专利名称：一种分离哺乳动物xy精子的方法
技术领域：
本发明涉及一种分离哺乳动物X精子和Y精子的方法。
背景技术：
在畜牧业生产中，有选择地繁殖出具有预知性别的畜禽后代将能大大提高畜牧业生产的速度和效率。用X或Y精子给母畜授精，在受精之前便可决定后代的性别，从而显著地改变后代的性别比例，达到性别控制的目的。以奶牛为例，奶牛农场主希望从其优质高产的核心群中繁殖出更多的小母牛，以增加或更新其奶牛群，通过性别控制就可以达到这一目的。同样，肉用牛农场主则希望繁殖出更多的小公牛，因为牛的生长速度和肉的品质与性别有关，公牛生长速度比母牛快，而且阉公牛肉的价格较高。在品种繁育方面，如果通过性别控制产下后代的准确率在90％以上，繁育畜群数量和性状改良的速度将比无性别控制的大大提高，从而可以节省大量的时间、精力和费用。
哺乳动物XY精子分离技术是有效的性别控制方法，如果能预先将X精子和Y精子分离，而后通过人工授精或者体外受精，就能得到预知性别的后代。自1925年Lush首次报道分离兔子的精子以来，许多科学工作者对分离精子的研究做了不懈的努力和尝试，这其中包括依据精子的密度、形态、大小、活力、表面电荷和免疫原性等特性，发明了各种各样的方法试图将决定性别的X精子和Y精分离开，但这些方法都有可靠性差、重复性低和效率不高的问题。直至目前，只有流式细胞仪精子分离法被公认为最科学最可靠，同时也是最高效的精子分离方法。流式细胞仪分离哺乳动物XY精子是根据哺乳动物X精子的DNA含量比Y精子多的原理，荧光染色之后通过分辨荧光差别将二者分开，受精之后达到性别控制的目的。
目前，流式细胞仪分离精子技术的不足之处在于分离精子的效率还较低，成本偏高，精子稀释液中含有卵黄等影响精子着色的物质，因荧光染色后XY精子分辨率差进而影响了分离精子的纯度，而且精子分离之后活力损失大，影响其受精能力。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种适用于哺乳动物精子分离的方法，在保证分离XY精子效率的同时，提高精子分离的准确率和分离后精子的活力，并适用于商业化生产。
本发明以如下技术方案解决上述技术问题(1)、在采集的公畜原精液中加入抗生素混合溶液，24小时内恒温下保存。
(1)、在采集的公畜原精液中加入抗生素混合溶液，24小时内恒温下保存。
(2)、用不含卵黄的精子稀释液将原精液稀释后加入荧光染色剂、并在水浴锅中孵育染色，水浴结束后加入色素。
(3)、在恒温下利用流式细胞仪分离所需的X或Y精子。
(4)、用预装有含卵黄的精子接收液的试管收集分离后的X精子和Y精子，分离得到的精液经离心浓缩后可直接用于人工授精或体外受精，或低温平衡后冷冻保存。
公畜原精液加入了抗生素混合溶液后，恒温保存的温度为22.5～27.5℃。
精液稀释液的成分及含量为
稀释的精液加入荧光染色剂Hoechst33342水浴染色后，加入色素FD&C#40的质量百分比为0.0025％～0.005％。
在10℃～25℃的恒温下用流式细胞仪分离XY精子。
分离所用的鞘液成分及含量为
精子接收液成分及含量为
使用之前按照体积百分比加入10％～30％的新鲜卵黄。
与目前的精子分离技术相比，本发明的优点在于(1)、采用本发明的方法对精子染色可有效提高XY精子的分辨率。
