专利名称：家蚕核型多角体病毒及制备方法和其在基因表达中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于病毒生物反应器领域的生产工艺，特指用于基因表达的家蚕杆状病毒DNA的改进，即改进的多角体基因两侧含酶切位点的家蚕核型多角体病毒及制备方法和其在基因表达中的应用。
背景技术：
杆状病毒作为表达载体有20年的历史，已成为常用的表达体系之一。杆状病毒在昆虫体内的发育循环中有两种主要的存在形式，一种是在昆虫细胞间穿梭感染的病毒离子，又称为出芽病毒，另一种是病毒粒子包被在一层蛋白质膜的多角体形式。多角体可以在环境中保持活性，并通过昆虫食下，多角体膜裂解，释放出病毒粒子，引起感染。由于病毒的多角体是在昆虫细胞的核内包装，也称为核型多角体病毒。目前作为表达载体的病毒主要为苜蓿尺蠖核型多角体病毒和家蚕核型多角体病毒。其原理是杆状病毒的多角体基因具有强启动子，表达量高，而多角体基因是病毒复制非必需基因，可以从病毒的基因组中缺失。表达外源基因的方法就是利用同源重组的方法，用外源基因取代多角体基因，构成一个含外源基因而多角体基因缺失的重组病毒，这样的重组病毒可以表达外源基因。苜蓿尺蠖核型多角体病毒病毒体系的商业化比较完善，有利用同源重组方式的AcBacPAK6病毒和在细菌中发生转座重组的Bac-to-Bac系统。但家蚕杆状病毒的商业化进程很慢，没有商业化的病毒DNA供售，主要是实验室通过收集病毒粒子获得。目前使用的用于重组的家蚕杆状病毒是用lac Z基因取代了多角体基因的病毒，这种病毒可以表达lac Z基因产物，分解X-gal形成蓝色。现行的家蚕-杆状病毒表达系统有两个缺点，一是病毒DNA难以获得。含lac Z基因的病毒不能形成多角体，只能产生病毒粒子。病毒粒子很小，只有通过超速离心才能收集。目前通用的方法是用含lac Z基因的家蚕杆状病毒粒子通过感染BmN细胞后收获病毒粒子，再进行超速离心纯化，这种方式获取的病毒DNA较少，也不利于保存，并且在设备上需要超速离心机等大型设备。另一个缺点是在作空斑分析时，有时加入X-gal后，未发生重组的蓝色斑也难以分辨，而且加入的X-gal也影响家蚕细胞的生长状态，造成病毒斑不典型，只有长期从事该领域的专家才能辨别，技术要求很高。
发明内容
本发明的目的是提供一种改进的多角体基因两侧含酶切位点的家蚕核型多角体病毒及制备方法和其在基因表达中的应用，这种用于外源基因重组的家蚕杆状病毒含多角体基因，病毒粒子可以包被在多角体中，通过分离、纯化多角体而获得家蚕核型多角体病毒DNA。
本发明的所述的病毒，其特征是由家蚕核型多角体病毒经过改造，在多角体基因两侧添加了Bsu 36I酶切位点而成。
上述病毒的制备方法为1.设计一对引物，在引物1序列中包含一段多角体翻译起始点的序列，在此序列前加上Bsu 36I的酶切位点，在引物2序列中包含一段多角体翻译终止点的序列，在此序列后加上Bsu 36I的酶切位点；2.以上述的一对引物通过PCR反应扩增出多角体基因片段；3.上述的多角体基因片段以BamH I和EcoR I酶切，并与以BamH I和EcoR I酶切杆状病毒表达系统的转移质粒pBacPAK8，用T4 DNA连接酶进行连接。连接液转化感受态细菌DH5 α，阳性克隆进行酶切鉴定；4.重组多角体基因的转移质粒和线性化BmPAK6病毒DNA共转染Bm N细胞，获得有多角体的家蚕杆状病毒分离株。
上述获得的多角体的家蚕杆状病毒分离株在基因表达中的应用为1.含多角体的家蚕杆状病毒分离株经纯化后，以多角体添食家蚕幼虫或以病毒粒子液注射家蚕幼虫或蛹，大量扩增病毒的多角体；2.上述的多角体纯化后，用裂解液裂解，提取病毒DNA；3.病毒DNA经Bsu 36I酶解后，环形断裂，形成两条DNA条带；4.这样的病毒DNA可以用作与外源基因发生重组，产生重组病毒。
本发明的优点在于将多角体基因重新引入家蚕—杆状病毒表达体系中，病毒DNA可以通过用多角体添食家蚕幼虫或蛹的方式大量获得；在多角体基因的两端有酶切位点，可以使病毒DNA充分线性化，提高重组率；病毒斑筛选时，容易分辨重组病毒形成的斑和未发生重组的病毒形成的多角体斑。
图1 改进的多角体基因两侧含酶切位点的家蚕杆状病毒的特征图。
图2 改进的多角体基因两侧含酶切位点的家蚕杆状病毒DNA经Bsu 36 I酶切后的电泳图。
图3改进的多角体基因两侧含酶切位点的家蚕杆状病毒感染家蚕细胞后形成的多角体。
具体实施例方式
如图1所示，图中，1表示在多角体基因翻译起始密码子前有一个插入的特征序列，，包含Bus 36 I的酶切位点；2表示在多角体基因翻译终止密码子后有一个插入的特征序列，包含Bus 36 I的酶切位点；3表示多角体基因的读码框，从atg开始到taa结束，以上述的一对引物通过PCR反应扩增出多角体基因片段，反应条件为94℃，变性4分钟；94℃，50秒，50℃ 40秒，72℃，1分钟共3个循环；94℃，50秒； 64℃ 30秒，72℃，1分钟，共25个循环，最后72℃延伸10分钟。
