专利名称：戊糖发酵性发酵细菌属性状转化微生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有编码选自木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛酶和转酮酶中至少一种酶的外源基因的重组DNA，以及含有该重组DNA片段的性状转化微生物，该性状转化微生物能够用于由含有木糖的原料高效地生产乙醇。
背景技术：
以纤维素类生物质为原料生产乙醇的场合，首先，要用由生物质分解至单糖的糖化液作为发酵原料。纤维素类生物质的分解、糖化中，采用使用纤维素酶的酶法或使用硫酸等的酸糖化法等，但由于生物质中还有纤维素以外的半纤维素含量高的物质，所以该糖化液中除葡萄糖外，还会含有来源于半纤维素的木糖。乙醇生产中所用的主要微生物有酵母属的酵母和发酵单胞菌属或发酵细菌属的细菌。通常，这些微生物由葡萄糖等糖高效地生产乙醇，但不能由木糖生产乙醇。因此，为了提高以生物质为原料的乙醇的生产收率，有必要将与木糖代谢有关的酶导入乙醇生产所用的微生物中，构建能够以木糖为底物生产乙醇的性状转化微生物。
已知发酵单胞菌属和发酵细菌属的细菌其发酵速度比酵母属的酵母快，例如，美国专利N0.5,712,133号的说明书中，公开了通过将戊糖发酵性性状转化至发酵单胞菌属的细菌，构建了能够由木糖高效地生产乙醇的性状转化微生物。但是，发酵单胞菌属的细菌与发酵细菌属的细菌相比，能够发酵的糖种类少，为了对含有麦芽糖和半乳糖或甘露糖等的原料高效地进行发酵，必须用更多的基因进行性状转化。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种性状转化微生物，其针对不能利用戊糖的发酵细菌属的微生物，用重组DNA的方法，导入戊糖代谢系酶，从而具有由戊糖生产乙醇的能力。
本发明者着眼于具有木糖分解能力的微生物，进行各种筛选，能得到与木糖的代谢有关的木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛酶和转酮酶的基因。但由于发酵细菌属细菌的宿主-载体系统尚未建立，所以对载体的构建、性状转化方法、编码木糖代谢关联酶的基因的克隆等进行了反复努力的研究，结果，这回发现，采用发酵性糖种类范围广的发酵细菌属细菌作为宿主时，容易适合于含各种糖的发酵原料，从而完成了本发明。
因此，本发明提供一种性状转化微生物，其具有导入编码选自木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛酶和转酮酶中至少一种酶的外源基因的发酵细菌属的戊糖发酵性，也就是说，具有以戊糖、特别是木糖为底物生产乙醇的能力。
本发明还提供将来源于木糖代谢系酶生产性菌株的、含有编码选自木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛酶和转酮酶中至少一种酶的基因的DNA片段与载体结合而构成的重组DNA。
图1是由木糖生物合成乙醇的途径的图。
图2是含有大肠杆菌来源的木糖异构酶基因和木酮糖激酶基因的重组质粒的限制酶酶切位点图。
图3是含有大肠杆菌来源的转醛酶基因和转酮酶基因的重组质粒的限制酶酶切位点图。
图4是含有4种木糖发酵性基因的重组质粒的限制酶酶切位点图。
图5是表示用重组棕榈发酵细菌株由木糖生产乙醇的结果的图。
图6是表示用重组棕榈发酵细菌株由木糖批式发醇生产乙醇的性能的图。
以下，对本发明进一步详细地说明。
本发明中，用具有木糖分解能力的微生物作为DNA供体，然后，分离、纯化编码选自木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛酶和转酮酶中至少一种酶的DNA后，用各种方法切断，制备编码该酶的DNA片段。将此片段与适当的载体DNA片段通过例如DNA连接酶等使其结合，形成含有选自木糖异构酶基因、木酮糖激酶基因、转醛酶基因和转酮酶基因中至少一种基因的重组DNA。