现有的精子分离技术在精子分离之前，利用含有卵黄的稀释液对原精液稀释保存，其最大的缺陷在于卵黄等蛋白物质影响了精子对荧光染料Hoechst33342吸收的均一性，不利于流式细胞仪对X精子和Y精子的分辨。而本发明将新鲜的原精液直接恒温保存，并加入混合抗生素抑制细菌的生长，在充分利用精浆中保护精子活力作用的物质同时，避免了卵黄等物质对精子染色均一性的影响。本发明利用改进的台罗氏液，每隔2个小时进行一个批次的精子稀释染色，染色结束立即进行分离，缩短染色到分离之间的时间间隔，在有效保证精子活力的同时使之得到均匀着色，利于X精子和Y精子的分辨。
(2)、采用本发明的方法分离精子可有效保持精子活力。
现有的精子分离技术在精子染色时，精子的稀释倍数比较大，精浆中的保护物质被高度稀释，保护作用下降，对精子活力造成很大影响。本发明在进行精子染色时，根据不同种类的动物将精子稀释到1.0～1.5亿/毫升，加入荧光染色剂、并在水浴锅中孵育染色。水浴结束后加入色素，去除死亡的精子，仅对细胞膜完整的活精子进行分离。本发明还在分离精子的接收管中添加含有卵黄的精子接收液，具有保护精子膜并保持精子活力的作用。
(3)在现有的精子分离方法中，分离过程一般在室温或恒温在4℃下进行；本发明在精子通过流式细胞仪进行分离的整个过程中，包括在流式细胞仪进样试管、进样细管通道和接收液试管内，均在稍高的温度下保持恒温。这样既能避免在较高温度下分离时精子活力的快速损失和细菌的快速繁殖，又能避免温度的急剧变化对精子造成的冷打击。
将本发明的技术与人工授精和体外受精等动物繁殖新技术相结合应用于畜牧业，能极大提高畜牧业的生产效率。而且本发明的技术同样可以适用于人类精液中XY精子的分离，用以尽量避免一些人患上与性别有关的疾病。
图1本发明中流式细胞仪检测到的XY精子DNA含量2本发明中分离得到的X精子样本利用重分析方法检测的准确率样3本发明中分离得到的Y精子样本利用重分析方法检测的准确率样图具体实施方式
实施例1(1)将采集得到的公牛新鲜精液加入抗生素混合溶液，置于22.5℃下水浴恒温保存。所加入的抗生素浓度如下
(2)、将原精液稀释到1.5亿/毫升，加入荧光染色剂Hoechst33342至40微克/毫升，在35℃的水浴锅中染色孵育50分钟。水浴结束后加入色素FD&C#40至质量百分比浓度0.0025％。精液稀释液的成分和含量为
HEPES的全称是N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸；
加入去离子水至200毫升；用1摩尔/升氢氧化钠溶液调节pH7.0；用0.22微米孔径的滤膜过滤除菌。
(3)、在16℃恒温下用流式细胞仪对X精子和Y精子进行分离，分离所用的鞘液和接收液成分和含量分别为鞘液
TRIS的全称是三羟甲基氨基甲烷；加入去离子水至1000毫升；用5摩尔/升的盐酸调节pH6.8；0.22微米孔径的滤膜过滤。
精子接收液
加入去离子水至100毫升；用5摩尔/升的盐酸调节pH7.0；0.22微米孔径的滤膜过滤；使用前每16毫升加入4毫升新鲜卵黄。
(4)、分离收集得到的精子离心浓缩，在精子图像分析系统下检测精子活率，10次重复试验中得到的精子平均活率为(67±1.6)％。
(5)、分离得到的X精子和Y精子样本用超声波断尾，重新加入Hoechst33342复染精子，通过流式细胞仪重分析精子DNA，利用高斯曲线拟合图形确定分离精子的准确率。在5次的重复试验中得到的X精子平均准确率为94％(如图2)，Y精子平均准确率为89％(如图3)。
实施例2将采集得到的隆林山羊新鲜精液加入抗生素混合溶液，置于25℃水浴恒温保存，所加入的抗生素浓度以微克/毫升表示如下太乐菌素、林可霉素、壮观霉素、庆大霉素分别为200、500、800和800。
