水体系蛋白质等电沉淀技术，把蚓激酶粗品中的杂蛋白沉淀出来。该方法具有操作条件相对温和，可以同时得到其它活性组分，酶基本无损失等的特点。
权利要求
1.一种蚓激酶粗品中去除杂蛋白的方法，其特征在于方法的步骤如下1)首先，将蚓激酶粗品溶于乙醇-水溶液中，配制粗酶质量百分比浓度为2～7％，乙醇体积百分比浓度为0～40％的溶液，反复搅拌溶解后滤去不溶物；2)然后，取20mL上述混合溶液加入到预热温度为20～40℃高压釜中，继而通入预热温度为20～40℃，压力为3.5～8.5MPa的加压CO2同时搅拌，调节溶液的pH为4.4，在高压下保持20～60分钟，蚓激酶粗品中的杂蛋白在该条件下完全沉淀出来，而活性成分仍存留在溶液中，再将沉淀分离出去即可。
2.根据权利要求1所述的一种蚓激酶粗品中去除杂蛋白的方法，其特征在于所说的高压釜预热温度和CO2预热温度为25～35℃。
3.根据权利要求1所述的一种蚓激酶粗品中去除杂蛋白的方法，其特征在于所说的CO2压力为6.0～8.0MPa。
4.根据权利要求1所述的一种蚓激酶粗品中去除杂蛋白的方法，其特征在于所说的酶质量百分比浓度为3～6％。
5.根据权利要求1所述的一种蚓激酶粗品中去除杂蛋白的方法，其特征在于所说的乙醇溶液体积百分比浓度为15～35％。
6.根据权利要求1所述的一种蚓激酶粗品中去除杂蛋白的方法，其特征在于所说的CO2压力维持时间为30～50分钟。
全文摘要
本发明公开了一种蚓激酶粗品中去除杂蛋白的方法。方法的步骤如下1)首先，将蚓激酶粗品溶于乙醇－水溶液中，配制粗酶质量百分比浓度为2～7％，乙醇体积百分比浓度为0～40％的溶液，反复搅拌溶解后滤去不溶物；2)然后，取20mL上述混合溶液加入到预热温度为20℃～40℃高压釜中，继而通入预热温度为20℃～40℃，压力为3.5～8.5MPa的加压CO
文档编号C12N9/64GK1587398SQ20041005404
公开日2005年3月2日 申请日期2004年8月24日 优先权日2004年8月24日
发明者姚善泾, 关怡新, 齐祥明 申请人:浙江大学