对本发明中使用的含有该基因的DNA供体微生物无特别的限制，只要具有分解木糖的能力都可以使用，特别适用的是属于埃希氏菌属、黄单胞菌属、克雷伯氏菌属、红细菌属、黄杆菌属、醋杆菌属、葡糖杆菌属、根瘤菌属、土壤杆菌属(abrobacterium)、沙门氏菌属和假单胞菌属的微生物。其中优选大肠杆菌。其它的埃希氏菌属微生物或上述以外的微生物中，具有分解木糖能力的微生物，以及因启动子部位或核糖体结合部位的异常而没有分解木糖的能力，但在其DNA上编码木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛酶或转酮酶结构基因的微生物，也可以作为含有该基因的DNA供体使用。进一步通过基因重组等，导入了木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛酶或转酮酶结构基因的性状转化微生物等也可以作为含有该基因的DNA供体微生物使用。也可以将由不同微生物得到的多种含有该基因的DNA片段与1个载体结合。
含有选自木糖异构酶基因、木酮糖激酶基因、转醛酶基因和转酮酶基因中至少一种基因的重组DNA，通过导入作为宿主的属于发酵细菌属的微生物，可以构建成具有生产木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛酶和/或转酮酶能力的性状转化微生物。导入的重组DNA的全部或一部分可以整合到发酵细菌属宿主细胞的基因组中，或者也可以存在于性状转化所用的载体上。
DNA从上述供体微生物的分离、纯化可以用其本身已知的方法进行，例如齐藤·三浦等的方法(Biochem.Biophys.Acta.Vol.72，619-629，1963)及其改进的方法，还可通过使用市售的DNA提取试剂盒等的方法等进行。以下，对按照齐藤·三浦等的方法进行的方法进一步进行具体说明。
首先，将供体微生物接种于含有0.5％甘氨酸的酵母-淀粉培养基(组成酵母提取物0.2％，可溶性淀粉1.0％，pH7.3)等合适的液体培养基中，4-60℃下，优选30℃下，搅拌培养8-48小时，优选搅拌培养过夜。培养结束后，通过固-液分离操作，例如在0-50℃，优选4℃、转速为3000-15000rpm，优选10000rpm的条件下进行离心分离，收集菌体。
然后将收集的微生物悬浮于VS缓冲液(0.15M NaCl，0.1M EDTA，pH8.0)中，加入溶菌酶后，在4-45℃，优选37℃，放置0.5-4小时，优选放置1小时，得到原生质体液。在该液体中加入TSS缓冲液(0.1MTris，0.1M NaCl，1％SDS，pH9.0)和5M NaCl，使原生质体溶解。接着，加入TE溶液(10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)-饱和酚，使其平稳、充分地悬浮。将所得的悬浮液在0-50℃，优选4℃，转速为3000-15000rpm，优选12000rpm下离心分离，得到的上层(水相)悬浮于氯仿中。进一步将其在0-50℃，优选4℃、转速为3000-15000rpm，优选12000rpm下进行离心分离，得到的上层(水相)再次用酚及氯仿进行悬浮处理。
随后加入冷的乙醇，回收生成的白色混浊的粗染色体DNA，将该DNA溶解于SSC缓冲液(0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠)中，对SSC缓冲液透析过夜。将核糖核酸酶按终浓度为1-50μg/ml，优选10μg/ml的量加入该透析内液中，在4-45℃，优选37℃，放置0.5-16小时，优选放置2小时。再加入终浓度为0.1-10μg/ml，优选1μg/ml的蛋白酶，在4-45℃，优选在37℃，放置15分钟-8小时，优选放置30分钟。然后与上述同样，将其用酚及氯仿处理、对SSC缓冲液透析，得到纯化的供体微生物的染色体DNA溶液。