将原精液稀释到1.3亿/毫升，加入荧光染色剂Hoechst33342至30微克/毫升，在33℃的水浴锅中染色孵育60分钟。水浴结束后加入色素FD&C#40至质量百分比浓度0.003％。
精液稀释液中，氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、碳酸氢钠、六水氯化镁、丙酮酸钠、葡萄糖、HEPES、牛血清白蛋白、硫酸庆大霉素的浓度以克/200毫升表示分别为1.1、0.04、0.005、0.15、0.01、0.04、0.15、1.5、0.1、0.005，乳酸钠为0.7毫升/200毫升。加入去离子水至200毫升；用1摩尔/升氢氧化钠溶液调节pH7.2；用0.22微米孔径的滤膜过滤。
在10℃恒温下用流式细胞仪对X精子和Y精子进行分离。分离所用的鞘液成分为TRIS、柠檬酸、果糖、氯化钠、青霉素、链霉素的浓度以克/1000毫升表示分别为22.00、10.0、10.0、1.0、0.05、0.05；加入去离子水至1000毫升；用5摩尔/升的盐酸调节pH6.8；用0.22微米孔径的滤膜过滤。
分离后所用的精子接收液成分及含量TRIS、柠檬酸、果糖、太乐菌素、林可霉素、壮观霉素、庆大霉素的浓度以克/100毫升表示分别为3.0、1.5、1.0、0.015、0.030、0.060、0.070；加入去离子水至100毫升；用5摩尔/升的盐酸调节pH7.0；0.22微米孔径的滤膜过滤，每12毫升接收液加入4毫升新鲜卵黄之后使用。
分离收集得到的精子离心浓缩，在精子图像分析系统下检测精子活率，10次重复试验中得到的山羊分离精子平均活率为(73±4.8)％。
分离得到的X精子和Y精子样本用超声波断尾，重新加入Hoechst33342复染精子，通过流式细胞仪重分析精子DNA，利用高斯曲线拟合图形确定分离精子的准确率。在5次的重复试验中得到的分离山羊X精子平均准确率为96％，Y精子平均准确率为92％。
实施例3将采集得到的长白公猪新鲜精液加入抗生素混合溶液，置于27.5℃水浴恒温保存，所加入的抗生素浓度如下太乐菌素、林可霉素、壮观霉素、庆大霉素的浓度以微克/毫升表示分别为180、400、700、700；
将精液稀释到1.0亿/毫升，加入荧光染色剂Hoechst33342至30微克/毫升，在37℃的水浴锅中染色孵育45分钟。水浴结束后加入色素FD&C#40至质量百分比浓度0.0035％。
精液稀释液中，氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、碳酸氢钠、六水氯化镁、丙酮酸钠、葡萄糖、HEPES、牛血清白蛋白、硫酸庆大霉素的浓度以克/200毫升表示分别为1.2、0.05、0.01、0.18、0.02、0.05、0.20、2.0、0.8、0.01，乳酸钠为0.75毫升/200毫升。加入去离子水至200毫升；用1摩尔/升氢氧化钠溶液调节pH7.0，用0.22微米孔径的滤膜过滤。
在25℃恒温下用流式细胞仪对X精子和Y精子进行分离；分离所用的鞘液成分为TRIS、柠檬酸、果糖、氯化钠、青霉素、链霉素的浓度以克/1000毫升表示分别为25.00、12.0、9.0、0.9、0.2、0.15。加入去离子水至1000毫升；用5摩尔/升的盐酸调节pH6.8；用0.22微米孔径的滤膜过滤。
分离后所用的接收液成分及含量TRIS、柠檬酸、果糖、太乐菌素、林可霉素、壮观霉素、庆大霉素的浓度以克/100毫升表示分别为4.5、2.5、1.5、0.02、0.050、0.080、0.080；加入去离子水至100毫升；用5摩尔/升的盐酸调节pH7.0；0.22微米孔径的滤膜过滤；每12毫升接收液加入1.8毫升新鲜卵黄后使用。