如图2所示，在原本的家蚕杆状病毒中不含Bsu 36 I酶切位点，不能被其酶切。经改进的多角体基因两侧含酶切位点的家蚕杆状病毒DNA可以被Bsu 36 I酶切，产生两个片段，一个多角体基因片段约750个碱基和另一个用作同源重组的大片段。
以含绿色荧光蛋白的重组家蚕杆状病毒的构建为例1.将GFP基因片段插入到重组转移质粒BacPak8中。
2.大量提取重组转移质粒BacPak8-GFP DNA。
3.收集经改造的多角体基因两侧含Bsu 36I酶切位点的家蚕核型多角体病毒的多角体颗粒。
4.上述的多角体颗粒用裂解液裂解。配方为0.1mol/L Na2CO3，0.15mol/L NaCl.，0.5mmol/LEDTA，pH 10.8。
5.裂解液经酚/氯仿抽提后，用70％乙醇沉淀病毒DNA。
6.病毒DNA用灭菌水溶解。
7.病毒DNA 5微克加5微升Bsu 36 I酶液酶解，反应总体积为50微升。
8.重组转移质粒BacPak8-GFP DNA 5微克和上述Bsu 36I酶解的病毒DNA 1微克在脂质体介导下，转染家蚕BmN细胞。5天后观察，一些细胞中产生荧光物质即绿色荧光蛋白，没有多角体出现。
9.病毒液转染新鲜的家蚕Bm N细胞，有大量的细胞发出荧光，没有多角体出现。说明这种病毒DNA经酶切后，重组率近达100％。
如图3所示，图中发白色的是GFP蛋白质发出的荧光，表明GFP基因已经表达，在细胞中观察不到多角体的存在。说明使用本发明的技术方法可以使外源基因重组率达近100％。
序列表发明内容中制备方法其中引物1的序列为GGCGGATCCTTAGGATGCCGAATTATTCATACA，引物2的序列为GACGAATTCCTCAGGTTAATACGCCGGACCAGT；实施例中在多角体基因翻译起始密码子前有一个插入的特征序列，为GGATCCTTAGG在多角体基因翻译终止密码子后有一个插入的特征序列，为CCTGAGGAATTC
权利要求
1.含酶切位点的家蚕核型多角体病毒，其特征是由家蚕核型多角体病毒经过改造，在多角体基因两侧添加了Bsu 36I酶切位点而成。
2.根据权利要求1所述的改造的含酶切位点的家蚕核型多角体病毒的制备方法，其特征在于(1)设计一对引物，在引物1序列中包含一段多角体翻译起始点的序列，在此序列前加上Bsu 36I的酶切位点，在引物2序列中包含一段多角体翻译终止点的序列，在此序列后加上Bsu 36I的酶切位点；(2)以上述的一对引物通过PCR反应扩增出多角体基因片段；(3)上述的多角体基因片段以BamH I和EcoR I酶切，并与以BamH I和EcoR I酶切杆状病毒表达系统的转移质粒pBacPAK8，用T4 DNA连接酶进行连接；连接液转化感受态细菌DH5α，阳性克隆进行酶切鉴定；(4)重组多角体基因的转移质粒和线性化BmPAK6病毒DNA共转染Bm N细胞，获得有多角体的家蚕杆状病毒分离株。
3.根据权利要求2所述的改造的含酶切位点的家蚕核型多角体病毒的制备方法，其特征在于所述引物1的序列为GGCGGATCCTTAGGATGCCGAATTATTCATACA，引物2的序列为GACGAATTCCTCAGGTTAATACGCCGGACCAGT。
4.实现权利要求1所述的改造的含酶切位点的家蚕核型多角体病毒在基因表达中的应用，其特征为(1)含多角体的家蚕杆状病毒分离株经纯化后，以多角体添食家蚕幼虫或以病毒粒子液注射家蚕幼虫或蛹，大量扩增病毒的多角体；(2)上述的多角体纯化后，用裂解液裂解，提取病毒DNA；(3)病毒DNA经Bsu 36I酶解后，环形断裂，形成两条DNA条带；(4)这样的病毒DNA可以用作与外源基因发生重组，产生重组病毒。
全文摘要
本发明提供一种可以用于表达外源基因的改造的家蚕杆状病毒，在多角体基因两侧添加上Bsu 36I的酶切位点。这样的经过改造的家蚕杆状病毒以多角体添食家蚕或病毒粒子注射家蚕幼虫或蛹而获得大量的改造后的家蚕杆状病毒多角体，可以提取大量的经过改造的家蚕杆状病毒DNA。这样获得的DNA经Bsu 36I酶切后可以通过同源重组的方法用于表达外源基因。发生重组的家蚕杆状病毒可以通过显微镜观察，挑选没有多角体的发生重组的家蚕杆状病毒斑。简化了重组病毒筛选的过程。
文档编号C12N15/866GK1637138SQ200410066139
公开日2005年7月13日 申请日期2004年12月9日 优先权日2004年12月9日
发明者王文兵, 王利群, 宋志秀, 于峰, 朱姗颖, 乌慧玲 申请人:江苏大学