用限制酶等分解上述所得的供体微生物的DNA，用蔗糖密度梯度法除去1kbp以下的DNA片段，可以将得到的物质用作供体DNA片段。此时所用的限制酶无特别的限定，可以使用切断DNA的AccII(别名FnuDII)等各种酶类。此外，除了上述的酶法以外，也可以用超声波处理或物理剪断力等将DNA切断。在这种情况下，如果用Klenow(クレノ一)片段、DNA聚合酶、绿豆(マングビ一ン)核酸酶等酶处理供体DNA片段的末端，则后面与载体DNA的结合效率提高，因而优选。还有，对于以供体微生物的DNA或其片段作为模板进行PCR扩增的产物，也可以直接或通过进行上述处理，作为供体DNA片段使用。
另一方面，作为载体DNA片段无特别的限定，但可以优选使用革兰氏阴性细菌间的广泛宿主域性质粒来源的pRK290、pMFY40或pMFY31经限制酶酶切处理后的物质等。也可适当选择使用上述以外的载体，例如，已知的革兰氏阴性细菌的广泛宿主域性质粒。对所用的限制性酶，也不限于生成粘末端的酶，可以使用将DNA切断的各种酶类，还可以用与上述切断供体微生物的DNA同样的方法，将载体DNA切断。
在与上述的供体DNA片段结合反应之前，可以将所得的载体DNA片段用碱性磷酸酶进行处理。由此提高该片段与供体DNA片段的结合效率。而且，通过PCR扩增制备供体DNA片段的场合，使用在扩增片段的两末端预先赋予EcoR I等限制酶位点的引物，使用该限制酶切断的DNA片段和用同样的限制酶切断的载体片段，则可以提高结合效率。对于供体DNA片段与载体DNA片段的结合反应，可以用已知的使用DNA连接酶的方法等常规方法进行，例如，可以将供体DNA片段与载体DNA片段退火后，在生物体外，通过适当的DNA连接酶的作用，制成重组DNA。或者，必要时，也可以在退火后导入宿主微生物中，利用生物体内的DNA修复能力，形成重组DNA。
作为插入含有供体DNA片段和载体DNA片段的重组DNA的宿主微生物，只要具有乙醇发酵能力、而且能使重组DNA稳定地保持，可以是任何一种微生物，本发明中，优选使用属于发酵细菌属的微生物，一般使用棕榈发酵细菌。将重组DNA导入宿主微生物的方法没有特别的限制，用棕榈发酵细菌等的场合，适合用电穿孔等利用电刺激的方法导入重组DNA。此外，对于棕榈发酵细菌以外的其他乙醇生产性微生物，例如运动发酵单胞菌及酵母、其他的宿主，也可以用同样的方法导入重组DNA。
作为这样所得的性状转化微生物的生长培养基，例如，在宿主微生物为发酵细菌的场合，经常用RM培养基等。用发酵细菌以外的枯草杆菌和酵母等作为宿主微生物的场合，可以用与所用的宿主微生物相对应的各种培养基进行培养，培养温度等培养条件也可以根据宿主微生物的性质适当设定。另外，如果所用的载体DNA片段是编码各种抗生素抗性基因的片段时，通过在培养基中添加适量的相应的抗生素，能够使重组DNA更稳定地保持。还有，如果所用的载体DNA编码宿主微生物的营养缺陷性互补基因时，使用不含有该营养素的培养基，同样能够使重组DNA的稳定性提高。
根据本发明，用重组DNA的方法，能够提供可以赋予发酵细菌属微生物木糖发酵性的重组DNA，以及含有该重组DNA片段的性状转化微生物。通过使用该性状转化微生物，可以以含有木糖的糖液为原料，高效地生产乙醇。
以含有木糖的糖液为原料生产乙醇可按下述方法进行用上述的戊糖发酵性性状转化微生物使含木糖的糖化原料发酵，从所得的发酵液回收乙醇。例如，可以使用将上述性状转化微生物固定化的固定化载体，按照其本身已知的乙醇发酵法进行。
上述的性状转化微生物在固定化载体上的固定化可按其本身已知的方法进行，例如包埋法、物理吸附法、共价结合法等。
作为载体，中空状、凹凸状、多孔质状等形状的单位体积的表面积大的物质，或者吸水后膨胀的物质中，持有流动性、具有不容易从反应系统流出的粒径及比重的物质适用；作为载体的形状，例如板状体，纤维状体，圆筒等特殊形状体、海绵状体、粒，块状体、立方状体等任何一种都可以使用，其中优选容易确保流动性和充分的表面积的微小粒状体。作为载体的材料，可以使用以往用作微生物和酶等的载体材料的各种有机、无机材料，例如，粒状活性炭、破碎活性炭、木炭、沸石、云母、砂粒等无机材料；光硬化性树脂、聚氨基甲酸乙酯、聚乙烯醇、聚乙烯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚丙烯、琼脂、海藻酸、角叉聚糖(カラギ ナン)、纤维素、葡聚糖、琼脂糖、离子交换树脂等树脂材料；硅胶等多孔质陶瓷；无烟煤；树脂材料中掺入活性炭等物质等，这些材料可以单独使用或2种以上组合使用。