分离收集得到的精子离心浓缩，在精子图像分析系统下检测精子活率，10次重复试验中得到的精子平均活率为(60±5.5)％。
分离得到的X精子和Y精子样本用超声波断尾，重新加入Hoechst33342复染精子，通过流式细胞仪重分析精子DNA，利用高斯曲线拟合图形确定分离精子的准确率。在5次的重复试验中得到的X精子平均准确率为90％，Y精子平均准确率为86％。
权利要求
1.一种分离哺乳动物XY精子的方法，根据哺乳动物X精子的DNA含量比Y精子多的原理，通过荧光染色之后使用流式细胞仪进行分离，其特征是(1)、在采集的公畜原精液中加入抗生素混合溶液，24小时内恒温下保存。(2)、用不含卵黄的精子稀释液将原精液稀释后加入荧光染色剂、并在水浴锅中孵育染色。水浴结束后加入色素。(3)、在恒温下利用流式细胞仪分离所需的X或Y精子。(4)、用预装有含卵黄的精子接收液的试管收集分离后的X精子和Y精子，分离得到的精液经离心浓缩后可用于人工授精或体外受精，或低温平衡后冷冻保存。
2.如权利要求1所述的分离哺乳动物XY精子的方法，其特征是公畜原精液加入了抗生素混合溶液后，恒温保存的温度为22.5～27.5℃。
3.如权利要求1或2所述的分离哺乳动物XY精子的方法，其特征是精液稀释液的成分及含量为成分 克/200毫升氯化钠 1.0～1.2氯化钾 0.04～0.05磷酸氢二钠 0.005～0.010碳酸氢钠 0.15～0.18六水氯化镁 0.01～0.02丙酮酸钠 0.04～0.05葡萄糖 0.15～0.20乳酸钠 0.70～0.75毫升/200毫升HEPES1.5～2.0牛血清白蛋白 0.1～0.8硫酸庆大霉素 0.005～0.010
4.如权利要求1所述的分离哺乳动物XY精子的方法，其特征是在10℃～25℃恒温下利用流式细胞仪分离X或Y精子。
5.如权利要求4所述的分离哺乳动物XY精子的方法，其特征是利用流式细胞仪分离X或Y精子时所用的鞘液成分及含量为成分克/1000毫升TRIS22.00～25.00柠檬酸 10.00～13.00果糖8.00～10.00氯化钠 0.80～1.00青霉素 0.05～0.29链霉素 0.05～0.25
6.如权利要求4或5所述的分离哺乳动物XY精子的方法，其特征是接收液成分及含量为成分克/100毫升TRIS3.00～4.50柠檬酸 1.50～2.50果糖1.00～1.50太乐菌素0.010.02林可霉素0.03～0.05壮观霉素0.06～0.08庆大霉素0.05～0.08使用之前按照体积百分比加入10％～30％的新鲜卵黄。
全文摘要
一种分离哺乳动物XY精子的方法，依据哺乳动物X精子的DNA含量比Y精子多的原理，利用荧光染料Hoechst33342对精子DNA染色之后通过流式细胞仪将其分离。本发明通过改进精子分离之前的保存方法、精子的稀释液、分离精子的鞘液和接收液，在保证分离XY精子效率的同时，提高了精子分离的准确率和分离后精子的活力，适用于黄牛、水牛、山羊等哺乳动物XY精子的大规模商业化分离生产，并可与人工授精和体外受精等动物繁殖新技术相结合，大大提高畜牧业生产的效率。
文档编号C12N5/06GK1667118SQ20041006079
公开日2005年9月14日 申请日期2004年8月31日 优先权日2004年8月31日
发明者卢克焕, 陆阳清, 张明 申请人:广西大学