上述的固定化载体通常是充填在生物反应器内使用。发酵所用的生物反应器因其形式不同，有完全混合槽型、充填层型、膜型、流动层型、横型等反应器。使用这样的生物反应器可以进行连续发酵，不需要进行微生物等的投入、回收的步骤，所以优选。
上述乙醇发酵时，可以将微生物的各种营养源按照需要配合在糖液中，例如，作为氮源，可以使用酵母提取物、玉米浆、胨、肉提取物、鲣鱼提取物等。
以下，通过实施例对本发明进一步进行具体地说明，但本发明不只限于这些实施例。
实施例实施例1含有大肠杆菌来源的木糖异构酶和木酮糖激酶基因的重组质粒DNA的制备棕榈发酵细菌不具有木糖发酵性。其原因是将木糖转换为木酮糖的木糖异构酶、催化木酮糖的磷酸化反应的木酮糖激酶、还有成为经过戊糖磷酸途径将转换的木酮糖磷酸高效地引导至生物合成乙醇用的关键酶，即醛糖还原酶和转酮酶的缺失，或其活性微弱。因而，通过将这些酶的基因导入并使其表达，可以赋予由木糖生产乙醇的能力(图1)。
为此，用PCR由大肠杆菌的基因组DNA克隆这些酶的基因。此外，为了使导入的4种酶的基因在棕榈发酵细菌的细胞内表达，利用已报道在与棕榈发酵细菌近缘的运动发酵单胞菌细胞内大量表达的调控甘油醛-3-磷酸脱氢酶表达的启动子基因(GAP启动子)。
大肠杆菌来源的木糖异构酶基因和木酮糖激酶基因通过PCR进行克隆。也就是说，在运动发酵单胞菌来源的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子基因的下游，串联地连接大肠杆菌来源的木糖异构酶基因和木酮糖激酶基因；同时，为了制备在该DNA片段的两末端赋予用于克隆的EcoRI限制性酶切位点的DNA片段，根据已知的运动发酵单胞菌来源的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因序列(J.Bacterol.Vol.169(12)，5653-5662，1987)和已知的大肠杆菌来源的木糖异构酶基因和木酮糖激酶基因的碱基序列(Appl.Environ.Microbiol.，Vol.47(1)，15-21，1984)，设计了以下4种PCR引物ZGX15′-CGGAATTCGTTCGATCAACAACCCGAATCCTATCG-3′ZGX25′-TACTGGAATAAATGGTCTTCGTTATGCAAGCCTATTTTGACCAGCCTCGAT-3′ZGX35′-ATCGACTGGTCAAAATAGGCTTGCATAACGAAGACCATTTATTCCAGTA-3′EX45′-CGGAATTCATGCATAGTTGCCAAAAGTTGCTGTCA-3′作为一次PCR，由运动发酵单胞菌菌体制备的基因组DNA用作模板，用ZGX1和ZGX3引物，扩增包含启动子和木糖异构酶基因的N末端部位的约300bp的DNA片段。另一方面，以大肠杆菌基因组DNA为模板，用ZGX2和EX4引物，扩增包含启动子基因的一部分和木糖异构酶基因及木酮糖激酶基因的约3.0kbp的DNA片段。
然后，将含启动子基因的DNA片段和含木糖异构酶基因及木酮糖激酶基因的DNA片段混合，94℃下加热20分钟后，在37℃保温15分钟，使其形成异源双链体，然后在TaqDNA聚合酶存在下，72℃下反应3分钟。将引物ZGX1和引物EX4加入该反应液中，进行二次PCR，扩增按GAP启动子基因、木糖异构酶基因、木酮糖激酶基因的顺序连接的约3.3kbp的DNA片段。将该DNA片段的两末端进行平端化反应后，与大肠杆菌用载体-质粒DNA、pUC118的HincII限制酶酶切片段混合，利用T4连接酶使其连接，制备重组质粒DNA。用该制备的重组质粒，按常规方法将大肠杆菌JM109性状转化后，将性状转化株涂布在含有50μg/ml的氨苄青霉素、0.1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷、20μg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷的LB平板培养基(1％Bacto胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，1.5％琼脂)上，形成菌落。由形成白色菌落的性状转化株提取的重组质粒为pUC118-xylAB(图2)。
实施例2含有大肠杆菌来源的转醛酶和转酮酶基因的重组质粒DNA的制备大肠杆菌的基因组DNA上，转醛酶基因和转酮酶基因不构成操纵子，位于相互离开的位置。因此，将转醛酶和转酮酶分别克隆后，使其按照在运动发酵单胞菌来源的GAP启动子的调控下的状态连接。为此，根据已知的运动发酵单胞菌来源的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因序列和已知的大肠杆菌来源的转醛酶基因(Nucleic Acids Res.，Vol.20，3305-3308，1992)，设计了以下4种PCR引物ZGT15′-CGCGGATCCGTTCGATCAACAACCCGAATCCTATC-3′ZGT25′-CTTAATAAGTTAGGAGAATAAACATGACGGACAAATTGACCTCCCTTCGT-3′ZGT35′-ACGAAGGGAGGTCAATTTGTCCGTCATGTTTATTCTCCTAACTTATTAAG-3′ETA45′-CATTTTGACTACCAGATCTAGATTACAGCAGATCGCCGATCATTTTTTCC-3′作为一次PCR，由运动发酵单胞菌菌体制备的基因组DNA用作模板，用ZGT1和ZGT3引物，扩增包含启动子和转醛酶基因的N末端部位、该启动子基因的上游末端附加有BamHI限制酶酶切位点的约300bp的DNA片段。另一方面，以大肠杆菌基因组DNA为模板，用引物ZGT2和ETA4，扩增包含启动子基因的一部分和转醛酶基因、该转醛酶基因的C末端附加有XbaI限制酶酶切位点的约1.2kbp的DNA片段。
然后，将含启动子基因的DNA片段和含转醛酶基因的DNA片段混合，94℃下加热20分钟后，在37℃保温15分钟，使其形成异源双链体，然后在TaqDNA聚合酶存在下，72℃下反应3分钟。将引物ZGT1和引物ETA4加入该反应液中，进行二次PCR，扩增按GAP启动子基因和转醛酶基因的顺序连接的约1.3kbp的DNA片段。将该DNA片段的两末端进行平端化反应后，与大肠杆菌用载体-质粒DNA、pUC118的HincII限制性酶酶切片段混合，利用T4连接酶使其连接，制备重组质粒DNA。
用该制备的重组质粒按常规方法将大肠杆菌JM109(ATCC 53323)性状转化后，将性状转化株涂布在含有50μg/ml的氨苄青霉素、0.1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷、20μg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷的LB平板培养基(1％Bacto胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，1.5％琼脂)上，形成菌落。由形成白色菌落的性状转化株提取的重组质粒为pUC118-tal。随后，进行转酮酶基因的PCR扩增。根据已知的转酮酶基因的碱基序列(J.Bacteriol.，Vol.174，1707-1708，1992)，合成以下2种引物ETK15′-CGGAATTCTCGAGCTCCAGTTACTCAATACGTAACAATAA-3′ETK25′-CGGCATGCCTCGAGGCAAACGGACATTATCAAGGTAATAAAAAAGGTCGC-3′作为一次PCR，由大肠杆菌的菌体制备的基因组DNA作为模板，用引物ETK1和ETK2，扩增在转酮酶基因的N末端上游赋予XbaI限制酶酶切位点，以及在其C末端下游赋予SphI限制酶酶切位点的约2.1kbp的DNA片段。将该DNA片段的两末端进行平端化反应后，与大肠杆菌用载体-质粒DNA、pUC118的HincII限制性酶酶切片段混合，利用T4连接酶使其连接，制备重组质粒DNA。
用该制备的重组质粒按常规方法将大肠杆菌JM109性状转化后，将性状转化株涂布在含有50μg/ml的氨苄青霉素、0.1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷、20μg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷的LB平板培养基(1％Bacto胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，1.5％琼脂)上，形成菌落。由形成白色菌落的性状转化株提取的重组质粒为pUC118-tkt。
然后，制备含有GAP启动子基因与转醛酶基因和转酮酶基因连接的DNA片段的重组质粒。也就是说，将重组质粒pUC118-tal在其转醛酶基因的C末端下游存在的XbaI限制酶切位点和SphI限制酶切位点切断所得的DNA片段，和将重组质粒pUC118-tkt由XbaI和SphI切断而制备的含有转酮酶基因的约2.1kbp的DNA片段混合，利用T4连接酶使其连接，制备重组质粒DNA。用该制备的重组质粒按常规方法将大肠杆菌JM109性状转化后，将性状转化株涂布在含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB平板培养基(1％Bacto胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，1.5％琼脂)上，形成菌落。由形成菌落的性状转化株提取的重组质粒中，确认GAP启动子基因、转醛酶基因、转酮酶基因依次串联连接，为pUC118-tal+tkt(图3)。
实施例3含有木糖发酵性基因的重组质粒DNA的制备为了将4种木糖代谢系酶基因导入棕榈发酵细菌并使其表达，将这些基因插入广泛宿主域性质粒载体中，制备重组质粒。
用EcoRI限制酶和BamHI限制酶切断重组质粒pUC118-xylAB，制备含有GAP启动子基因、木糖异构酶基因和木酮糖激酶基因的约3.4kbp的DNA片段。另外，用BamHI限制酶和Xho I限制酶切断重组质粒pUC118-tal+tkt，制备含有GAP启动子基因、转醛酶基因和转酮酶基因的约3.3kbp的DNA片段。将此两个DNA片段与用EcoRI限制酶和SalI限制酶切断广泛宿主域性载体-质粒pMFY31(Agric.Biol.Chem.Vol.49(9)，2719-2724，1985)而制备的约11.6kbp的DNA片段混合，利用T4连接酶使其连接，制备重组质粒DNA。用该制备的重组质粒按常规方法将大肠杆菌JM109性状转化后，将性状转化株涂布在含有50μg/ml的氨苄青霉素、0.1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷、20μg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷的LB平板培养基(1％Bacto胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，1.5％琼脂)上，形成菌落。确认由形成菌落的性状转化株提取的重组质粒中，GAP启动子、木糖异构酶基因、木酮糖激酶基因、GAP启动子、转醛酶基因、转酮酶基因依次连接，为pMFY31-xt(图4)。
实施例4木糖发酵性棕榈发酵细菌的制备将在大肠杆菌内构建的重组质粒pMFY31-xt性状转化至棕榈发酵细菌(ATCC 51623)。
将棕榈发酵细菌在RM培养基(2.0％葡萄糖、1.0％Bacto-酵母提取物、0.2％KH2PO4、pH6.0)中静置培养过夜，取5ml该预培养液接种于50ml的T培养基(2.0％葡萄糖、1.0％Bacto-酵母提取物、1.0％KH2PO4、0.2％(NH4)2SO4、0.05％MgSO4·7H2O，pH6.0)中，30℃下培养90分钟。将培养液在4℃、300rpm下离心分离10分钟，收集菌体，然后加入20ml冷却的10％甘油，悬浮、洗净。在4℃、3000rpm下，再离心10分钟后，制成感受态细胞(コンピテントセル)。将200μl的感受态细胞和10μl的pMFY31-xtDNA溶液在冰上混合后，转移至电穿孔装置附带的样品池中，在电压为200V，静电容量为250μFD，电阻为200Ω的条件下，施加电脉冲。将1mlT培养基立即加入到样品池中，30℃下静置培养1小时后，使其在选择培养基上形成菌落。在以木糖为唯一碳源、并含有100μg/ml的氨苄青霉素的T琼脂平板培养基(2.0％木糖、1.0％Bacto-酵母提取物、1.0％KH2PO4、0.2％(NH4)2SO4、0.05％MgSO4·7H2O，1.5％琼脂、pH6.0)上选择木糖发酵性的性状转化体。确认4种酶的基因在棕榈发酵细菌性状转化株细胞内表达。得到的性状转化株已保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，其保藏号为FERM P-19451(其在平成16年6月30日根据布达佩斯条约移交给国际保藏，保藏号为FERM BP-10048)。
将棕榈发酵细菌[pMFY31-xt]用T培养基培养后，制备无细胞提取液，测定4种酶的活性(Mol.Gen.Genet.，Vol.234，201-210，1992，Methods Enzymol.，Vol.9，499-505，1966，J.Bacteriol.，Vol.100.1289-1295，1969)。另外，作为对照菌株，使用大肠杆菌与棕榈发酵细菌[pMFY31]，同样进行活性测定、并进行比较。木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛酶、转酮酶在棕榈发酵细菌的细胞内高效表达，表现出的活性明显高于大肠杆菌(表1)。
表1木糖发酵性基因在重组棕榈发酵细菌细胞内的表达酶活性(mU/mg蛋白)菌株木糖异构酶木酮糖激酶转醛酶转酮酶棕榈发酵细菌[pMFY31]0.08 0.070.13 0.11棕榈发酵细菌[pMFY31-xt] 9.33 8.142.46 2.59大肠杆菌K12 3.23 2.781.85 1.391U的木糖异构酶在30℃下，1分钟内生成1μmol木酮糖所需的酶量1U的木酮糖激酶在30℃下，1分钟内消耗1μmol木酮糖所需的酶量1U的转醛酶在30℃下，1分钟内生成1μmol甘油醛-3-磷酸所需的酶量1U的转酮酶在30℃下，1分钟内生成1μmol甘油醛-3-磷酸所需的酶量因为可以确认通过导入pMFY31-xt后4种酶的高表达，所以可以用重组株由木糖生产乙醇。对以木糖为唯-碳源的发酵性进行了研究。在2％葡萄糖、2％木糖及2％葡萄糖+木糖为碳源的培养基上接种，测定菌体生长及乙醇生成量的时间进程(图5)。对于以木糖为唯一碳源的培养基，与只有葡萄糖相比，生长速度虽然低，但是，在培养的第5天，约消耗1％的木糖，产生约0.5％的乙醇，收率为90％以上。此外，对于葡萄糖+木糖培养基，在培养的第4天，木糖几乎无残留，成功地生产出接近理论收率的乙醇。在掺入葡萄糖的情况下，木糖发酵性显著提高，通过生物反应器的最适化，可以确定作为适合于实际应用的发酵菌的地位。
实施例5将重组菌棕榈发酵细菌FERM P-19451(FERM BP-10048)接种于以来源于生物质部分糖化液的葡萄糖和木糖为碳源的GX培养基(2.0％葡萄糖、2.0％木糖、1.0％酵母提取物、1.0％KH2PO4、0.2％(NH4)2SO4、0.05％ MgSO4·7H2O，pH6.0)，静置培养2天，用作预培养液。正式培养用上述的GX培养基，将预培养液按相对于正式培养用GX培养基10％的比例接种，30℃下缓慢搅拌进行培养。测定菌体生长程度、葡萄糖浓度、木糖浓度和乙醇浓度的时间进程，经过3天的培养，木糖基本上消耗完，产生接近于理论收率的乙醇(图6)。
实施例6在废木材的硫酸糖化制备的糖液(12％葡萄糖，3％木糖)中，分别添加下述终浓度的下述物质酵母提取物1.0％，KH2PO41.0％，(NH4)2SO40.2％，MgSO4·7H2O 0.05％，用pH调整至6.0的培养基进行连续发酵。重组棕榈发酵细菌FERM P-19451(FERM BP-10048)用光硬化性树脂ENTG-3800(关西ペイント公司生产)进行包埋固定化。连续发酵中使用通风管型生物反应器(流动层型)，将固定化载体按20％的充填率投入反应器后，从反应器的下部连续注入上述培养基。而且，一旦捕集到通过发酵而生成的二氧化碳后，从反应器的下部再次供给，从而形成流动床。在30℃、稀释率D＝0.1h-1下进行连续发酵时，能够以99％以上的糖消耗率以及95％以上的乙醇收率，稳定进行连续发酵1个月以上。
实施例7在稻秸的硫酸糖化制备的糖液(8％葡萄糖，3％木糖)中，分别添加下述终浓度的下述物质酵母提取物1.0％，KH2PO41.0％，(NH4)2SO40.2％，MgSO4·7H2O 0.05％，用pH调整至6.0的培养基进行连续发酵。将中空圆筒型(2mm×3mm)聚丙烯制成的载体投入菌体悬浮液中，进行重组棕榈发酵细菌FERM P-19451(FERM BP-10048)的吸附固定化。连续发酵中使用固定床生物反应器(充填层型)，将固定化载体按80％的充填率投入反应器后，从反应器的下部连续地供给上述培养基。在30℃、稀释率D＝0.2h-1下进行连续发酵时，能够以9 9％以上的糖消耗率以及95％以上的乙醇收率，稳定进行连续发酵1个月以上。
实施例8实施例7的连续发酵装置中，将2个固定床生物反应器串联连接，进行与实施例3同样的试验。结果，在释释率D＝0.2h-1的条件下，也能以99％以上的糖消耗率和95％以上的乙醇收率，稳定地连续发酵1个月以上。
权利要求
1.一种发酵细菌属的戊糖发酵性性状转化微生物，其导入了编码选自木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛酶、转酮酶中至少1种酶的外源基因。
2.一种重组DNA，将来源于木糖代谢系酶生产性菌株的、含有编码选自木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛酶、转酮酶中至少1种酶的基因的DNA片段与载体结合而成。
3.根据权利要求2所述的重组DNA，其中的木糖代谢系酶生产性菌株是属于埃希氏菌属、黄单胞菌属、克雷伯氏菌属、红细菌属、黄杆菌属、醋杆菌属、葡糖杆菌属、根瘤菌属、土壤杆菌属、沙门氏菌属或假单胞菌属的微生物。
4.根据权利要求2所述的重组DNA，其中木糖代谢系酶生产性菌株是大肠杆菌。
5.根据权利要求1所述的性状转化微生物，其导入了权利要求2-4中任何一项所述的重组DNA。
6.根据权利要求5所述的性状转化微生物，其中导入的重组DNA的全部或一部分整合到发酵细菌属宿主细胞的基因组中。
7.根据权利要求5所述的性状转化微生物，其中导入的重组DNA的全部或一部分存在于载体上。
8.一种乙醇的生产方法，其特征在于，用权利要求1所述的戊糖发酵性性状转化微生物使含木糖的糖化原料发酵，由所得的发酵液回收乙醇。
9.一种固定化载体，将权利要求1所述的戊糖发酵性性状转化微生物固定化。
10.一种生物反应器，具备权利要求9所述的固定化载体。
11.一种乙醇的生产方法，其特征在于，使用权利要求9所述的固定化载体，使含有木糖的糖化原料连续地发酵。
全文摘要
本发明提供一种性状转化微生物，其针对不能利用戊糖的发酵细菌属微生物，用重组DNA方法，导入戊糖代谢系酶，从而能够由戊糖生产乙醇。
文档编号C12N15/54GK1580244SQ200410055668
公开日2005年2月16日 申请日期2004年8月2日 优先权日2003年7月31日
发明者梁濑英司, 冈本贤治, 高寺贵秀, 杉浦敦子 申请人:关西涂料株式会社